西安交通大学学报 医学版 第 卷 索羊水调节机制的新领域 已有研究报道 在人胎盘 及胎膜组织中有 &'7 表达 主要有 &' &'&'%&'&'&' 和 &' 并参与母体与胎儿间的液体交换 且与羊水量的调节相关 联 对于前 种 &'7 与羊水量的调节关系已经有不少研究 而对于 &' 在不同羊水量的产

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1 第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!"#$## %&'& $& 临床研究 水通道蛋白 在羊水量过少产妇胎盘和胎膜中的表达变化及意义 王晓慧 石小芳 郭丹凤 潘 青 李 悦 同芙菊 兰州大学第一医院妇产科 甘肃兰州 临汾市人民医院妇产科 山西临汾 % 兰州大学第一临床医学院 甘肃兰州 摘要 目的 探讨水通道蛋白 &' 在特发性羊水过少产妇胎盘和胎膜中定性及相对定量表达情况及其在羊水平衡过程中的作用 方法 选择在兰州大学第一医院经剖宫产分娩的 例产妇 其中 例特发性羊水过少者作为实验组 例羊水量正常的足月产妇为对照组 采用 & 免疫组化法和实时荧光定量 技术 检测两组产妇羊膜 绒毛膜 胎盘中 &' 的表达及分布 结果 &' 在足月妊娠产妇羊膜 绒毛膜及胎盘中均有表达 且在羊膜的表达与羊水量呈正相关 在胎盘的表达与羊水量呈负相关 在不同羊水量的绒毛膜的表达均呈增加趋势 结论 &' 在妊娠晚期羊水量调节中可能发挥着重要作用 关键词 羊水过少 水通道蛋白 &' 胎盘 胎膜 膜内途径中图分类号 % 文献标志码 &!"#$ $#%%&$%$"$'$#% (&)* +,-./#, 01+,-./-" * -"/$" &) '," 12#$ 3)*4#/# $-56$". 7$5,!7-"*"$!.8.$4,570.7,-8.-"9.# ",:$57,-"9.#$-56$". 7$5,!7-"*"$!.8. $.8$;70.7,-8.,"$","$"%!..8.$4,578,",!-8 $,!-8#,$7-"9.#",:$57,-"9.#,"- ()"#()*++ #, "+"+#"-#&."", ",####," "+",+ +#"+&/++#+ "# +##,+" "+"#()*+#"#&()*,"#""0+,++#"#& +, #", +# " + #, #", +#" +& #"#, "+#" +& ()*++#"-#& *+,( "+ ()* # , 羊水成分的 是水 在保护胎儿中发挥着重要作用 正常妊娠时羊水的产生与吸收是动态平衡的过程 引起羊水产生或吸收失衡的任何因素均可造 成羊水过少 可能带来不良的妊娠结局 增加围生期孕产妇 胎儿及新生儿的发病率和死亡率 近年来 随着水通道蛋白 -#-.5,"&' 的发现 开启了探 收稿日期 //% 修回日期 // 基金项目 甘肃省自然科学基金资助项目 ). #.5$ $)-#5-8!,$"!$4.#"-,.".*-"7#5.:,"!$). 通信作者 王晓慧 /6-,8,-.#,-"!.6 优先出版 "7!","$!67$-,868//!" #$#!"

2 西安交通大学学报 医学版 第 卷 索羊水调节机制的新领域 已有研究报道 在人胎盘 及胎膜组织中有 &'7 表达 主要有 &' &'&'%&'&'&' 和 &' 并参与母体与胎儿间的液体交换 且与羊水量的调节相关 联 对于前 种 &'7 与羊水量的调节关系已经有不少研究 而对于 &' 在不同羊水量的产妇胎盘 胎膜组织中的表达变化少有报道 本研究采用免疫组化方法和实时定量 技术 从蛋白和 6)& 水平检测 &' 在特发性羊水过少及正常羊水量足月妊娠产妇胎盘和胎膜组织中的分布及表达 材料与方法 主要试剂 兔抗人 &' 单克隆抗体 & 免疫组化试剂盒购买于北京中杉金桥生物技术有限公司 )&,7.8#7)& 提取试剂 5,6$!5, 3 3-7$5, 逆转录试剂盒 2$-8/,6$ 试剂盒购买于大连宝生物公司 &' 引物及内参 肌动蛋白 /-!," 委托北京金维智公司帮助合成 - 病例选择 选择 年 % 月至 % 年 月 在兰州大学第一医院分娩的足月孕妇 例 其中 例特发性羊水过少者作为实验组 例羊水量正常者作为对照组 病例纳入标准 两组产妇均为选择性剖宫产 系单胎妊娠 无糖尿病 高血压 病毒感染 母儿血型不合或自身免疫性疾病等可能影响羊水量的妊娠合并症和并发症 产后检查胎盘时未发现巨大胎盘 胎盘绒毛膜血管瘤等 排除羊水污染等情况 羊 水异常的诊断标准 以产前 超检测羊水指数 -6",.,!8#,,"$&41 决定分组 并于预产期 周内测定羊水指数 正常羊水量范围是 &41 为!6&41!6 为羊水过少 剖宫产术中进一步核实羊水量情况 羊水总量 6 为正常范围 羊水总量 6 确定为羊水过少 如果术中羊水总量和术前羊水指数不符合的病例 则予以去除 羊水过少组产妇平均年龄 岁 平均分娩孕期 % 羊水正常组产妇平均年龄 岁 平均分娩孕期 两组产妇平均年龄 孕周差异无统计学意义 << 资料具有可比性 羊水过少组产妇羊水指数 %!6 羊水量 6 羊水正常组产妇羊水指数!6 羊水量 % 6 与正常组比较差异均有统计学意义 < <. 标本取材 于胎盘娩出后 6," 内 取一块胎膜 并用镊子将羊膜和绒毛膜分离 刮净绒毛膜上附着的蜕膜组织 分别取约!6=!6 大小的 块羊 膜和绒毛膜 距脐带!6 处切取 块胎盘组织 大小约!6=!6=!6 用 漂洗 一部分经 6 甲醛固定 常规石蜡包埋 另一部分立即放入液氮中 转存至 > 冰箱保存 本研究经本院伦理委员会批准 每位纳入实验的孕妇均签署知情同意书 /0 免疫组化 ) 法检测及结果判读 & 法检测 &' 蛋白在两组产妇羊膜 绒毛膜及胎盘中的表达部位及变化 常规包埋 切片 脱蜡 水化 高压锅柠檬酸液修复抗原 加一抗 &' 兔抗人单克隆抗体 稀释比为? 在 %> 冰箱孵育 加二抗 羊抗兔 1* 单克隆抗体 放入湿盒孵育 6," 然后滴加 & 显色剂 每次实验均设阴性对照 光镜下观察 根据其在胎盘组织中表达的阳性细胞百分比和染色程度作为判断依据 并进行评分 每张切片光镜下随机观察 个高倍视野 =% 每个视野观察 个细胞中阳性细胞的表达数 求平均值后计算出阳性表达细胞占总细胞的百分数 并进行评分 着色程度 为 分 浅黄色 A 为 分 黄色 为 分 棕色及深棕色 为 分 阳性细胞百分比 阳性细胞数 为 分 为 分 为 分 为 分 两项相加后分 % 级 分为 A% 分为 分为 最后按阳性细胞所占细胞总数的百分比 = 阳性细胞的染色程度评分进行综合评分 所有的切片均由 位资深的病理医师进行双盲观察 /1 实时荧光定量 )( 检测 %( 的表达 采用 35,9.8 试剂盒分别提取两组产妇羊膜 绒毛膜及胎盘中 )& 用逆转录酶进行逆转录 以 /-!," 为内参照 提取!)& 模板进行实时荧光定量 反应 使用 软件进行数据处理和分析 &' 基因的上下游引物分别为 B/*&&*/ 3&***&***&3*3&333/B 和 B/&3&*&*/ &3**3&333**33&3*/B /-!," 的上下游引物分别为 B/33*3*&3&&33*3/B 和 B/*&&**&3*&*&&**&*&3/B 循环参数为 > 下预变性 7 反应 个循环 随后 > 7 及 > 7 条件下交替反应 % 个循环 > 6," 及 > 7 的条件下反应 个循环 > 7 条件下反应 个循环 每个样本设置 个复孔 取平均值 待所有反应结束后 使用 软件记录荧光反应曲线及循环阈值 5$7.8!!8$ 并输出实验数据 扩增及溶解图等 采用实验组 对照组 法计算目的基因的相对表达量 其中 < 内参基因 内参基因 对照 / -!," 为内参 正常胎盘组织为对照基准 表!" #$#!"

3 期 王晓慧 石小芳 郭丹凤 等 水通道蛋白 在羊水量过少产妇胎盘和胎膜中的表达变化及意义 示实验组胎盘中 6)& 的表达量相对于对照组的变 % 化倍数 统计学方法 应用 软件对实验数据进行统计学分析 计数资料采用卡方检验 计量资料以均数 标准差 表示 两组间比较采用两独立样本均数 检验 为差异有统计学意义 - 结 果 - 免疫组化染色结果 &' 蛋白主要表达于 人类羊膜上皮细胞 绒毛膜滋养细胞 胎盘合体滋养层细胞及胎盘血管内皮细胞 阳性染色于细胞质 呈棕黄色颗粒 图 羊水过少组中羊膜上皮细胞表达强阳性率为 较羊水正常组明显下调 与正常组比较差异有统计学意义 而在绒毛膜滋养细胞和胎盘滋养细胞中的表达阳性率分别为 较羊水正常组明显上调 差异均有统计学意义 表 图 在羊水过少组和羊水正常组产妇羊膜 绒毛膜 及胎盘 ) 的表达情况 4,5$77,.".&'5.$,","-6",.,!6$6 5-"$&!.5,.",!6$6 5-"$-"8-!$"-4..8,.5-6",.75.#-"" ",.,!8#,5.# &=% & 羊水过少组 4 羊水正常组 表 不同羊水量产妇胎盘组织中 蛋白的表达评分 3-5$77,."7!.5$.&'5.$,","8-!$"-,,$5$"-6",.,!8#,-6.#" 组别 羊水正常 < 部位 A 阳性率 羊膜 绒毛膜 胎盘 羊水过少 < 羊膜 % % 绒毛膜 % 胎盘 % % 与羊水正常组羊膜比较 与羊水正常组绒毛膜比较 与羊水正常组胎盘比较 采用卡方检验 &' 蛋白在羊水过少组羊膜中表达减少 在绒毛膜和胎盘表达增加 -/- 产妇胎盘和胎膜中 %( 的表达情况 &' 和 /-!," 的溶解曲线峰值重叠较好 峰较为锐利 单一 即表明 &' 及 /-!," 扩增均为特异 性 没有异常的非特异荧光产物 结果重复性好 可信度高 两组产妇羊膜 绒毛膜 胎盘中均可检测到!" #$#!"

4 西安交通大学学报 医学版 第 卷 &'6)& 的表达 其中羊膜上皮细胞 &' 6)& 的表达强度为正常组的 倍 明显低于羊水正常组 < 而绒毛滋养细胞和胎盘滋养细胞 &' 6)& 的表达强度分别为正常组的 % 倍 倍 均明显高于对照组 差异均有统计学意义 <% 图 图 - 不同羊水量产妇胎盘组织中 %( 的相对表达量 4, $8-,:$$5$77,.". &' 6)&," 6-$5"-8 8-!$"-,,$5$"-6",.,!8#,-6.#" 与羊水正常组比较. 讨 论羊水过少会导致胎儿发育异常 也影响围产期胎 儿疾病发病率及死亡率 目前 羊水过少的病因尚未完全明确 已引起国内外学者的高度重视 &' 是一类对水具有高度选择性的糖蛋白 也是一种内在膜蛋白 介导水的跨膜转运并参与调节细胞的渗透平衡 其蛋白发生机能障碍与体内水平衡紊乱性疾病有 着密切关系 年 &3 等首次证实 &' 表达于人类胎盘 胎膜中 而在人类胎盘 胎膜上的研究样本数 均较少 &' 在细胞间水平衡中有重要作用 在人类妊娠期胎膜中的作用研究开启了新的希望 &3 等研究发现 (10 细胞株表达 &' 这 个亚型 且潜在参与羊水量的调节 支持假说 在妊娠期间的任何阶段都有可能导致 &'7 的异常表达 这会导致发生羊水过少 本研究应用免疫组化和实时荧光定量的方法 发现 &'6)& 及蛋白在足月妊娠产妇的羊膜 绒毛膜及胎盘组织中均有表达 分析发现 &' 蛋白主要分布于羊膜上皮细胞 绒毛膜滋养细胞 胎盘合体滋养细胞和血管内皮细胞的胞质中 与 &3 对胎盘的研究结果一致 这提示 &' 可能在羊水的调节和母胎液体交换中起重要作用 最近的研究表明 在各种实验条件下 羊水的膜 内吸收是羊水调控最重要的方式和关键因素 膜内吸收速率不仅可以调节羊水体积而且也是主要的调节 器 胎儿吞咽羊水 排出胎尿及胎肺分泌活动调节 主要为满足自身需要 维持胎儿机体内环境稳定 对 羊水量调节作用相对较小 0&)* 等研究发现 结扎胎羊食管 使吞咽活动中断 羊水的膜内吸收明显增加 防止羊水过多 也证实了这一观点 本研究结果表明 &'6)& 及蛋白在特发性羊水过少羊膜组织中表达显著减少 而 &'6)& 及蛋白在特发性羊水过少产妇绒毛膜 胎盘中表达显著增加 推测羊水过少时羊膜上皮细胞可能通过 &' 的表达量下降 减少母胎液体交换 胎儿血容量及胎儿皮肤肾脏水分排泄 减少羊水的生成 同时改变细胞膜对羊水的通透性 阻止过多的液体重吸收进入胎儿血循环 在一定程度上减少羊水膜内途径的重吸收 从而达到平衡羊水生成与吸收的目的 但是 对于 &' 在羊水过少产妇羊膜部位的表达减少是引起羊水过少的原因还是为适应羊水过少而作出的适应性改变 需要进一步的研究 如体外实验敲除 &' 基因后观察羊水变化 从而更深一步了解 &' 在羊水平衡调节中的作用 当发生羊水过少时 提示 &' 可能通过某些机制对调节胎盘水流量具有显著作用 增强从母体循环的水流运输 通过胎盘到胎儿以维持母 / 胎之间的液体平衡 &' 6)& 及蛋白在特发性羊水过少及羊水量正常产妇绒毛膜组织中表达均增加 表明绒毛膜中 &' 的表达相对于羊膜及胎盘对羊水量调节可能相对较小 或与羊膜及胎盘对羊水量调节的机制不同 且 &' 在羊膜及胎盘的表达在妊娠过程中对母 / 胎之间液体的快速交换可能发挥更重要的作用 而 &' 在绒毛膜的表达并非起着对水平衡调节的功能 可能还存在其他潜在功能 &' 在结构上除去共有的 )& 序列外 还有自己独特的 ) 序列 提示这种潜在功能是水通道蛋白超家族所特有 如 &' 在细胞损伤及修复等方面的潜能 需要进一步的研究 本文仅采用 & 法定性及 3/ 方法相对定量地分析了 &' 在羊水过少产妇羊膜 绒毛膜及胎盘组织的变化 进一步还需应用 ($7$5" 8. 法定量分析蛋白表达变化和 &' 基因敲除后羊水的变化 从而深入研究 &' 在羊水平衡过程中的功能 参考文献 /('1$$ /'1$&"#0!" #$#!"

5 期 王晓慧 石小芳 郭丹凤 等 水通道蛋白 在羊水量过少产妇胎盘和胎膜中的表达变化及意义 "+#, "+0 &"$# ( /('1.('1.&"0 ##"# &23 0& 谢幸 苟文丽 & 妇产科学!& 第 版 北京 人民卫生出版社 & %$(4'/ 56$(22'*&0+*5 ""#"#-0 ",( "+# "&!#-!"0& (!(' 5&(+#"-+&$+*0 % 67'7%'!42'7' (&",-#""&3+ 3(%% *( 534('57' 4374 %&7 +++-&3" % /$/3($/6&(-+,'*( - &3#+ 3(#0& 5'1 5('$7' 23(5(&( +"+#"+" ++--&* % %0& ('1)/3&("8++#+ +#" +&*#7-1 #%%0& 编辑 国 荣 上接第 页 3($/1///4/276(($6&# $/!7(73($6/$/6(.(&/# #+ #++ +9##-# #+9, ++""##0 + " + " &(*+# "+,+&( (+ %% *#"%0& 周霞 党亚洁 王桂芳 等 & 烟曲霉暴露对支气管哮喘大鼠肺组织 6$(%( ( $!7'//$(22(/!& 糖皮质激素受体表达的调控作用 & 中华结核和呼吸杂志 #-###+ #/ %0& &!#-0& 6(/(4( %$($$$6(47'$!7&5+ 5//(75 &$0++ #0 ###"## -#0 +, ++!(*6'203#0 #"+#+"## &( + +"#+&/++ (+ #$#$$& %0& 编辑 韩维栋 上接第 页 $7('&/0 2(. ($2(1(4 (!&*-0#" "+""#- +#0 #-,(2!"#""+"-" " +#+&(# 3+0!" "&0& & 7$7/774('7!(1/4( 2$& *($4 4(' *&#,0-"# "- (2!&!(,+,0!( + %0& &!%0& $/ 5((!6/4//! &# 5/3( (7 '(6(/!(!&# +"0,-""-""- 0####/"#0 #"0"&!%%%%0 " ++&(#3+ %%& (11(.(4 %$/'14(!$(!( &# 6*4(64&/"#+##+## (2! +"0,-"#++"-" - &5*#*$#&&0&&,+#0#""&50 1(%(( '&( -C"+## +## % -#+##&!## # 6' 2(( */43(! (*&0,-"#5#- "& %2(. ($&%#-,9#!0& "#" "#""+"-"0 编辑 卓选鹏 #"""0+&!0!" #$#!"

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中国中西医结合杂志 年 月第 卷第 期!  羊水过少是一种常见的妊娠并发症 发病率为 > > 使围产儿发病率和死亡率明显升高 研究表明水通道蛋白, 1 在人羊膜和胎盘中有表达 无并发症的羊水过少产妇 在羊膜 绒毛膜上表达的减少 而在胎盘上的表达增加 认为 在羊膜上的表达所发生的变化是一种生理性代偿 复方丹参注射液对人羊膜上皮细胞水通道蛋白 表达的影响 张译文 马小燕 丁盛娣 谢爱兰 朱雪琼摘要 目的 研究复方丹参注射液对人羊膜上皮细胞 / 0. 1 0/. / 水通道蛋白, 1 表达的影响 探讨复方丹参注射液治疗羊水量过少的机制 方法 选取无并发症的 例羊水过少和 名羊水量正常的足月产妇的 / 进行原代培养 采用 和免疫印迹 0 0 技术 检测复方丹参注射液不同浓度 & 23 4 不同作用时间

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