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麒窦岑
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1 08-06 Nucleic Acid Purification Kit MagExtractor -RNA- (Code No. : NPK 200,201) 使用说明书科研用 TOYOBO CO., LTD. Life Science Department OSAKA JAPAN

2 目录 [1] 前言... 1 [2] 使用前须知... 1 [3] 试剂盒中所包含的物品... 2 [4] 操作程序试剂盒以外所需要的其他物品试剂准备样品的前处理方法抽提流程用 MFX-2000 抽提 RNA 手动法抽提 RNA DNaseⅠ 处理 [5] 疑难解答 [6] 参考文献注意本试剂盒中所包含的都是研究用试剂请不要用于诊断, 临床等场合在使用本试剂盒的时候, 请严格遵守实验室的基本注意事项, 并注意安全对于 PCR 法,Hoffmann-La Roche 公司保留专利 MagExtractor 是东洋纺织株式会社的登录商标 FALCON 是 BECTON DICKINSON 公司的登录商标

3 [1] 前言在含有 RNA 结合促进剂的蛋白质变性剂溶液中,RNA 能被磁珠吸附本试剂盒利用该特性来抽提培养细胞, 组织等总 RNA, 可用于 RT-PCR( 逆转录 PCR) 实验本试剂盒可作为全自动核酸抽提装置 MFX-2000 的试剂, 也能用于手工抽提使用 MFX-2000 的场合请先仔细阅读 MFX-2000 的使用说明书性能特征能够从培养细胞等各种样品中抽提纯化总 RNA 抽提出的 RNA 主要包含 rrna,mrna 不含苯酚氯仿等危险溶剂通过磁石进行固液分离, 无需离心操作能够短时间内分离 RNA 使用 MFX-2000 自动抽提时,24 个样品大约只需 4 小时就能够完成抽提 [2] 使用前须知 MagExtractor -RNA- 对应以下样品对应样品样品量获取量备注培养细胞 ~5 x 10 6 cells ~ 10 μ g / 10 6 cells 根据细胞的种类或培养条件等不同,RNA 的获取量也会有所变动组织 ~30mg ~ 15 μ g / 30mg 根据组织的种类或保存条件等不同,RNA 的获取量也会有所变动酵母 ~10O.D.(660nm)0.5ml 培养液中的细胞 ~20μg / 5 O.D. 需要通过 Zymolyase 等进行前处理根据培养条件等不同,RNA 的获取量也会有所变 1

4 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司动从全血或血清样品中直接抽提时, 收率会非常低使用全血样品时, 必须先进行离心等操作富集白细胞与使用酵母相同, 通过 Lysozyme 处理后, 也可以从大肠杆菌中抽提出 RNA, 可能会混入少量基因组 DNA [3] 试剂盒中所包含的物品本试剂盒能抽提 50 样品进行 RNA 的试剂请在适当的温度下保存 50ml 溶解吸附液 ( 含有蛋白质变性剂 ) ml 洗净液 Ⅰ( 含有蛋白质变性剂 )... 4 或者室温 88ml 洗净液 Ⅱ( 低浓度缓冲液 )... 4 或者室温 5ml 溶出液 (RNase free 蒸馏水 )... 4 或者室温 3ml 磁珠... 4 或者室温 0.9ml2- 巯基乙醇 (2-ME)... 4 如果试剂溅到衣服或者手上, 请用清水充分清洗如若碰到眼睛, 请立刻用清水清洗, 然后去医院就诊溶解吸附液和洗净液 Ⅰ 中含有蛋白质变性剂, 在操作的时候须特别注意手工抽提时候, 洗净液 Ⅰ, 洗净液 Ⅱ 必须恢复室温后方可使用也可以直接在室温下保存 ( 如果要长期保存, 建议在 4 下保存 ) 请将溶解吸附液和 2- 巯基乙醇溶液 (2-ME) 以 100:1(v / v) 的比例混合后使用混合液请在 4 下保存, 在 3 个月之内使用垂询电话 :

5 [4] 操作程序 1. 试剂盒以外所需要的其他物品 (1) 试剂从酵母中抽提 RNA 时, 需要以下试剂 : Zymolyase(20,000U / g : 化学工业公司生产 ) Zymolyase buffer(0.9m Sorbtol 0.1M EDTA,50mM DTT(pH7.5)) (2) 器具器材使用 MFX-2000 的场合专用试管 (Code No.: MFX-301) 带滤芯 tip(code No.: MFX-401) 离心管 (50ml 用,15ml 用,2ml 用 ) *1 *1 离心管推荐以下产品 50ml 离心管 :BLUE MAX 2170(BECTON DICKINSON 公司生产 ), 15ml 离心管 :BLUE MAX Jr(BECTON DICKINSON 公司生产 ),2ml 离心管 :2220,2200 (INOUPTIC 公司生产 ),72.693,72.694(Assist 公司生产 ) 手工抽提的场合 *1 1.5ml 离心管用的磁性台架或简易台式离心机 (3,000~5,000rpm) 涡旋震荡器水浴槽 (65 ) 2. 试剂准备先将溶解吸附液和 2-ME 以 100:1(v / v) 的比例混合后再使用取 700 μl 溶解吸附液和 7μl 的 2-ME 充分混匀全量制备时, 在存放溶解吸附液的容器里 (50ml) 加入 500μl 的 2-ME 充分混匀请将此混合液 ( 溶解吸附液 ( 含有 2-ME)) 在 4 下保存 ( 可以存放 3 个月 ) 使用手工抽提时, 请务必等洗净液 Ⅰ, 洗净液 Ⅱ 恢复到室温后再使用 3

6 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 3. 样品的前处理方法由于样品中的 RNA 不稳定, 所以请将样品在溶解吸附液 ( 含有 2-ME) 中溶解 *2 另外, 对于酵母等样品, 在溶解之前必须先对细胞壁用溶菌酶进行消化处理以下列出了几种代表性样品的前处理 (1) 培养细胞培养细胞通过离心等操作回收至 1.5ml 离心管内, 再添加 700μl 的溶解吸附液 ( 含有 2-ME), 用微量移液器仔细搅拌, 直至完全没有粘性为止 ( 此操作如果时间过短会影响 RNA 的收率 ) 用漩涡混合器混合 30 秒左右后, 在室温下放置 10~15 分钟 (2) 组织将溶解吸附液 ( 含有 2-ME)750~900μl 注入 1.5ml 离心管中, 放置于冰上切下组织, 置液氮中冻结然后, 用锤子等敲碎组织, 将冻结组织片 (10~30mg 左右 ) 放入溶解吸附液中 ( 柔软的样品可以按照此法操作 ) 使用微型试管用的匀浆器, 在冰上匀浆组织用涡旋震荡器搅拌 30~60 秒左右, 直至完全没有粘性 3,000~5,000rpm, 离心 10 秒左右 * 1, 将 620~750μl 左右的上清液放入另外一个试管内 * 2 此时如果粘性还很高, 可以通过微量移液器反复吹吸, 直至至完全没有粘性为止 ( 如果有粘性会影响收率 ) 室温放置 10~15 分钟 *1 高速离心时,RNA 可能沉淀而影响收率 *2 上清液中残留少量不溶性物质不会影响抽提 *1 (3) 酵母在使用前, 将 Zymolyase 20T(20,000U / g) 用 Zymolyase buffer 配成 30mg / ml 溶液, 冰浴放置 ( 试剂组成 : 参照第 2 页 ) 离心培养液, 回收酵母将沉淀悬浮于 50μl 的 Zymolyse 溶液中 ( 如果是菌落, 可用接种环挑入 50 μl 的 Zymolyse 中 ) 垂询电话 :

7 用涡旋震荡器充分混匀, 在 37 下温育 5~20 分钟在处理液中直接加入 700μl 的溶解吸附液 ( 含有 2-ME), 通过微量移液器仔细混合用涡旋震荡器震荡 30 秒左右, 然后在室温下放置 10~15 分钟 4. 抽提流程以下列出了使用 MagExtractor -RNA- 抽提的流程样品溶解吸附液 ( 含有 2-ME): 放置 10~15 分钟 [ 样品的溶解 ] 前处理溶液磁珠 : 约 1 分钟... [RNA 吸附 ] B/F 分离洗净液 Ⅰ: 约 10 秒...[ 除去非特异的吸附物 ] B/F 分离洗净液 Ⅱ: 约 5 秒 (2 次 )...[ 除去蛋白质变性剂 ] B/F 分离溶出液 ( 蒸馏水 ): 约 2 分钟 (65 )[ 从 RNA 的磁珠中洗脱 ] B/F 分离回收上清液 (40μl) *1 也可适用于抽提大肠杆菌 RNA, 大肠杆菌通过 Lysozyme 处理后, 再沉淀菌体进行抽提抽提大肠杆菌 RNA 时, 在 RNA 溶液中可能会混入基因组 DNA, 建议用 DNase I 进行处理, 具体请参照第 11 页 DNaseⅠ 处理 5. 用 MFX-2000 抽提 RNA 在使用 MFX-2000 之前, 请先阅读 MFX-2000 的使用说明书在使用 MFX-2000 抽提 RNA 的时候, 需要有加温功能可以使用标准式样 ( 加温, 简易保冷功能 / Code:MFX-102 ) 或者特别式样 ( 加温, 电子冷却功能 / Code:MFX-103) 等机种 5

8 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 (1) 操作程序的选择以下显示了 MFX-2000 中提供的抽提 RNA 用的操作程序请根据需要加以选择 1 普通操作程序用 40μl* 1 的 RNA 溶出液对 RNA 进行溶出回收液可以直接用于 DNaseⅠ 处理及逆转录反应等可测定回收液的吸光度抽提所需时间约为每一个样品 10 分钟 2 乙醇溶液 * 2 沉淀操作程序将 40μl 溶出液注入含 500μl 乙醇沉淀用试剂的试管中可用于不立刻使用 RNA 或需将 RNA 长期保存的场合需要通过离心来回收 RNA 抽提所需时间约为每一个样品 10 分钟操作程序输入号码液晶的显示内容通常 21 RNA: Normal 乙醇溶液沉淀 22 RNA: Ethanol (2) 加温 block, 冷却 block 的温度设定加温 block, 冷却 block 的温度设定如下加温 block 冷却 block 设定温度使用简易保冷 block 的场合下, 请事先将保冷 block 置于冷藏库或者低温室冷却简易保冷 block 用于回收液的短时间保冷温度设定时, 请仔细阅读 MFX-2000 的使用说明书 1* 溶出液量会有所增减 2* 把自家制备的乙醇溶液沉淀用的试剂放置在试剂台架上乙醇溶液沉淀用试剂将事先注入回收用试管内, 并能够从中析出 40μl 溶出液垂询电话 :

9 (3) 附带专用过滤器的 tip 的使用把附带专用过滤器的 tip(code No.:MFX-401) 置于 tip 架内使用的数量请参照下表请务必使用附带专用过滤器的 tip(code No.:MFX-401) 安装超过规定的 tip 数量不会有所影响 tip 已用 γ 射线灭菌使用时请带好手套在 tip 架的左下方, 纵向列出了 tip 的必要使用量详细安装位置请阅读 MFX-2000 的使用说明书 7

10 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司使用通常操作程序的情况 : 样品数 tip 数样品数 tip 数使用乙醇溶液沉淀操作程序的情况 : 样品数 tip 数样品数 tip 数垂询电话 :

11 (4) 安装专用试管专用试管 (Code No.:MFX-301) 安装于抽提架 A~E, 加温 block 及冷却 block 等对于抽提架 A~E 及加温 block, 请不要使用专用试管以外的其他试管否则容易发生故障对于抽提架 A~E, 也可以使用专用的 6 连试管 (Code No.:MFX-302) 对于冷却 block, 也可以使用带螺旋帽的 1.5ml 试管 ( 适合用于保存 RNA) 详细使用方法请阅读 MFX-2000 的使用说明书 (5) 试剂的使用试剂分别注入指定大小的试管中, 安装于试剂架的指定位置根据样品数的不同需要的试剂量也会有所不同请参照第 8 页的表来安装试剂注入试剂时, 如果剂量较少, 可以使用微量移液器, 如果剂量较多, 则以试管的刻度为标准请将磁珠事先搅拌充分后放入试剂架使用乙醇溶液沉淀操作程序时, 可以自由设定乙醇沉淀用试剂的组成 ( 例 1: 蒸馏水 :3M 醋酸钠 (ph5.2): 乙醇 =7:1:25, 例 2: 蒸馏水 :5M 醋酸铵 : 异丙醇 =0.9:1:2) 抽提后剩下的试剂可以再次使用, 不过需要注意的是, 如果长时间放置, 可能会由于干燥等原因使得液体的组成发生变化使用的试剂剂量请不要多于规定量, 否则会引起喷嘴污染以及液体溅出安装位置试剂名称试管 1 洗净液 Ⅱ 50ml 试管 2* 1 乙醇溶液 1* 7 磁珠 2ml 小型试管 9 洗净液 Ⅰ 15ml 试管 10 溶出液只在使用乙醇沉淀操作程序的情况下, 使用自已制备的乙醇 ( 异丙醇 ) 沉淀用试剂 9

12 样品数东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司各试剂的使用量试剂名称洗净液 Ⅱ 乙醇沉淀磁珠洗净液 Ⅰ 溶出液用试剂试管大小 50ml 50ml 2ml 15ml 15ml 安装位置各试管中注入的试剂量 (ml) 垂询电话 :

13 (6) 样品的前处理以及安装根据 3~4 页的样品前处理方法来处理样品请将待处理样品置于抽提架的样品置放孔在抽提架的各个孔边有 1~24 的编号, 指明了样品的安置位置对于样品的制备推荐使用带螺旋帽的 1.5ml 样品试管请在打开试管盖的状态下放入指定位置使用普通的 1.5ml 试管时, 请按图示剪断后安放剪断时请注意安全请沿此处剪断前处理溶液量请使用 620~750μl 培养细胞, 酵母等的前处理溶液请使用 700~750μl, 组织破碎液由于沉淀物会导致的损耗, 故请在使用时以 620μl 以上为标准 ( 使用 600μl 以下的溶液量时, 在搅拌过程中会起泡, 使得获取量减少 ) (7) 抽提开始, 样品回收根据以下要领, 启动机器确认样品, 试管 ( 试剂量 ), 试管种类, 专用 tip 等是否按说明书进行安置确认各试剂架的使用位置 ( 将其锁定 ), 确认 stage 是否完全收回到内部, 并请关闭机器前门在液晶画面输入操作程序号和样品数出现请按下开始键的画面后, 在确认无误后按下 START 键在所有的抽提操作结束后会再次显示请按下开始键的画面此时打开机器的前门并取出样品 11

14 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 6. 手动法抽提 RNA 准备 700μl 根据第 3~4 页的样品前处理方法制备的样品前处理溶液前处理结束后的样品 (700μl) 50μl 磁珠溶液 ( 颠倒搅拌, 使其均匀混合后再添加 ) 搅拌 20sec* 1 ( 漩涡混合器搅拌强度 : 最大 ) 在室温下放置 40~60sec B/F 分离 * 2 * 3 600μl 洗净液 Ⅰ 搅拌 10sec( 漩涡混合器搅拌强度 : 最大 ) B/F 分离 800μl 洗净液 Ⅱ 搅拌 5sec( 漩涡混合器搅拌强度 : 最大 ) B/F 分离 800μl 洗净液 Ⅱ 搅拌 5sec( 漩涡混合器搅拌强度 : 最大 ) B/F 分离瞬时高速离心后, 再次去除上清部分 * 4 40μl 溶出液搅拌 5sec( 将粒子混合 ) 在 65 下放置 2min 搅拌 5sec 瞬时高速离心上清将回收液的一部分稀释 10~20 倍后测定 A 260, 算出 RNA 浓度 * 5 *1 请用漩涡混合器的最大搅拌强度进行搅拌 *2 将试管置于磁性台架上并靠近磁珠, 并且通过多次颠倒混合后使得盖上的磁珠完全贴近磁石然后, 轻轻震动磁性台架, 使得盖上的溶液掉落下来最后使用微量移液器去除上垂询电话 :

15 清部分 *3 在没有磁性台架的场合下, 可以使用简易台式离心机进行 5 秒钟 3,000r.p.m 左右的离心操作由于离心后粒子会变得较难分开, 在搅拌时请确认粒子是否已混匀 *4 请尽可能小心的去除 *5 根据算式 :RNA 浓度 (ng / μl)=a 稀释率得出 7.DNaseⅠ 处理在 RT-PCR 之时, 由于 mrna 的构造尚不知道, 当制备夹含内含子区域的引物对产生困难时, 或者是基因组上存在与 mrna 有相似构造的假基因时, 必须考虑混入的微量基因组 DNA 所带来的影响特别是当表达量较少的 mrna 通过 RT-PCR 进行扩增的场合时, 必须使用 RNase free 的 DNaseⅠ 来对混入的 DNA 做酶分解处理以下是其中一个实例 (1) 准备的物品 10 DNaseⅠ buffer* 1 RNase free DNaseⅠ(10 U/μl) DEPC 处理水 TE 饱和苯酚氯仿 : 异戊醇 (24:1) 5M 醋酸氨溶液 (ph 未作调整 ) 糖原溶液 (2mg/ml)( 分子生物学用 ) 异丙醇 70% 乙醇溶液 (2) 操作程序 1 DNaseⅠ 处理 RNA 溶液... X(μl) DEPC 处理水 X 10 DNaseⅠ buffer

16 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 RNase free DNaseⅠ(10 U/μl) Total... 10(μl) 置于冰上反应 10~30 分钟 * 2 2 苯酚及氯仿处理 / 异丙醇沉淀 10μl DNaseⅠ 处理液 100μl DEPC 处理水 100μl TE 饱和苯酚用漩涡混合器仔细搅拌混合置于冰上,5min 4,12,000r.p.m. 5min 离心将上清液注入其他微型试管内 *1 100mM Tris-HCI,20mM MgCl 2 (ph7.5) *2 DNaseⅠ 在冰上能够充分发挥作用如果在高温下反应, 则会使得 RNA 产生分解等量的氯仿 : 异戊醇 (24:1) 充分搅拌后,4,12,000r.p.m. 5min 离心 100μl 上清 5μl 糖原溶液 (2mg/ml) 100ml 5M 醋酸氨溶液 200μl 异丙醇用漩涡混合器搅拌在 -20 下, 放置 30~60min 4,12,000r.p.m. 10~15min 离心, 去除上清液 * 1 70% 乙醇溶液 1ml 缓慢旋转混合 4,12,000r.p.m. 2min 离心, 去除上清液瞬时高速离心, 彻底去除乙醇沉淀 DEPT 处理水, 或者是逆转录反应液垂询电话 :

17 逆转录反应液 * 2 *1 能够确认到有糖原的沉淀请注意不要吸入沉淀块 *2 同时制备没有进行逆转录反应的阴性对照, 以确认 PCR 的扩增是否来自 RNA [5] 疑难解答发生错误时请参照以下对策 (1)RNA 的获取量低 * 1 原因在溶解吸附液中溶解处理不充分在溶解吸附液中放置时间过短对策样品在溶解吸附液中溶解时, 通过 pipetting 搅拌, 直至液体完全丧失粘性样品在溶解吸附液中混合后, 请在室温下培育 15 分钟以上样品过剩时, 粒子会凝集, 获取量会减少请再次考虑减样品过剩少样品量的条件特别是在使用 MFX-2000 进行自动抽提的情况下更需注意离心过度在去除组织样品等中的不溶物时, 以 5,000r.p.m. 长时间离心的话,RNA 有可能会和杂物一起沉淀在使用 MFX-2000 进行自动抽提时, 如果试剂的使用量过使用试剂不足少, 抽提将可能无法正常进行在 RNA 的量非常少的情况下, 请确认抽提试管内是否还留有试剂 (2)A260/280 很低原因样品过剩 RNA 浓度 RNA 稀释液对策请减少样品量吸光度测试时的 RNA 浓度如果过低, 会使得 A 260 / 280 的值变低与用 buffer 稀释相比, 用蒸馏水稀释 RNA 后测定, 会使得 A 260 / 280 的值变低 15

18 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 *1 RNA 获取量会由于细胞组织的种类的不同而有很大的差别垂询电话 :

19 (3)RT-PCR 结果不良原因混入了基因组 DNA 对策根据样品的不同, 有些会混入基因组 DNA* 1, 可以根据第 11 页的 DNaseⅠ 处理的操作程序来处理另外, 进行 RT-PCR 时, 即使使用没有进行逆转录的样品, 也推荐进行对是否在 PCR 中同时扩增出了基因组 DNA 的确认 RNA 的分解参照 (4) *1 在使用大肠杆菌等的场合下, 有时通过电泳可确认到存在来自基因组 DNA 的污染 (4)RNA 被分解原因 RNA 的加温处理对策 RNA 如果在反应 buffer 中长时间加温会发生分解若要长时间加温, 则使用添加 RNase 抑制物的 buffer 另外, 加温尽可能不要高于 70 DNaseⅠ 处理条件根据 DNaseⅠ 处理条件,RNA 有时会发生分解推荐使用本操作程序 11 页的 DNaseⅠ 处理条件有的操作程序会使 DNaseⅠ 在加热后失去活性但在 DNaseⅠ buffer 中进行 80 以上的加热处理, 会促进 RNA 的分解样品过剩使用过剩的样品会使得抽提后的 RNA 溶液中残留 RNase 请再次考虑减少样品量的条件 (5) 磁珠凝集, 不易分开样品过剩原因对策样品过剩时, 粒子会凝集, 获取量会减少请再次考虑减少样品量的条件在溶解吸附液中溶解处理不充分在溶解吸附液中放置时间过短样品在溶解吸附液中溶解时, 通过 pipetting 来进行搅拌, 直至液体完全丧失粘性样品在溶解吸附液中混合后, 请在室温下培育 15 分钟以上 17

20 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 (6) 回收 RNA 溶液染有颜色原因残留有血红素, 叶绿素等对策使用含有大量血红素, 叶绿素等样品时, 回收液有可能会被染色请减少样品量另外, 在采取动物内脏时, 请尽量避免混入血液成分可以通过 (DNaseⅠ 处理 (0 )) 苯酚及氯仿处理异丙醇沉淀的步骤来去除沉淀混入磁珠磁珠若是混入回收液中, 会使得回收液呈现茶色磁珠不会对酶反应等产生阻碍作用, 可以通过轻度离心加以去除 [6] 参考文献 1) Vogelstein, B., and Gillespie. D. (1979) Preparative analytical purification of DNA from agarose. Proc. Natl Acad. Sci. 76: ) Boom, R., Sol C.J.A., Salimans, M.M.M., Jansen, C.L. Wertheim-van Dillen. P.M.E. and van der Noordaa. J. (1990) Rapid and simple method for purification of nucleic acids.j.clin. Microbiol. 28: 垂询电话 :

21 [ 制造销售商 ] 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司上海市浦东新区张杨路 188 号汤臣商务中心 C 座 310 室邮编 : 交货期限订货相关咨询 Tel: Fax: sales@bio-toyobo.cn 产品内容技术相关咨询 Tel: Fax: tech@bio-toyobo.cn 代理商资料 :

实时定量PCR的全套解决方案

实时定量PCR的全套解决方案 08-04 mrna Purification Kit MagExtractor - mrna - (Code No.: NPK-801) 使用说明书研究用 TOYOBO CO., LTD. Life Science Department OSAKA JAPAN 目录 [1] 前言...1 [2] 纯化流程概要...1 [3] 对应样品...1 [4] 试剂盒中所包含的物品 (5 次份 ) *...3