实时定量PCR的全套解决方案

Size: px

Start display at page:

Download "实时定量PCR的全套解决方案"

并久侍
5 years ago
Views:

1 08-04 mrna Purification Kit MagExtractor - mrna - (Code No.: NPK-801) 使用说明书研究用 TOYOBO CO., LTD. Life Science Department OSAKA JAPAN

3 目录 [1] 前言...1 [2] 纯化流程概要...1 [3] 对应样品...1 [4] 试剂盒中所包含的物品 (5 次份 ) *...3 [5] 试剂盒以外所需要的其他物品...4 [6] 处理 RNA 时的注意点...4 [7] 操作程序从培养细胞, 组织中直接抽提 MRNA 的方法...5 (1) 制备溶解液...5 (2) 样品的前处理...5 (3) mrna 的纯化 ( 第一次 )...6 (4)DNase I 处理...7 (5) mrna 的纯化 ( 第二次 ) 从 TOTAL RNA 中纯化 MRNA 的方法...9 (1) 制备溶解液...9 (2)Total RNA 的 DNase I 处理...9 (3)mRNA 的纯化 ( 第一次 )...10 (4) mrna 的纯化 ( 第二次 )...11 [8] 抽提实例...12 [9] 疑难解答...13 [10] 相关商品...15 注意本试剂盒中所包含的都是研究用试剂请不要用于诊断, 临床等用途在使用本试剂盒的时候, 请严格遵守实验室的基本注意事项, 并注意安全

5 [1] 前言本试剂盒是用 oligo(dt) 固定化了的磁珠粒来纯化 mrna (poly(a) + RNA) 的试剂因为使用的是磁珠, 可以通过使用磁台架, 最低限度地减少复杂的离心操作, 迅速的纯化 mrna 使用本试剂盒从 Total RNA 培养细胞组织等中得到的 mrna 主要能作为 RT-PCR * cdna 克隆,cDNA Array( 参照本公司 Gene Navigator TM cdna Array Filter Gene Navigator TM cdna Array System; 参照 p. 14 的 [10] 相关商品 ) 的模板来使用要注意的是, 本试剂盒不适用于本公司的自动核酸抽提装置 (MFX ) < 性能特征 > 可以从培养细胞, 组织等各种样品中直接纯化出 mrna 能够从 Total RNA 中纯化出 mrna 不含苯酚氯仿等危险可溶物质采用了 DNase I 处理以及两次纯化步骤的操作程序, 因此可以纯化出高纯度的 mrna * Hoffmann La Roche 公司拥有 PCR 的专利 [2] 纯化流程概要利用 mrna 进行的 RT-PCR cdna 克隆 cdna Array 等实验是否成功很大程度上取决于 mrna 的品质和纯度为此, 本试剂盒采用了 DNase I 处理以去除基因组 DNA, 以及通过重复两次纯化工艺来达到最小限度抑制 rrna 混入的标准操作程序操作程序第一次纯化第二次纯化用途 RT-PCR RT-PCR cdna Library 的制备 cdna Array 在第一次纯化中可能会混入基因组 DNA, 请务必进行 DNase 处理在第二次纯化中因为已去除了第一次纯化后残留的 rrna 以及基因组 DNA, 回收量将是第一次纯化后的 1/3~1/5 左右 1

6 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 R 利用 MagExtractor -mrna- 进行 mra 纯化的流程图培养细胞组织溶解液匀浆吸着液磁珠 Total RNA DNase I 溶解液 * 吸着液 Lysate 第一次纯化杂交 rrna trna genomic DNA mrna AAAAA 洗浄溶出 TTTTT oligo(dt) 固定化磁珠 AAAAA TTTTT mrna AAAAA DNase I * 磁珠溶解液吸着液杂交第二次纯化 mrna 洗浄溶出 AAAAA TTTTT AAAAA TTTTT mrna AAAAA * 已经 DNase I 处理过的样品不需要进行上述步骤垂询电话 :

7 [3] 对应样品 MagExtractor -mrna- 对应于以下的样品对应样品培养细胞动物组织植物组织 Total RNA 样品量 ~ cells ~50 mg ~100 mg ~100 μg [4] 试剂盒中所包含的物品 (5 次份 ) * 本试剂盒含有以下 mrna 抽提用试剂请在下述温度下保存试剂名容量保存温度溶解液 4 ml 4 吸着液 8 ml 4 或者室温洗浄液 30 ml 4 或者室温溶出液 5 ml 4 或者室温磁珠 2.5 ml 4 2- 巯基乙醇 (2-ME) 0.1 ml 4 DNase I (1 unit/μl) 10 μl -20 RNase Inhibitor (10 units/μl) 10 μl DNase I 缓冲剂 100 μl -20 试剂如果沾在衣服或者手上, 请在使用结束后用清水充分清洗如若碰到眼睛, 请立刻用清水清洗, 然后去咨询医生溶解液中含有蛋白质变性剂, 因此在操作的时候务必谨慎 2- 巯基乙醇在消防法中被定为危险物第四类第二石油类危险等级 Ⅲ 因为属于易燃物质, 请避免在火源的附近使用酶以及酶的反应缓冲剂以外的试剂请务必等回复到室温以后再用在使用溶解液和 2- 巯基乙醇 (2-ME) 时, 请只在使用前一刹那加入必要量 400:2.8(v/v) 请不要保存混合液 * 若仅进行一次纯化时则为 10 次 3

8 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 [5] 试剂盒以外所需要的其他物品针筒(1 ml) 注射针(20~25 G) 磁性台架( 本公司 Magical Trapper : Code No.: MGS-101)( 也可使用离心机 ) 漩涡混合器 heat-block( 或者水浴槽 ) (65 ) 简易台式离心机( 能够进行 3,000~5,000 rpm 左右的简易离心 ) 离心机对组织样品进行破碎的仪器或器械( 本公司 Cool Mill:Code No.: CLM-101, 等 ) 液氮( 破碎组织样品时使用 ) [6] 处理 RNA 时的注意点 1. 实验操作在进行 RNA 实验时, 必须注意要抑制 RNase 的作用因此, 除了要防止通过使用器具以及试剂中混入 RNase, 即注意实验环境之外, 还要防止通过唾液, 汗等混入 RNase, 故建议戴上口罩和手套 2. 器材在实验器材允许的情况下, 请对一次性塑料制品进行高温高压湿热灭菌处理在使用玻璃器皿的情况下, 请使用干热灭菌, 或者在 0.1% Diethylpyrocarbonate (DEPC) 溶液中,37 下浸泡 12 小时, 然后再进行高温高压湿热灭菌 (121,30 分钟 ) 垂询电话 :

9 [7] 操作程序 1. 从培养细胞, 组织中直接抽提 mrna 的方法 (1) 制备溶解液 2 次纯化的操作程序中对于每个样品, 在 800μl 溶解液中需加入 5.6μl 2-ME 在 1 次纯化的操作程序中, 在 400 μl 溶解液中只需加入 2.8 μl 2-ME 制备此混合液时, 请尽量不要保存混合液 (2) 样品的前处理 1 培养细胞通过对培养细胞 ( cell 以下 ) 进行离心分离, 将产物回收到 1.5 ml 微型试管内, 然后加入 400 μl 溶解液 ( 含有 2-ME), 再通过 pipetting 进行溶解接着, 用装有注射针 (20~25 G) 的针筒 (1 ml) 中来回抽吸 10 次左右, 以减低溶液的粘性 ( 如果此项操作不够充分, 就有可能使磁珠发生凝集, 使得 RNA 的抽提无法顺利进行 ) 在转移至下一工程之前加入 800 μl 吸附液, 并用漩涡混合器搅拌 2 组织取出组织后请立即在液氮中冻结保存在使用时先用铁锤等将冻结的组织敲碎成粉末状 ( 使用本公司的 Cool Mill 能够简便有效地加以实现 ), 称取破碎后样品的必要量 ( 参照 p. 3 [3] 对应样品 ) 置于 1.5ml 微型试管内 *1*2, 再加入 400 μl 溶解液 ( 含有 2-ME) 使用 1.5ml 微型试管对应的均浆器, 或者参考操作手册, 对组织进行均浆化操作, 直至均匀在装有注射针 (20~25 G) 的针筒 (1 ml) 中来回抽吸 10 次左右, 以减低溶液的粘性 ( 如果此项操作不够充分, 就有可能使得磁珠发生凝集, 使得 RNA 的抽提无法顺利进行 ) *3 在转移至下一工程之前加入 800 μl 吸附液, 并用漩涡混合器搅拌离心 (10,000 rpm 3 min) 回收上清液用于下一个工程 *1 样品量过剩是造成回收量以及纯度低下的原因 *2 为了不使样品融解, 请尽快将其在液氮中进行冷却 *3 根据样品破碎程度, 有时此项操作会无法顺利进行这种情况下请通过充分的 pipetting 操作来减低粘性 5

10 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 (3) mrna 的纯化 ( 第一次 ) 根据以下操作程序进行操作对于酶以外的试剂请务必等其回复室温后再使用磁珠 (250 μl) B/F( 固液 ) 分离 *1*2 添加预处理过的样品在室温下放置 10 min *3 瞬时高速离心后再次去除上清液 *4 添加 90 μl 溶出液在 65 下放置 2 min 瞬时高速离心 *1 通过瞬时高速离心, 将附在盖子上的溶液摔落下来接着, 将试管置于磁性台架上, 使磁珠完全靠近磁石使用微量移液器仔细去除上清液如果不慎吸到了磁珠, 将吸入的液体放回试管内, 静置后, 再次去除上清液在上清液尚有 20μl 左右的状态下再次静置, 等磁珠完全集中到磁石处后, 就能容易的去除剩下的上清液 *2 如果没有磁性台架, 则进行 15,000 rpm 30 sec 的离心分离在这种情况下, 粒子会变得不易分散, 请通过微量移液在需要时再进行充分悬浊 *3 请尽可能仔细去除上清液 *4 进行 1 次纯化时请加入 20~ 30μl 溶出液进行溶出取回收液的部分稀释 10~20 倍, 测定 A 260, 算出 RNA 浓度 RNA 浓度 (ng/μl)=a 260 稀释率 40 上清液 (1 次纯化 mrna) 垂询电话 :

11 (4)DNase I 处理 1 制备反应液 1 次纯化 mrna 90μl 10 DNase I 缓冲剂 10μl RNase Inhibitor (10 units/μl) 1μl DNase I (1 unit/μl) 1μl 102μl 2 置于冰上 15 分钟 *5 3 加入 400 μl 溶解液 ( 含 2-ME), 用漩涡混合器轻轻搅拌, 以停止反应 *5 DNase I 在冰上能够充分发挥功能如果在冰点以上的温度下反应会造成 RNA 的分解纯化前加入 800 μl 吸附液, 充分混合 7

12 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 (5) mrna 的纯化 ( 第二次 ) 根据以下操作程序进行操作 ( 磁珠 (250 μl) 添加 DNase I 处理过的 1 次纯化 mrna ((4)-4) 在室温下放置 10 min 瞬时高速离心后再次去除上清液添加 20~30 μl 溶出液在 65 下放置 2 min 瞬时高速离心 *6*7 上清液 *6 回收液中即使混入磁珠也不会对反应有所影响但是, 在进行浓度测定时, 请先进行 15,000 rpm 1 min 的离心分离 *7 取回收液的一部分稀释 10 倍, 测定 A 260, 算出 RNA 浓度 RNA 浓度 (ng/μl)=a 260 稀释率 40 垂询电话 :

13 2. 从 Total RNA 中纯化 mrna 的方法 Total RNA 使用的是通过 AGPC 法 (Acid Guanidinum-Phenol-Chroloform 法 ) 或者本公司的 MagExtractor -RNA- 等制备出的物品要制备 Total RNA 请参照其他操作程序 (1) 制备溶解液在进行 2 次纯化时, 对于每个样品, 在 800 μl 溶解液中加入 5.6 μl 2-ME 进行 1 次纯化时, 在 400 μl 溶解液中加入 2.8 μl 2-ME 制备此混合液时, 请尽量避免保存混合液 (2)Total RNA 的 DNase I 处理 1 根据以下所示内容来制备反应溶液 Total RNA *1*2*3 xμl (~100 μg) 溶出液 (88-x)μl 10 DNase I Buffer 10μl RNase Inhibitor (10 units/μl) 1μl DNase I (1 unit/μl) 1μl 100μl 2 在冰上放置 15 分钟 *4 3 加入 400μl 溶解液 ( 含有 2-ME), 使用漩涡混合器轻轻搅拌, 以停止反应 4 添加 800μl 吸附液, 使用漩涡混合器轻轻搅 *1 Total RNA 的浓度在 1 μg/μl 以下时, 请通过乙醇沉淀进行浓缩 *2 Total RNA 在 100 μg 以下时也按此反应比例进行反应 ( 无需降低规模 ) *3 对于 DNase I 处理结束后的 Total RNA, 也请按 (2) 3 以下的操作进行 *4 DNase I 在冰上才能够充分发挥功能 9

14 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 (3)mRNA 的纯化 ( 第一次 ) 根据以下操作程序进行操作对于试剂请务必等其回复室温后再使用磁珠 (250 μl) *5*6 添加 DNase 处理过的 Total RNA((2)-4) 在室温下放置 10 min *5 将试管置于磁性台架上, 使磁珠完全靠近磁石使用微量移液器仔细去除上清液如果不慎吸到了磁珠, 将吸入的液体放回试管内, 静置后, 再次去除上清液在上清液尚留下 20μl 左右的状态下再次静置, 等磁珠完全集中到磁石处后, 就能容易去除剩下的上清液 *6 如果没有磁性台架, 则进行 15,000 rpm 30 sec 的离心分离这种情况下, 粒子会变得不易分散, 请在需要时再通过 pipetting 进行充分混合 *7 瞬时高速离心后再次去除上清液 *8 添加 100 μl 溶出液 *7 请尽可能仔细去除上清液在 65 下放置 2 min 瞬时高速离心 *8 进行 1 次纯化时请加入 20~30μl 进行溶出上清液 ( 一次纯化到此结束 ) *9 添加 400 μl 溶解液 ( 含有 2-ME) 添加 800 μl 吸附液开始第二次纯化 (1 次纯化后的 mrna) *9 1 次纯化时, 取回收液的一部分稀释 10 倍, 测定 A 260, 算出 RNA 浓度如果混入磁珠则不能正确地测出浓度, 请进行 15,000 rpm 1 min 离心分离 RNA 浓度 (ng/μl)=a 260 稀释率 40 垂询电话 :

15 (4) mrna 的纯化 ( 第二次 ) 根据以下的操作程序进行操作磁珠 (250 μl) 添加 1 次纯化过的 mrna 在室温下放置 10 min 瞬时高速离心后再次去除上清液添加 20~30 μl 溶出液在 65 下放置 2 min 瞬时高速离心 *10*11 上清液 *10 回收液中即使混入磁珠也不会对反应有所影响但是, 在进行浓度测定时, 请先进行 15,000 rpm 1 min 的离心分离 *11 取回收液的一部分稀释 10~ 20 倍, 测定 A 260, 算出 RNA 浓度 RNA 浓度 (ng/μl)=a 260 稀释率

16 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 [8] 抽提实例以下列出使用本试剂盒的抽提实例样品样品量回收量 Total RNA 100 μg 1~3 μg 培养细胞 cell 1~3 μg 鼠肝脏 30 mg 1~2 μg 鼠肺 30 mg 0.5~1 μg 鼠心脏 40 mg 0.5~1 μg 植物叶 100 mg 0.5~1 μg 回收量根据样品的种类以及状态的不同会有所变动请以记载的数值为标准进行考虑垂询电话 :

17 [9] 疑难解答发生问题时, 请参照以下的对策 1. RNA 的回收量低原因样品保存状态欠佳对策在采取完样品材料后请立即冻结保存样品在溶解液内溶解时, 请充分匀浆, 并使其通过装有注射针的溶解处理不充分针筒以降低粘性另外, 对于组织, 请事先进行充分的冻结破碎工作样品过于坚硬样品量过剩样品中所含 RNA 量过少请充分进行冻结破碎, 或进行匀浆样品量过剩时, 会使粒子凝集, 粘性变高, 回收量下降请降低样品量请通过 AGPC 法等其他方法对大量的样品进行处理, 以制备 Total RNA, 并使用本试剂盒制备 mrna 2. RNA 被分解原因样品保存状态欠佳冻结样品在使用前已经融解混入 Rnase 对策在采取完样品材料后请立即冻结保存样品尽可能保存在液氮中, 使用时请迅速放入溶解液中溶解请戴上手套和口罩另外, 请避免和使用 RNase 的其他实验使用同一个器具及场所等如果 RNA 在反应缓冲剂中长时间加温则会分解若需要长时对 RNA 加温处理间加温, 请使用添加了 RNase Inhibitor 的反应缓冲剂另外, 加温时请尽量控制温度在 72 以下有些 DNase I 处理条件可能会使得 RNA 分解, 推荐使用本操 DNase l 处理条件作程序的 DNase I 处理条件也有加热 DNase I 使之失活的操作程序, 但会产生将含 DNase I 溶液加热到 80 以上会促进 RNA 分解的情形 13

18 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 3. RNA 的纯度低原因对策样品量过剩试剂还没有完全回复到室温状态请考虑减少样品量对于酶以外的试剂请先待其回复到室温后再加以使用洗净时的磁珠混合不充分仅通过倒转混合有时并不能充分混匀在没有使用漩涡混合器的情况下, 请通过 pipetting 进行混合 4. RT-PCR 结果不良原因混入基因组 DNA 对策已证实在没有进行 DNase I 处理的情况下特别容易混入基因组 DNA 请先进行 DNase I 处理另外, 在进行 RT-PCR 时, 推荐对未进行逆转录反应的样品也进行 PCR 操作, 以便确认来自基因组 DNA 的增幅产物是否存在 RNA 的分解参照相关操作程序 [9] 2. 洗净不充分溶解液中含有蛋白变性剂请对溶解液充分洗净, 并仔细去除上清 5. 磁珠凝结, 无法分开液如果觉得溶出后的样品内混入了蛋白变性剂 ( 若 A 260 /A 280 的数值变高 ), 请在酶反应前进行乙醇沉淀原因对策样品溶解时, 请透过装有注射针的针筒根据样品的破碎状态, 此溶解处理不充分项操作可能会比较困难这种情况下请通过 pipetting 来降低液体的粘性样品量过剩如果处理时样品量过剩, 就可能引起粒子凝集, 回收量低下请考虑减少样品量垂询电话 :

19 [10] 相关商品品名内容 Code No. Magical Trapper ( 磁珠分离用台架 ) 1 台 MGS-101 Coll Mill 1 台 CLM-101 自动样品破碎装置 HMX-2000 <<Twist Crusher>> 1 台 HMX-101 Handy Pestle 100 根 HMX-301 MagExtractor -RNA- (Total RNA 抽提用试剂盒 ) 100 次份 NPK-201 RT-PCR high 100 次份 PCR-201 RT-PCR high -Plus- << 逆转录一次成功 >> 100 次份 PCR-301 RT-PCR Kit -ReverTra Dash 次份 PCR-401 First strand cdna Synthesis Kit ReverTra Ace -α- 100 次份 FSK-101 ReverTra Ace 10,000 U TRT-101 RNase Inhibitor 2500 U SIN-101 dntps Mixture (10 mm) 200 μl NTP-301 KOD Dash 250 U LDP-101 KOD DNA Polymerase 250 U KOD-101 KOD -Plus- 200 U KOD-201 rtaq (recombinant Taq) DNA Polymerase < 不含 Mg 型 > 250 U TAP-201 rtaq (recombinant Taq) DNA Polymerase < 含 Mg 型 > 250 U TAP-211 Gene Navigator TM cdna Array Filter -human cancer selected- 5 片 EPK-201 Gene Navigator TM cdna Array System -human cancer selected- 5 次份 EPK-211 Gene Navigator TM cdna Array Filter -human cancer- 5 片 EPK-202 Gene Navigator TM cdna Array System -human cancer- 5 次份 EPK-212 Gene Navigator TM cdna Array Filter -human immunology- 5 片 EPK-203 Gene Navigator TM cdna Array System -human immunology- 5 次份 EPK-213 Gene Navigator TM cdna Array Filter -mouse cancer- 5 片 EPK-302 Gene Navigator TM cdna Array System mouse cancer- 5 次份 EPK-312 Gene Navigator TM cdna Amplification System -Biotin- 5 次份 EPK-101 Gene Navigator TM cdna Amplification System -RI- 5 次份 EPK

21 [ 制造销售商 ] 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司上海市浦东新区张杨路 188 号汤臣商务中心 C 座 310 室邮编 : 交货期限订货相关咨询 Tel: Fax: sales@bio-toyobo.cn 产品内容技术相关咨询 Tel: Fax: tech@bio-toyobo.cn 代理商资料 :

实时定量PCR的全套解决方案

实时定量PCR的全套解决方案 18-07 高效率逆转录试剂盒 First Strand cdna Synthesis Kit ReverTra Ace -α- (Code No. FSK-101) 使用说明书科研用 TOYOBO CO., LTD. Life Science Department OSAKA JAPAN 目录 1 简介... 1 2 RT-PCR 法的原理... 2 3 试剂盒的组成... 3 4 操作步骤...