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兼柯
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1 第 39 卷第 2 期 2018 年 4 月同济大学学报 ( 医学版 ) JOURNAL OF TONGJI UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE) Vol 39 No 2 Apr doi: / j 临床研究 mirna 146b 3p 在早期非小细胞肺癌中的诊断价值沙杰 1,2 2, 范理宏 (1. 南京医科大学, 南京 ; 2. 同济大学附属第十人民医院呼吸科, 上海 ) 摘要目的探讨 mir 146b 3p 在早期非小细胞肺癌良性肺结节与健康人群外周循环血中的表达差异及诊断价值方法通过 RT PCR 测定 118 例早期非小细胞肺癌 42 例良性肺结节与 48 例健康人群外周循环血中的 6 种 mirnas(mir 15b 5p mir 17 5p mir 19a 3p mir 20a 5p mir 92a 3p mir 146b 3p) 的相对表达量, 并进行统计学分析评价其在早期的诊断价值结果相较于良性肺结节患者与健康人群,miR 146b 3p 在非小细胞肺癌患者外周循环血中呈显著过表达用 ROC 曲线来评价 mir 146b 3p 的诊断价值, 在肺癌与良性结节组中 : mir 146b 3p 的曲线下面积为 0 77, 当取临界值 0 01 时, 灵敏度为 75%, 特异性为 71%; 在肺癌与健康人组中 : mir 146b 3p 的曲线下面积为 0 93, 当取临界值 0 72 时, 灵敏度为 89%, 特异性为 84% Logistic 回归模型表明 : 在肺癌与良性结节组中, 年龄与 mir 146b 3p 为独立危险因素, 其 ROC 曲线下面积为 0 81, 当取临界值 0 85 时, 灵敏度为 65%, 特异性为 89%; 在肺癌与良性结节组中,miR 19a 3p 与 mir 146b 3p 为独立危险因素, 其 ROC 曲线下面积为 0 98, 当取临界值 0 90 时, 灵敏度为 94%, 特异性为 95% 结论 mir 146b 3p 对早期非小细胞肺癌良性肺结节与健康人群有一定鉴别意义, 可作为临床一种新的血液标志物关键词非小细胞肺肿瘤 ; mirnas; mir 146b 3p 中图分类号 R734 2 文献标志码 A 文章编号 (2018) Diagnostic value of mirna 146b 3p in early non small cell lung cancer SHA Jie 1,2, FAN Li hong 2 (1. Nanjing Medical University, Nanjing , Jiangsu Province, China; 2. Dept. of Respiratory Medicine, Tenth People s Hospital, Tongji University, Shanghai , China) Abstract Objective To assess the diagnostic value of mir 146b 3p in peripheral blood for early non small cell lung cancer ( NSCLC). Methods Peripheral blood samples were collected from 118 patients with early NSCLC, 42 patients with benign pulmonary nodules and 48 healthy subjects. Circulating mir 15b 5p, mir 17 5p, mir 19a 3p, mir 20a 5p, mir 92a 3p and mir 146b 3p were detected by real time fluorescent quantitative PCR ( RT qpcr) and compared among different groups. Results The expression of mir 146b 3p was significantly higher in NSCLC patients than that in patients with benign lung nodules and healthy controls. The area under the ROC curve (AUC) of mir 146b 3p in differential diagnosis between NSCLC and benign lung nodules was 0 77; with the cut off value of 0 01, the sensitivity and specificity was 75% and 71%, respectively. The AUC of mir 146b 3p in differentiating early NSCLC patients from healthy subjects was 0 93; with the cut off value of 0 72, the sensitivity and the specificity was 89% and 84%, respectively. Logistic regression model 收稿日期 : 基金项目 : 上海市科委纳米专项基金 (12NM ); 同济大学中央高校基本科研业务费重点学科交叉类项目 ( ) 作者简介 : 沙杰 (1991 ), 男, 硕士研究生.E mail: @ qq.com 通信作者 : 范理宏.E mail: fanlih@ aliyun.com 73

2 同济大学学报 ( 医学版 ) 第 39 卷 indicated that age and mir 146b 3p were independent risk factors for early NSCLC compared to benign lung nodules, and the AUC was 0 81, with the cut off value of 0 85, the sensitivity and the specificity was 65% and 89%. MiR 19a 3p and mir 146b 3p were independent risk factors for early NSCLC compared to healthy controls, and the AUC was 0 98, with the cut off value of 0 90, the sensitivity and specificity was 94% and 95%, respectively. Conclusion MiR 146b 3p can differentiate early NSCLC from benign lung nodules and healthy control, indicating that it might be used as a new biomarker for early diagnosis of non small cell lung cancer. Key words non small cell lung cancer; mirnas; mir 146b 3p 肺癌是全球范围内致死率最高的恶性肿瘤, 每年造成 120 万人的死亡, 其中非小细胞肺癌占到了 80% ~ 85% 而在我国, 肺癌已成为男性恶性肿瘤发病率首位, 女性的第二位其总体 5 年存活率低至 15% 若能在早期被及时诊断与干预的话, 其 5 年存活率能显著提高至 61% ~ 90% [1 2] 但不幸的是, 多数患者由于缺乏有效的早期诊断, 约 75% 的患者在肿瘤晚期出现症状时才得到相应治疗, 早已错过了最佳治疗时期所以如何在肺癌早期对患者作出及时的诊断成为重中之重临床工作中的重点难点是对于肺部结节良恶性鉴别, 单一通过影像学表现易出现假阴性结果, 延误患者最佳治疗时机现阶段病理活检是肺癌诊断的金标准, 例如影像引导下的肺穿刺和支气管镜活检, 但这类有创检查对患者存在潜在的风险现有的肿瘤标志物灵敏度及特异性都无法达到临床要求所以一种更理想的检查方法有待被发现, 它应具有无创高灵敏度高特异性简单方便等特性 Micro RNAs(miRNAs) 是一类长度为 20 ~ 24 个核苷酸的非编码小分子 RNA, 与肿瘤的发生转移和耐药等密切相关多项研究已证实 mirnas 具有肿瘤抑制或促进的作用 [3 5] 研究发现血清 / 血浆中存有 mirnas, 称为循环 mirnas 循环 mirnas 能以 Ago2 mirna 蛋白复合物的形式稳定存在于血浆中而逃避 RNase 降解故通过对比肿瘤患者与健康人循环血中的 mirnas 表达谱, 对不同肿瘤中 mirnas 的特异性表达谱进行鉴定, 将有助于肿瘤的早期诊断 [6] [7] 本课题组前期研究通过对非小细胞肺癌病例与健康人病例的血清 mirnas 表达谱分析, 筛选出了具有诊断价值的 mirnas 本次研究基于以上结果, 进一步检测 118 例早期非小细胞肺癌 42 例肺部良性结节 48 例健康人的 6 种 (mir 74 15b 5p mir 17 5p mir 19a 3p mir 20a 5p mir 92a 3p mir 146b 3p) 循环血 mirnas 表达水平, 并分析其相关诊断价值 1 资料与方法 1 1 资料收集本研究获得同济大学附属第十人民医院伦理委员会批准所有入组病例血样与临床资料均收集于同济大学附属第十人民医院 2015 年 10 月至 2016 年 4 月间肺结节病例采集于胸外科及呼吸科所有拟行手术或活检且影像学最大直径 30 mm 的肺结节患者, 共计 250 例, 于术前 1 ~ 2 周采集血样, 待确定其病理诊断后筛选入组最终非小细胞肺癌入组 118 例, 良性结节入组 42 例非小细胞肺癌组中腺癌 110 例, 鳞癌 8 例, 见图 1 入组标准包括 : (1) 病理诊断 ;(2) 结节直径 30 mm;(3) 入组分期为 T1N0M0( 第 8 版肺癌分期 );( 4) 无其他肿瘤史 ; (5) 未进行放化疗 ;(6) 肺内无活动性炎症良性结节组包括 25 例肉芽肿性结节 11 例错构瘤等健康人血样收集于体检人群, 共 48 例经确诊均无肺内活动性炎症或任何相关肿瘤疾病样本在性别年龄吸烟史方面差异无统计学意义, 见表 1 样本于晨间空腹采集 5 ml 全血,4, 离心半径 5 8 cm, r / min, 离心 15 min, 提取血清 -80 冰箱保存 1 2 方法本次研究使用 mirneasy Serum / Plasma kit (QIAGEN, 德国 )RNA 提取试剂盒, 按照使用手册从 200 μl 血清中提取 14 μl 总 RNA, 并使用 NanoDrop 2000 微量分光光度计测定其浓度与纯度 mirnas 反转录试剂盒 ( 灏勤生物 ) 反转录得到 20 μl cdna, 其反应体系包括 dntp 4 μl, 反转录缓冲液 4 μl, 特定缓冲液 4 μl, 茎环引物 1 μl, 总 RNA 5 μl, 加 RNase

3 第 2 期沙杰等 : mirna 146b 3p 在早期非小细胞肺癌中的诊断价值 Free 水补足至 20 μl 使用 Eppendorf MCpro 设定反转录程序为 42 孵育 40 min,70 孵育 15 min 下步使用 mirnas 荧光定量检测试剂盒 ( 灏勤生物 ) 进行 RT PCR 其反应体系包括缓冲液 10 μl, 探针和引物预混液 1 μl,cdna 1 μl, 加 RNase Free 水补足至 20 μl 使用 ABI 7900 实时荧光定量 PCR 按照 s 95 5 s s 45 个循环进行扩增 1 3 统计学处理采用相对定量法对各 mirna 血清中含量进行分析以 U6 为内参,2 -ΔCt 作为其相对含量, 其中 ΔCt = CtmiRNA - CtU6 所有统计学工作均采用 SPSS 17 0 软件进行分析采用独立样本 t 检验判断目标 mirnas 是否存在表达差异通过 ROC 曲线分析目标 mirnas 的诊断价值, 以及特异性与灵敏度并使用 Logistic 回归分析找出其独立危险因素以及回归公式所有数据均以 x±s 表示,P<0 05 为差异有统计学意义图 1 研究对象入组流程图 Fig 1 Flow chart of research objects 表 1 入组病例资料 Tab 1 Data of enrolled cases 项目非小细胞肺癌良性结节 P 值健康人 P 值 n 性别男女年龄 / 岁 57 08± ± ± < 吸烟史是否组织分型腺癌 110 鳞癌 8 肉芽肿 25 错构瘤 11 其他 6 2 结果 2 1 mirnas 表达结果显示 5 种 mirnas ( mir 15b 5p mir 17 5p mir 19a 3p mir 92a 3p mir 146b 3p) 在非小细胞肺癌与良性结节中有表达差异, 同时 5 种 mirnas( mir 15b 5p mir 17 5p mir 19a 3p mir 20a 5p mir 146b 3p) 在非小细胞肺癌与健康人中表达差异有统计学意义, 见表 Logistic 回归将上述具有差异表达的 mirnas 进行单因素 Logistic 回归分析, 结果表明在非小细胞肺癌与良性结节组中 : mir 17 5p mir 19a 3p mir 146b 3p 具有显著的预测性 ; 同时在非小细胞肺癌与健康人组中 : mir 15b 5p mir 17 5p mir 19a 3p mir 20a 5p mir 146b 3p 具有显著预测性, 见表 3 进一步将肺癌与良性结节组通过多因素 Logistic 回归分析计算, 得出年龄与 mir 146b 3p 为相关独立危险因素,Logistic 回归公式为 Logit(P)= 1 16 年龄 mir 146b 3p; 同理得出肺癌与健康人组中 mir 19a 3p 与 mir 146b 3p 为相关独立危险因素, Logistic 回归公式为 Logit ( P) = 3 39 mir 19a 3p+5 57 mir 146b 3p, 见表 4 75

4 同济大学学报 ( 医学版 ) 第 39 卷表 2 6 种 mirnas 相对表达量 Tab 2 The relative expression of 6 mirnas mirnas 非小细胞肺癌组良性结节组 P 值健康对照组 P 值 mir 15b 5p 1 69± ± ± mir 17 5p 1 35± ±0 27 < ±0 12 <0 001 mir 19a 3p 0 31± ± ± mir 20a 5p 0 34± ± ±0 19 <0 001 mir 92a 3p 2 92± ±0 28 < ± mir 146b 3p 0 52± ±0 09 < ±0 02 <0 001 表 3 单因素 Logistic 回归 Tab 3 Univariate Logistic regression mirnas 肺癌与良性结节组肺癌与健康人组 OR 95%CI P 值 OR 95%CI P 值 mir 15b 5p ~ ~ <0 001 mir 17 5p ~ < ~ <0 001 mir 19a 3p ~ ~ <0 001 mir 20a 5p ~ <0 001 mir 92a 3p ~ mir 146b 3p ~ < ~ <0 001 表 4 多因素 Logistic 回归 Tab 4 Multivariate Logistic regression 项目肺癌与良性结节组肺癌与健康人组 B SE P 值 OR 95%CI B SE P 值 OR 95%CI mir 15b 5p ~ 4 01 mir 17 5p ~ ~ 7 75 mir 19a 3p ~ ~ mir 20a 5p ~ mir 146b 3p ~ < ~ 性别 ~ ~ 6 21 年龄 ~ ~ 1 05 Constant ROC 曲线肺癌与良性结节组中 : mir 146b 3p 的曲线下面积 (AUC) 为 0 77, 当取临界值 0 01 时, 灵敏度为 75%, 特异性为 71% MiR Panel 的曲线下面积为 0 81, 当取临界值 0 85 时, 灵敏度为 65%, 特异性为 89%, 见图 3 同时收集并分析肺癌与良性肺结节病例临床常用的肿瘤标志物 ( AFP CEA NSE SCC CA153 CA211 CA50 CA199) 曲线下面积, 其大小自 0 41 至 0 59 不等, 明显低于前二者, 并不具备明显的早期临床诊断价值 ; 肺癌与健康人组中 : mir 146b 3p 的曲线下面积 ( AUC) 为 0 93, 当取临界值 0 72 时, 灵敏度为 89%, 特异性为 84% mir 19a 3p 的曲线下面积 (AUC) 为 0 93, 当取临界值 0 76 时, 灵敏度为 84%, 特异性为 92% MiR Panel 的曲线下面积更是达到 0 98, 当取临界值 0 90 时, 灵敏度为 94%, 特异性为 95% 见图 2 76

5 第 2 期沙杰等 : mirna 146b 3p 在早期非小细胞肺癌中的诊断价值图 2 Tab 2 MiRNAs ROC 曲线 ROC curve of mirnas A: 肺癌与良性结节组 mir 146b 3p ROC 曲线 ;B: 肺癌与良性结节组 mir Panel ROC 曲线 ;C: 肺癌与良性结节组肿瘤标志物 ROC 曲线 ; D: 肺癌与健康人组 mir 146b 3p ROC 曲线 ;E: 肺癌与健康人组 mir 19a 3p ROC 曲线 ;F: 肺癌与健康人组 mir Panel ROC 曲线 3 讨论随着低剂量螺旋 CT(low dose computed tomog raphy, LDCT) 的普及与发展, 肺部结节的检出率也随之提高这类结节大体可分为恶性与良性两类良性病变中感染性肉芽肿占多数错构瘤, 还包括血管性淋巴性病变等恶性结节主要包括腺癌鳞癌转移瘤尽管多数结节最后经病理诊断为良性, 但仍有部分结节性质可疑, 仅通过影像学分析难以诊断, 必须进行有创活检, 这无疑增加了患者的医疗成本与心理负担所以急需一种无创的检查方法与影像学检查进行补充早有报道表明 mirnas 与肿瘤的发生转移和耐药等密切相关, 且 mirnas 取材方便, 可连续监测, 有望成为一种理想的潜在血清肿瘤标志物 MiR 146 家族包括 mir 146a 和 mir 146b, 分别位于人第 5 号和第 10 号染色体, 其序列高度保守且与成熟序列仅有 2 个碱基之差, 在生命活动中承担了众多作用 mir 146 家族是第 1 个被发现具有调节免疫的 mirna, 研究证实在固有免疫 TLR( Toll like receptors) 通路中 mir 146 担任负向调节作用, 即当 mir 146 过表达时, 其两个重要靶基因 IRAK1 和 TRAF6 表达均下调 mir 146 的抑癌作用与下调信号通路中 NF κb 的表达有关而在肺癌方面, [8] Sweta 等研究发现, 与健康对照组相比, mir 146b 3p 在肺腺癌患者血清中呈显著过表达, 但目前尚缺乏 mir 146b 3p 对于肺癌发生发展的相关机 [9 13] 制研究已有多项报道表明, 非小细胞肺癌与健康人中的循环血 mirnas 具有表达差异 Boeri [14] 等的报道中表明 mirnas 作为肺癌早期诊断的 [15] 临床价值此外,Chen 等通过对比 400 例非小细胞肺癌与 220 例健康对照组的 mirnas 表达, 发现 10 种 mirnas 表达差异具有统计学意义陈昊 [16] 等通过对 206 例非小细胞肺癌与 135 例健康人的外周循环血 mirnas 表达量分析发现 mirna, 可作为非小细胞肺癌非侵入性诊断标志物但现研究缺少对于肺部良性结节的报道良性结节的发生发展导致了肺内微环境的改变, 同时也致使 mirnas 发生异常表达所以通过分析比较非小细胞肺癌与良性结节的 mirnas 表达谱, 即可对两者进行鉴别诊断通过对早期非小细胞肺癌肺部良性结节患者与健康人群外周循环血 6 种 mirnas 表达进行检测对比, 本研究发现 mir 146b 3p 在非小细胞肺癌患者外周循环血中呈过表达, 显著高于肺部良性结节与健康人群与本课题组前期实验相同 : mir 15b 77

6 同济大学学报 ( 医学版 ) 第 39 卷 5p mir 17 5p mir 19a 3p mir 20a 5p 在非小细胞肺癌与健康人中呈差异表达 Logistic 回归分析表明在肺癌与良性结节组中, 年龄与 mir 146b 3p 为相关独立危险因素, 肺癌与健康人组中 mir 19a 3p 与 mir 146b 3p 为相关独立危险因素, 且有较高的特异性 (95%) 和灵敏度 (94%), 相较于当前临床常用的肿瘤标志物, 具有更强的早期鉴别诊断能力综上所述, 本次研究结果表明血清 mir 146b 3p 在非小细胞肺癌肺部良性结节患者与健康人群的早期鉴别诊断中具有一定的价值和潜力, 可作为一种新的血清肿瘤标志物, 很好的弥补了影像学检查在早期肺部结节良恶性判定上的劣势通过进一步的基础机制研究和大规模临床验证, 有望能提高早期肺部结节良恶性鉴别的准确性参考文献 [ 1 ] SIEGEL R, NAISHADHAM D, JEMAL A[J].Cancer statistics, 2013[J]. CA Cancer J Clin, 2013,63(1): [ 2 ] DESANTIS C, NAISHADHAM D, JEMAL A. Cancer statistics for African Americans, 2013[ J]. CA Cancer J Clin, 2013,63(3): [ 3 ] JENNIFER F BARGER, S PATRICK NANA SINKAM. MicroRNA as tools and therapeutics in lung cancer[ J]. Respir Med, 2015,109(7): [ 4 ] SHEN J, LIAO J, GUARNERA M A, et al. Analysis of micrornas in sputum to improve computed tomo graphy forlung cancer diagnosis[ J]. J Thorac Oncol, 2014,9(1): [ 5 ] RUSEK A M, ABBA M, ELJASZEWICZ A, et al. MicroRNA modulators of epigenetic regulation, the tumor microenvironment and the immune system in lung cancer[j]. Mol Cancer, 2015,14: 34. [ 6 ] BIANCHI F. Lung cancer early detection: the role of circulating microrna [ J]. EBio Medicine, 2015, 2: [ 7 ] LIHONG F, HUIWEI Q, JUNLIANG T, et al. Identi fication of serum mirnas by nano quantum dots mi croarray as diagnostic biomarkers for early detection of non small cell lung cancer[ J]. Tumor Biol, 2015,37 (6): 1 8. [ 8 ] SWETA R, KATHY G, JOHN C, et al. Globle analy sis of serum micrornas as potential biomarkers for lung adenocarcinoma[ J]. Cancer Biol Ther, 2013,14 (12): [ 9 ] DING X, YANG Y, SUN Y, et al. MicroRNA 585 acts as a tumor suppressor in non small cell lung cancer by targeting hsmg 1[ J]. Clin Transl Oncol, 2017,19 (5): [10] WU L, HU B, ZHAO B, et al. Circulating microrna 422a is associated with lymphatic metastasis in lung cancer [J]. Oncotarget, 2017,8(26): [11] COCHETTI G, POLI G, GUELFI G, et al. Different levels of serum micrornas in prostate cancer and be nign prostatic hyperplasia: evaluation of potential diag nostic and prognostic role [ J ]. Onco Targets Ther, 2016,9: [12] JANIAK M, PASKAL W, RAK B, et al. TIMP4 ex pression is regulated by mir 200b 3p in prostate cancer cells[ J]. APMIS, 2017,125(2): [13] 邱雯莉, 周红光.hsa mir 34b 过表达慢病毒载体的构建转染和表达 [ J]. 兰州大学学报 ( 医学版 ), 2016, 42(3): [14] BOERI M, VERRI C, CONTE D, et al. Microrna sig natures in tissues and plasma predict development and prognosis of computed tomography detected lung cancer [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2011,108(9): [15] CHEN X, HU Z, WANG W, et al. Identification of ten serum micrornas from a genome wide serum mi crorna expression profile as novel noninvasive biomark ers for nonsmall cell lung cancer diagnosis [ J]. Int J Cancer, 2012,130(7): [16] 陈昊, 范理宏. 血清 mirna 生物标志物对 NSCLC 的诊断价值 [J]. 同济大学学报 ( 医学版 ),2016,37(4):

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<4D6963726F736F667420576F7264202D20B2CCA3BA4542B2A1B6BE52746120496747BFB9CCE5D3EBB1C7D1CAB0A9B7D6C6DAB5C4B9D8CFB52E646F63> EB 病毒 Rta/IgG 抗体与鼻咽癌分期的关系蔡永林, 郑裕明, 成积儒, 李军, 莫永坤, 钟青燕 ( 广西梧州市红十字会医院, 梧州市肿瘤防治研究所, 广西梧州 543002) 摘要 : 目的探讨 EB 病毒 Rta/IgG 抗体与鼻咽癌临床分期的关系方法用酶