摇缘愿农摇药摇学摇学摇报 Vol. 员苑摇 period. And the lipase activity,the biomass and the yield of spinosad were improved by 猿员园郾园怨 %, 愿郾怨苑 % and 猿猿郾怨源 %,respectively

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壁卢
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1 农药学学报摇园员缘, 员苑 ( 猿 ): 缘苑原远远 Chinese Journal of Pesticide Science / www. nyxxb. com. cn 研究论文 DOI: 员园郾猿怨远怨 / j. issn. 员园园愿苑猿园猿郾园员缘郾园猿郾园植物油对刺糖多孢菌生长及其合成多杀菌素能力的影响马摇坤, 摇裘娟萍, 摇赵春田 ( 浙江工业大学生物与环境工程学院, 杭州猿员园园员源 ) 摘摇要 : 为研究不同种类植物油对刺糖多孢菌生长及其合成多杀菌素能力的影响, 探索提高多杀菌素产量的方法, 在发酵培养基中分别添加葵花油花生油大豆油芝麻油橄榄油和菜籽油, 研究了其对菌体生长脂肪酶活性和多杀菌素产量的影响, 并利用 RT PCR 对脂肪酶基因及多杀菌素合成相关基因的转录水平进行分析结果表明 : 远种供试植物油对菌体生长和多杀菌素产量的影响程度不同, 依次为菜籽油跃橄榄油跃花生油跃芝麻油跃葵花油跃大豆油, 其中菜籽油有利于诱导脂肪酶的表达延缓菌体的衰亡和延长产素期, 脂肪酶活力菌体生物量和多杀菌素产量分别提高猿员园郾园怨 % 愿郾怨苑 % 和猿猿郾怨源 % ; 脂肪酶基因和多杀菌素合成基因的转录强度也有明显提高因此, 菜籽油是其最佳的辅助性脂类碳源关键词 : 刺糖多孢菌 ; 多杀菌素 ; 植物油 ; 脂肪酶 ; 荧光定量 PCR; 转录中图分类号 :S 源愿郾愿摇摇摇文献标志码 :A 摇摇文章编号 : 员园园愿苑猿园猿 ( 园员缘 ) 园猿园缘苑员园 Effect of vegetable oils on the growth and spinosad biosynthetic potency of Saccharopolyspora spinosa Ma Kun, 摇 Qiu Juanping, 摇 Zhao Chuntian (College of Biological and Environmental Engineering,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 猿员园园员源,China) Abstract:In order to investigate the influence of vegetable oils on the growth and spinosad biosynthetic potency of Saccharopolyspora spinosa and explore new methods to improve the yield of spinosad,six kinds of vegetable oils,including sunflower oil,peanut oil,soybean oil,sesame oil, olive oil and rapeseed oil were screened. To study their influence on the growth,the lipase activity and the spinosad synthetic potency of S. spinosa,different vegetable oils were added to the fermentation medium as partial carbon sources,respectively. In addition,the temporal transcriptional profiles of the lipase gene and some selected genes in the spinosad biosynthetic pathway were examined by RT PCR. The results indicated that the effects of different vegetable oils on the growth of S. spinosa and the production of spinosad varied significantly,which were that rapeseed oil 跃 olive oil 跃 peanut oil 跃 sesame oil 跃 sunflower oil 跃 soybean oil. The rapeseed oil was conducive to the induction of lipase expression,the delay of the decline phase of S. spinosa and the extension of the spinosad synthetic 摇收稿日期 : 园员源员园源 ; 录用日期 : 园员缘园猿园远. 摇作者简介 : 马坤, 男, 硕士研究生,E mail:mkdfwy 岳员远猿. com; 赵春田, 男, 通信作者 ( Author for correspondence), 博士, 讲师, 主要从事应用微生物学研究,E mail:zct 园园愿岳 yahoo. com 摇基金项目 : 浙江省自然科学基金项目 (Y 员员员员愿 ); 浙江工业大学自然科学基金项目 ( 员园园员员园缘园员远源园愿 ); 浙江省生物工程重中之重学科开放基金项目 ( 园员猿园员园猿 ).

2 摇缘愿农摇药摇学摇学摇报 Vol. 员苑摇 period. And the lipase activity,the biomass and the yield of spinosad were improved by 猿员园郾园怨 %, 愿郾怨苑 % and 猿猿郾怨源 %,respectively. The transcriptional intensity of lipase gene and spinosad synthetic genes were also promoted. Thus the rapeseed oil was the optimal candidate of auxiliary carbon sources among the selected vegetable oils. Keywords:Saccharopolyspora spinosa;spinosad;vegetable oils;lipase;rt PCR;transcription 摇摇多杀菌素 (spinosad) 系刺糖多孢菌 Saccharopo lyspora spinosa 发酵产生的新型大环内酯类农用抗 [ 员生素, 具有触杀及胃毒作用 ], 能以光解方式快速 [ 猿降解 ], 且兼具生物农药的安全性和化学农药的速 [ 源效性 ] [ 缘远目前, 多杀菌素衍生物已达数百种 ], 国 [ 苑愿外已用于防治农作物病虫害 ] [ 怨员园 ] 蚊蝇及仓储 [ 员员员病虫害等 ] ; 而我国对多杀菌素的研究仍处于实验室阶段, 尚未工业化多杀菌素的生物合成源于聚酮链的延伸, 起始单元丙酰基团在聚酮合酶的作用下按照 A A P A A A A A A A(A: 乙酰基,P: 丙酰基 ) 的顺序逐步缩合, 整个过程由位于员园个组装模件上的酶系催化完成, 经硫酯酶环化, 并依次在员元环的 C 怨位 [, 员猿 C 员苑位连接鼠李糖和福乐糖胺基团 ] 由此可知, 在多杀菌素快速合成期, 需要大量的酰基前体, 它们主要来源于碳源代谢的中间产物因此, 供试碳源的分解特性对多杀菌素的合成至关重要葡萄糖是抗生素产生菌较好的碳源和能源, 但其分解阻遏作用 [ 员源会抑制多种抗生素的合成, 甚至使产素过程逆转 ] 植物油是一种疏水性物质, 在水中的溶解度很小, 可以减弱阻遏效应, 且其降解产物为短链脂肪酸, 可作 [ 员缘为抗生素合成的前体 ] 此外, 植物油有利于抗生素与菌体的分离, 降低次级代谢产物对细胞的毒害作 [ 员远用 ] 因此, 植物油是一种有效的非干扰性碳源, 常用作大环内酯类抗生素合成的辅助性碳源目前已有利用植物油促进放线菌次级代谢的报道, 例如头孢 [ 员远员苑菌素和红霉素等 ], 但有关植物油对刺糖多孢菌生长和多杀菌素产量的影响未见报道笔者研究了植物油种类对多杀菌素发酵过程中 ph 值脂肪酶活力残糖和油脂利用等参数的影响, 以及其代谢调节对脂肪酶基因 (lip) 和多杀菌素合成相关基因 (gtt gdh epi kre SpnA SpnF SpnG SpnP) 转录水平的影响, 以期筛选出最佳的辅助性脂类碳源, 为进一步提高多杀菌素的产量提供理论依据员摇员郾员摇材料与方法仪器与试剂 SpectraMax M 缘酶标仪 ( 美国 Molecular Devices 公司 );LC 园 AD 岛津高效液相色谱仪 ( 日本岛津公司 );ND 缘园园型超微量紫外可见分光光度计 ( Bio Take 公司 );CFX 怨远 connect 型荧光定量 PCR 仪器 ( 美国 BIO RAD 公司 ) 葵花油和大豆油 ( 中粮集团有限公司 ); 菜籽油 ( 山东鲁花集团有限公司 ); 橄榄油 ( 上海嘉里食品工业有限公司 ); 芝麻油 ( 含山县韶关鹰皇油脂有限公司 ); 花生油 ( 山东省临沂市花生种植合作社 ); 对硝基苯酚棕榈酸酯 (Sigma 公司 ); 郾缘 % 多杀菌素悬浮剂 (spinosad 缘 SC, 商品名称为菜喜, 美国陶氏益农公司 );RNAiso Plus 试剂 PrimeScript RT Master Mix 逆转录酶及 SYBR Premix Ex Tap Ⅱ( TaKaRa 公司 ); 其他试剂均为分析纯或色谱纯员郾摇供试菌株及其培养员郾郾员摇菌株来源及培养基摇刺糖多孢菌 S. spinosa 由浙江工业大学微生物研究所保藏供试培养基包括固体种子和发酵培养基猿种 : 员 ) 斜面及固体培养基 (g / L): 葡萄糖怨郾园, 酵母膏猿郾园, 玉米浆员园郾园,MgSO 源苑 H O 园郾, 琼脂园郾园, ph 苑郾缘 ) 一级和二级种子培养基 ( g / L ): 葡萄糖员园郾园, 蛋白胨源郾园, 酵母粉源郾园,MgSO 源苑 H O 园郾缘, KH PO 源郾园,K HPO 源猿 H O 源郾园,pH 愿郾园猿 ) 发酵培养基 ( g / L): 葡萄糖缘缘郾园, 玉米粉愿郾园, 蛋白胨苑郾缘, 酵母膏员园郾园,MgSO 源苑 H O 园郾缘, 棉籽饼粉猿园郾园, 植物油缘郾园 ( 对照组除外 ),ph 愿郾园上述猿种培养基分别用于刺糖多孢菌的斜面菌种培养种子液培养和发酵液培养, 灭菌条件均为员员缘猿园 min 员郾郾摇菌株培养种子培养 : 将刺糖多孢菌斜面菌种接入装液量为缘园 ml / 缘园 ml 的一级种子培养基中, 于园园 r / min 猿园条件下培养源愿 h, 即为一级种子液 ; 取一级种子液以体积分数员园 % 的接种量转入装液量为员园园 ml / 缘园园 ml 的二级种子培养基中, 相同条件下培养源 h, 即为二级种子液发酵培养 : 将二级种子液以体积分数员园 % 的接

3 摇 No. 猿马摇坤等 : 植物油对刺糖多孢菌生长及其合成多杀菌素能力的影响摇缘怨种量转入装液量为猿园 ml / 缘园 ml 的发酵培养基中, 于园园 r / min 猿园条件下培养怨 d 期间每隔源 h 取样测定其 ph 值还原糖生物量脂肪酶活力植物油含量 ( 对照组除外 ) 多杀菌素效价等理化参数员郾猿摇试验设计及测定项目试验设葵花油花生油大豆油芝麻油橄榄油和菜籽油远个处理, 以不添加植物油为对照每个处理重复猿次, 各组取样后立即测定相应的理化参数 :ph 值测定采用 PB 员园 ph 计 ; 还原糖测定采用猿, 缘二硝基水杨酸法 ( DNS 法 ) [ 员愿 ] ; 生物量测定采 [ 员怨用干重法 ] ; 脂肪酶活力的测定采用对硝基苯酚 [ 园员法 ], 在 ph 愿郾园猿苑条件下, 以每分钟释放员 μmol 对硝基苯酚 (p NP) 所需的酶量定义为员个 [ 酶活单位 ; 残油的测定采用铜皂法 ] ; 多杀菌素效 [ 员怨价测定采用 HPLC 方法 ] 员郾源摇刺糖多孢菌 RNA 的制备及 RT PCR 分析选取大豆油菜籽油试验组和对照组发酵培养猿耀耀耀耀耀耀耀耀苑 d 的样品用于 RNA 的制备及 RT PCR 分析提取的 RNA 样品经反转录后获得 cdna, 用于脂肪酶基因 lip 糖基侧链合成基因 (gtt gdh epi kre) 聚酮链合成及交联基因 ( SpnA SpnF) 鼠李糖转移酶基因 (SpnG) 和福乐糖胺转移酶基因 ( SpnP) 在相应检测区间内转录强度的分析员郾源郾员摇刺糖多孢菌 RNA 的制备摇取员 ml 上述发酵液样品于 Ep 管中, 于员园园园伊 g 源条件下离心员园 min, 收集菌体, 加入 l ml RNAiso Plus, 振荡混匀, 静置缘 min; 于员园园园伊 g 源条件下离心缘 min, 取上清液, 加入园郾 ml 氯仿, 漩涡振荡员缘 s, 静置缘 min; 于员园园园伊 g 源条件下离心员缘 min, 取园郾猿 ml 上清液, 加入等量的异丙醇, 混匀后静置员园 min; 于员园园园伊 g 源条件下离心员园 min, 弃上清液, 沉淀用员 ml 苑缘 % 乙醇洗涤后, 于苑缘园园伊 g 源条件下离心缘 min, 弃上清液 ; 室温干燥沉淀, 加入猿园 μl RNase Free dh O 溶解沉淀, 待 RT PCR 分析员郾源郾摇反转录及荧光定量 PCR 分析摇准确量取缘园园 ng 的 RNA 样品用于 cdna 单链的反转录, 按反转录试剂盒说明书 (PrimeScript TM RT Master Mix, TaKaRa Code:RR 园猿远 A) 合成 cdna 反转录体系为 : 缘伊 Prime Script RT Master Mix μl,rnase Free dh O 缘 μl,rna 样品缘园园 ng,rnase Free dh O 猿缘园园 / c 其中,c(ng / μl) 为 RNA 样品的质量浓度根据内参基因和待测基因的 DNA 序列, 利用 NCBI 的 Pick Primers 设计引物 ( 表员 ) 按照荧光定量 PCR 使用说明书 ( SYBR Premix Ex Tap TM Ⅱ, TaKaRa Code:RR 愿园 A) 完成相应模板引物和试剂的添加荧光定量 PCR 反应体系为 :SYBR Premix 引物名称 Primers SigA F SigA R lip F lip R SpnA F SpnA R SpnF F SpnF R SpnP F SpnP R SpnG F SpnG R gtt F gtt R gdh F gdh R epi F epi R kre F kre R Table 员摇引物序列 ( 缘猿 ) Primer Sequence( 缘猿 ) 表员摇 GGTGTTCCAGTCCACCGAAT GACCTCACGCAGGAAACGTA CGATCAAGAACGTCTCCGGT AAGTCGAGGCTCTGGTCGAT CGAAGCCGGGAACCTGATAG CAGAAGGAAGCCGGGTCAG GCGATCGTGTCGATGGGATG CAGATTCCAGCCACGGTCTT CGACGAAGTACGGGAGATGG TCACTGAACACGACTCCAGC GGTCGAAGTACTGGGGAAGC TCAACCTGTTCCTGCGTACC TTGTCCATCGTGGAGAAGCC CACCACGTCGTTGTCGTAGA GAGCCGAATTCCCCGTACTC ACCTTCTCCGGGAACTGGTA GGCTCGCATGACCCATATCA ATGCACCCGTGATGTCAAGT GCGGCAAGAACTTCCTGAAA TGATCGTCCACAACGGACAG 内参基因及待测基因的引物序列 The primer sequences of reference genes and target genes 产物长度 Product length / bp GenBank 登录号 Accession number 菌株来源 Source 员远愿 AM 源园怨猿 S. erythraea NRRL 猿猿愿员员怨 JF 苑怨缘缘愿员 S. spinosa xsp 园员员园猿苑缘 AY 园园苑缘远源 S. spinosa NRRL 员愿猿怨缘员苑 AY 园园苑缘远源 S. spinosa NRRL 员愿猿怨缘怨 AY 园园苑缘远源 S. spinosa NRRL 员愿猿怨缘员员源 AY 园园苑缘远源 S. spinosa NRRL 员愿猿怨缘愿员 AF 猿缘缘源远苑 S. spinosa NRRL 员愿猿怨缘员猿苑 AF 猿缘缘源远愿 S. spinosa NRRL 员愿猿怨缘员园猿 AF 猿缘缘源远远 S. spinosa NRRL 员愿猿怨缘苑猿 AF 猿缘缘源远愿 S. spinosa NRRL 员愿猿怨缘

4 摇远园农摇药摇学摇学摇报 Vol. 员苑摇 Ex TapⅡ 缘 μl,pcr Forward Primer 园郾 μl,pcr Reverse Primer 园郾 μl,cdna 样品员 μl,rnase Free dh O 猿郾远 μl PCR 反应程序为 : 怨缘猿园 s; 怨缘变性缘 s; 远园猿园 s 退火和延伸, 循环源园次原 Ct 结果用法分析, 内参基因选用刺糖多孢菌主要 Sigma 因子 SigA 员郾缘摇数据处理利用 Excel 和 Statview 统计分析软件对试验数据均值和差异显著性进行分析, 其中, 表示差异显著,P 约园郾园缘 ; 表示差异极显著,P 约园郾园员 ; 数据处理后用 Oringin 愿郾园绘图员郾缘郾员摇多杀菌素相对效价的计算摇根据公式 ( 员 ) 和 ( ) 计算发酵样品中多杀菌素的效价和相对效价 (A 原苑园源. 苑猿 ) Y 越伊 B ( 员 ) 员猿远怨. 园 ( 员 ) 式中 :Y 为发酵液样品的效价,mg / L;A 为样品峰面积,mV min;b 为样品稀释倍数, 苑园源郾苑猿和员猿远怨郾园分别代表多杀菌素标准曲线 y 轴截距和 x 轴斜率 [ 员怨 ] ( 此标准曲线由本实验室以郾缘 % 的多杀菌素悬浮剂为标样制作而成 ) Y R / % 越 Y t Y EC 伊员园园 ( ) ( ) 式中 :Y t 为 t 时刻各取样点发酵液样品的效价,mg / L;Y EC 为对照组发酵终点时的效价,mg / L; Y R 为样品中多杀菌素的相对效价,% 员郾缘郾摇单位菌体酶活含量的计算摇根据公式 ( 猿 ) 计算单位菌体酶活含量 E( P U / mg), 用于表征植物油对脂肪酶诱导效果及合成能力的影响 E E P 越 t ( 猿 ) B t ( 猿 ) 式中 :E t 为 t 时刻样品中脂肪酶酶活, U / ml;b t 为 t 时刻菌体生物量,mg / ml 员郾缘郾猿摇单位菌体多杀菌素相对含量的计算摇根据公式 ( 源 ) 和 ( 缘 ) 计算单位菌体多杀菌素相对含量 Y PR (% ), 用于表征植物油对刺糖多孢菌多杀菌素合成能力的影响 Y E Y P 越 ( 源 ) B max ( 源 ) 式中 :Y E 为发酵终点时各组样品的效价, mg / L;B max 为菌体生物量峰值,g / L;Y P 为各组发酵终点时的效价 Y E 与菌体生物量峰值 B max 的比值, mg / g Y Y PR / % 越 PO 伊员园园 ( 缘 ) Y PC ( 缘 ) 式中 :Y PO 为含油试验组发酵终点时的效价与相应菌体生物量峰值的比值,mg / g Y PC 为对照组发酵终点时的效价与菌体生物量峰值的比值, mg / g Y PR 为单位菌体多杀菌素相对含量,% 摇郾员摇结果及分析植物油种类对菌体生长及多杀菌素合成的影响郾员郾员摇对菌体生物量及产素能力的影响摇由图员 A 可见 : 各处理在员耀耀耀耀耀耀耀耀缘 d 内生长趋势相似, 均在第缘天时菌体量达到最高值其中, 大豆油葵花油芝麻油和花生油试验组的生长延迟现象较明显, 生物表示差异显著 (P 约园. 园缘 ); 表示差异极显著 (P 约园. 园员 ) and reprsent significant difference at 园. 园缘 and 园. 园员 level,respectively. Fig. 员摇图员摇植物油种类对菌体生物量 (A) 及多杀菌素相对效价 (B) 的影响 Influence of vegetable oils on the biomass of S. spinosa(a)and the relative titer of spinosad(b)

5 摇Ｎｏ猿马摇坤等植物油对刺糖多孢菌生长及其合成多杀菌素能力的影响摇远员量相对较低菌体自溶较早且大豆油在发酵后期对菌体生长的抑制作用十分显著菌体量最低细胞在次级代谢初期已开始裂解而菜籽油和橄榄油能够促进菌体的生长在多杀菌素快速合成期仍保持较高的菌体活力从图员Ｂ可知不同种类植物油对多杀菌素产量的影响不同依次为菜籽油跃橄榄油跃花生油跃芝麻油跃葵花油跃大豆油其中菜籽油和橄榄油试验组多杀菌素的合成速率均高于其他组并在菌体衰亡的初期仍持续合成直至衰亡后期多杀菌素产量才趋于平稳郾员郾摇对单位菌体多杀菌素相对含量的影响摇因表示差异显著Ｐ约园园缘表示差异极显著Ｐ约园园员为多杀菌素是胞内产物比较生长曲线和多杀菌素ａｎｄｒｅｐｒｓｅｎｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ园园缘ａｎｄ园园员ｌｅｖｅｌｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ合成曲线图员可知刺糖多孢菌的生物量与多杀图摇植物油种类对单位菌体多杀菌素相对含量的影响菌素产量具有一定的正相关性由图可知菜籽Ｆｉｇ摇Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｖｅｇｅｔａｂｌｅｏｉｌｓｏｎｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｓｐｉｎｏｓａｄ油试验组中菌体合成多杀菌素的能力最强大豆油ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｐｅｒｕｎｉｔｂｉｏｍａｓｓ组最差说明菜籽油不仅有利于菌体的初级代谢也长繁殖各组对糖的利用趋势相似随后多杀菌素快可以调节次级代谢促进多杀菌素的高效合成郾摇植物油种类对多杀菌素发酵过程中ｐｈ值和速合成还原糖的利用出现明显差异菜籽油和橄榄还原糖变化的影响油能够促进刺糖多孢菌对糖的利用保持较高的消耗速率其残糖浓度介于对照组和其他试验组间大ｐｈ值是菌体代谢活动的表征对抗生素的合成由图猿Ａ可见在发酵员耀豆油组的残糖浓度最高猿起关键的调控作用ｄ内刺糖多孢菌快速分解氮源ｐｈ值迅速上升郾猿摇植物油种类对菌体脂肪酶活力及油脂利用能发酵缘ｄ以后不同植物油引起的ｐｈ值差异性逐渐郾猿郾员摇对菌体脂肪酶活力的影响摇刺糖多孢菌对菜籽油组的ｐｈ值仍维持在多杀菌素合成较适的范力的影响由图源Ａ可见在整个发酵过程中各处在耀缘ｄ由于碳源的快速消耗ｐｈ值呈下降趋势力的影响植物油的利用能力除受碳源影响外还受脂肪酶活显现其中大豆油组的ｐｈ值显著升高而橄榄油和围内从图猿Ｂ可知在发酵员耀缘ｄ内菌体快速生表示差异显著Ｐ约园园缘表示差异极显著Ｐ约园园员ａｎｄ理组脂肪酶活性均呈先升后降的变化趋势但各组ｒｅｐｒｓｅｎｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ园园缘ａｎｄ园园员ｌｅｖｅｌｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ图猿摇植物油种类对多杀菌素发酵过程中ｐｈ值Ａ和还原糖Ｂ变化的影响Ｆｉｇ猿摇ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｖｅｇｅｔａｂｌｅｏｉｌｓｏｎｐｈＡａｎｄｒｅｄｕｃｉｎｇｓｕｇａｒＢｄｕｒｉｎｇｓｐｉｎｏｓａｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ

6 摇远Ｖｏｌ员苑摇农摇药摇学摇学摇报表示差异显著Ｐ约园园缘表示差异极显著Ｐ约园园员ａｎｄｒｅｐｒｓｅｎｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ园园缘ａｎｄ园园员ｌｅｖｅｌｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ图源摇植物油种类对多杀菌素发酵过程中脂肪酶活性的影响Ｆｉｇ源摇Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｖｅｇｅｔａｂｌｅｏｉｌｓｏｎｌｉｐａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｄｕｒｉｎｇｓｐｉｎｏｓａｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ酶活性最大值及持续时间有明显差别其中菜籽油组的脂肪酶活力最高持续时间最长而大豆油组最低多杀菌素自第缘天时开始快速合成因此计算此时单位菌体脂肪酶含量图源Ｂ由图源Ｂ可知菜籽油不仅通过增加菌体量来提高酶活性而且作为刺糖多孢菌脂肪酶的较适诱导物进一步提高了单位菌体的产酶量或酶活性郾猿郾摇刺糖多孢菌对不同种类植物油的消耗曲线摇结果如图缘所示在菌体生长的员耀ｄ内各处理组中植物油几乎不被利用进入对数生长期才逐渐被分解利用至发酵中后期因各组脂肪酶活力的差异增大油脂的消耗曲线呈不同趋势发酵终点时以菜籽油处理组残油为参照大豆油试验组残留量最高而菜籽油的最低因此菜籽油是较为理想的脂类碳源郾源摇植物油种类对脂肪酶基因及多杀菌素合成相关基因转录水平的影响表示差异显著Ｐ约园园缘表示差异极显著Ｐ约园园员ａｎｄｒｅｐｒｓｅｎｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ园园缘ａｎｄ园园员ｌｅｖｅｌｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ图缘摇多杀菌素发酵过程中菌体对不同种类植物油的消耗曲线郾源郾员摇对脂肪酶合成基因转录水平的影响摇由菌Ｆｉｇ缘摇Ｃｕｒｖｅｏｆｌｉｐｉｄｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆ脂肪酶活性变化曲线图源Ａ可知大豆油和菜籽可知各组脂肪酶基因转录强度的变化与相应脂肪体生长曲线图员Ａ多杀菌素合成曲线图员Ｂ及油在多杀菌素发酵过程中的作用效果不同因此选择这两组和对照组利用ＲＴＰＣＲ检测脂肪酶基因ｌｉｐ在发酵猿耀远ｄ内的转录强度图远从图中可知菜籽油试验组中刺糖多孢菌脂肪酶基因的转录强度最高发酵至第缘天时其转录强度约是大豆油的倍对应的酶活性相差员园郾苑Ｕｍｌ说明其对脂肪酶的诱导效果强于大豆油从整个转录过程Ｓｓｐｉｎｏｓａｄｕｒｉｎｇｓｐｉｎｏｓａｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ酶活性和油脂消耗的变化趋势是相符的郾源郾摇对多杀菌素糖基侧链合成基因转录水平的影响摇鼠李糖既是刺糖多孢菌细胞壁脂多糖的组成部分又与福乐糖胺一样是多杀菌素的生物活性基团由源个多杀菌素糖基侧链合成基因ｇｔｔｇｄｈｅｐｉｋｒｅ负责编码其中ｇｔｔ和ｇｄｈ基因编码脱氧六

7 摇Ｎｏ猿马摇坤等植物油对刺糖多孢菌生长及其合成多杀菌素能力的影响摇摇摇摇摇远猿糖而ｅｐｉ和ｋｒｅ则在此前体的基础上合成鼠李糖源#缘由于不同种类植物油对刺糖多孢菌生长图员Ａ和多杀菌素产量图员Ｂ的影响不同因此选择发酵猿耀苑ｄ的样品检测了这源个基因ｇｔｔｇｄｈｅｐｉｋｒｅ在初级和次级代谢阶段转录水平的变化图苑由图苑可知从刺糖多孢菌迅速生长期猿耀缘ｄ到多杀菌素快速合成期缘耀苑ｄ菜籽油试验组中糖基侧链合成基因的转录活性显著高于大豆油试验组而由图员可知菜籽油对菌体生物量和多杀菌素产量的促进效果优于大豆油这说明源个糖基表示差异显著Ｐ约园园缘表示差异极显著Ｐ约园园员ａｎｄｒｅｐｒｓｅｎｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ园园缘合成基因均参与了初级代谢和次级代谢远#苑在菌ａｎｄ园园员ｌｅｖｅｌｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ体迅速生长期各组均需ｇｔｔｇｄｈ合成的ＴＤＰ源酮图远摇植物油种类对多杀菌素发酵过程中脂肪酶远脱氧Ｄ葡萄糖及ｅｐｉｋｒｅ合成的鼠李糖用以保基因转录水平的影响证细胞的基础代谢和细胞壁的构建当进入发酵中Ｆｉｇ远摇Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｖｅｇｅｔａｂｌｅｏｉｌｓｏｎｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ后期这源个基因在菜籽油试验组的转录强度显著ｉｎｔｅｎｓｉｔｙｏｆｌｉｐａｓｅｓｙｎｔｈｅｔｉｃｇｅｎｅｄｕｒｉｎｇｓｐｉｎｏｓａｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ提高多杀菌素的合成速率明显高于对照组和大豆碳糖生物合成的共同前体ＴＤＰ源酮远脱氧Ｄ葡萄油试验组说明菜籽油可以通过提高多杀菌素糖基ｇｔｔｇｄｈｅｐｉｋｒｅ分别为ＴＤＰ葡萄糖合酶基因源远葡萄糖脱水酶合成基因猿缘差向异构酶基因和源酮还原酶合成基因ｇｔｔｇｄｈｅｐｉｋｒｅｒｅｐｒｅｓｅｎｔｇｌｕｃｏｓｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｇｅｎｅｇｌｕｃｏｓｅｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅｇｅｎｅ猿缘ｅｐｉｍｅｒａｓｅｇｅｎｅａｎｄ源ｋｅｔｏｒｅｄｕｃｔａｓｅｇｅｎｅｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ表示差异显著Ｐ约园园缘表示差异极显著Ｐ约园园员ａｎｄｒｅｐｒｓｅｎｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ园园缘ａｎｄ园园员ｌｅｖｅｌｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ图苑摇植物油种类对多杀菌素糖基侧链合成基因转录水平的影响Ｆｉｇ苑摇Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｖｅｇｅｔａｂｌｅｏｉｌｓｏｎｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｉｎｔｅｎｓｉｔｙｏｆｓａｃｃｈａｒｉｄｅｃｈａｉｎｓｓｙｎｔｈｅｔｉｃｇｅｎｅｓｄｕｒｉｎｇｓｐｉｎｏｓａｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ

8 摇远源农摇药摇学摇学摇报Ｖｏｌ员苑摇杀菌素合成初期源个合成基因在菜籽油试验组中侧链合成基因的转录表达进而促进刺糖多孢菌的生长和多杀菌素产量的转录强度均高于对照组和大豆油试验组随着多郾源郾猿摇对多杀菌素合成基因转录水平的影响摇为杀菌素合成速率加快菜籽油试验组的转录活性同深入了解菜籽油对多杀菌素合成基因转录水平的影步提高而此时大豆油试验组的理化环境已不适宜响选择聚酮链合成和交联基因ＳｐｎＡＳｐｎＦ鼠李菌体的生长和多杀菌素产生菌体量下降ｐｈ值迅糖和福乐糖胺糖基转移酶基因ＳｐｎＧＳｐｎＰ分析速上升多杀菌素合成基因的转录受阻最终导致多其在发酵源耀苑ｄ内的转录强度由图愿可知在多杀菌素产量较低摇摇ＳｐｎＡＳｐｎＦＳｐｎＧＳｐｎＰ分别为多杀菌素聚酮合酶基因聚酮交联基因鼠李糖转移酶基因和福乐糖胺转移酶基因ＳｐｎＡＳｐｎＦＳｐｎＧＳｐｎＰｒｅｐｒｅｓｅｎｔｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｇｅｎｅｒｈａｍｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｇｅｎｅａｎｄｆｏｒｏｓａｍｉｎｅｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｇｅｎｅｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ表示差异显著Ｐ约园园缘表示差异极显著Ｐ约园园员ａｎｄｒｅｐｒｓｅｎｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ园园缘ａｎｄ园园员ｌｅｖｅｌｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ图愿摇植物油种类对发酵过程中多杀菌素合成基因转录水平的影响Ｆｉｇ愿摇Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｖｅｇｅｔａｂｌｅｏｉｌｓｏｎｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｉｎｔｅｎｓｉｔｙｏｆｓｐｉｎｏｓａｄｓｙｎｔｈｅｔｉｃｇｅｎｅｓｄｕｒｉｎｇｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ猿摇讨论多杀菌素是一种极具前景的新型农用抗生素脂的分解利用能力最强是较为理想的诱导物和复合碳源植物油在脂肪酶的作用下水解为甘油和脂肪我国尚未掌握其工业化生产技术主要是因为多杀酸后者经 β 氧化分解产生大量酰基ＣｏＡ既可有菌素发酵过程中易出现碳代谢物阻遏效应本研究效地缓解速效碳源引起的阻遏效应又是多杀菌素尝试以植物油作为刺糖多孢菌生长和多杀菌素合成合成前体乙酰ＣｏＡ丙酰ＣｏＡ和甲基丙二酰的部分碳源通过对脂肪酶基因转录水平脂肪酶活ＣｏＡ的主要来源沈兆兵等在对含有相似聚酮链性及油脂量的测定发现菜籽油对脂肪酶基因的转生物合成途径的红霉素研究中发现植物油能促进录表达具有显著促进作用酶活最高持续时间最ＴＣＡ循环及中间代谢物琥珀酰ＣｏＡ的积累愿并长在多杀菌素快速合成期仍保持较高的活性对油在甲基丙二酰ＣｏＡ异构酶的作用下转化为红霉素

9 摇 No. 猿马摇坤等 : 植物油对刺糖多孢菌生长及其合成多杀菌素能力的影响摇远缘的合成前体甲基丙二酰 CoA [ 怨 ] 由此推测, 植物油分解产生的酰基 CoA 类代谢物, 可为多杀菌素的合成提供前体, 促进其快速合成但由于植物油的种类不同, 其所含的饱和脂肪 [ 猿园酸不饱和脂肪酸的种类和比例各不相同 ], 由于菌种的遗传背景不同, 其对油脂的分解利用具有一定的选择性, 因此不同植物油对同一菌株或同一种植物油对不同菌株的脂肪酶诱导作用存在差异, 其油脂利用能力也不相同杨莲芳等对红霉素的发酵研究表明, 菜籽油对红霉素合成的促进作用优于大 [ 猿员豆油 ], 本研究得出了与此一致的结论与大豆油相比, 菜籽油中不饱和脂肪酸的种类和含量均较高, 组分更复杂, 其中可能含有促生长因子抗生素合成调控因子抗氧化因子等, 其作用机制尚不清楚, 有待进一步研究通过对多杀菌素合成相关基因的转录分析发现, 糖基侧链合成基因和多杀菌素合成基因在菜籽油试验组中的转录水平相对较高, 这与该组中生物量和多杀菌素产量偏高相吻合, 说明菜籽油良好的分解特性可以促进菌体的生长和多杀菌素的合成综合发酵过程中 ph 值还原糖生物量脂肪酶活力及油脂等检测参数可知, 菜籽油能够促进菌体对糖和油脂的利用, 生物量最高, 发酵中后期仍能维持较适的 ph 值范围, 延缓菌体的衰亡, 单位菌体多杀菌素含量也最高说明菜籽油不仅通过增加菌体量, 还能以增强单位菌体产素能力的方式来提高多杀菌素的产量因此, 菜籽油是供试植物油中多杀菌素合成的最佳脂类碳源此外, 研究发现, 在含油培养基中多杀菌素的合成能力与脂肪酶活力呈正相关, 这与杨连芳和卞晨光等分别对红霉素发酵的研究结论相同, 即脂肪酶活力越高, 菌体对油脂的利用能力越强, 抗生素的产 [ 猿员猿量越高 ] 因此, 对可利用油脂作为菌体生长及抗生素合成的刺糖多孢菌而言, 除选择合适的脂类碳源外, 还可利用基因工程技术在脂肪酶合成基因的上游插入强启动子或增加脂肪酶基因的拷贝数, 以提高菌体对油脂的利用能力, 从而进一步提高多杀菌素的产量参考文献 (Reference): [ 员 ] 摇 Millar N S,Denholm I. Nicotinic acetylcholine receptors:targets for commercially important insecticides[ J ]. Invert Neurosci, 园园苑, 苑 ( 员 ): 缘猿原远远. [ ] 摇 Kirst H A. The spinosyn family of insecticides:realizing the potential of natural products research[ J]. J Antibiot, 园员园, 远猿 ( 猿 ): 员园员原员员员. [ 猿 ] 摇 Liu Shangzhong,Li Q X. Photolysis of spinosyns in seawater, stream water and various aqueous solutions[ J]. Chemosphere, 园园源, 缘远 ( 员员 ): 员员员原员员苑. [ 源 ] 摇 Thompson G D,Dutton R,Sparks T C. Spinosad a case study: an example from a natural products discovery programme[ J]. Pest Manag Sci, 园园园, 缘远 ( 愿 ): 远怨远原苑园. [ 缘 ] 摇 Sparks T C,Crouse G D,Dripps J E,et al. Neural network based QSAR and insecticide discovery: spinetoram[ J ]. J Comput Aided Mol Des, 园园愿, ( 远原苑 ): 猿怨猿原源园员. [ 远 ] 摇 Sparks T C, Crouse G D, Durst G. Natural products as insecticides:the biology,biochemistry and quantitative structure activity relationships of spinosyns and spinosoids[ J ]. Pest Manag Sci, 园园员, 缘苑 ( 员园 ): 愿怨远原怨园缘. [ 苑 ] 摇 Wang Dong,Gong Peiyu,Li Mei,et al. Sublethal effects of spinosad on survival,growth and reproduction of Helicoverpa armigera(lepidoptera:noctuidae)[j]. Pest Manag Sci, 园园怨, 远缘 ( ): 猿原苑. [ 愿 ] 摇 Jones T,Scott Dupree C,Harris R,et al. The efficacy of spinosad against the western flower thrips, Frankliniella occidentalis,and its impact on associated biological control agents on greenhouse cucumbers in southern Ontario[ J]. Pest Manag Sci, 园园缘, 远员 ( ): 员苑怨原员愿缘. [ 怨 ] 摇 Jarjees E A,McGraw B K,Messing R, et al. Effects of spinosad based fruit fly bait GF 员园 on tephritid fruit fly and aphid parasitoids[j]. Biological Control, 园园缘, 猿缘 ( ): 员缘缘原员远. [ 员园 ]Antonio G E,Sánchez D,Williams T,et al. Paradoxical effects of sublethal exposure to the naturally derived insecticide spinosad in the dengue vector mosquito,aedes aegypti[ J]. Pest Manag Sci, 园园怨, 远缘 ( 猿 ): 猿猿原猿远. [ 员员 ]Nayak M K,Daglish G J,Byrne V S. Effectiveness of spinosad as a grain protectant against resistant beetle and psocid pests of stored grain in Australia[J]. J Stored Prod Res, 园园缘, 源员 ( 源 ): 源缘缘原源远苑. [ 员 ]Vayias B J,Athanassiou C G,Milonas D N,et al. Persistence and efficacy of spinosad on wheat, maize and barley grains against four major stored product pests[j]. Crop Prot, 园员园, 怨 ( 缘 ): 源怨远原缘园缘. [ 员猿 ]Hong Lin, Zhao Zongbao, Melan on C, et al. In vitro characterization of the enzymes involved in TDP D forosamine biosynthesis in the spinosyn pathway of Saccharopolyspora spinosa[j]. J Am Chem Soc, 园园愿, 员猿园 ( 员源 ): 源怨缘源原源怨远苑. [ 员源 ]Rokem J S,Lantz A E,Nielsen J. Systems biology of antibiotic production by microorganisms[ J]. Nat Prod Rep, 园园苑, 源 ( 远 ): 员远原员愿苑. [ 员缘 ]Hu Changhua,Zou Yi,Zhao Wenting. Effect of soybean oil on the production of mycelial biomass and pleuromutilin in the shake flask culture of Pleurotus mutilis[ J]. World J Microbiol Biotechnol, 园园怨, 缘 ( 员园 ): 员苑园缘原员苑员员. [ 员远 ]Hamedi J, Malekzadeh F, Saghafi nia A E. Enhancing of erythromycin production by Saccharopolyspora erythraea with common and uncommon oils[ J]. J Ind Microbiol Biotechnol, 园园源, 猿员 ( 员园 ): 源源苑原源缘远. [ 员苑 ]Kim N R,Lim J S,Hong S I,et al. Optimization of feed conditions in a 郾缘员 fed batch culture using rice oil to improve

10 摇远远农摇药摇学摇学摇报 Vol. 员苑摇 cephalosporin C production by Cephalosporium acremonium M 缘 [J]. World J Microbiol Biotechnol, 园园缘, 员 ( 缘 ): 苑愿苑原苑愿怨. [ 员愿 ] 张永勤, 王哲平, 宋雨梅, 等. 还原糖测定方法的比较研究 [J]. 食品工业科技, 园员园, 猿员 ( 远 ): 猿原猿猿 Zhang Yongqin, Wang Zheping, Song Yumei, et al. Comparative study on the determination of reducing sugar[ J]. Sci Technol Food Ind, 园员园, 猿员 ( 远 ): 猿原猿猿.(in Chinese) [ 员怨 ] 王子宝, 沈淑媛, 裘娟萍. 刺糖多孢菌生长特性及移种标准 [J]. 农药, 园员, 缘员 ( 苑 ): 源怨源原源怨愿. Wang Zibao,Shen Shuyuan,Qiu Juanping. Growth characteristic and inoculation standard for Saccharopolyspora spinosa [ J ]. Agrochemicals, 园员, 缘员 ( 苑 ): 源怨源原源怨愿.(in Chinese) [ 园 ]Gupta N, Rathi P, Gupta R. Simplified para nitrophenyl palmitate assay for lipases and esterases[ J]. Analyt Biochem, 园园, 猿员员 ( 员 ): 怨愿原怨怨. [ 员 ] Margesin R,Feller G,H mmerle M,et al. A colorimetric method for the determination of lipase activity in soil[ J ]. Biotechnol Lett, 园园, 源 ( 员 ): 苑原猿猿. [ ] 张旭, 王金龙, 胡江林. 聚醚类抗生素发酵液中残油含量的比色法检测 [J]. 生物技术, 园园苑, 员苑 ( ): 源苑原源怨. Zhang Xu,Wang Jinlong,Hu Jianglin. Determination of oil in the broth of the polyether antibiotics fermentation by colorimetry [J]. Biotechnol, 园园苑, 员苑 ( ): 源苑原源怨.(in Chinese) [ 猿 ]Desai R P,Leaf T,Woo E,et al. Enhanced production of heterologous macrolide aglycones by fed batch cultivation of Streptomyces coelicolor[j]. J Ind Microbiol Biotechnol, 园园, 愿 ( 缘 ): 怨苑原猿园员. [ 源 ] Waldron C,Matsushima P,Rosteck P R,et al. Cloning and analysis of the spinosad biosynthetic gene cluster of Saccharopolyspora spinosa[j]. Chem Biol, 园园员, 愿 ( 缘 ): 源愿苑原源怨怨. [ 缘 ]Huang Kexue, Xia Liqiu, Zhang Youming, et al. Recent advances in the biochemistry of spinosyns[ J]. Appl Microbiol Biotechnol, 园园怨, 愿 ( 员 ): 员猿原猿. [ 远 ] Madduri K,Waldron C,Matsushima P,et al. Genes for the 摇摇摇摇毣櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥毣化学工业出版社农药类精品图书推荐 biosynthesis of spinosyns:applications for yield improvement in Saccharopolyspora spinosa[ J ]. J Ind Microbiol Biotechnol, 园园员, 苑 ( 远 ): 猿怨怨原源园. [ 苑 ]Madduri K,Waldron C,Merlo D J. Rhamnose biosynthesis pathway supplies precursors for primary and secondary metabolism in Saccharopolyspora spinosa[ J ]. J Bacteriol, 园园员, 员愿猿 ( 员怨 ): 缘远猿原缘远猿愿. [ 愿 ] 沈兆兵, 陈国豪, 陈长华. 豆油在红霉素发酵中的作用及作用机制的研究 [J]. 中国抗生素杂志, 园园远, 猿员 ( 员员 ): 远缘苑原远远园. Shen Zhaobing,Chen Guohao,Chen Changhua. Study on effect of soybean oil on fermentation of erythromycin and its mechanism [J]. Chin J Antibiot, 园园远, 猿员 ( 员员 ): 远缘苑原远远园.(in Chinese) [ 怨 ]Hunaiti A A, Kolattukudy P E. Source of methylmalonyl coenzyme a for erythromycin synthesis: methylmalonyl coenzyme a mutase from Streptomyces erythreus[ J]. Antimicrob Agents Chemother, 员怨愿源, 缘 ( ): 员苑猿原员苑愿. [ 猿园 ]Hamedi J, Malekzadeh F, Saghafi nia A E. Enhancing of erythromycin production by Saccharopolyspora erythraea with common and uncommon oils[ J]. J Ind Microbiol Biotechnol, 园园源, 猿员 ( 员园 ): 源源苑原源缘远. [ 猿员 ] 杨莲芳, 曹健, 张中州, 等. 不同种类植物油对红霉素发酵的影响 [J]. 食品与发酵科技, 园园怨, 源缘 ( 源 ): 源远原源愿. Yang Lianfang,Cao Jian,Zhang Zhongzhou,et al. Effect of vegetable oils on the erythromycin fermentation[ J ]. Food Ferment Technol, 园园怨, 源缘 ( 源 ): 源远原源愿.(in Chinese) [ 猿 ] 卞晨光, 宫衡, 付水林, 等. 以脂肪酶活为指标快速筛选红霉素摇瓶发酵培养基 [ J]. 中国抗生素杂志, 园园源, 怨 ( 苑 ): 猿愿缘原猿愿苑. Bian Chenguang, Gong Heng, Fu Shuilin, et al. A rapid method to select medium in shake flask of erythromycin by potency deduction of the specific activity of lipase[ J]. Chin J Antibiot, 园园源, 怨 ( 苑 ): 猿愿缘原猿愿苑.(in Chinese) 农药手册 ( 责任编辑 : 曲来娥 ) 毣胡笑形摇等译摇摇本书为 The Pesticide Manual ( 员远 th edition) 的中译本是全世界公认的权威性农药工具书本手册详细介绍了怨园个农药品种的英中文通用名称结构式分子式相对分子质量结构类型活性用途化学名称 CAS 登录号理化性质加工剂型应用生产企业商品名哺乳动物毒性生态毒性和环境行为等内容文前附有编译说明条目说明立体化学命名法农药抗性等内容, 文后附录中对另外苑员园个农药品种进行了简要介绍另外, 书后还附有缩写与代码英文农药生产企业名录及中国大陆农药企业名录等附录? 摇书摇摇号 : 怨苑愿苑员园愿愿摇摇摇摇定价 : 源愿园援园元? 摇出版时间 : 园员缘年猿月摇摇摇摇摇开本 : 员远 ( 杨新玲摇供稿 ) 櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥櫥毣

( CIP) / [ ] ;,,. - :, ISBN K CIP ( 2001) : [ ] : : : : : ( ) : ht tp : / / w w w. ss

( CIP) / [ ] ;,,. - :, ISBN K CIP ( 2001) : [ ] : : : : : ( ) : ht tp : / / w w w. ss ( CIP) / [ ] ;,,. - :,2001. 7 ISBN 7-80149 - 553-5... -. K833. 138. 9 CIP ( 2001) 030585 : [ ] : : : : : ( 5 65139963 100732 ) : ht tp : / / w w w. ssdp h. c om. c n : : : : 850 1168 1/ 32 : 6. 75 : 111