56 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No (2) 种子培养基 (g/l): 葡萄糖 10g, 胰蛋白胨 30g, 酵母浸粉 3g, 牛肉膏 3g, 玉米浆 2.5g,MgSO 4 2g, (NH 4 ) 2 SO 4 0.5g 灭前 ph7.5 (3

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率鑫邴
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2013,33(8):55 59 混合油脂补料发酵提高多杀菌素的产量王美玲薛超友赵方龙卢文玉 ( 天津大学化工学院天津 ) 摘要通过补加植物油 ( 菜籽油玉米油豆油 ) 油酸甲酯玉米浆, 考察其对多杀菌素发酵产量的影响结果显示, 在 96h 补加 3% 的混合油脂 ( 油酸甲酯菜籽油 =2 1), 同时在 96h 和 144h 分别补加 1% 的玉米浆可使多杀菌素的产量提高 2.11 倍, 发酵单位达到 mg/L, 为实现工业化生产奠定基础关键词补料分批发酵多杀菌素混合油脂刺糖多孢菌中图分类号 Q819 多杀菌素 (spinosad) 是刺糖多孢菌发酵生成的次级代谢产物, 因其杀虫广谱性对非靶目标和环境的安全性以及良好的可降解性获得了 1999 年的美国总统绿色化学品挑战奖 [1], 是应用广泛的生物杀虫剂多杀菌素属聚酮类抗生素, 但与常见 I 型聚酮不同, 其内含有 3 个环内分子间 C C 键 [2] 在聚酮合成酶(PKS) 的作用下, 以丙酸为起始单元, 按照 A A P A A A A A A A(A 乙酰,P 丙酰 ) 的顺序逐步缩合形成聚酮链, 再由硫酯酶催化环化反应生成四元环 [3], 并分别在 C9 位 C17 位的羟基位连接上鼠李糖和福乐糖胺使其具有生物活性 [4] 多杀菌素的主要成分为组分 A 和组分 D,A 组分约占 85% ~90%,D 组分约占 10% ~15%, 两者的主要区别在于 C6, 在 C6 的基团分别为氢和甲基目前, 制约多杀菌素实现产业化和广泛推广应用的主要问题在于生产成本高, 发酵工艺复杂, 发酵效能低培养基优化和菌株改造是目前国内多杀菌素研究 [5] 的重点, 李能威等通过单因素多因素试验和 2 次正交试验获得最优发酵培养基, 使多杀菌素产量达到 [6] mg/L, 较对照提高 62.5% Liang 等通过紫外线诱变筛选得到一株具有鼠李糖和丙酸钠抗性的突变株, 添加前体正丙醇后产量达到 125.3mg/L, 比野生菌株提高了 285.5%; 但继续提高产量效果都不明显 ; 收稿日期 : 修回日期 : 国家自然科学基金 ( ) 天津市科技支撑计划重点项目 (11ZCKFSY0100) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :wenyulu@tju.edu.cn [7] Wang 等根据阿维菌素产生菌阿维链霉菌 (S. avermitilis) 可以利用廉价碳源淀粉, 将 S.spinosa 和 S. avermitilis 进行种间融合, 高产融合菌株多杀菌素产量为 25mg/L 较原始菌株提高 %; 目前国内所报道的多杀菌素的产量一般都低于本文通过补料方法得到的 mg/L 的产量植物油被广泛应用于提高抗生素的产量, 卞晨光 [8] 等发现在摇瓶中添加豆油后红霉素的产量从 3038 [9] U/ml( 不加豆油 ) 提高到 5221U/ml;Park 等发现以 7g/L 的豆油替代淀粉作为碳源时 Streptomycessp.6621 [10] 合成头霉素 C 的产量提高 4.7 倍 ;Vucetic 等添加油酸甲酯使 S.hygroscopicus 代谢多烯 H 85 的产量提高 40% 而不同油或酯类对多杀菌素发酵产量的影响至今没有报道, 基于多杀菌素的合成途径, 以及其他抗生素的合成过程, 本文尝试采用添加植物油油酸甲酯玉米浆以提供多杀合成的前体和能量, 并大幅提高了多杀菌素发酵单位在此基础上, 探讨多杀菌素发酵过程中各个参数的变化趋势, 为多杀菌素的开发研究提供指导 1 材料与方法 1.1 菌株和培养基 (1) 菌株为本实验室保存的基因工程菌 S.spinosa LU104 [11], 是在野生菌中通过质粒 plu104 过表达多杀菌素合成的某些关键基因得到产白色孢子, 发酵周期为 10d, 培养温度为 28~30, 遗传性状稳定的工程菌

56 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No.82013 (2) 种子培养基 (g/l): 葡萄糖 10g, 胰蛋白胨 30g, 酵母浸粉 3g, 牛肉膏 3g, 玉米浆 2.5g,MgSO 4 2g, (NH 4 ) 2 SO 4 0.5g 灭前 ph7.

2 56 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No (2) 种子培养基 (g/l): 葡萄糖 10g, 胰蛋白胨 30g, 酵母浸粉 3g, 牛肉膏 3g, 玉米浆 2.5g,MgSO 4 2g, (NH 4 ) 2 SO 4 0.5g 灭前 ph7.5 (3) 发酵培养基 (g/l): 葡萄糖 60g, 麦芽糖 10g, 棉籽蛋白 20g, 玉米浆 10g, 酵母膏 10g,K 2 HPO 4 0.5g, NaCl0.5g,MgSO 4 2g,CaCO 3 5g, 灭前 ph 培养条件将 200μl 孢子悬液 (10 8 cfu/ml) 加入到装液量为 30ml 的种子培养基中, 培养 48~60h; 种子按照 10% 的接种量接种于装有 30ml 发酵培养基的 250ml 摇瓶中,30 培养 10d, 测定各个参数 1.3 测定方法 ph 的测定 : 由 ph 测定仪测定多杀菌素产量的测定 : 参考 Lily 公司的方法 [12] 还原糖的测定 : 采用 3,5 二硝基水杨酸法 (DNS 法 ) 测定菌体浓度的测定 : 干重法 1.4 数据处理每个处理重复 3 次, 结果取平均值, 并计算出标准差 sd 2 结果与讨论 2.1 基础发酵培养基中添加不同油脂对多杀菌素产量的影响油类在发酵中除作为碳源和能源外, 还作为消泡剂减少液体和大气交界面的表面张力, 但过量的油脂会增加发酵液的粘度 [13] 0h 时向发酵培养基中分别添加不同浓度的玉米油菜籽油豆油 (1% 2% 3%) 和油酸甲酯 (1% 2% 3% 4%) 考察对发酵产量的影响, 结果如图 1 所示可以发现添加油脂均可以促进多杀菌素的产量,2% 油酸甲酯和 1% 菜籽油对其促进作用最大, 与对照 ( 未添加 ) 相比多杀菌素分别增加 38.2% 和 36.08%; 此外, 添加油脂浓度的增加与产量变化为非正相关的关系以葡萄糖作为主要的碳源和能源生产抗生素时会导致葡萄糖效应 [14], 抑制次级代谢产物的合成, 所以经常采用葡萄糖的补料或流加来减少其抑制作用在培养基中添加植物油也可以减小葡萄糖的抑制作用 [15], 因为油类物质分解生成甘油和脂肪酸, 后者经过 β 氧化转变为乙酰 CoA, 从而避免速效碳源引起的分解代谢物阻遏作用 ; 此外, 乙酰 CoA 也是多杀菌素合成前体丙酰 CoA 和甲基丙二酰 CoA 的来源之一沈兆兵 [16] 等研究发现, 豆油的添加可以有效促进 TCA 循环, 促进琥珀酰 CoA 的积累, 进一步形成红霉素前体甲基丙二酰 CoA 由此, 我们认为, 在与红霉素结构相似的多杀菌素的合成过程中, 油类分解及胞内代谢产生的 CoA 类代谢物, 如乙酰 CoA 丙酰 CoA 和甲基丙二酰 CoA 为多杀菌素的生物合成提供了大量的前体和结构单元, 从而促进了多杀菌素的合成图 1 不同种类和浓度的油脂对多杀菌素发酵的影响 Fig.1 Theefectofaddedvariousoilson spinosynproductioninshakeflask 2.2 混合油脂的配比和添加时间对多杀菌素产量的影响在发酵初始分别添加浓度为 1% 2% 3% 4% 5% 混合油脂 ( 油酸甲酯菜籽油 =2 1), 考察发酵 10d 时的生物量浓度和多杀菌素产量, 结果如图 2 与对照组相比, 添加 3% 的混合油脂多杀菌素的产量和菌浓分别提高 52.59% 和 31.33%, 继续增加混合油脂浓度对产物合成和菌体生长产生一定的抑制作用抗生素等次级代谢产物的发酵分为菌体生长期和产物合成期两个阶段, 一般在菌体生长的对数末期添加前体物质有利于次级代谢物的合成研究混合油脂不同添加时间对产物的影响, 结果如图 3 所示 :96h 为最佳添加时间, 多杀菌素产量与 0h 添加相比提高 [17] 9.65%, 明显优于其它添加方案 ;Noushin 等研究表明在含有不同油类的糖多孢菌属发酵培养过程中, 进入稳定期后, 脂肪酶的活性均达到最大, 脂肪酸的利用率更大分析认为 : 补料过早会导致油脂分解得到的前体未进入产物的合成途径而直接用于菌丝体的生长 ; 中后期 (72~120h) 补加促进菌浓的增加, 说明发酵后期葡萄糖代谢不足以满足菌体的生长和代谢, 需要补充其他营养物质 ; 由于长时间缺乏营养导致后期菌体代谢已经衰退,144h 补加油脂对多杀菌素的合成

95%, 说明玉米浆在促进菌体生长的同时其分解得到的微量元素或生长素刺激了多杀菌素的合成但在多组分物质补料策略中, 混合油脂与玉米浆的组合较其他组合方式对产物的促进更显著, 较策略 9 与策略 10 分别提高 11.

3 2013,33(8) 王美玲等 : 混合油脂补料发酵提高多杀菌素的产量 57 没有明显的促进作用图 2 不同浓度混合油脂对多杀菌素发酵的影响 Fig.2 Theefectofmixedlipidconcentration ontheproductionofspinosyn 结果如表 1 所示, 在发酵后期补加不同的碳源能源 ( 葡萄糖混合油脂 ) 和氮源 ( 玉米浆 ) 均可以显著提高多杀菌素的产量, 其中在单组分补加方式中,96h 144h 各补加 1% 的玉米浆对多杀菌素的促进作用较明显, 与对照相比, 产量提高 67.95%, 说明玉米浆在促进菌体生长的同时其分解得到的微量元素或生长素刺激了多杀菌素的合成但在多组分物质补料策略中, 混合油脂与玉米浆的组合较其他组合方式对产物的促进更显著, 较策略 9 与策略 10 分别提高 11.9% 16%; 策略 10 得到的多杀菌素产量远低于其他混合补料 ( 策略 8 9), 但发酵结束时菌浓却最高 ( 数据未列出 ), 这说明混合油脂在多杀菌素发酵中提供前体物质的角色是葡萄糖所不可替代的, 发酵后期补加玉米浆与葡萄糖的主要作用是促进菌体的生长图 3 混合油脂 (3%) 不同补加时间对多杀菌素发酵的影响 Fig.3 Theefectofmixedlipidaddition timeontheproductionofspinosyn 2.3 补料对发酵产量的影响在未补加油脂的情况下进行发酵, 如图 4 所示, 发酵 192h 左右 ph 开始上升, 通过镜检发现伴随着 ph 的上升, 发酵罐内的菌体开始出现自溶现象 ; 此外, 注意到发酵结束时还原糖的浓度降到 1% 以下, 因此, 我们认为, 营养物质的不足, 可能是后期 ph 上升和多杀菌素产量低的重要原因速效氮源也存在类似于葡萄糖的抑制作用 [18], 可考虑在发酵后期采用补加的方法来解除此抑制作用玉米浆作为速效氮源含有微生物的生长和代谢所必需的氮源微量元素维生素等 [19], 在工业化发酵生产中常作为廉价氮源用来替代酵母粉等昂贵氮源 [20 21] 基于此, 考虑在发酵后期采用不同的补料方式 ( 如表 1), 以维持后期细胞的生长和产物的合成策略图 4 S.spinosaLU104 分批发酵过程曲线 Fig.4 Thebatchfermentationprofileof S.spinosaLU104 表 1 不同补料方式对多杀菌素产量的影响 Table1 Theefectofdiferentfeedingstyles onspinosynproduction 后期补加方式 Spinosyn (mg/l) 1 96 补加 3% 的混合油脂 h 补加 2% 的玉米浆 h 补加 2% 的玉米浆 h 补加 2% 的玉米浆 (CSL) h 各补加 1%CSL h 各补加 1% Glucose h 各补加 0.5% Glucose h 混合油脂 (3%) h 玉米浆 ( 各 1%) h 混合油脂 (3%) hGlucose ( 各 0.5%) h 玉米浆 ( 各 1%) h Glucose( 各 0.5%) 对照

4 58 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No 补料分批发酵实验通过对 S.spinosaLU104 发酵行为的系统研究, 初步确定了后期补加玉米浆和混合油脂的发酵方案 (96h 补加 3% 混合油脂, 同时 96h 144h 各补加 1% 的玉米浆 ); 为了更好地反映发酵模式改进后菌株的动态发酵行为和生长特性, 对产量菌浓 ph 葡萄糖消耗进行了系统考察由图 5a 可知, 补加营养物质促进菌体的生长, 补料组发酵结束时菌体浓度较对照组提高 21.22%, 在 96~ 144h 之间葡萄糖消耗速率明显大于对照组 ; 发酵 144 h 后补料组由于菌体浓度的增大, 发酵液粘稠度增大, 从而影响了氧的传递, 使得葡萄糖消耗速率稍有降低 ; 此外, 菌体利用油脂作为碳源也减少了葡萄糖的消耗两种模式下, 发酵结束时培养基中的残糖 ( 如图 5b) 浓度都低于 1% 所以在工业化的发酵罐培养中, 可通过后期提高转速来增加溶氧, 以满足菌体生长的需要, 进一步提高多杀菌素的产量此外, 我们注意到, 两种发酵模式下, 前期培养基的 ph 值 ( 如图 5b) 均是先升高后下降, 这是由于发酵前期菌体利用速效氮源 ( 玉米浆酵母膏 ) 产生游离 NH + 4 引起的在发酵 50h 左右多杀菌素开始合成, 葡萄糖大量消耗产生有机酸使 ph 下降 ; 在发酵后期, 对照组由于碳源或溶氧的限制, 菌体自溶,pH 值会上升 ; 补料组由于 96h 补加玉米浆和混合油脂, 速效氮源的利用使 ph 上升, 但同时油脂分解产生脂肪酸会中和 OH, 所以发酵中后期 ph 基本维持在 7 左右, 恒定的 ph 环境和大量的前体物质大大促进了多杀菌素的合成, 多杀菌素的产量是对照组的 2.11 倍图 5 S.spinosaLU104 补料发酵与分批发酵过程曲线 Fig.5 Concentrationofcel,spinosyn(a)and glucose,ph(b)inbatchandfed batch fermentationofs.spinosalu104 holowdenotethefed batchfermentation 3 结论本文以基因工程菌 S.spinosaLU104 为出发菌株, 优化补加油脂的种类浓度时间, 使多杀菌素的产量大大提高实验得到 2% 油酸甲酯和 1% 菜籽油对多杀菌素合成的促进作用大于豆油玉米油, 是适合的碳源和前体物在发酵 96h 时添加 3% 的菜籽油和油酸甲酯混合物, 多杀菌素的产量达到 mg/L, 较不添加油类提高 68.10% 发现发酵中期(96h) 添加 3% 的混合油脂和 1% 的玉米浆, 同时在 144h 补加 1% 玉米浆,pH 在较小的范围内波动, 能大大促进菌体的生长和产物的合成, 多杀菌素的产量为 mg/L 是分批发酵的 2.11 倍此外, 描述了发酵过程中各个参数的变化趋势, 为多杀菌素的工业化放大提供理论依据参考文献 [1]ThompsonGD,DutonR,SparksTC.Spinosad acasestudy: anexamplefrom anaturalproductsdiscoveryprogramme.pest ManagementScience,2000,56: [2]SparksTC,CrouseG D.Naturalproductsasinsecticide:the biology, biochemistry and quantitative structure activity relationshipsofspinosoids.pestmanagsci,200l,57(10): [3] KirstH A.Thespinosynfamilyofinsecticides:realizingthe potentialofnaturalproductsresearch.thejournalofantibiotics, 2010,63: [4]LinHong,ZongbaoZhao,etal.Invitrocharacterizationofthe enzymes involved in TDP D forosamine biosynthesis in the spinosynpathwayofsacharopolysporaspinosa.jamchemsoc, 2008,130: [5] 李能威, 张晓琳, 郭伟群, 等. 多杀菌素发酵培养基的研究. 西北农林科技大学学报,2010,38(1): LiNW,ZhangXL,GuoW Q,etal.Studyonthefermentation mediaforspinosad production. JournalofNorthwestA&F University,2010,38(1): [6] Liang Yan, Wenyu Lu, Jianping Wen. Improvementof Sacharopolysporaspinosaandthekineticanalysisforspinosad production.applbiochembiotechnol,2009,152: [7]WangChao,XiaoLinZhang,ZhiChen,etal.Strainconstruction forenhancedproductionofspinosadviaintergennericprotoplast fusion.canjmicrobiol.2009,55(9): [8] 卞晨光, 宫衡. 豆油对红霉素生物合成的影响及作用机制分析. 华东理工大学学报,2004,30(2): BianCG,GongH.Efectofsoybeanoilonthebiosynthesisof erythromycinanditsmechanism.journalofeastchinauniversity

5 2013,33(8) 王美玲等 : 混合油脂补料发酵提高多杀菌素的产量 59 ofscienceandtechnology,2004,30(2): [9] Park Yong Soo, Isao Momose, Kimiko Tsunoda, etal. EnhancementofcephamycinCproductionusingsoybeanoilasthe solecarbonsource.applmicrobiolbiotechnol,1994,40: [10] VuceticJ,KaradzicI,Gojgic CvijovicG,etal.Improving hexaeneh 85productionbyStreptomyceshygroscopicus.JSerb ChemSoc,1994,59(12): [11] ChaoyouXue,YuejiaoDuan.Stepwiseincreaseofspinosad productioninsacharopolysporaspinosabymetabolicengineering.biochemicalengineeringjournal,2013,72: [12]StrobelR J,NakatsukasaW M.Responsesurfacemethodsfor optimizing Sacharopolyspora spinosa, a novel macrolide producerc.journalofindustrialmicrobiology,1993,11: [13] LargeK P,IsonA P.Theefectofagitationrateonlipid utilisation and clavulanic acid production in Streptomyces clavuligerus.journalofbiotechnology,1998,63: [14] SergioSanchez,ArnoldLDemain.A Metabolicregulationof fermentationproceses.enzymeandmicrobialtechnology,2002, 31: [15] DuBokChoi,ShinyaTamura,YongSooPark,etal.Eficient tylosinproductionfrom Streptomycesfradiaeusingrapeseedoil. JournalofFermentationandBioengineering,1996,82: [16] 沈兆兵, 陈国豪, 陈长华. 豆油在红霉素发酵中的作用及作用机制的研究. 中国抗生素杂志,2006,31(11): ChenZB,ChenGH,ChenCH.Studyonefectofsoybeanoil onfermentation oferythromycin and itsmechanism. Chinese JournalofAntibiotics,2006,31(11): [17]NoushinMirjalili,VasiliosZormpaidis,PeterFLeadlay,etal. Theefectofrapeseedoiluptakeontheproductionoferythromycin andtriketidelactonebysacharopolysporaerythraea.biotechnol. Prog,1999,15: [18]OmuraS,TanakaY,KitaoC,etal.Stimulationofleucomycin productionbymagnesiumphosphateanditsrelevancetonitrogen cataboliteregulation.antimicrobialagentsandchemotherapy, 1980,18: [19]SamuelAmartey,ThomasW Jefries.Comparisonofcornsteep liquorwithothernutritionsinthefermentationofd xyloseby PichiastipitisCBS6054.Biotechnologyleters,1994,16: [20] LimaA L,NascimentoR P,BonE P,etal.Streptomyces drozdowicziceluloseproductionusingagro industrialby products and itspotentialusein thedetergentand textileindustries. EnzymeMicrobTechnol,2005,37(2): [21]DeAzeredoLAI,DeLimaMB,CoelhoRR,etal.Alow cost fermentation medium forthermophilic protease production by Streptomycesp594usingfeathermealandcornsteepliquor.Cur Microbiol,2006,53: EnhancedProductionofSpinosadbyFed batchfermentation WANGMei ling XUEChao you ZHAOFang long LUWen yu (SchoolofChemicalEngineeringandTechnology,TianjinUniversity,Tianjin ,China) Abstract Theefectoftheadditionofcornoil,rapeseedoil,soybeanoil,methyloleate,themixtureof rapeseedoilandmetyloleateontheproductionofspinosadbysacharopolysporaspinosalu104wasstudied. Theresultsindicatedthattheyieldofspinosadwasincreased2.11 foldupto804.59mg/lwhenadding3% mixtureoil(rapeseedoil metyloleate=1 2)at96hand1% cornsteepliquorat96hand144h. Keywords Fed batchfermentation Spinosad Mixedlipid Sacharopolysporaspinosa

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