Western Blotting 实验原理及应用 免疫印迹是一个用于蛋白质分析的常规技术, 在电场的作用下将电泳分离的蛋白从凝胶转移至一种固相支持物, 然后利用抗原 - 抗体的特异性反应, 从蛋白混合物中检测出目标蛋白, 从而定量或定性的确定正常或实验条件下细胞或组织中目标蛋白的表达情况 Weste

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1 艾比玛特生物医药 ( 上海 ) 有限公司 Western Blotting 实验指南 Western Blotting 实验原理及应用 Western Blotting 检测操作手册 Western Blotting Q&A Troubleshooting for Western Blotting 1

2 Western Blotting 实验原理及应用 免疫印迹是一个用于蛋白质分析的常规技术, 在电场的作用下将电泳分离的蛋白从凝胶转移至一种固相支持物, 然后利用抗原 - 抗体的特异性反应, 从蛋白混合物中检测出目标蛋白, 从而定量或定性的确定正常或实验条件下细胞或组织中目标蛋白的表达情况 Western blotting 还可用于蛋白 - 蛋白 蛋白 -DNA 和蛋白 -RNA 相互作用的后续分析, 作为一种廉价 便捷 可靠的研究工具, 将与质谱和蛋白质芯片等技术一起在蛋白质组时代发挥重要作用 Western Blotting 的 protocol 种类繁多, 但大同小异, 基本为上述几个步骤 要得到一个完美的实验结果, 不仅需要优质的抗体, 同时应对整个实验流程和体系进行严格的质量控制, 才能最终达到你的实验目的 影响免疫印迹成败的一个主要因素是抗原分子中可被抗体识别的表位性质 因为涉及到抗原样品的变性, 只有那些识别耐变性表位的抗体可以与抗原结合 多数多克隆抗体中或多或少含有这种类型的抗体, 所以在免疫印迹中常选用多克隆抗体 第二个影响因素是蛋白原液中抗原的浓度 一些表达量低的蛋白在免疫印迹前常需要通过免疫沉淀, 亚细胞分离等手段富集 2

3 Western Blotting 检测操作手册 一. 实验器材 : 1. 实验器具 : 电泳仪 转膜仪 移液枪, 摇床, 暗盒, 杂交盒,AbSMARTminiblot 板 ( 货号 E1-10/15/20) 50 ml 离心管,2/4 ml EP 管 2. 实验试剂 :1 电泳缓冲液 蛋白样品 蛋白预染 marker, 2 loading buffer, 1% 丽春红,1 PBST( 含 0.1% 的 Tween-20),5% 脱脂牛奶 ( 溶于 1 PBST), 75% 酒精, 甲醇, 转膜液 (Tris- 甘氨酸 PH8.0) 二. 实验步骤 : 1. 制胶 : 按照分子克隆上面的配方, 依据实验验证蛋白的分子量大小选择制备相应浓度的 SDS-PAGE 胶 2. 蛋白样品预处理 : 已经融化的待检测蛋白样品等体积加入 2 loading buffer,100,5 min ( 注意 : 如果是膜蛋白裂解液, 不可进行高温加热操作, 置于 37 培养箱中, 温浴 30 min ) 将加热完毕的样品在室温平衡 1-2 min, 加热后的样品涡旋混匀 30 S, 然后进行离心, 在高速离心机上 rpm 2 分钟 按顺序放置在架子上待用 3. 上样 : 从 4 取出蛋白预染 marker(6% 的胶选择 Fermentas 公司的 #SM1811 的 marker; 8%, 12%, 15% 的胶选择货号 #SM0671 的 marker), 待溶解后, 按照实验需要和顺序上样 ( 样品上样量 : 以过表达 WB 实验为例, 蛋白样品浓度 >1mg/ml,20 l/ 孔 ) 每块胶上样完毕后需用 2 loading 补齐 marker 和空白的胶孔 (marker 胶孔内补 5 l, 空白胶孔内补上和左右孔相同体积 2 loading), 4 电泳 : 开始设置为恒压 150 V( 大约电流为 300mA) 待前沿( 溴酚蓝 ) 进入分 3

4 离胶 1cm 左右, 将电压调高到 180 V, 根据实验验证的蛋白大小控制电泳时间 5. 膜的活化 : 在杂交盒里倒上 1 PBST 溶液, 将适当大小的 PVDF 膜放入杂交盒中, 在摇床上 80 rpm,5 min 洗膜 然后关闭摇床, 倒去 1 PBST, 加入甲醇,40 rpm, 活化 5 min 然后倒出甲醇溶液, 先用 1 PBST 润洗一下, 再用 1 PBST 洗 3 次 每次 80 rpm,5 min 6. 转膜 : 本实验采用天能湿转转膜仪 300mA 恒流转移 1h( 客户也可根据自身蛋白大小和实验需要设置转膜电压 / 电流和转膜时间 ) 7. 丽春红预染将已转上蛋白的 PVDF 膜, 用 1% 的丽春红, 预染 2min, 以显示转膜结果 8. 封闭 : 在杂交盒里倒上 1 PBST 溶液, 将由丽春红预染的 PVDF 膜, 在摇床上 80 rpm,5 min 洗膜 ( 洗去丽春红 ), 再换新的 1 PBST 洗 3 次 每次 80 rpm, 5 min 随后倒掉 1 PBST, 在杂交盒中用 5% 脱脂牛奶, 水平摇床上 40 rpm 室温封闭 1 h 9. 一抗稀释 : 按照实验要求用 5% 脱脂牛奶稀释一抗 Abmart 为您提供优质的一抗标签抗体,His-Tag mab(2a8), Myc-Tag mab(19c2), HA-Tag mab(26d11), GFP-Tag mab(17g9), GFP-pAb, GST-Tag mab(12g8),dykddddk Tag mab(3b9) 即 FLAG 抗体, 此系列抗体最低稀释比例为 1:5000, 为您成功实验打下坚实基础! 具体货号欢迎来电来信咨询 10. 一抗孵育 : 取 320 l 已稀释好的抗体, 按照实验设计加入 AbSMARTminiblot 板 ( 货号 E1-10/15/20, 此板能够大大减少您实验时抗体的使用量, 同时很大程度上简化实验操作 ) 板中, 在摇床上, 室温反应 1h 倒出 1 PBST 时注意别把膜倒出来 4

5 11. 二抗孵育 : 先用 1 PBST,80 rpm,10min 洗膜 3 次, 按实验要求将稀释好的二抗加入相应的杂交盒中, 在摇床上 40rpm, 反应 30min Abmart 为您提供优质的二抗 : Goat Anti-Mouse-IgG-HRP,( 货号 M21001S/M21001L), Goat Anti-Rabbit-IgG-HRP( 货号 M21002S/M21002L) 此系列抗体最低稀释比例为 1:8000, 最大程度的保证您的实验成功率, 节约您 的实验成本 12. 洗涤 : 吸除剩余的二抗, 换新鲜的 1 PBST 洗 3 次, 每次 10 min 13. 曝光 : 此过程公司选用的显色系统是 GE Healthcare ECL Plus Western blotting Reagent Pack( 在模式系统用胶片可检测到 5pg 蛋白量样品, 扫描仪可检测到 40pg 蛋白量样品 ), 采取胶片手工曝光 5

6 Western Blotting Q&A Q : Western Blotting 一般用于什么样的实验? A: Western blotting 是一个用于蛋白质分析的常规技术, 它可以从蛋白混合物中检测出目标蛋白, 从而半定量或定性 ( 无法绝对定量 ) 的确定正常或实验条件下细胞或组织中目标蛋白的表达情况 另外,Western blotting 还可用于蛋白 - 蛋白 蛋白 -DNA 和蛋白 -RNA 相互作用的后续分析, 并结合组分分离技术, 检测目标蛋白的定位情况, 成为免疫荧光实验的补充 同时, 在后基因组时代, 随着质谱和蛋白质芯片等技术的不断完善, 作为一种廉价 便捷 可靠的研究工具,Western blotting 将与其他技术一起相互配合, 发挥更重要的作用 Q : Western Blotting 的实验结果如何优化? A: Western Blotting 由于实验步骤较多, 每一步操作都会对最终结果产生影响 样品制备时, 样品量多少非常重要, 如果目标蛋白的绝对量较少, 则需通过组分分离 IP 等方法进行富集 ; 上样量应适中, 过多会导致信号过强, 分辨率降低, 过少会导致信号过弱 ( 注 : 对于过表达 Western Blotting 样品制备, 有时由于转染效率低, 而使得后续实验失败, 为此,Abmart 为您提供 TranSmarter ( 货号 R10001S/R10001L) 转染试剂, 实验证明, 该转染试剂在多种哺乳动物细胞系中有着良好的转染效率, 为您实验的成功打下坚实基础!) 电泳时, 应选择合适的胶浓度和电压电流参数, 确保蛋白有效分离, 条带清晰整齐 转膜时, 应根据蛋白大小, 选择合适的转膜体系及电流参数和时间, 通过调整缓冲液成分, 提高转膜效率及蛋白与膜的结合力 封闭时, 应根据实际情况, 选择合适的封闭物和缓冲液, 以及封闭液浓度和封闭时间, 以降低非特异性反应, 达到最高的信噪比 6

7 选择抗体时, 有条件的话可以尝试多种抗体 ( 单抗 多抗, 甚至可以使用多种抗体联用 ), 不同的稀释比例 反应温度和时间, 以确定一个最佳的组合 显色时, 可以尝试不同灵敏度的显色液以及信号采集系统, 力争获得分辨率 对比度和区分度最佳的结果 Q: 如何较好地设置 Western Blotting 内参? A: 内参即是内部参照, 对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白, 它们在各组织和细胞中的表达相对恒定, 在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物 其作用是校正蛋白定量 上样过程中存在的实验误差, 保证实验结果的准确性 在 WesternBlotting 中使用内参其实就是在 WB 过程中另外用内参对应的抗体检测内参, 这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达, 由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定, 借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差, 这样半定量的结果才更为可信 此外使用内参可以作为空白对照, 检测蛋白转膜情况是否完全 整个 WesternBlotting 显色或者发光体系是否正常 常用的蛋白内参有 GAPDH 和细胞骨架蛋白 beta-actin 或 beta-tubulin 一般要选择一个在处理因素作用的条件下蛋白含量不会发生改变的蛋白作内参 为了让实验更加严谨有更说服力都要设计对照实验, 对照分为 : 阳性对照 ( 最好有标准品 ( 如 β-actin GAPDH 或阳性血清 ); 阴性对照 ( 测血时用相应小鼠未免疫血清 ( 即正常血 ); 空白对照 ( 不加一抗, 用 PBS 代替 ); 无关对照 ( 用无关抗体 ) Abmart 公司为您提供优质的内参抗体 : Actin mab(5a7),actin mab for plants(26f7),gapdh mab(3b3),gapdh pab,β -Tubulin mab(10b1), β - Actin pab,annexin A1 pab, 此系列抗体最低稀释比例为 1:5000, 是您 WesternBlotting 实验中不可缺少的抗体 具体货号欢迎来电来信咨询 7

8 Q: 我该选择什么样的抗体? A: 由于抗体及公司种类繁多, 针对同一种蛋白常常会有多种不同的抗体 首先应根据自己的实验需要 (WB,IF,IP,IHC 等 ) 进行筛选, 不同实验目的的抗体有时无法通用 ( 参照抗体说明书 ); 其次, 可以参照已发表文献中所用抗体, 或向已用实验者进行征询 ; 另外, 针对单克隆和多克隆抗体, 可根据以下标准进行选择 ; 如果目标蛋白无相应的商业化抗体, 或商业化抗体效果均不佳, 可考虑寻找合适的抗体公司进行定制 多克隆抗体 单克隆抗体 单克隆抗体群 ( 由一个免疫原产生的多个单克隆抗体混合物 ) 抗体抗原作用信号强度 极佳 由抗体的亲和力决定 ( 可能极佳或者极弱 ) 极佳 特异性 通常很好, 但有时会有非特异性相互作用 极佳, 但有时会有交叉反应 极佳 ( 由于选择可以进行 IP 且没有交叉反应的抗体组成单克隆抗体群 ) 亲和力高 ( 由于抗体可 特异性好, 亲和力高 ( 由于选择可以 优点 以与目的蛋白的多个 特异性好, 且可以无限量供应 进行 IP 且没有交叉反应的抗体组成 抗原决定蔟相互作用 ) 单克隆抗体群 ) 缺点 非特异性相互作用很难去除 需要筛选亲和力高的抗体 ; 抗原表位可能会被相互作用蛋白遮蔽 能够筛选得到的符合条件的单克隆并不多, 所以单克隆抗体群也就不容易获得 免疫沉淀效 果 由抗体的亲和力决定 ( 极佳或者极佳 ( 由于亲和力高 ) 极弱 ) 极佳 ( 由于选择可以进行 IP 且没有 交叉反应的抗体组成单克隆抗体群 ) 免疫共沉淀 效果 通常很好, 但有时非特 异性相互作用会带来 假阳性 由抗体的亲和力决定和抗原表 位是否被相互作用蛋白遮蔽决 定 ( 极佳或者极弱 ) 极佳 ( 由于选择可以成功进行 IP 且 没有交叉反应的抗体组成单克隆抗 体群 ) 染色质免疫 沉淀效果 通常很好, 但有时非特 异性相互作用会带来 假阳性 由抗体的亲和力决定和抗原表位是否被遮蔽或者以及抗原表位是否被交联实验所破坏决定 ( 极佳或者极弱 ) 极佳 ( 由于选择可以成功进行 IP 且 没有交叉反应的抗体组成单克隆抗 体群 ) 8

9 Troubleshooting for Western Blotting 问题可能原因可能采取的措施 1. 抗体浓度过高降低抗体 ( 一抗 / 二抗 ) 浓度 2. 封闭液选择不当比较不同封闭液 根据不同的体系优化封闭液 提高封闭物浓度 3. 封闭不完全 优化封闭时间和 ( 或 ) 温度, 室温下至少 1 h 或 4 过夜 在封闭液中添加终浓度 0.05% 的 Tween-20 用含终浓度 0.05% 的 Tween-20 的封闭液稀释抗体 更换封闭液 背景高且均一 4. 抗体与封闭液中其他蛋白 发生交叉反应 avidin-biotin 系统避免使用奶粉, 奶粉中含有 biotin 检测交叉反应 : 封闭一张干净的不含蛋白的膜, 抗 体孵育后检测 增加清洗次数及清洗液体积 5. 清洗不充分 如果之前未添加 Tween-20, 可添加 Tween-20 至终 浓度 0.05% 6. 曝光时间过长缩短曝光时间 确保转膜前, 已根据厂商指导将膜彻底浸润 更换新膜 7. 膜出问题 确保膜始终有足够的液体覆盖, 避免干掉 避免徒手操作, 应配戴手套, 使用镊子 每一步孵育都应确保充分 9

10 8. 缓冲液污染或长菌重新配制缓冲液 1. 抗体浓度过高降低抗体 ( 一抗 / 二抗 ) 浓度 2. 封闭液选择不当比较不同封闭液 根据不同的体系优化封闭液 提高封闭物浓度 3. 封闭不完全 优化封闭时间和 ( 或 ) 温度, 室温下至少 1 h 或 4 过夜 在封闭液中添加终浓度 0.05% 的 Tween-20 用含终浓度 0.05% 的 Tween-20 的封闭液稀释抗体 更换封闭液 背景高, 且以斑点形式存 在 4. 抗体与封闭液中其他蛋白 发生交叉反应 avidin-biotin 系统避免使用奶粉, 奶粉中含有 biotin 检测交叉反应 : 封闭一张干净的不含蛋白的膜, 抗体孵育后检测确保转膜前, 已根据厂商建议将膜彻底浸润 避免徒手操作, 应配戴手套, 使用镊子 更换新膜 5. 膜出问题 确保膜始终有足够的液体覆盖, 避免干掉 每一步孵育都应确保充分 膜过多时, 应避免相互堆叠 操作时应小心, 对膜造成的损伤会产生非特异性反 应 6. 缓冲液污染 使用新的缓冲液 用前过滤 7. 仪器污染确保转膜仪 杂交仪等仪器清洁无污染 10

11 确保转膜后膜上没有残留的胶 转膜结束后, 染胶以确定转膜效率 转膜时胶与膜应充分接触 确保转膜时滤纸与膜装配正确 按厂商指导将膜充分浸润 1. 转膜效率低 转膜体系在转膜过程中避免过热 信号弱或无信号 使用阳性对照和 ( 或 ) 分子量 marker 优化转膜时间和电流 确保在抗体杂交前的样品制备条件没有破坏样品的 抗原性 ( 注意 : 某些蛋白不能在变性条件下电泳 ) 2. 蛋白与膜结合不充分 在转膜缓冲液中添加 20% 的甲醇 低分子量的蛋白使用孔径较小的膜 3. 抗体量不足 增加抗体浓度 抗体可能已经失效, 通过点杂交确定抗体活性 4. 抗体浓度过高 抗体浓度过高会导致信号迅速减弱, 造成信号弱的 假象 5. 抗原量不足增加上样量 6. 抗原被封闭液掩盖 更换封闭液 优化封闭液浓度 7. 缓冲液中含有叠氮化钠叠氮化钠是辣根过氧化酶的抑制剂 8. 曝光时间过短延长曝光时间 9. 底物反应时间过短延长反应时间至 5 分钟 10. 底物失活检查底物活性 11

12 确保两瓶底物之间没有交叉污染 剥膜造成有些抗原丢失或变性, 优化剥膜过程 11. 剥膜造成影响 仅在必需时剥膜重杂 避免反复剥同一张膜 12. 膜上抗原降解某些封闭物具有蛋白水解活性 ( 如 gelatin) 13. 转好的膜存放时间过长重新电泳转膜 1. 抗体浓度过高降低抗体浓度 非特异性条带 2.SDS 造成非特异性结合 转膜结束后清洗膜 免疫反应过程中避免使用 SDS 3. 二抗试剂的非特异结合更换二抗 4. 一抗特异性差采用单抗或亲和纯化的抗体 弥散条带 1. 抗体浓度过高降低抗体浓度 2. 上样量过高减少上样量 条带曝空或淬灭迅速抗体浓度过高降低抗体浓度, 尤其是二抗浓度 确保在胶和膜之间没有气泡 根据厂商指导将膜彻底浸润 仅局部区域有信号 转膜不完全 避免徒手操作, 应配戴手套, 使用镊子 更换新膜 膜过多时, 应避免相互堆叠 12

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