5. Phos-tag TM 方法的原理 注意 :BTL-111 有很大的亲水空间, 所以在免疫印迹实验中灵敏度最高 6. Phos-tag TM 方法需配置的溶液 溶液 A:Tris 盐缓冲液 (10 TBS,1L,pH7.5) # Tris(0.10mol/L) 12.1g # NaCl(1.0

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1 免疫印迹法检测磷酸化蛋白 使用生物素标记的 Phos-tag TM 进行化学发光法检测 Ver.6(2012/1) 1. 背景磷酸化是翻译后修饰的一种重要形式, 与目标蛋白的功能调解 定位和特异性结合有关 检测磷酸化蛋白方法 ( 比如磷酸蛋白质组学 ) 在评估生物多样性和生理状态方面是非常重要的 2002 年,Koike 教授的团队 ( 日本广岛大学 ) 发现了一种双环的金属复合体 (1,3-bis[bis(pyridin-2-ylmethyl)amino]propan-2-olato dizinc(ii)), 该复合体可作为磷酸结合标签分子 (ph 值为中性的 Phos-tag TM 液体 ( 比如 Kd= 25 nm 的苯基磷酸二阶阴离子, Ph-OPO 3 2- )) 之后,Koike 教授的团队研发了可用于磷酸化蛋白质组学研究 Phos-tag TM 系列产品 这份操作手册是介绍在 PVDF 膜上进行电泳印迹时使用 Phos-tag TM 锌 (II) 复合物进行化学发光, 检测所有磷酸化蛋白的方法 2. Phos-tag TM BTL-104,BTL-105 和 BTL-111 的介绍 Phos-tag TM 配体,BTL-104,BTL-105 和 BTL-111 可在 PVDF 膜上高灵敏度检测磷酸化蛋白 该方法需要亲和素标记的辣根过氧化物酶 (HRP) 和化学发光检测试剂 该产品是无色固体, 对皮肤无辐射 Phos-tag TM 生物素需在冰箱保存 (4 ) 3. 警告和限制 Phos-tag TM 配体不能用于临床诊断和治疗 不能用于人或者动物的体内或者体表实验, 只能用于科研 只有经过实验室技能培训的人才能使用该产品 避免接触皮肤或者眼睛 如果接触到, 请立即用水清洗 4. Phos-tag TM 方法的优势 # 无辐射 # 不需要对 PVDF 膜进行封闭处理 # Phos-tag TM 结合的特异性与氨基酸和氨基酸序列无关 # 可进行下游的实验, 比如再用抗体进行检测或者质谱分析 # Phos-tag TM BTL 液体可在室温至少保存 6 个月 # 与 HRP 标记抗体的使用步骤基本一致

2 5. Phos-tag TM 方法的原理 注意 :BTL-111 有很大的亲水空间, 所以在免疫印迹实验中灵敏度最高 6. Phos-tag TM 方法需配置的溶液 溶液 A:Tris 盐缓冲液 (10 TBS,1L,pH7.5) # Tris(0.10mol/L) 12.1g # NaCl(1.0mol/L) 58.4g # 灭菌水 0.9L # 2mol/L 液体盐酸, 调 ph 值至 7.5 适量 # 灭菌水, 调整试剂至 1L 适量 溶液 B: 10%(v/v) 吐温 20(Tween 20) 溶液 (50ml) # 吐温 20(Tween 20) 5mL # 灭菌水 45mL 溶液 C: 1 TBS-T(1L) # 溶液 A 100mL # 溶液 B 10mL # 灭菌水 890mL 溶液 D:Phos-tag TM BTL-104 和 BTL-105 甲醇溶液 # Phos-tag TM BTL-104 或者 Phos-tag TM BTL mg # 甲醇 0.13mL 溶液 E-104&E-105:Phos-tag TM BTL 溶液 (4 避光保存 ) # 10mmol/L Phos-tag TM BTL-104: 溶液 D(0.13mL)+ 溶液 C(1.17mL) # 10mmol/L Phos-tag TM BTL-105: 溶液 D(0.13mL)+ 溶液 C(1.00mL) 溶液 E-111: Phos-tag TM BTL-111 溶液 (4 避光保存 ) # 商业化提供的产品 (1mmol/L Phos-tag TM BTL-111)

3 溶液 F:10mmol/L Zn(NO 3) 2 液体溶液 (50mL) # Zn(NO 3) 2(H 2O) 6( 分子量 :297) 0.15g # 灭菌水 50mL ( 或者使用 10mmol/L ZnCl 2 溶液 ) 溶液 G: 亲和素标记的辣根过氧化物酶溶液 # 亲和素 - 辣根过氧化物酶偶联物 (GE Healthcare Bio-Sciences: RPN1231) 7. 以 4:1 的比例制备 Phos-tag TM BTL 和亲和素标记的 HRP 的复合物 1) 将下列试剂混合后, 获得溶液 H 可在室温保存 30 分钟 # 溶液 C(1 TBS-T) 469μl # 溶液 E-104, E-105 或者溶液 E-111(Phos-tag TM BTL 溶液 )* 1 1~10μl # 溶液 F(10mmol/L Zn(NO 3) 2 ) 20μl # 溶液 G( 亲和素标记的辣根过氧化物酶 ) 1μl 2) 将溶液 H 加入到离心过滤装置 (NMWL = 30,000, Nanosep TM 30K, Pall Life Sciences) 用附带的帽子封住 3) 室温离心 (14,000 g)20 分钟 ( 去除过多的 Phos-tag TM BTL) 4) 在帽子中保留的液体 ( 制备的复合物 )(<10μl) 用 30mL 溶液 C(1 TBS-T) 稀释, 这样制备了溶液 PB-SH ( 以 4:1 的比例制备 Zn 2+ Phos-tag TM BTL 和亲和素标记的 HRP 的复合物 )* 2 多余的 Phos-tag TM BTL 在装置的底部, 不在帽子中 * 1 PB-SH 溶液中的 (Phos-tag TM BTL) 4-( 亲和素标记的 HRP) 在 4 保存 30 天 * 2 [Phos-tag TM BTL]>>4 [ 亲和素标记的 HRP] 常见问题 1 8. 用 Phos-tag TM 生物素结合亲和素标记的 HRP 检测 1) 转移了蛋白的 PVDF 膜用溶液 C(1 TBS-T) 浸泡在相应的装置中 请戴塑料手套操作 膜需要温和震荡至少 1 小时 确定膜不会和装置粘在一起 确保膜不会干 常见问题 2 & 3 2) 在塑料袋中溶液 PB-SH (ca. 1 ml/5 cm 2 ) 和膜一起孵育 袋子温和震荡 30 分钟 3) 将膜从袋中取出, 在装置中用溶液 C (ca. 10 ml/5 cm 2 ) 室温洗 2 次, 每次洗 5 分钟 ( 装置可以温和晃动 ) 确定膜不会和装置粘在一起 保证膜不会干 4) 用化学发光试剂进行显色

4 9. 转移了蛋白的 PVDF 膜再用抗体检测 溶液 K:0.5mol/L Tris-HCl 缓冲液 (1L,pH 6.8) # Tris 60.6g # 灭菌水 0.8L # 6mol/L 液体 HCl, 调 ph 值至 6.8 适量 # 灭菌水, 调整体积至 1L 液体 适量 溶液 L:10%(w/v)SDS 液体 (1L) # SDS 100g # 灭菌水, 调整体积至 1L 适量 溶液 M: 剥离 (Stripping) 缓冲液 (1L) # 溶液 K 125mL # 溶液 L 200mL # 2- 巯基乙醇 7mL # 灭菌水 668mL 1) 在装置中, 转移蛋白的 PVDF 膜用 Zn 2+ -Phos-tag TM BTL 和亲和素标记的 HRP 孵育后, 用溶液 C(1 TBS-T, 25 ml/5 cm 2 ) 浸泡 膜温和震荡至少 1 小时, 确保膜不会干 如果膜干了, 在剥离 (Stripping) 处理前用甲醇浸泡 2) 用溶液 M( 剥离缓冲液,25 ml/5 cm 2 ) 浸泡膜 膜在室温温和震荡 20 分钟 不需要加热 确定膜不会和装置粘在一起 3) 膜用溶液 C(1 TBS-T,25 ml/5 cm 2 ) 浸泡 膜在室温温和震荡 1 小时 确定膜不会和装置粘在一起 去除洗涤溶液 4) 用溶液 C(1 TBS-T,25 ml/5 cm 2 ) 浸泡膜 膜温和震荡至少 1 小时 确定膜不会和装置粘在一起 去除洗涤溶液 5) 用溶液 C(1 TBS-T,25 ml/5 cm 2 ) 浸泡膜 膜室温温和震荡 1 小时 确定膜不会和装置粘在一起 去除洗涤溶液 确定膜不会干 6) 用合适的蛋白进行封闭, 接着用抗体进行检测 之后进行化学发光检测 10. 用 Phos-tag TM BTL-104 进行斑点杂交分析样品 # 非磷酸化蛋白 : 牛血清白蛋白, 人血清, 碳酸酐酶,β- 半乳糖苷酶 # 磷酸化蛋白 : α- 酪蛋白,β- 酪蛋白, 卵白蛋白, 胃蛋白酶 # 去磷酸化蛋白 ( 用碱性磷酸酶处理 ) α- 酪蛋白,β- 酪蛋白, 卵白蛋白, 胃蛋白酶

5 膜 # PVDF 膜 (Hybond P, GE Healthcare Bio-Sciences) 化学发光检测试剂盒 # ECL TM -plus western blotting detection reagent (GE Healthcare Bio-Sciences) 仪器 化学发光图 Reprinted with permission The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. PVDF 膜上的蛋白可以特异性检测到, 可检测到 ng 级别 相应的去磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白未检测到信号 11. 用 Phos-tag TM BTL-104 进行免疫印迹二维 (2D)(IEE/SDS-PAGE) 实验 蛋白样品 ( 每份 50μg) # EGF 刺激前的 A431 细胞 ( 人表皮癌细胞 ) 裂解液 # EGF 刺激后的 A431 细胞 ( 人表皮癌细胞 ) 裂解液 化学发光图 膜 #PVDF 膜 ( Hybond P, GE Healthcare Bio-Sciences) 化学发光检测试剂盒 # ECL TM -plus western blotting detection reagent (GE Healthcare Bio-Sciences) 仪器 比较膜上的信号强度 ( 比如红圈,MW<20 kda) 和信号点的数量 ( 比如蓝圈,MW<20 kda), 我们得知 EGF 刺激后的信号更强, 信号点也更多

6 12. 用 Phos-tag TM BTL-104 进行免疫印迹二维 (2D)(IEE/SDS-PAGE) 实验 样品 # 上述实验提到的 A431 细胞经过 EGF 刺激后进行免疫印迹的膜 ( 剥离后 ) 抗体和 HRP 标价的抗体 # HRP anti-ptyr antibody (PY20, GE Healthcare Bio-Sciences) # anti-pser antibody (Rabbit-Polyclonal, Zymed Laboratories) # HRP anti-igg antibody (GE Healthcare Bio-Sciences) 化学发光检测试剂盒 # ECL TM -plus western blotting detection reagent (GE Healthcare Bio-Sciences) 仪器 化学发光图像 (A) 和叠加图像 (B&C) A: 利用 Phos-tag BTL-104 进行化学发光 B:A 图与 HRP-anti-pTyr antibody 进行化学发光的叠加图片 C:A 图与 anti-pser antibody/hrp-anti-igg antibody 进行化学发光的叠加图片 B 图和 C 图中绿色的点是使用 Phos-tag BTL-104, 红色的点是使用抗体, 绿色和红色重叠的部分呈现白色 Reprinted with permission The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 13. Phos-tag TM BTL-111 和 Phos-tag TM BTL-104 的比较 样品 # 磷酸化蛋白 β- 酪蛋白, 卵白蛋白, 胃蛋白酶 # 去磷酸化蛋白 ( 用碱性磷酸酶 (AP) 处理 ) β- 酪蛋白, 卵白蛋白, 胃蛋白酶 膜 #PVDF 膜 (Hybond P, GE Healthcare Bio-Sciences)

7 化学发光试剂盒 # Lumigen TM- TMA-6,(Lumigen) 仪器 化学发光图像 β- 酪蛋白 卵白蛋白 胃蛋白酶 上面 :β- 酪蛋白 ( ng), 经过碱性磷酸酶 (AP) 处理 12 个小时的 β- 酪蛋白 (200ng, 最右边的那道 ) 中间商 : 卵白蛋白 ( ng), 经过碱性磷酸酶 (AP) 处理 12 个小时的卵白蛋白 (200ng, 最右边的那道 ) 下面 : 胃蛋白酶 ( ng), 经过碱性磷酸酶 (AP) 处理 12 个小时的胃蛋白酶 (200ng, 最右边的那道 ) 结果显示 Phos-tag 与生物素之间的链接的长度影响免疫印迹实验中 Phos-tag 与磷酸化蛋白结合 ( 见 5. Phos-tag TM 方法 ) 14. 用 Phos-tag TM BTL-111 进行免疫印迹 1 维 (SDS-PAGE) 实验蛋白样品 ( 每份 5μg) # A431 细胞裂解液 ( 第 2 道 ) # 碱性磷酸酶处理的 A431 细胞裂解液 ( 第 3 道 ) # EGF 刺激的 A431 细胞裂解液 ( 第 4 道 ) # 碱性磷酸酶处理的 EGF 刺激的 A431 细胞裂解液 ( 第 5 道 ) # 过钒酸钠刺激的 A431 细胞裂解液 ( 第 6 道 ) # 碱性磷酸酶处理的过钒酸钠刺激的 A431 细胞裂解液 ( 第 7 道 ) # HeLa 细胞裂解液 ( 第 8 道 ) # 碱性磷酸酶处理的 HeLa 细胞裂解液 ( 第 9 道 ) # PMA 刺激的 HeLa 细胞裂解液 ( 第 10 道 ) # 碱性磷酸酶处理的 PMA 刺激的 HeLa 细胞 膜 #PVDF 膜 (Hybond P, GE Healthcare Bio-Sciences) 化学发光试剂盒 # Lumigen TM- TMA-6,(Lumigen)

8 仪器 考马斯亮蓝 (CBB) 染色和化学发光图像 不同裂解液的 10 种样品 ( 第 2~11 道 ) 和两种蛋白分子 marker( 第 1 道和第 12 道 ) 第 1 道是 APRO TM marker low orange(apro Science), 第 12 道是 Amersham marker broad range(ge Healthcare Bio-Sciences) Phos-tag TM BTL-111 可特异性检测转移蛋白的膜上的磷酸化蛋白 使用 Phos-tag TM BTL-111 分析裂解液, 无需进行膜封闭 问题 1 在溶液 E(10μl) 中的 Phos-tag TM BTL 比在溶液 G(1μl) 中的亲和素标记的辣根过氧化物酶多很多 使用少量的 Phos-tag TM BTL( 比如 1μl) 和溶液 G(1μl) 也可以得到相同的结果 客户需要自己调整溶液 E 的用量获得高灵敏度或者减少成本 如果溶液 E 的用量减少, 不需要减少 zinc(ii) 溶液 ( 溶液 F) 的用量 在使用商业化提供的磷酸化蛋白和亲和素标记的辣根过氧化物酶 (GE Healthcare Bio-Sciences) 的实验中,BTL-104 和 BTL-105 由于空间结构不一样导致检测效率有区别 问题 2 如果膜没有完全在溶液 C 中浸泡, 那背景值会比较高, 并且有斑点 而且无法观察到蛋白信号 ( 比如右边图中的白色斑点 ) 确认膜完全浸泡在溶液 C 中 问题 3 建议使用 PVDF 膜 全国代理 宝柏 中国 info@boppard.cn 北京 Tel: 上海 Tel: 广州 Tel: 香港 Tel:

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