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1 蛋白印迹技术讲座 WB Michael Wong 王士奇 Scientific Support Specialist 科学支援专家 Abcam (Hong Kong) Ltd

2 讲座内容概览 1. 什么是 western blotting? 2. 实验程序 3. 常见问题和解决方法

3 什么是 western blotting? 用电泳把细胞或组织蛋白作质量分离 Anti-GAP43 antibody - Neuronal Marker (ab12274) 使用特异性抗体来检测蛋白 分析蛋白的分子量和相对比值

4 为何使用 western blotting? 目标蛋白有没有在我的样本表达? 样本在经过 X 处理之后, 目标蛋白的表达量有否增加或减少? 目标蛋白在不同的细胞或组织的表达量是否有差异? 医学诊断 : WB 可以用作检测莱姆病 (Lyme disease), 疯牛病 (Mad cow disease), 艾滋病毒 (HIV) 确认

5 讲座内容概览 1. 什么是 western blotting? 2. 实验程序 3. 常见问题和解决方法 4. 兔源单克隆抗体 (RabMAb)

6 样本的准备 跟据目标蛋白提取的难易度选择合适的裂解液 确保目标蛋白能被顺利溶解出来 NP-40 lysis buffer: 150 mm sodium chloride, 1% NP-40, 50mM Tris, ph8.0 RIPA lysis buffer: 150mM sodium chloride, 1% NP-40 or Triton X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 50mM Tris, ph 8.0

7 样本的准备 裂解之后, 检测样本的蛋白含量并加入上样液 (SDS-PAGE buffer) 最常用 : 还原及变性的缓冲液 (e.g. Laemmli buffer) 将多肽套上负电 使蛋白变性并将多肽拉直 将二硫键打断 使抗原表位暴露出来 Laemmli 2X buffer 4% SDS 10% beta-mercaptoethanol 20% glycerol 0.004% bromophenol blue 0.125M Tris-HCl

8 凝胶上样 µg 全细胞裂解液 or 100 ng 纯化蛋白 每条泳道上相同蛋白量 根据目标蛋白的表达量优化上样量 Back glass plate Comb Spacer Front glass plate Polyacrylamide gel Casting stand

9 Current 凝胶电泳 (SDS-PAGE) Polyacrylamide gel: polymerization of acrylamide and N,Nmethylenebis-acrylamide (Bis, for short) 蛋白从阴极 (-) 移到阳极 (+) 和根据蛋白的大小来分离 - + Dye Front

10 凝胶电泳 (SDS-PAGE) 使用不正确的凝胶浓度会造成较差的蛋白分离 优化跑胶时间, 避免跑胶过快或过热

11 蛋白转膜 凝胶 ( 带有已分离的蛋白 ) 与将转的膜紧贴放置 (PVDF or Nitrocellulose) 使用电流把蛋白从凝胶转到膜上

12 封闭 膜上未有蛋白黏附的区域需要被封闭以防止抗体的非特异性结合 常用的封闭剂 脱脂奶粉 BSA 脱脂奶粉室温封闭一小时

13 封闭 膜上未有蛋白黏附的区域需要被封闭以防止抗体的非特异性结合 常用的封闭剂 脱脂奶粉 BSA

14 第一和第二抗体孵育 一抗特异性地检测目标蛋白 二抗辨认一抗的恒定区 ( 物种特异的 ) 一抗 : 室温 1-2 小时孵育或 4 度过夜孵育 二抗 : 室温 1-3 小时孵育

15 检测及染色 二抗带有标签, 用作检测 常用 : 辣根过氧化物酶 (HRP) 或碱性磷酸酶 (AP) 底物和酶反应释放出可检测的产物 放射自显影, 化学发光, 显色反应是最常用 也可以选用直接标签的一抗 Substrate Secondary antibody Detectable product/conjugate Primary antibody Antigen on membrane

16 实验流程影片 示范 WB 的主要步骤 样本的准备 电泳 转膜 检测

17 理想结果 条带清楚 正确的分子质量 没有非特异性条带 在不同的样本也可以出相似的结果 Lane 1 : 293T cell lysate Lane 2 : HeLa cell lysate Lane 3 : HepG2 cell lysate Lane 4 : HUVEC cell lysate Lane 5 : MCF7 cell lysate Lane 6 : SH SY5Y cell lysate Anti-GAPDH antibody [EPR6256] (ab128915) Predicted band size : 36 kda

18 讲座内容概览 1. 什么是 western blotting? 2. 实验程序 3. 常见问题和解决方法 4. 兔源单克隆抗体 (RabMAb)

19 常见问题及解决方法 问题 : 没有信号 目标蛋白的量不足 上样量不足 目标蛋白本身在细胞里的表达量很低 富集步骤 ( 例如 : 核裂解液 诱导表达 ) 使用了不正确的裂解液导致目标蛋白无法被溶解

20 常见问题及解决方法 问题 : 没有信号 蛋白没有被顺利转到膜上 可以使用丽春红 (Ponceau Red) 染膜检查 气泡阻隔 使用过高电流 膜孔过大 大分子质量蛋白转膜 (>100kDa) 较慢的转膜速度 倾向于沉淀 SDS/ Methanol ratio 在转膜缓冲液的比例

21 常见问题及解决方法 问题 : 没有信号 膜的过度清洗 过度封闭 抗体孵育浓度过低 二抗不相配 检测试剂盒过期或底物失效

22 常见问题及解决方法 问题 : 高背景 封闭上的问题 封闭不足 在抗体稀释液中加入封闭剂 抗体和封闭剂交叉反应 磷酸化特异性抗体检测到牛奶里的酪蛋白 (casein) 使用其它封闭剂, 例如 BSA

23 常见问题及解决方法 问题 : 高背景 抗体孵育浓度过高 抗体孵育温度过高 二抗的非特异性结合 可用不加一抗的对照实验来检验 清洗不足

24 常见问题及解决方法 问题 : 多重条带 / 非特异性条带 过分上样 目标蛋白降解 没有加入蛋白酶及磷酸酶抑制剂 样本保持在不适当的温度 一抗的非特异性结合 孵育浓度过高 可以使用封闭肽 (blocking peptides) 检视 使用经亲和纯化 (affinity purified) 的抗体 封闭不足 清洗不足

25 常见问题及解决方法 问题 : 多重条带 / 非特异性条带 二聚体 / 多聚体的形成 确保还原 / 变性条件 亚型 / 剪接变异体 查看相关文献及蛋白资料库, 了解蛋白背景资料

26 常见问题及解决方法 问题 : 观察到的条带分子质量大小于预测的不符 翻译后修饰 (e.g. phosphorylation, glycosylation etc.) 翻译后剪切 (e.g. pro-proteins and active form) 剪接变异体 相对电荷, 氨基酸的组成 二聚体 / 多聚体的形成 尽量了解您的目标蛋白 ( 一般 10-15% 的差距可以接受 )!

27 常见问题及解决方法 问题 : 不均匀的染色 孵育时要搅拌 细菌污染

28 常见问题及解决方法 问题 : 涂抹的条带 过分上样 蛋白降解

29 实验改进案例 1- 檢測 ADAM10 Protein information: Function: Cleaves the membrane-bound precursor of TNF-alpha at '76-Ala- -Val-77' to its mature soluble form. Responsible for the proteolytic release of several other cell-surface proteins, including heparin-binding epidermal growth-like factor, ephrin-a2 and Post-translational modifications: The precursor is cleaved by a furin endopeptidase Cellular localization: Cell membrane

30 实验改进案例 1- 檢測 ADAM10 Antibody information: Name: anti-adam10 antibody (Catalogue No: ab1997) Description: Rabbit polyclonal to ADAM10 Cross reactivity: Mouse, Human Immunogen: Synthetic peptide, corresponding to amino acids of Human ADAM10 Tested in WB (1/500-1/2000, predicted MW: 84kDa)

31 实验改进案例 1- 檢測 ADAM10 Problem: high background, many non-specific bands Protocol: Sample: Human SH-SY5Y cell lysate Protein loaded: 100ug Lysis buffer: RIPA Protease inhibitors: PMSF Blocking: 5% non-fat milk for 4hr at RT Antibody incubation: Primary: 1:1000 in TBST overnight at 4 ºC Secondary: 1: 2000 in TBST for 1.5hr at RT Washing: 10min in TBST for 3 times Optimization 1. Load 20 ug/lane protein 2. Protease inhibitor cocktail 3. Block for 1-2hr at RT/Add 3% blocking agent in antibody diluent/use BSA instead 4. 1 st ab 1:2000; 2 nd ab 1: Wash 6 times each 5min 6. No primary control

32 实验改进案例 2- 檢測 SC35 Protein information: Function: Necessary for the splicing of pre-mrna. It is required for formation of the earliest ATP-dependent splicing complex and interacts with spliceosomal components bound to both the 5'- and 3'-splice sites during spliceosome assembly. Post-translational modifications: Extensively phosphorylated on serine residues in the RS domain. Cellular localization: Nucleus

33 实验改进案例 2- 檢測 SC35 Antibody information: Name: anti-sc35 antibody [SC- 35] (Catalogue No: ab88720) Description: mouse monoclonal [SC-35] to SC35 Cross reactivity: human, Xenopus laevis, fruit fly (Drosophila melanogaster) Immunogen: preparation of partially purified mammalian spliceosomes Tested in WB (use at an assay dependent dilution, predicted MW: 26kDa)

34 实验改进案例 2- 檢測 SC35 Problem: no bands Protocol: Protein loaded: 20ug Lysis buffer: TAE Protease inhibitors: protease inhibitor cocktail Sample heating: 95 ºC for 5min Blocking: 5% non-fat milk for 3hr at RT Antibody incubation: Primary: 1:1000 for 2hr at 25ºC Secondary: 1: 5000 for 40min at 37 ºC Optimization 1. Increase protein loading amount 2. Use RIPA lysis buffer 3. Heat 100 ºC for 10min 4. Block with 5% BSA 5. Incubate with 1:1000 primary antibody overnight at 4C 6. Increase 2 nd antibody incubation time 7. HeLa cell as positive control

35 search for Optiblot product Related Western blot products Prism Protein Ladders 4 x multicoloured pre-stained protein ladders which can be used for estimating molecular weight of a protein or Western blot transfer efficiency. Further information: Mitosciences WB Antibody panels Antibodies optimized and premixed for Western blot analysis For detailed information:

36 问题? Website: ( 一般产品查询 ) 或联络本公司在您当地的授权代理商 ( 实验咨询或产品投诉 )

37 谢谢!

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