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肉毓熊
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1 Western Blotting 实验操作指南 2015 年 3 月修订版提高实验效率! 目录 Western Blotting 检测的操作方法及注意事项 1. 电泳 (SDS-PAGE) 2. 转膜 3. 封闭 4. 一抗反应 5. 二抗反应 6. 检测 ( 化学发光法 ) Troubleshooting Western Blotting 关联试剂 HRP 底物 (Luminol) 发光 HRP 标记二抗

2 本手册旨在表明利用 Western Blotting 技术检测蛋白质时的操作要点 Western Blotting 技术是将蛋白质样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后, 转移到固相载体 ( 例如纤维素薄膜 ) 上, 利用抗原抗体反应来检测目的蛋白的方法如果整个实验过程中每一个实验步骤都能成功, 就可以获得很好的实验结果本手册按照 Western Blotting 实验操作流程, 对各步骤的操作方法和注意事项进行了通俗易懂的说明和介绍另外, 本手册中的 Troubleshooting( 故障排除 ) 可为您解决实验操作中遇到的各种问题操作流程一二抗抗反反应应 Western Blotting 检测的操作方法和注意事项 1 电泳 1 电泳前的注意事项凝胶的选择 (SDS-PAGE) 1.5 hr 样品制备凝胶电泳分为 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 等电聚焦电泳二维电泳 Western Blotting 通分子量 Marker 的选择常使用 SDS-PAGE 设立对照样品设立比对样品 2 转膜 2 转膜前注意事项转膜仪的选择半干法 1.5 hr 湿法过夜蛋白质从 SDS 聚丙烯酰胺凝胶转移膜的选择到膜上蛋白质的转膜一般使用电转移 Western Blotting 实验操作手册如果已知目的蛋白的分子量, 选择的分离胶浓度应使蛋白质的迁移位置在中央如果是未知分子量的蛋白质样品, 使用梯度凝胶通常将检测样品还原处理后再进行凝胶电泳, 但经 DTT 及巯基乙醇等处理的蛋白质立体结构会发生变化, 有可能抗体不能很好的识别特定的位点, 就不能结合上去应同时对非还原处理的样品进行凝胶电泳为了确认转膜是否正确, 应选择有色分子量 Marker 但使用有色 Marker 时, 蛋白质会与色素结合, 不适用于准确分子量的测定估算分子量时请选择适合的荧光 Marker 为了验证凝胶电泳及转膜正常进行, 检测样品应同时与阴性对照和阳性对照同时进行凝胶电泳和转膜因转膜效率及检测体系不同, 在不同膜上截留的蛋白会存在差异, 应将比对样品和检测样品在同一个凝胶上进行电泳转膜仪分为半干转膜仪和湿电转膜仪湿法转膜法转膜效率高且转膜均匀, 但使用的电转液液量多, 需边冷却边转膜, 转膜时间长而半干转膜法转膜时间短, 只需要少量的电转液因高分子量蛋白质及碱性蛋白质转膜效率低, 适合使用湿电转膜仪常用的转移膜主要有 PVDF 膜 (Polyvinylidene-Fluoride) 和硝酸纤维素膜 PVDF 膜与目的蛋白的结合能力高, 灵敏度高, 不易破碎, 同时也适用于再次标记 (Reprobing)(PVDF 膜使用前需浸泡在甲醇中仪增加膜的亲水性 ) 而硝酸纤维素膜虽不需要浸泡但极易破碎

3 3 封闭洗涤 4 一抗反应洗涤 5 二抗反应洗涤 1.0 hr 以上 or 过夜为了防止蛋白检测用抗体非特异性与膜结合, 对未结合蛋白的膜区域进行封闭很重要根据需要 Western Blotting 操作过程中需洗膜, 洗膜可除去未反应的试剂, 抑制背景 1.0 hr 以上 or 过夜使用一抗进行目的蛋白的检测 6 检测 ( 化学发光显色 ) 0.5 hr 1.0 hr 使用二抗进行一抗的检测二抗反应前应进行点杂交预实验, 研讨二抗的正确使用量 0.5~1.0 hr 检测方法有化学发光法和显色法显色法操作简便, 但化学发光检测法检测灵敏度高, 一般经常使用化学发光检测法化学发光检测法是利用底物被二抗的 HRP 分解时生成的有色物对目的蛋白的有无及蛋白量进行检测 3 封闭前的注意事项膜标记好正反面转膜后有时会分不清膜的正反面凝胶电泳时使用有色分子量 Marker 或转膜后可在膜上稍微剪断一个角 ( 可自由决定剪断方向 ) 封闭剂的选择有时特定的封闭剂达不到预期的封闭效果另外封闭时间过长会抑制抗原抗体反应及标记抗体的酶活性, 应准备几种封闭剂进行点杂交预研讨实验选择合适的封闭剂注意避免让膜变干洗涤时的注意事项洗涤液的选择一般使用 PBS 或 TBS 缓冲液根据目的蛋白和检测试剂选择洗涤液选择不含抑制 HRP 的叠氮化钠的洗涤液比较好磷酸化蛋白质适合使用 TBS 缓冲液或含 Tween20 的 TBS 缓冲液添加 Tween20 根据需要在洗涤液中添加 Tween20( 终浓度为 0.05%), 洗涤液的用量能够浸没膜即可 4 一抗反应时的注意事项一抗的选择抗体有识别 1 个抗原决定簇的单克隆抗体和识别多个抗原决定簇的多克隆抗体另外有的抗体识别一级结构, 有的抗体识别立体结构, 后者不能与变性或还原的蛋白质结合制备抗体时, 如果免疫原是变性蛋白, 那么制备的抗体只能与变性蛋白结合, 不能与天然蛋白质结合用于 Western Blotting 的一抗一般都有销售购买抗体时要考虑以上几点, 选择抗体时, 对同一个抗原的不同类型抗体在产品数据上进行详细调查后再购买, 尽量使用特异性高的单克隆抗体反应方法减少失败的最好方法是将高度稀释的低浓度抗体溶液添加到托盘中, 放入膜后,4 缓慢摇动过夜反应如果抗体使用量有限制建议使用杂交袋, 使用杂交袋时要确保不能有气泡 5 二抗反应时的注意事项二抗的选择可从不同宿主获得的二抗, 如果背景较高, 使用另一种宿主的二抗可减少背景还销售宿主以外的对动物种属来源血清蛋白进行吸收操作的抗体确认动物种属后根据检测方法选择合适的抗体一般使用 HRP( 辣根过氧化物酶 ) 标记的二抗进行化学发光检测的方法其它还有使用 AP( 碱性磷酸酶 ) 标记抗体 ( 对发光物质进行检测 ) 荧光物质及放射性同位素标记的二抗 6 化学发光检测时的注意事项按照各试剂的操作流程进行重复操作, 研讨最佳实验条件将转膜后的膜放置在保鲜膜上, 将检测试剂滴加在膜上, 确保试剂均匀覆盖在膜上因目的蛋白的浓度和使用的抗体浓度不同, 胶片曝光条件也不同, 因此要进行预研讨实验在发光持续时间内可改变胶片曝光条件进行多次检测去除抗体 (stripping) 和重复检测 (reprobing) 使用专用缓冲液从膜上可将一抗二抗和检测试剂除去后可在同一膜上进行目的蛋白和其它蛋白的再次检测, 可对检测条件及最佳检测条件进行研讨 Western Blotting 实验操作手册 -2-

4 Western Blotting Troubleshooting 有污渍或斑点, 整体背景普遍偏高洗膜不充分抗体浓度过高曝光时间过长封闭不充分原因增加洗涤液量和洗涤次数解决方法使用含 Tween20 的洗涤液时添加 Tween20 使其终浓度为 0.05% ( 注 :Tween20 浓度过高, 蛋白质会从膜上溶解分离 ) 一抗二抗浓度过高, 会产生高背景降低抗体浓度缩短胶片曝光时间更换合适的封闭剂检测系统不同所适用的封闭剂也不同提高封闭剂中的蛋白浓度摸索最佳封闭时间和温度至少在室温下封闭 1 小时以上或 4 过夜封闭在封闭液中添加 Tween20( 终浓度为 0.05%) 使用杂交袋进行抗体反应时, 杂交袋内有残留气泡封闭剂与一抗或二抗有交叉反应使用的封闭剂不适合 HRP 标记抗体发生凝集使用的膜有问题实验器具有污染缓冲液有污染在密封杂交袋前确保完全除去气泡不要一次完全密封, 在密封处留出一小部分, 可完全排除气泡更换封闭剂因脱脂奶中含有生物素, 不可用于生物素 - 亲和素检测系统的膜封闭进行与封闭剂的交叉反应实验新的膜封闭后, 使用实验中使用的抗体进行反应, 再使用实验中使用的检测试剂 ( 底物 ) 进行检测降低 HRP 耦联物的浓度研讨并更换不同的封闭剂 HRP 标记抗体发生凝集, 会形成斑点使用 0.2 μm 滤器进行过滤使用新的质量好的抗体按照生产厂家的操作流程进行操作, 确保膜保持湿润使用新的膜防止膜干燥操作过程中要确保膜浸泡在充分的反应液中反应时要保持摇动使用膜时要慎重膜受损会产生背景不要直接用手取膜, 取膜时请戴干净的手套或使用镊子电泳槽转膜仪及抗体反应时所使用的托盘要保持清洁, 注意要防止异物混入制备新的缓冲液使用缓冲液前需过滤出现白色条带抗体浓度过高降低抗体浓度, 特别要降低 HRP 标记抗体的浓度 HRP 量过多会出现白色条带出现非特异性条带抗体浓度过高 SDS 对蛋白质的非特异性吸附降低抗体浓度转膜后要洗涤膜免疫分析过程中避免使用 SDS -3- Western Blotting 实验操作手册

5 信号弱或无信号 IB RD Western BLoT Immuno Booster( 制品 code T7111A) 可有效改善结果 Western BLoT Rapid Detect v2.0( 制品 code T7122A) 可有效改善结果原因解决方法蛋白质转膜不成功 IB RD 转膜后, 凝胶染色查看转膜效率 ( 注 : 蛋白质染色后, 有可能不能检测出少量的抗原 ) 转膜时, 注意要确保凝胶与膜完全接触注意转膜仪组装是否正确, 确认电极的方向和凝胶与膜的放置顺序按照生产厂家的操作流程进行操作, 确保膜保持湿润电转移过程中要避免转膜仪变热添加阳性对照或分子量 Marker 摸索最佳转膜时间和电流样品制备过程中要确保不要丢失样品的抗原性 ( 一部分蛋白质在非还原条件下有时不能被电泳 ) 目的蛋白质量较差 IB RD 增加蛋白电泳量抗体量不充分 IB RD 有可能目的蛋白对应的抗体亲和性较弱提高抗体浓度抗体活性有可能下降 Dot blot 试验确定抗体活性标记抗体失活使用不含有叠氮化钠的抗体叠氮化钠抑制 HRP 活性发光底物劣化调查底物活性可以少量调制 working solution, 暗室内加入少量 HRP 标识抗体观察是否有蓝光出现如果没有蓝光出现, 说明底物或 HRP 标识抗体已经劣化注意装有试剂的瓶子不要出现污染保存的底物试剂与其他试剂混合, 也有可能导致底物劣化进行了 stripping 和 reprobing 进行 stripping 时, 有可能导致目的蛋白剥落或变性优化洗膜方法只在必要时进行 reprobing 尽量避免在同一张膜上进行重新标记封闭后目的蛋白被屏蔽研讨其他种类的 blocking buffer 优化 blocking buffer 的蛋白浓度发光底物反应时间过短优化发光底物反应时间调查基础试剂活性曝光时间过短延长曝光时间膜上的抗原分解 Blocking 用试剂的成分中有可能含有蛋白酶活性 ( 例 : 明胶 ) 膜上保存的蛋白质分解制作新的探针膜上部分无信号转膜不完全转膜时, 注意要确保凝胶与膜完全接触不要有气泡按照生产厂家的操作流程进行操作, 确保膜保持湿润不能徒手操作, 一定戴干净的手套, 使用镊子操作使用新的膜为了使膜的温育过程中不相互重叠, 多个膜要分开温育, 样品制备过程中要确保不要丢失样品的抗原性条带扩散抗体浓度过高电泳用的蛋白量过高下调抗体浓度减少电泳的蛋白量 Western Blotting 实验操作手册 -4-

6 Western Blotting 用试剂 <1> 1 电泳 (SDS-PAGE) 分子量 Marker CLEARLY Protein Ladder (Unstained) 500 μl 3453A 1,040 CLEARLY Stained Protein Ladder 500 μl 3454A 940 电泳 Buffer Tris-Glycine Buffer( 即用型粉剂 ) 制品名称 Buffer 配置量包装量制品 code 价格 ( 元 ) Tris-GlycineBuffer(TG) Powder,PH8.3 1 包溶解于蒸馏水后配成 1 L 的 TG Buffer 终浓度 :25 mm Tris 192 mm Glycine 10 Pouches (for 10L) T Tris-Glycine-SDS Buffer (TG-SDS)Powder,pH8.3 1 包溶解于蒸馏水后配成 1 L TG-SDS Buffer 终浓度 :25 mm Tris 192 mm Glycine 0.1%SDS 10 Pouches (for 10L) T 转膜膜 (PVDF 硝酸纤维素膜) 转膜 buffer 3 封闭 Blocking Buffer... 除酪蛋白 BSA 以外, 还建议使用下面的制品使用鱼来源酪蛋白作为封闭剂即用型 (ready-to-use) 与脱脂奶粉 BSA 等动物来源封闭试剂相比, 鱼来源酪蛋白与动物来源抗体的非特异性交叉反应非常低, 可进行清晰的检测 Western BLoT Blocking Buffer(Fish Gelatin) 1 L T7131A 600 全部组份为化学成分的无蛋白封闭剂即用型 (ready-to-use) 最大限度抑制非特异性信号比一般使用的脱脂奶粉检测灵敏度高除一般检测样品外, 也可有效检测磷酸化蛋白质 Western BLoT Blocking Buffer(Protein free) 500 ml T7132A 1, Western Blotting 实验操作手册

Western Blotting 用试剂<2> ④ 一抗反应洗涤请查询本公司官方网站各种一次抗体 HRP标记二次抗体 ⑤ 二抗反应洗涤预混型洗涤Buffer 片剂 Buffer配置量包装量 Phosphate Buffered Saline with Tween 20(PBS-T) Tablets, ph7.

7 Western Blotting 用试剂<2> ④ 一抗反应洗涤请查询本公司官方网站各种一次抗体 HRP标记二次抗体 ⑤ 二抗反应洗涤预混型洗涤Buffer 片剂 Buffer配置量包装量 Phosphate Buffered Saline with Tween 20(PBS-T) Tablets, ph7.4 1 tablet溶解于蒸馏水后配成1 L 的PBS-T Tris Buffered Saline with Tween 20(TBS-T) Tablets, ph7.6 1 tablet溶解于蒸馏水后配成 500 ml的 TBS-T 制品名称制品code 价格(元) 100 tablets T9183 2, tablets T9142 2,060 推荐试剂-1 抗原抗体反应促进剂即使使用少量抗体也可有效进行抗体反应信号弱或无信号想提高信号强度满足这些需求 Western BLoT Immuno Booster/ Immuno Booster PF Immuno Booster作为抗体稀释液相比于一般方法检测灵敏度提高了几倍几十倍抗体反应时使用可提高检测灵敏度制品名称 Western BLoT Immuno Booster Western BLoT Immuno Booster PF 最适封闭条件包装量制品code 价格(元) 无特殊条件各 250 ml T7111A 1, ml T7115A 1,630 无蛋白 Western BLoT Immuno Booster PF是完全化学成分的无蛋白的促进抗原抗体反应的试剂无蛋白条件时的专用试剂建议封闭剂也使用无蛋白的封闭剂无蛋白试剂适用于磷酸化蛋白的检测样品含有的特殊蛋白质的检测及防止试剂来源蛋白质混入到反应体系中使用 Immuno Booster 可提高检测灵敏度 Human Transferrin 抗体稀释液 50 TBS-T Western BLoT Immuno Booster A公司反应促进剂 Western BLoT Immuno Booster PF 曝光5分钟 ng 封闭剂 Western BLoT Blocking Buffer (Protein Free) (制品code T7132A) 一抗 Goat anti-human Transferrin affinity purified (终浓度 0.5 μg/ml) 二抗 Affinity Purified Antibody Peroxidase Label Rabbit anti-goat IgG(H+L) 底物 Western BLoT Chemiluminescence HRP Substrate (制品code T7101A) 洗涤液 TBS-T 本公司比较数据 Western Blotting实验操作手册 -6-

0 50 次 T7122A 3,170 6 化学发光检出用 HRP 基质 Western BLoT HRP Substrate 系列 Western BLoT Chemiluminescence HRP Substrate Western BLoT Quant HRP Substrate 可使用的膜 PVDF 硝酸纤维素膜检出 Chemiluminescence :X 光底片 Quant

8 Western Blotting 用试剂 <3> 推荐试剂 -2 快速高灵敏度检测试剂满足这些需求 Western BLoT Rapid Detect v2.0 替代 HRP 标记二抗, 可快速高灵敏度检测! 想在短时间内有效进行抗体反应想节省准备各动物种属 HRP 标记二抗的时间信号弱或无信号, 想提高信号强度转膜后 1 小时内可完成检测 (Rapid 操作流程 ) 提供各种提高检测灵敏度的操作流程以 Rapid Dectect 代替 HRP 标记二抗, 不需要准备各种动物种属的 HRP 标记二抗 Western BLoT Rapid Detect v 次 T7122A 3,170 6 化学发光检出用 HRP 基质 Western BLoT HRP Substrate 系列 Western BLoT Chemiluminescence HRP Substrate Western BLoT Quant HRP Substrate 可使用的膜 PVDF 硝酸纤维素膜检出 Chemiluminescence :X 光底片 Quant Hyper Ultra Sensitive:CCD camera X 光底片制品名称特点包装量制品 code 价格 ( 元 ) 与其他公司同等产品相比, 信号更清晰检出界限 pg 级可长时间持续稳定发光高感度的定量性检出界限低 pg 级 7 ml 250 ml ( 1) 500 ml 7 ml ( 2) 200 ml T7101Q 120 T7101A T7101B (A 2) T7102Q T7102A T7102B (A 2) 1,600 3, ,050 4,100 Western BLoT Hyper HRP Substrate 即使少量抗体也能很好检出检出界限中 fg 级 7 ml ( 2) 200 ml T7103Q T7103A T7103B (A 2) 120 2,500 4,990 Western BLoT Ultra Sensitive HRP Substrate 本系列中灵敏度最高检出界限低 fg 级 20 ml ( 2) 200 ml T7104Q T7104A T7104B (A 2) 1,290 4,130 8,260 1: 2 种溶液各 125 ml 混合后调成反应液 (250 ml) 可检出面积约 2,500 cm 2 的膜 2: 2 种溶液各 50 ml 混合后调成反应液 () 可检出面积约 1,000 cm 2 的膜清晰的发光信号 Western BLoT Chemiluminescence HRP Substrate( 制品 code: T7101A) 与其他公司同等品 HRP 底物产品, 检出 HRP 标记二抗 (39 ~5,000 pg), 结果见右图抗体 :Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Peroxidase conjugated 膜 : 硝酸纤维膜使用 WesternBLoT Chemiluminescence HRP Substrate, 可检出非常清晰的信号 ( 曝光时间 5 秒使用 X 光底片 : 本公司比较数据 ) T7101A A 公司二抗量 (pg) 5,000 2,500 1, Western Blotting 实验操作手册

9 Western Blotting 用试剂 <4> Western BLoT Rapid Detect v2.0 (Code No.T7122A) 的详细介绍 Western BLoT Rapid Detect v2.0 是以独特的 HRP 标记 lgg Detector 作为标记二抗, 是检测一抗的 Western Blotting 专用检测试剂本制品的主要组份是 lgg Detector, 一个粒子表面固定约 100 个蛋白分子, 能与抗体的 Fc 片段相结合, 并标记上了约 50 个 HRP 分子试剂中含有的 lgg Detector HRP 利用这种特别设计的 HRP 标记颗粒, 使用 Western BLoT Rapid Detect v2.0 实现了一般 Western Blotting 法无法实现的快速检测高灵敏度检测和多种抗体的同时检测 lgg Detector 替代 HRP 标记二抗可缩短实验时间! v2.0 同以往制品相比, 处理更简便检测灵敏度更高迅速转膜后 1 小时即可完成检测 (Rapid 操作流程参照右图 ) Rapid 操作流程目的蛋白 Y 抗体 1 封闭一般方法 60 分 Rapid 操作流程 5 分钟转移了蛋白的 PVDF 膜 2 一抗反应 3 洗涤 60 分 30 分 30 分钟不要封闭 (5 分钟 ) 4 二抗反应 60 分不要 5 洗涤 6 检出 1~5 所需时间 30 分检测用底物 240 分钟 25 分钟 HRP 检测用底物 60 分钟 Y + 本试剂一抗 (HRP 标记物 ) 一抗和本试剂混合后进行抗体反应 (30 分钟 ) 使用方法简便一抗反应时仅需将本试剂和一抗混合 (Rapid 操作流程 ) 无需使用各动物种属的 HRP 标记抗体除 Rapid 操作流程外, 还提供提高检测灵敏度的其他各种操作流程 2 step 高灵敏度操作流程 ( 参照下面的使用例 ) 增强二抗检测灵敏度的操作流程重复检测增强检测灵敏度的操作流程 Y Western BLoT HRP Substrate 系列进行检测 Y 洗涤 (5 分钟 5) HeLa 细胞裂解液中的 β-actin 和 GAPDH 检测 (2 step 高灵敏度操作流程 ) 电泳转膜封闭一抗反应与本试剂反应检出方法以 Hela 细胞裂解液为检测样品进行电泳和 PVDF 转膜后使用 Western BLoT Blocking Buffer (Protein Free) (Code No. T7132A) 进行了封闭一抗反应时, 使用小鼠抗 β-actin 抗体小鼠抗 GAPDH 抗体反应 1 小时, 然后再使用本试剂或二抗反应 1 小时 1 抗 β-actin 抗体 + 抗 GAPDH 抗体本试剂 2 抗 β-actin 抗体本试剂 3 抗 GAPDH 抗体本试剂 4 抗 GAPDH 抗体 HRP 标记二次抗体检测时使用 Western BLoT Chemiluminescence HRP Substrate(Code No.T7101A) 在 CCD 相机上曝光 5 分钟结果从 123 可以看出即使同时检测多种抗原, 也与检测 1 种抗原的检测结果相同从 34 可以看出使用本试剂的检测结果与使用二抗的一般 Western Blotting 的检测结果相同 β-actin GAPDH (μg) Western Blotting 实验操作手册 -8-

TALON Resin 的优点 H2C 采用对组氨酸重复序列高特异性吸附的Co2+ COO- 高产量高纯度 Carrier Bead 4个配位基团螯合固定Co2+ N COO- HC N Co2+ N COO- HC 2 避免金属离子脱落 N N 在多种条件下纯化蛋白质样品即使在6 M盐酸胍变性条件下也可以纯化得到高产量高纯度的蛋白质 TALON

$5 kda) 在不同浓度的b-ME条件下采用 TALON Resin 纯化目标蛋白质偶数泳道 20 μl非吸附样品奇数泳道 5 ml洗脱产物 9 plyss中slyd蛋白质 (27 kda) 的非特异吸附情况,结果如下变性条件 TALON Resin Eluted fractions 1 2 3 Wash Wash KDa Load NI-NTA$ $Eluted fractions 1 2 3 43 Ni 2+ -NTA Resin 对 SlyD 蛋白质有非特异性吸附 29 * 18.4 83 * 6 His-DHFR 49 SlyD 造成纯化产物中混入杂蛋白质 32.$ Resin 均没有发生非特异性的吸附 32.

concentration (mm) His60 Ni SuperflowTM Resin 的特点更高的组氨酸标签融合蛋白结合量 60 mg融合蛋白/ml 树脂可以进行FPLC纯化蛋白质结合量 60 mg组氨酸标签融合蛋白质/ml树脂 (基于6 HN-AcGFP1纯化) 树脂类型树脂结构树脂珠直径 6 %交联的琼脂糖在变性和非变性条件下纯化

10 TALON Resin 的优点 H2C 采用对组氨酸重复序列高特异性吸附的Co2+ COO- 高产量高纯度 Carrier Bead 4个配位基团螯合固定Co2+ N COO- HC N Co2+ N COO- HC 2 避免金属离子脱落 N N 在多种条件下纯化蛋白质样品即使在6 M盐酸胍变性条件下也可以纯化得到高产量高纯度的蛋白质 TALON 树脂组氨酸标签蛋白质 TALON Resin 具有高特异性吸附的特性 TALON Resin 不会发生非特异性吸附 TALON Resin 只结合目标蛋白质 Ni -NTA Resin常会发生非特异性吸附的情况而TALON 2+ 0 mm Resin则几乎不会吸附组氨酸标签融合蛋白质以外的蛋白质 KDa 1 比较Ni2+-NTA Resin和TALON Resin对细菌株BL21 (DE3) mm 20 mm 30 mm 收集2 ml大肠杆菌裂解液中的n-末端融合6 His-DHFR (19.5 kda) 在不同浓度的b-ME条件下采用 TALON Resin 纯化目标蛋白质偶数泳道 20 μl非吸附样品奇数泳道 5 ml洗脱产物 9 plyss中slyd蛋白质 (27 kda) 的非特异吸附情况,结果如下变性条件 TALON Resin Eluted fractions Wash Wash KDa Load NI-NTA Eluted fractions Ni 2+ -NTA Resin 对 SlyD 蛋白质有非特异性吸附 29 * * 6 His-DHFR 49 SlyD 造成纯化产物中混入杂蛋白质非变性条件下TALON Resin 纯化蛋白质 TALON Resin Ni-NTA 非变性条件 TALON Resin Eluted fractions Wash Wash Load NI-NTA Eluted fractions SlyD 无论是在变性条件还是在非变性条件下 TALON Resin 均没有发生非特异性的吸附 32.5 Yield of purified DHFR (%) 40 KDa 得到的目标蛋白质纯度高 30 在非变性条件下 bme存在时比较两种树脂对细胞裂解液中6 His-DHFR的纯化结果 20 在非变性条件下采用TALON Resin 纯化的产物回收率高纯化产物中不会混入杂蛋白质产物纯度高 βme concentration (mm) His60 Ni SuperflowTM Resin 的特点更高的组氨酸标签融合蛋白结合量 60 mg融合蛋白/ml 树脂可以进行FPLC纯化蛋白质结合量 60 mg组氨酸标签融合蛋白质/ml树脂 (基于6 HN-AcGFP1纯化) 树脂类型树脂结构树脂珠直径 6 %交联的琼脂糖在变性和非变性条件下纯化 SuperflowTM μm 各种规格的树脂:10 ml 250 ml 4 产品形式树脂可以再生使用 50 %悬浊液/20 %乙醇中(已螯合了Ni离子预装柱形式 His60 Ni Superflow的操作流程组氨酸标签融合蛋白质的纯化过程主要分为4步细胞裂解目的蛋白质结合杂蛋白洗涤目的蛋白质洗脱 Protein Purification with His60 Ni Superflow Resin Native purification Native proteins Wash Expression vector (e.g., pecoli) Bind Denaturing Purification Elute Pure his-tagged protein Denatured proteins Purification of his-tagged proteins using His60 Ni Superflow Resin. Purification of his-tagged proteins using His60 Ni Superflow Resin

11 His60 Ni Superflow TM Resin 能实现高产量的蛋白质纯化! kda A 同类产品 His60 Ni Superflow TM Resin M OS FT WI W2 E1 E2 E3 E4 M OS FT WI W2 E1 E2 E3 E4 B * 采用 pecoli Linear Expression System 表达 6 HN-AcGFP 融合蛋白质在同等条件下, 分别采用其他公司的同类产品 ( 图 A) 和 His60 Ni Superflow TM Resin( 图 B) 纯化等量的融合蛋白质 M : 蛋白 marker W1 W2 : 洗涤液 OS : 蛋白原液 E1~E4 : 洗脱液 FT : 穿透流出液 * 6 HN-AcGFPI 如果您想要获得高纯度的蛋白纯化样品, 建议您使用 TALON Resin 组氨酸标签融合蛋白质的纯化 ( 高特异性的 Co 2+ 树脂 ) 组氨酸标签融合蛋白质纯化树脂 TALON Metal Affinity Resin TALON 2 ml Disposable Gravity Column 组氨酸标签融合蛋白质纯化树脂适用于高压高流速条件 TALON Superflow TM Metal Affinity Resin 组氨酸标签融合蛋白质纯化柱及试剂盒 HisTALON TM Gravity Columns HisTALON TM Gravity Column Purification Kit HisTALON TM Buffer Set 组氨酸标签融合蛋白质纯化柱及试剂盒适用于 FPLC 纯化 HisTALON TM Cartridge HisTALON TM Cartridge Purification Kit 磁珠类树脂 TALON Magnetic Beads TALON Magnetic Beads Buffer Kit 组氨酸标签融合蛋白质纯化树脂适用于细胞粗提液纯化 TALON CellThru Resin CellThru 10-ml Disposable Columns 组氨酸标签融合蛋白质纯化离心柱适用于小规模纯化 TALONspin TM Columns 产品名称组氨酸标签融合蛋白质一步法纯化柱适用于细菌培养液多样品纯化 TALON Single Step Columns(5 ml) TALON Single Step Columns(20 ml) 细菌和细胞蛋白质专用抽提缓冲液 xtractor Buffer Kit xtractor Buffer 规格产品编号树脂空柱抽提缓冲液纯化缓冲液 25 ml 250 ml 50 columns 25 ml 250 ml 5 1 ml 1 Kit 20 次 5 1 ml 1 Kit 2 1 ml 6 1 ml 1 Kit 10 ml 20 columns 10 columns 25 columns 50 columns 25 columns 10 columns 1 Set 500 ml 预装柱预装柱预装柱预装柱预填充还有 500 ml 1,000 ml 规格的相应产品组氨酸标签融合蛋白质的纯化 ( 高产量的 Ni 2+ 树脂 ) 组氨酸标签融合蛋白质纯化树脂适用于高压高流速条件 His60 Ni Superflow TM Resin 产品名称组氨酸标签融合蛋白质纯化柱及试剂盒 His60 Ni Gravity Columns His60 Ni Gravity Column Purification Kit His60 Ni Buffer Set 组氨酸标签融合蛋白质纯化柱及试剂盒适用于 FPLC 纯化 His60 Ni Cartridge His60 Ni Cartridge Purification Kit 规格产品编号树脂空柱抽提缓冲液纯化缓冲液 25 ml 4 25 ml 250 ml 5 1 ml 1 Kit 20 次 5 1 ml 1 Kit 预装柱预装柱还有 500 ml 1,000 ml 规格的相应产品 TALON 系列产品已取得美国专利 ( 专利号 :5962,641) 了解更多产品信息及相关产品的 Licensing Statements, 请登录

12 相关试剂 ~ 推荐和介绍其他与 Western Blotting 相关的试剂 ~ Stripping Buffer 选择性价比高的试剂什么是 Stripping Buffer? 是指使用专用 buffer 从膜上除去一抗和检出试剂 Stripping 后可在同一张膜上进行目的蛋白和其它目的蛋白的再次检测可对最佳检测条件进行研讨 Western BLoT Stripping Buffer Ready-to-use Western BLoT 后用于洗去膜上的一抗和二抗的 buffer 可在温和条件下洗膜在温和的条件下 ( 室温 30 分钟 ) 进行反应, 可减轻对膜上固定的抗原蛋白的影响 Western BLoT Stripping Buffer 500 ml T7135A 600 BCA 法定量 TaKaRa BCA Protein Assay Kit 超群的性价比! 针对不同种类蛋白质, 测定值几乎无变动可在 20~2,000 μg/ml 宽广的范围内获得良好线性关系不受界面活性剂或各种 Buffer 影响 (~5% Trition X-100 ~5% SDS ~4M Guanidine-HCl 等 ) 详情请参考网站 2 种测定方法标准方法 (1 ml 反应体系 /200 μl 反应体系 ) : 定量范围 50~2,000 μg/ml 低浓度测定方法 (1 ml 反应体系 /200 μl 反应体系 ): 定量范围 ~50 μg/ml 500 次 (1 ml 反应体系 ) TaKaRa BCA Protein Assay Kit T9300A 次 (200 μl 微量反应体系 ) Bradford 法定量 TaKaRa Bradford Protein Assay Kit 操作简单迅速可在 1~1,000 μg/ml 的范围内进行定量不受还原剂影响 (~100 mm DTT ~1M Glucose ~1M 2-ME 等 ) 详情请参考网站 2 种测定方法标准方法 (1 ml 反应体系 /200 μl 反应体系 ) : 定量范围 25~1,000 μg/ml 低浓度测定方法 (1 ml 反应体系 /200 μl 反应体系 ): 定量范围 1~25 μg/ml 超群的性价比! 500 次 (1 ml 反应体系 ) TaKaRa Bradford Protein Assay Kit T9310A 次 (200 μl 微量反应体系 ) 宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 Takara Biotechnology (Dalian) Co.,Ltd. 代理商联系信息地址 : 辽宁省大连市经济技术开发区东北二街 19 号 (P.C ) 电话 : 传真 : , service@takara.com.cn http: // 技术咨询电话 Ver 年 3 月印刷 5K

Protein Labeling and Detection

Protein Labeling and Detection ECL plex Product Specialist 1/ Western Blot 2/ Western Blotting- PI 3/ Western Blotting 1. 2 1 2. 3. 4. Y 3 4 5. 4/ 1. SDS- (SDS-PAGE) SDS ( β- ) --SDS 5/ SDS-PAGE - - - (Tris-HCL ph 6.8) glycine/chloride