54

Transcription

1 53

2 54

3 55

4 摘 要 本 文 论 述 了 用 于 分 析 测 定 和 识 别 确 认 蟹 肉 熟 食 体 内 氯 霉 素 的 LC/MS/MS 方 法 这 是 太 平 洋 西 北 地 区 实 验 室 开 发 的 另 一 个 LC/MS/MS 方 法 的 延 伸 [1,2], 该 方 法 是 用 来 定 量 检 测 ppb 级 别 以 下 的 虾 体 内 氯 霉 素 方 法 包 括 : 用 干 冰 粉 碎 蟹 肉 熟 食 ; 用 乙 酸 乙 酯 提 取 氯 霉 素 ; 氮 吹 仪 蒸 发 浓 缩 ; 添 加 甲 醇 氯 化 钠 水 溶 液 和 庚 烷 ; 脂 肪 进 入 到 庚 烷 层, 水 相 进 入 到 乙 酸 乙 酯 层 ; 用 氮 吹 转 移 乙 酸 乙 酯 ; 然 后 溶 于 甲 醇 水 溶 液 中 ; 过 滤 ; 最 后 使 用 LC/MS/MS 方 法 进 行 分 离 / 检 测 / 识 别 确 认 蟹 肉 内 添 加 了 0.10( 第 一 次 ),0.10( 第 二 次 ),0.25,0.50 和 1.0ng/g(ppb) 氯 霉 素 平 均 绝 对 回 收 率 分 别 为 和 86%,RSD 不 到 1% 监 测 到 四 个 子 离 子 (m/ z152,176,194 和 257), 他 们 的 母 离 子 为 m/z321 测 定 基 于 使 用 了 子 离 子 m/z152( 基 峰 ) 的 峰 面 积 建 立 的 标 准 曲 线, 校 准 溶 液 配 制 : 将 标 准 物 质 添 加 到 控 制 提 取 的 蟹 肉 组 织 中, 浓 度 为 0.1.,0.20,0.50 和 1.0ppb 对 一 组 六 个 的 基 质 控 制 样 ( 没 有 添 加 标 样 的 蟹 肉 ) 进 行 了 分 析, 没 有 检 测 到 氯 霉 素 为 了 定 性 识 别, 添 加 标 样 的 蟹 肉 的 离 子 比 ( 子 离 子 与 基 峰 子 离 子 比 ) 与 相 应 的 标 样 的 离 子 比, 在 氯 霉 素 浓 度 为 ppb 范 围, 该 比 值 小 于 10%, 但 是 在 1.00ppb 的 添 加 标 样 的 蟹 肉 内, 在 离 子 m/z257 的 比 值 上 升 到 21% 注 释 : 实 验 室 信 息 栏 是 一 个 快 速 发 布 实 验 室 方 法 的 有 效 工 具 ( 期 刊 ) 没 有 必 要 报 告 全 部 科 学 工 作 用 者 必 须 确 保 他 们 适 当 有 效 的 程 序 使 得 实 验 室 的 方 法 和 技 术 对 于 用 者 使 用 来 说 是 可 靠 和 准 确 的 对 任 何 商 用 物 品, 设 备 和 过 程 的 参 考 使 用, 都 不 是 食 品 药 品 管 理 局 的 研 究 机 构 所 同 意 授 权 或 者 推 荐 的 引 言 氯 霉 素 是 一 类 广 谱 抗 生 素 类 药 物, 于 1950 年 开 发 研 制 它 具 有 非 常 有 效 的 抗 菌 功 效 几 十 年 来 的 临 床 使 用 已 经 产 生 了 显 著 大 量 的 证 据 表 明 氯 霉 素 对 人 类 具 有 毒 性 作 用 越 来 越 有 一 种 倾 向 就 是 在 国 内 和 国 际 市 场 上 存 在 着 该 药 物 的 滥 用, 因 为 氯 霉 素 对 动 物 和 水 产 类 生 物 治 疗 的 疗 效 好 氯 霉 素 残 留 也 许 就 存 在 于 动 物 食 物 的 组 织 中, 这 样 对 一 些 消 费 者 存 在 着 健 康 风 险 为 此,FDA 食 品 药 品 管 理 局 不 允 许 这 类 药 物 使 用 在 生 产 食 物 的 动 物 身 上 食 物 中 抗 生 素 残 留 问 题 是 全 球 公 共 健 康 所 关 注 的, 因 为 他 们 促 进 了 细 菌 的 进 化 而 对 任 何 抗 生 素 产 生 了 抗 药 性 在 几 年 前 就 有 了 使 用 GC/MS 检 测 虾 体 内 的 氯 霉 素 分 析 方 法 (3,4) 最 近,FDA 已 经 开 发 了 LC/MS 方 法 来 检 测 虾 体 内 的 氯 霉 素 1 和 蟹 体 内 的 氯 霉 素 5 尽 管 后 来 的 蟹 体 内 氯 霉 素 检 测 方 法 成 为 我 们 分 析 的 指 定 方 法, 我 们 也 注 意 到 前 者 虾 体 内 氯 霉 素 检 测 方 法 更 容 易 操 作, 考 虑 到 稍 好 的 回 收 率 和 利 用 了 三 重 四 极 杆 技 术, 这 个 技 术 能 够 进 行 子 离 子 识 别, 要 比 离 子 阱 方 法 技 术 更 加 稳 定 我 们 进 一 步 修 订 了 虾 体 内 氯 霉 素 检 测 方 法, 通 过 使 用 多 个 离 心 管 取 代 分 离 漏 斗, 使 用 庚 烷 代 替 正 己 烷 ( 降 低 了 暴 露 于 毒 害 神 经 溶 剂 的 时 间 ), 使 得 这 个 方 法 变 得 更 加 流 畅 和 安 全 56

5 试 剂 和 化 学 品 乙 酸 乙 酯, 庚 烷, 甲 醇 和 乙 腈 ( 高 纯 度,HPLC, 残 留 级 ); 冰 醋 酸, 醋 酸 铵, 氯 化 钾, 试 剂 级 ; 氯 霉 素, 美 国 药 品 管 理 局 参 考 标 准 物 质 (Lot N), 去 离 子 水 ( 用 于 HPLC 之 间 需 要 过 滤 ) 稀 释 液 配 制 : 甲 醇 : 水, 用 等 比 例 的 水 和 甲 醇 混 合 流 动 相 A: 用 HPLC 级 水 配 制 10mM 醋 酸 铵 和 0.1% 乙 酸 混 合 液 将 1.547g 的 醋 酸 铵 和 2ml 的 冰 醋 酸 溶 于 2000ml 的 容 量 瓶 中, 用 HPLC 级 水 定 容 到 刻 度 线 上 流 动 相 B:95:5 乙 腈 : 流 动 相 A 将 50ml 流 动 相 A 加 入 到 1000ml 容 量 瓶 中, 然 后 用 乙 腈 定 容 到 刻 度 线 上 4% 氯 化 钠 :(4% 氯 化 钠 ), 称 量 40.0g 的 氯 化 钠 到 1000ml 容 量 瓶 中, 然 后 实 验 室 去 离 子 水 定 容 至 刻 度 线 仪 器 设 备 仪 器 :Finnigan TSQ 质 谱 仪 和 Surveyor 液 相 色 谱 仪 LC/MS/MS[ 见 仪 器 参 数 ] 色 谱 柱 :Phenomenex LUNA 5μm C x 2mm 食 品 处 理 机 :Robot-Coupe model R10 或 等 同 仪 器 离 心 机 : 必 须 能 够 容 纳 50ml 的 离 心 管 和 具 有 3000rpm 转 速 设 备 :Wrist-Action Mechanical Shaker 和 Vortex Mixer 涡 旋 混 匀 器, 具 有 加 热 水 浴 的 氮 吹 仪 抽 吸 装 置 : 在 trap flask 抽 滤 瓶 中 放 置 有 孔 的 制 动 塞, 将 抽 滤 瓶 壁 测 口 与 真 空 装 置 相 连, 稳 妥 的 将 一 根 聚 四 氟 乙 烯 或 软 的 塑 料 管 插 入 到 制 动 塞 孔 上 将 一 个 可 用 的 吸 管 器 头 与 塑 料 管 末 端 相 连 这 个 末 端 就 是 喷 口 用 来 抽 走 水 层 中 庚 烷, 这 个 吸 管 器 头 可 以 在 不 同 样 品 之 间 进 行 更 换 如 果 喷 口 头 处 于 管 壁 垂 直 于 液 面 时, 这 个 装 置 可 以 用 来 吸 走 分 层 溶 剂 的 上 层 液 离 心 管 :50ml, 聚 丙 烯, 圆 锥 形, 螺 旋 帽 注 射 针 :1ml, 聚 丙 烯, 用 来 过 滤 提 取 过 滤 器 :13mm 0.2um PVDE 聚 偏 二 氟 乙 烯 膜 过 滤 器 玻 璃 量 具 :A 类 各 种 移 液 管 和 容 量 瓶 仪 器 参 数 色 谱 条 件 梯 度 洗 脱 : 见 右 上 角 表 氯 霉 素 大 约 保 留 时 间 :~12 minutes 流 速 :200μL/minute 柱 温 :40 57

6 自 动 进 样 器 条 件 进 样 体 积 :10μL 注 射 器 冲 洗 清 洗 体 积 :6mL 样 品 进 样 盘 温 度 :10 质 谱 仪 条 件 离 子 化 条 件 : 负 离 子 ESI 电 喷 雾 电 压 :1.5 kv 鞘 气 : 氮 气, 压 力 为 80psi 毛 细 管 温 度 : 350 离 子 源 补 偿 电 压 :5 V 母 离 子 (Q1): m/z 321 碰 撞 气 (Q2): 氩 2.5 millitorr 碰 撞 电 压 : 26 V 子 离 子 (Q3): m/z 257, m/z 194, m/z 176, m/z 152 子 倍 增 器 电 压 : 1.27 kv 0 100% 0% 15 20% 80% % 0% % 0% 样 品 制 备 将 100g 熟 食 蟹 肉 和 200g 干 冰 放 在 Robot-Coupe 食 品 处 理 器 中 该 混 合 物 加 工 成 均 匀 细 末 然 后 将 这 个 由 蟹 肉 末 和 干 冰 组 成 的 混 合 物 在 进 行 下 一 步 步 处 理 前 在 低 温 下 进 行 脱 气 过 夜 ( 有 些 安 全 性 提 醒 : 混 合 物 不 要 储 存 在 密 封 的 罐 内, 因 为 气 体 压 力 可 能 会 带 来 爆 炸 的 危 险, 第 二 点 根 据 加 入 干 冰 总 量, 可 能 会 在 冷 藏 接 触 过 程 中 发 生 窒 息 的 危 险 ) 干 冰 技 术 是 基 于 Bunch (2) 等 人 的 工 作 基 础 样 品 提 取 与 净 化 见 图 1 实 验 辅 助, 见 方 法 流 程 图 ] 将 10g 脱 气 冰 冻 的 蟹 肉 末 称 好 后 放 到 第 一 个 50ml 的 塑 料 离 心 管 中, 共 有 三 个 离 心 管 再 将 20ml 的 乙 酸 乙 酯 添 加 到 离 心 管 中, 盖 紧 盖 子 使 用 腕 力 机 械 振 荡 器 用 力 振 荡 离 心 管 10 分 钟, 然 后 以 3000rpm 转 速 离 心 5 分 钟, 将 上 清 液 移 入 到 第 二 个 离 心 管 内 然 后 将 另 一 个 20ml 乙 酸 乙 酯 加 入 到 样 品 中 ( 第 一 个 离 心 管 内 ), 盖 紧 腕 力 振 荡 5 分 钟, 然 后 在 3000rpm 转 速 下 离 心 5 分 钟, 再 将 上 清 液 倾 倒 再 第 二 个 离 心 管 中 丢 弃 带 有 蟹 肉 球 的 第 一 个 样 品 管 ( 建 议 在 丢 弃 样 品 管 之 前, 将 样 品 管 在 通 风 厨 内 通 风 吹 干 ) 用 氮 吹 在 水 浴 C 下 对 第 二 个 样 品 管 中 提 取 物 进 行 浓 缩 ( 直 至 乙 酸 乙 酯 挥 发 没 有, 仅 有 一 滴 没 有 蒸 发 的 液 滴 存 留 ), 在 这 个 时 候 将 2ml 的 甲 醇 添 加 到 第 二 个 样 品 管 中, 盖 紧 盖 子, 涡 旋 30 秒 钟 然 后 在 第 二 个 样 品 管 中 添 加 25ml 的 4% 氯 化 钠 溶 液 和 20ml 庚 烷 混 合 液 用 手 振 荡 30 秒 钟, 然 后 静 置 分 层 ( 直 到 破 乳 化 ) 将 上 层 的 庚 烷 通 过 抽 提 装 置 移 走, 丢 弃 去 酯 提 取 液 再 次 重 复 用 20ml 庚 烷 处 理, 然 后 同 样 移 走 丢 弃 加 入 15ml 乙 酸 乙 酯, 提 取 水 相 中 氯 霉 素 并 保 留 在 第 二 个 离 心 管 内, 盖 紧 盖 子, 然 后 用 力 振 荡 1 分 钟 1 次 然 后 静 置 放 置 几 分 钟, 或 者 直 到 上 层 有 机 层 清 晰 所 有 乳 化 都 破 坏 后 然 后 移 走 有 机 层 是 很 关 键 的 有 时 可 以 用 离 心 的 方 式 将 稳 定 的 乳 化 层 破 坏 将 有 机 层 转 移 到 第 三 个 离 心 管 内, 然 后 在 用 15ml 乙 酸 乙 酯 进 行 再 次 提 取 ( 如 果 乳 化 现 象 很 强 固, 即 使 在 离 心 后 仍 存 在 乳 化 现 象, 可 以 转 移 到 一 定 的 体 积 而 不 存 在 污 染, 第 二 步 转 移 也 同 样, 通 常 第 二 步 转 移 过 程 中, 乳 化 更 严 重 ) 在 所 有 的 提 取 液 转 移 到 第 三 个 离 心 管 内 后, 提 取 液 用 氮 吹 仪 水 浴 C 下 进 行 浓 缩, 浓 缩 的 残 留 液 稀 释 到 1ml, 旋 转 混 匀, 然 后 用 0.2um 膜 过 滤 器 和 1ml 聚 丙 烯 注 射 器 处 理, 注 入 到 自 动 进 样 小 瓶 内 提 取 液 可 以 用 来 分 析 58

7 标 准 样 品 原 始 标 准 母 液 准 确 称 量 20mg 美 国 药 品 局 参 考 标 准 氯 霉 素, 然 后 用 50ml 甲 醇 溶 解 标 准 母 液 浓 度 为 400,000ng/ ml 工 作 标 准 溶 液 1(WS1) 配 制 : 吸 取 1ml 标 准 液 母 液 到 100ml 容 量 瓶 中, 用 稀 释 液 定 容, 该 溶 液 浓 度 为 :4000ng/ ml 工 作 标 准 溶 液 2(WS2): 移 取 1ml 的 WS1 到 100ml 的 容 量 瓶, 然 后 用 稀 释 液 定 容, 配 制 浓 度 为 40ng/ml 根 据 表 1 配 制 线 性 校 准 标 准 液, 取 WS2, 稀 释 到 10ml, 然 后 取 相 同 量 的 稀 释 后 的 标 准 液 和 空 白 蟹 肉 提 取 液, 混 合 均 匀 后, 配 制 成 最 终 的 组 织 体 标 准 液 空 白 蟹 肉 提 取 液 包 含 最 终 的 没 有 添 加 药 物 的 蟹 肉, 经 历 整 个 提 取 操 作 方 法 过 程 得 到 为 了 获 得 足 够 了 空 白 蟹 肉 提 取 液, 可 以 选 择 : 提 取 多 个 蟹 肉 空 白 : 放 大 量 提 取 蟹 肉 组 织 ; 或 者 对 先 前 提 取 的 蟹 肉 空 白 建 立 储 存 ; 空 白 蟹 肉 提 取 添 加 到 纯 标 准 样 品 氯 霉 素 中 有 助 于 补 偿 在 样 品 和 标 样 之 间 由 于 基 质 带 来 的 对 对 色 谱 或 碎 裂 的 干 扰 影 响 尽 管 仅 使 用 了 四 点 校 正 ( 与 LIB4290 相 同 ), 我 们 推 荐 常 规 的 5 点 校 准,have the lowest standard 50% of thespike 最 低 添 加 标 准 小 于 50% 或 目 标 浓 度 表 1. 校 准 标 准 样 品 样 品 添 加 和 方 法 设 计 分 析 的 蟹 肉 为 冷 冻 熟 食 品, 进 口 于 智 利 每 10g 样 品 中 分 别 添 加 氯 霉 素, 浓 度 分 别 为 :0.10ng/g,0.25ng/g, 0.50ng/g 和 1.0 ng/g, 使 用 10,25,50 和 100ul 的 添 加 溶 液 添 加 溶 液 制 备 : 浓 度 为 100ng/ml, 移 取 25.0ml 的 WS1 工 作 溶 液, 然 后 用 稀 释 液 稀 释 适 当 倍 数 每 四 个 添 加 样 品 重 复 测 定 5 次, 对 于 0.1ng/g 添 加 浓 度, 设 定 2 组, 重 复 测 定 十 次 5 个 空 白 控 制 样 也 进 行 测 定 测 定 数 大 于 30 既 然 多 个 样 品 处 理 是 同 时 完 成 的, 样 品 提 取 通 常 需 要 一 天 半 完 成 ( 不 包 括 样 品 制 备 ) 部 分 提 取 样 品 在 提 取 过 程 中 需 要 放 置 在 冰 箱 中 过 夜, 提 取 完 的 提 取 液 也 可 以 放 在 冰 箱 中 用 于 以 后 的 分 析 对 于 每 天 仪 器 分 析, 进 行 样 品 分 析 之 前, 在 样 品 组 之 间, 在 所 有 样 品 测 定 完 之 后, 先 插 入 线 性 校 准 标 样 分 析 ( 总 共 三 次 ) 在 标 准 样 与 样 品 组 之 间, 以 及 每 天 分 析 开 始, 都 要 先 进 行 稀 释 液 分 析 在 第 一 个 样 品 组 之 前, 要 对 蟹 肉 控 制 样 品 ( 基 质 空 白 ) 进 行 分 析 为 规 范 起 见, 我 们 也 建 议 在 第 一 组 校 准 标 准 样 ( 和 稀 释 液 ) 分 析 之 前, 重 复 5 次 进 行 单 一 标 准 样 分 析 以 检 查 系 统 适 宜 性 在 第 一 组 校 准 标 样 ( 和 稀 释 液 分 析 ) 之 后, 要 对 试 剂 空 白 进 行 分 析 在 样 品 组 分 析 完 毕 后, 也 可 以 就 对 中 间 浓 度 标 样 进 行 分 析 ( 这 个 浓 度 要 接 近 目 标 浓 度 ), 这 样 可 以 不 进 行 一 组 校 准 曲 线 样 品 分 析 对 于 LC/MS/MS 分 析, 四 个 子 离 子 (m/z152,176,194 和 257) 来 自 于 母 离 子 m/a321 测 量 是 基 于 子 离 子 ( 基 峰 )m/z152 的 峰 面 积 形 成 的 校 准 曲 线, 校 准 溶 液 相 当 于 蟹 肉 组 织 中 浓 度 为 0.10, 0.20, 0.50, 和 1.0 ppb( 由 蟹 肉 控 制 提 取 液 制 成 ) 由 于 每 天 都 要 分 析 三 组 标 准 样 品, 三 组 数 据 用 于 每 个 标 准 浓 度, 然 后 形 成 标 准 曲 线 (= 每 条 曲 线 有 12 个 数 据 ) 59

8 结 果 和 讨 论 定 量 计 算,5 个 添 加 样 品 的 平 均 绝 对 回 收 率 从 51-86%, 见 表 2 5 次 重 复 的 添 加 样 品 的 相 对 标 准 偏 差 都 小 于 1%, 表 明 日 重 复 性 非 常 好 ( 实 验 室 间 %RSD=0.74).1.0 和 0.50ppb 添 加 浓 度 水 平 的 绝 对 回 收 率 之 间 差 小 于 2%( 分 别 86% 和 84%) 然 而, 在 0.5ppb 浓 度 水 平 下, 回 收 率 有 明 显 的 降 低 校 准 曲 线 的 相 关 系 数 高 于 在 规 范 实 验 室 的 日 常 使 用 中, 定 量 限 通 常 等 同 于 最 低 标 准 浓 度, 不 能 报 告 为 痕 量 级 然 而,0.10ng/g 的 添 加 样 品 的 回 收 率, 他 们 的 响 应 要 低 于 最 低 标 准 样 品 浓 度 出 于 研 究 考 虑, 我 们 外 推 校 准 曲 线, 报 告 了 不 同 浓 度 的 回 收 率, 见 表 1, 因 为 在 高 于 三 倍 信 造 比 信 号 值 很 好 用 来 定 量 限 注 意 : 用 本 质 上 同 样 的 方 法 来 检 测 虾 和 龙 虾 里 的 氯 霉 素, 我 们 发 现 到 蟹 的 回 收 率 会 更 低, 也 往 往 会 有 更 多 乳 化 层 确 认 : 从 识 别 确 认 角 度 讲, 在 标 准 样 品 中 的 氯 霉 素 保 留 时 间 和 在 样 品 中 的 氯 霉 素 保 留 时 间 比 较, 相 差 在 0.1 分 内 但 是, 更 重 要 的 是, 添 加 样 品 中 的 离 子 比 ( 每 个 子 离 子 与 基 峰 子 离 子 相 比 ) 和 标 准 样 品 中 的 离 子 比, 在 氯 霉 素 浓 度 为 ppb 范 围 内, 相 差 10%( 相 对 ), 然 而, 对 于 浓 度 0.10ppb,m/z257, 相 差 到 了 21%, 见 表 3 在 所 有 浓 度 水 平 下, 标 准 样 品 的 离 子 比 的 标 准 偏 差 在 % 给 定 添 加 浓 度 的 蟹 肉 样 品 与 相 同 浓 度 的 标 准 样 品 进 行 比 较 ( 或 者, 三 次 重 复 标 样 的 每 个 离 子 的 离 子 比 的 平 均 值 ): 蟹 肉 内 含 有 氯 霉 素 药 物 的 确 认 标 准 : 样 品 和 ( 基 质 ) 标 样 的 保 留 时 间 误 差 范 围 在 ±0.3 分 钟 内 母 离 子 为 m/z 321. 子 离 子 m/z 152, 176, 194 和 257; 没 有 其 他 明 显 峰 子 离 子 m/z 152 为 基 峰 讲 样 品 的 m/z 176, 194, 和 257 与 m/z 152 比 与 标 准 品 的 m/z 176, 194, 和 257 与 m/z 152 比 进 行 一 系 列 比 较, 差 异 小 于 10% ( 相 对 ) 最 弱 的 子 离 子 的 信 造 比 要 大 于 5 X. 结 论 这 个 方 法 简 单 易 行, 应 用 了 基 于 湿 法 化 学 技 术 - 它 可 以 广 泛 为 分 析 人 员 所 使 用 该 方 法 最 大 限 度 降 低 了 溶 剂 和 玻 璃 器 具 的 使 用, 在 高 通 量 环 境 分 析 中 非 常 有 用 ( 然 而, 它 还 是 需 要 花 费 1 到 1 天 半 的 时 间 来 完 成 多 个 样 品 的 提 取 ) 该 方 法 能 同 时 进 行 蟹 肉 熟 食 内 氯 霉 素 测 定 的 定 量 和 定 性 识 别, 这 对 于 常 规 情 况 非 常 有 用 该 方 法 也 可 以 用 于 虾 和 龙 虾 的 氯 霉 素 检 测 致 谢 感 谢 PRLNW 实 验 人 员 : 感 谢 Rachel Tomlin 友 好 和 有 效 的 样 品 制 备 工 作, 感 谢 Jan Bussey 在 LC/MS/MS 仪 方 面 工 作, 尤 其 感 谢 Barbara Neuhaus 在 技 术 支 持 和 方 法 技 术 方 面 的 领 导 作 用 60

9 参 考 文 献 1. LC/MS/MS Analysis of Chloramphenicol in Shrimp, Barbara K. Neuhaus, Jeffrey A. Hurlbut, and Walter Hammack. (2002) Laboratory Information Bulletin No Homogeneous Sample Preparation of Raw Shrimp with the Aid of Dry Ice, Elaine Bunch, Diane Altwein, Lloyd Johnson, Joyce Farley, and Amy Hammersmith. (1995) J. AOAC Int, 78, Allen Pfenning, Jose Roybal, Heidi Rupp, Sherri Turnipseed, Steven Gonzales, Jeffrey Hurlbut. (2000) J.AOAC Int., 83, 26ff. 4.Allen Pfenning, Mark Madson, Jose Roybal, Sherri Turnipseed, Steven Gozales, Jeffrey Hurlbut, and G. Salmon. (1998) J.AOAC Int., 81, 714ff. 5. Confirmation of Chloramphenicol Residue in Crab by Electrospray LC/MS, Allen Pfenning, Sherri Turnipseed, Jose Roybal, Mark Madson, Rebecca Lee, and Joseph Storey. (2002) Laboratory Information Bulletin No

10 62

11 63

12 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 同 时 测 定 蜂 王 浆 中 氯 霉 素 甲 砜 霉 素 和 氟 甲 砜 霉 素 残 留 朱 宽 正 张 晓 黎 文 红 张 莉 ( 湖 北 省 产 品 质 量 监 督 检 验 研 究 院 ) 摘 要 : 采 用 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 (LC-MS/MS) 同 时 测 定 了 蜂 王 浆 中 氯 霉 素, 甲 砜 霉 素 和 氟 甲 砜 霉 素 残 留 样 品 加 入 阴 性 蜂 蜜 和 水 均 质 后, 采 用 乙 酸 乙 酯 提 取, 蒸 发 浓 缩,C18 固 相 萃 取 净 化 HPLC 分 离 后, 串 联 质 谱 法 以 电 喷 雾 负 离 子 选 择 反 应 监 测 模 式 (SRM) 进 行 定 性 定 量 分 析 通 过 对 固 相 萃 取 条 件 的 优 化, 大 大 减 小 了 基 质 的 干 扰 氯 霉 素, 氟 甲 砜 霉 素 和 甲 砜 霉 素 的 检 出 限 分 别 为 0.1ng/g,0.2ng/g 和 0.5ng/g, 平 均 回 收 率 为 79.9~88.4%, 相 对 标 准 偏 差 (RSD) 均 小 于 8.2% 关 键 词 : 氯 霉 素 ; 甲 砜 霉 素 ; 氟 甲 砜 霉 素 ; 蜂 王 浆 ; 固 相 萃 取 ; 高 效 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 Simultaneous determination residues of Chloramphenicol,Thiamphenicol and Florfenicol in royal jelly by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry Abstract: A method was presented for simultaneous determination residues of chloramphenicol (CAP),Thiamphenicol (TAP) and Florfenicol (FF) in royal jelly by using high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC MS/MS).After a preliminary homogenization in negative honey and water, samples were extracted with ethyl acetate, and evaporated to dryness; the following clean up was carried out on a C18 SPE cartridge. After reversed-phase HPLC separation, identification and quantification were performed using selected reaction monitoring (SRM) and electrospray ionization in negative mode. In order to dispel the matrix interference, the conditions of solid phase extraction were optimized. The detection limits of the method were 0.1ng/g,0.2ng/g and 0.5ng/g for CAP, FF and TAP, respectively. The average recoveries were 79.9%~88.4%, and the RSD were lower than 8.2.%. Keywords; Chloramphenicol; Thiamphenicol; Florfenicol; royal jelly; Solid phase extraction; High performance Liquid chromatography-tandem mass spectrometry 氯 霉 素 甲 砜 霉 素 和 氟 甲 砜 霉 素 都 属 于 氯 霉 素 类 抗 生 素, 因 对 革 兰 氏 阴 性 菌 和 革 兰 氏 阳 性 菌 具 有 很 强 的 活 性, 表 现 出 广 谱 的 抗 菌 能 力, 广 泛 地 应 用 于 动 物 养 殖 业 中 其 中 氯 霉 素 作 为 第 一 个 人 工 合 成 的 抗 菌 药 物, 至 今 已 有 50 多 年 的 使 用 历 史, 由 于 它 能 导 致 人 体 产 生 再 生 障 碍 性 贫 血 和 溶 血 性 贫 血 等 毒 副 作 用 [1], 欧 盟 美 国 等 先 后 规 定 其 作 为 禁 用 药 物, 不 得 用 于 畜 牧 养 殖 业 中, 不 得 在 动 物 源 性 食 品 中 检 出 残 留, 最 低 检 出 限 为 0.1~0.3μg/kg 甲 砜 霉 素 和 氟 甲 砜 霉 素 与 氯 霉 素 结 构 相 似, 是 替 代 禁 用 氯 霉 素 的 理 想 药 物, 最 高 残 留 限 量 一 般 为 50~100μg/kg 虽 然 它 们 毒 性 降 低, 在 动 物 体 内 残 留 量 低, 但 毒 副 作 用 依 然 存 在 [2] 在 蜜 蜂 的 养 殖 过 程 中, 此 类 药 物 用 于 预 防 或 治 疗 各 种 病 虫 害, 易 在 蜂 王 浆 产 品 中 形 成 残 留, 为 保 证 蜂 王 浆 的 食 用 安 全, 建 立 准 确 可 靠 的 定 性 定 量 方 法 是 十 分 必 要 的 目 前, 对 于 水 产 品 蜂 产 品 动 物 组 织 等 不 同 基 质 中 氯 霉 素 的 单 一 检 测 方 法 很 多 [3-7], 多 种 氯 霉 素 类 抗 生 素 的 同 时 测 定 报 道 不 多, 主 要 采 用 液 相 色 谱 法 (HPLC) [8] 和 液 质 联 用 法 (LC-MS 或 LC-MS/MS) [9-10], 其 中 针 对 蜂 王 浆 中 氯 霉 64

13 素 甲 砜 霉 素 和 氟 甲 砜 霉 素 的 同 时 检 测 方 法 国 内 外 尚 未 有 报 道 本 文 采 用 LC-MS/MS 法 建 立 了 蜂 王 浆 中 氯 霉 素 甲 砜 霉 素 和 氟 甲 砜 霉 素 的 定 性 定 量 的 检 测 方 法 为 了 消 除 基 质 干 扰, 采 用 固 相 萃 取 技 术 净 化, 并 对 洗 脱 和 淋 洗 条 件 进 行 了 优 化 本 方 法 定 性 定 量 准 确, 检 出 限 低, 重 现 性 好 1. 实 验 部 分 1.1 仪 器 与 试 剂 U3000 HPLC 仪 ( 美 国,Dionex 公 司 ),TSQ quantum access 三 重 四 极 杆 串 联 质 谱 仪 ( 美 国,Thermo fisher 公 司 ); 固 相 萃 取 仪 ( 美 国,supelco 公 司 );HITACHI CD6D 离 心 机 ;;YAMATO 涡 旋 混 合 器 ; 多 功 能 微 量 化 样 品 处 理 仪 ( 长 沙 中 迅 电 子 工 程 研 究 所 );C 18 固 相 萃 取 小 柱,3ml/500mg( 美 国,supelco 公 司 ) 标 准 品 氯 霉 素 (chloramphenicol,cap) 和 氟 甲 砜 霉 素 (florfenicol,ff) 购 自 Sigma 公 司, 甲 砜 霉 素 (thiamphenicol,tap) 购 自 Fluka 公 司, 纯 度 均 99%, 用 甲 醇 溶 解 并 配 制 1.0mg/mL 标 准 储 备 液, 再 根 据 需 要 稀 释 成 适 当 含 量 的 混 合 标 准 工 作 液,4 避 光 保 存 ; 蜂 蜜 阴 性 干 粉 ( 美 国,CHARM 公 司 ); 其 他 试 剂 均 为 HPLC 色 谱 纯 1.2 样 品 前 处 理 提 取 在 室 温 下, 取 1g 蜂 王 浆 样 品 于 50ml 离 心 管 内, 向 其 中 加 入 1.0ml 阴 性 蜂 蜜 稀 释 液, 混 匀 再 加 入 5ml 蒸 馏 水, 混 匀, 加 入 15ml 乙 酸 乙 酯, 充 分 震 荡 提 取 15min 在 4000 转 下 离 心 5min, 转 移 上 层 有 机 相 至 50ml 梨 形 瓶 中, 用 10ml 乙 酸 乙 酯 重 复 提 取 两 次, 合 并 于 50ml 梨 形 瓶 中 45 下, 减 压 浓 缩 加 入 5ml 蒸 馏 水, 超 声 5 min 使 之 充 分 溶 解, 待 净 化 净 化 用 C 18 进 行 SPE 净 化, 先 后 以 3.0ml/min 的 速 度 用 4ml 甲 醇 4ml 蒸 馏 水 活 化 用 上 述 步 骤 提 取 的 水 相 以 1.0ml/min 的 速 度 过 柱 上 样 完 毕 后, 用 4ml 10% 的 甲 醇 水 溶 液 进 行 淋 洗, 流 速 保 持 1.0ml/min, 用 4ml 60% 的 甲 醇 水 溶 液 以 1.0ml/min 的 速 度 洗 脱, 液 面 全 部 通 过 C 18 柱 后, 加 大 负 压, 使 C 18 柱 内 残 留 液 充 分 淋 下 在 40 下, 洗 脱 液 N2 吹 干, 再 以 流 动 相 定 容 至 1ml, 过 0.45μm 滤 膜, 备 用 1.3 液 相 色 谱 及 质 谱 条 件 色 谱 条 件 色 谱 柱 : Acclaim 120 C mm,3μm( 美 国,Dionex 公 司 ); 保 护 柱 :Phenomenex C18,4.0mmL 3.0mmID( 美 国,Phenomenex 公 司 ); 流 动 相 梯 度 洗 脱 见 表 1, 其 中 A: 水 ;B: 甲 醇 ; 柱 温 :30 ; 进 样 量 : 10μL 65

14 1.3.2 质 谱 条 件 电 喷 雾 离 子 源 (ESI-), 选 择 反 应 监 控 (SRM) 扫 描 模 式, 喷 雾 电 压 :3500V; 毛 细 管 温 度 :350 ; 氮 气 作 为 鞘 气 和 辅 助 气, 其 中 鞘 气 气 为 40, 辅 助 气 为 5, 氩 气 用 作 碰 撞 气, 碰 撞 压 力 为 1.5mTorr; SRM 监 测 离 子 对 碰 撞 能 量 (CE) 见 表 2, 扫 描 峰 宽 0.002m/z, 扫 描 时 间 为 0.1s,Q1 和 Q3 的 分 辨 率 均 为 结 果 与 讨 论 2.1 提 取 条 件 的 优 化 氯 霉 素 类 药 物 属 于 弱 极 性 物 质, 易 溶 于 有 机 溶 剂 根 据 以 前 的 大 量 文 献 报 道 [3-10], 本 文 采 用 乙 酸 乙 酯 作 为 提 取 液, 由 于 蜂 王 浆 组 分 复 杂, 含 有 大 量 蛋 白 质 的 均 匀 胶 体, 提 取 时 不 能 用 单 一 的 溶 剂 全 部 溶 解 样 品 要 从 蜂 王 浆 中 提 取 待 测 物 质, 必 须 破 坏 其 胶 体 状 态, 使 其 形 成 均 匀 的 体 系, 这 样 才 能 实 验 在 第 一 步 提 取 中 避 免 损 失 不 确 定 的 有 效 组 分 由 于 食 用 蜂 王 浆 时, 一 般 需 要 按 比 例 用 蜂 蜜 调 剂 饮 用, 所 以 本 方 法 尝 试 性 采 用 美 国 CHARM 公 司 生 产 的 阴 性 蜂 蜜 干 粉 稀 释 后, 作 为 阴 性 辅 助 提 取 液 用 于 溶 解 王 浆 样 品, 可 得 均 匀 的 体 系, 并 且 提 取 回 收 效 果 明 显 2.2 固 相 萃 取 条 件 的 优 化 C 18 固 相 萃 取 柱 为 非 极 性 固 定 相, 可 对 弱 极 性 的 氯 霉 素 甲 砜 霉 素 和 氟 甲 砜 霉 素 进 行 选 择 吸 附 因 此 本 文 采 用 C 18 柱 作 为 固 相 萃 取 柱, 并 且 对 其 净 化 条 件 进 行 了 优 化 C 18 小 柱 经 3 ml 甲 醇 3ml 蒸 馏 水 活 化 后, 取 5ml 加 标 提 取 液 上 样 分 别 用 一 系 列 比 例 的 甲 醇 - 水 溶 液 淋 洗, 收 集 淋 洗 液, 无 需 进 一 步 洗 脱 收 集 用 以 上 淋 洗 液 直 接 进 样 分 析, 以 甲 醇 的 含 量 为 横 坐 标, 回 收 率 为 纵 坐 标, 洗 脱 分 布 曲 线 如 图 1 所 示 当 甲 醇 浓 度 大 于 10% 时, 柱 中 保 留 的 氟 甲 砜 霉 素 开 始 洗 脱, 因 此 可 以 确 定 淋 洗 液 的 浓 度 为 10% 的 甲 醇 水 溶 液 当 甲 醇 浓 度 为 60% 时, 柱 上 对 三 种 待 测 物 已 经 无 保 留, 当 甲 醇 比 例 加 大 时, 大 量 干 扰 物 质 洗 脱 下 来, 基 质 噪 音 增 大 因 此 可 以 确 定 洗 脱 液 为 60% 甲 醇 水 溶 液 进 一 步 通 过 不 同 体 积 的 10% 和 60% 甲 醇 水 溶 液 进 行 淋 洗 和 洗 脱, 对 淋 洗 液 和 洗 脱 液 的 体 积 进 行 了 优 化, 优 化 后 的 体 积 均 为 4ml, 加 大 体 积 对 回 收 率 无 明 显 改 变 66

15 R(%) 洗 脱 液 甲 醇 比 例 (%) CAP THA FF 2.3 LC-MS/MS 条 件 优 化 图 1 固 相 萃 取 洗 脱 分 布 图 1μg/mL 的 三 种 混 标 以 流 动 注 射 的 方 式 进 入 质 谱 仪, 采 用 ESI 负 离 子 电 离 模 式, 通 过 全 离 子 扫 描, 找 出 准 确 的 母 离 子 峰, 并 且 对 其 参 数 进 行 优 化, 在 碰 撞 池 将 其 打 碎, 分 别 找 出 3 个 信 号 较 强 的 碎 片 离 子, 以 母 离 子 和 子 离 子 组 成 监 测 离 子 对, 以 选 择 反 应 检 测 (SRM) 模 式 对 待 测 物 进 行 定 性 和 定 量 分 析 选 择 丰 度 最 强 并 且 色 谱 峰 上 无 干 扰 的 碎 片 离 子 组 成 的 监 测 离 子 对 m/z 321.0/152.0, m/z 354.0/289.9 和 m/z 356.0/185.0 分 别 用 于 氯 霉 素, 甲 砜 霉 素 和 氟 甲 砜 霉 素 的 的 定 量, 其 它 离 子 对 分 别 用 于 它 们 的 辅 助 定 性 本 文 以 甲 醇 - 水 为 流 动 相, 采 用 梯 度 洗 脱 的 方 式, 从 提 取 离 子 色 谱 图 ( 图 2) 可 见, 甲 砜 霉 素, 氟 甲 砜 霉 素 和 氯 霉 素 的 保 留 时 间 分 别 为 7.7,8.0 和 8.6min 图 2. 提 取 离 子 色 谱 图 67

16 2.4 方 法 的 线 性 范 围 检 出 限 回 收 率 和 精 密 度 本 方 法 采 用 外 标 曲 线 定 量 利 用 标 准 储 备 液, 以 甲 醇 稀 释, 配 制 三 种 待 测 物 的 混 合 标 准 液 以 目 标 组 分 的 峰 面 积 Y 对 相 应 的 质 量 浓 度 X(ng/mL) 做 标 准 曲 线 氯 霉 素, 氟 甲 砜 霉 素 和 甲 砜 霉 素 的 线 性 范 围, 线 性 方 程 相 关 系 数 以 及 方 法 检 出 限 (S/N 3) 如 表 3 所 列 以 阴 性 样 品 为 测 试 样 品 进 行 回 收 实 验, 得 到 的 各 种 药 物 的 回 收 率 相 对 标 准 偏 差 (RSD)(n=6) 如 表 4 所 示 3. 结 论 通 过 对 固 相 萃 取 条 件 的 优 化, 以 固 相 萃 取 对 样 品 进 行 净 化, 利 用 LC-MS/MS 同 时 测 定 了 蜂 王 浆 中 三 种 氯 霉 素 类 药 物 残 留 氯 霉 素, 氟 甲 砜 霉 素 和 甲 砜 霉 素 的 方 法 检 出 限 分 别 为 0.1ng/g,0.2ng/g 和 0.5ng/g, 满 足 于 国 内 外 的 最 低 检 出 限 要 求, 并 且 定 性 定 量 准 确, 重 现 性 好 68

17 参 考 文 献 : [1]TURTON.J. A, HAVARD.A. C, ROBINSON.S, HOLT. D. E, ANDREW.S.C. M, FAGG.R and WILLIAMS.T. C.An assessment of chloramphenicol and thiamphenicol in the induction of aplastic anaemia in the BALB/c mouse. Food and Chemical Toxicology, 2000, 38: 925~938. [2] 赵 芸, 余 玲 雁, 余 霞 奎, 许 宝 青. 水 产 品 中 氟 甲 砜 霉 素 的 残 留 分 析 方 法 研 究. 浙 江 农 业 学 报, 2004,16 (4) :218~220. [ 3 ] 沈 崇 钰, 丁 涛, 陈 惠 兰. 高 效 液 相 色 谱 - 电 喷 雾 多 级 质 谱 联 用 测 定 蜂 产 品 中 氯 霉 素 残 留. 检 验 检 疫 科 学,2003,13(6):26~28. [4]Scortichini.G, Annunziata. L, Haouet.M.N, Benedetti. F, Krusteva.I, Galarini.R. ELISA qualitative screening of chloramphenicol in muscle, eggs, honey and milk: method validation according to the Commission Decision 2002/657/EC criteria. Analytica Chimica Acta, 2005, 535 : 43~48. [5]Shen HaoYu, Jiang HaiLiang. Screening determination and confirmation of chloramphenicol in seafood, meat and honey using ELISA, HPLC UVD, GC ECD, GC MS EI SIM and GCMS NCI SIM methods. Analytica Chimica Acta, 2005, 535: 33~41. [6] Forti.A.F, Campana.G, Simonella.A, Multari.M., Scortichini.G. Determination of chloramphenicol in honey by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, 2005,529 :257~263. [7]Impens Sandra, Reybroeck Wim, Vercammen Jan, Courtheyn Dirk, Ooghe Sigrid, De Wasch Katia, Smedts Walter, De Brabander Hubert.Screening and confirmation of chloramphenicol in shrimp tissue using ELISA in combination with GC MS2 and LC MS2. Analytica Chimica Acta 2003, 483:153~163. [ 8 ] 杨 方, 陈 国 南. 高 效 液 相 色 谱 法 同 时 检 测 水 产 品 中 氯 霉 素 甲 砜 霉 素 与 氟 甲 砜 霉 素 残 留. 福 建 分 析 测 试,2005,14(1):2112~2113. [9] 陈 小 霞, 岳 振 峰, 吉 彩 霓, 梁 世 中. 高 效 液 相 色 谱 2 电 喷 雾 电 离 三 级 四 极 杆 质 谱 测 定 鸡 肉 中 氯 霉 素 甲 砜 霉 素 和 氟 甲 砜 霉 素 的 残 留 量. 色 谱,2005,23(1):92~95. [10] 彭 涛, 李 淑 娟, 储 晓 刚, 蔡 云 霞, 李 重 九. 高 效 液 相 色 谱 / 串 联 质 谱 法 同 时 测 定 虾 中 氯 霉 素 甲 砜 霉 素 和 氟 甲 砜 霉 素 残 留 量. 分 析 化 学,2005,33(4):463~

18 高 效 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 测 定 水 产 品 中 红 霉 素 的 残 留 量 于 慧 娟 蔡 友 琼 黄 冬 梅 惠 云 华 ( 中 国 水 产 科 学 研 究 院 东 海 水 产 研 究 所, 渔 业 与 环 境 水 产 品 加 工 实 验 室, 上 海,200090) 摘 要 : 建 立 了 高 效 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 测 定 水 产 品 中 红 霉 素 的 残 留 量 的 方 法, 以 红 霉 素 同 位 素 标 记 物 (Erythromycin,N,N-Dimethyl -13 C 2 ) 为 内 标 物 物, 样 品 用 乙 腈 提 取, 经 正 己 烷 去 脂 HLB 固 相 柱 萃 取 后, 内 标 法 定 量 分 析 条 件 为 : 色 谱 柱 :THERMO HypersilC 18 柱 (150 mm 2.1mm), 柱 温 : 30, 流 速 :0.3mL/min 流 动 相 :0.1mmol/L 乙 酸 和 甲 醇 方 法 检 测 限 为 1µg/kg, 线 性 范 围 1ng/mL-100ng/mL, 回 收 率 大 于 90% 关 键 词 : 高 效 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱, 水 产 品, 红 霉 素, 残 留 红 霉 素 (Erythromycin A) 是 大 环 内 脂 类 抗 生 素, 对 葡 萄 球 菌 属 各 种 链 球 菌 和 革 兰 阳 性 杆 菌 均 具 有 抗 菌 活 性, 应 用 非 常 广 泛 ; 长 期 服 用 会 出 现 乏 力 恶 心 呕 吐 腹 痛 发 热 及 肝 功 能 异 常, 严 重 者 可 引 起 听 力 减 退 红 霉 素 在 养 殖 业 ( 畜 禽 水 产 品 ) 中 主 要 用 于 细 菌 性 疾 病 的 治 疗 与 防 治 由 于 红 霉 素 在 动 物 体 内 代 谢 时 间 较 长, 因 此 不 可 避 免 地 在 动 物 体 内 产 生 残 留, 给 食 品 安 全 带 来 危 害 目 前 世 界 各 国 为 保 证 食 品 安 全 对 红 霉 素 的 使 用 和 红 霉 素 在 食 品 中 [1 ] 的 残 留 限 量 进 行 了 规 定, 我 国 农 业 部 235 号 公 告 和 欧 盟 EC 1181/2002 [ 2 ] 规 定 红 霉 素 在 动 物 组 织 中 最 大 残 留 限 量 为 200µg/kg 2006 年 国 际 食 品 法 典 兽 药 残 留 委 员 会 (CCRVDF) 第 16 届 会 议 又 一 次 规 定 红 霉 素 在 鸡 组 织 的 最 大 的 残 留 量 为 100µg/kg 为 了 适 应 国 内 外 的 发 展 的 需 要, 建 立 灵 敏 高 效 的 红 霉 素 检 测 方 法 已 是 当 务 之 急 [3] 目 前 红 霉 素 的 测 定 方 法 主 要 有 生 物 法 和 液 相 色 谱 法 两 种, 生 物 法 虽 灵 敏 度 较 高, 但 因 操 作 烦 琐 时 间 长 易 出 现 假 阳 性, 而 逐 渐 被 液 相 色 谱 法 代 替 液 相 色 谱 - 荧 光 法 液 相 色 谱 - 电 化 学 法 和 液 相 色 谱 - 质 谱 法 是 目 前 测 定 食 品 中 红 霉 素 残 留 的 主 要 方 法 由 于 红 霉 素 不 稳 定, 在 样 品 处 理 过 程 中 发 生 分 解, 影 响 了 红 霉 素 定 量 的 准 确 性, 所 以 红 霉 素 的 定 量 大 多 采 用 内 标 法 P.Edder [4] 等 采 用 液 相 色 谱 - 荧 光 法 测 定 了 动 物 源 性 食 品 中 红 霉 素 的 残 留 量, 并 进 行 了 内 标 法 ( 以 罗 红 霉 素 为 内 标 物 ) 和 外 标 法 对 比, 试 验 结 果 表 明 : 外 标 法 回 收 率 小 于 60%, 内 标 法 回 收 率 大 于 95%, 检 测 限 为 100µg/kg J.Sastre Torano[5] 等 人 以 9- 芴 代 甲 氧 基 酰 氯 为 衍 生 试 剂, 以 罗 红 霉 素 为 内 标 物 采 用 液 相 色 谱 - 荧 光 检 测 器 对 人 尿 中 红 霉 素 的 残 留 量 的 测 定 方 法 进 行 了 研 究, 回 收 率 大 于 95%, 检 测 限 达 0.3mg/L E.Dressi [7] 等 以 竹 桃 霉 素 为 内 标 物 利 用 电 化 学 检 测 器 和 紫 外 检 测 器 测 定 生 物 基 质 中 红 霉 素 的 残 留 量 回 收 率 大 于 95%, 检 出 限 为 125µg/kg GB/T [8] 采 用 罗 红 霉 素 为 内 标 物, 测 定 畜 禽 肉 中 红 霉 素 的 残 留 量, 灵 敏 度 达 1µg/kg 内 标 法 定 量 的 关 键 问 题 是 内 标 物 的 选 择, 内 标 物 选 择 不 当 将 会 影 响 被 测 物 定 量 和 定 性 的 准 确 性 从 目 前 的 药 物 使 用 情 况 来 看, 在 动 物 养 殖 业, 竹 桃 霉 素 和 罗 红 霉 素 都 有 用 做 兽 药 的 可 能, 竹 桃 霉 素 在 日 本 肯 定 列 表 中 已 被 列 入 受 控 药 物, 罗 红 霉 素 虽 未 受 控, 但 已 有 复 合 制 剂 在 销 售, 所 以 采 用 竹 桃 霉 素 或 罗 红 霉 素 为 内 标 物 测 定 动 物 组 织 中 红 霉 素 的 残 留 是 不 合 适 的 本 论 文 提 出 了 以 红 霉 素 同 位 素 标 记 物 (erythromycin,n,n-dimethyl -13 C 2 ) 为 内 标 物, 利 用 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 对 水 产 品 中 红 霉 素 的 残 留 量 进 行 测 定 通 过 样 品 前 处 理 方 法 的 研 究 液 相 色 谱 和 质 谱 条 件 的 优 化, 建 立 了 水 产 品 中 微 量 红 霉 素 残 留 量 检 测 方 法, 该 方 法 检 测 限 达 1.0µg/kg, 精 密 度 小 于 7%, 完 全 符 合 国 际 上 兽 药 残 留 检 测 的 要 求 此 方 法 的 优 点 是 1 红 霉 素 -13 C 2 是 红 霉 素 同 位 素 标 记 物, 不 是 兽 药, 因 此 用 此 做 内 标 物 无 定 性 定 量 风 险 2 红 霉 素 -13 C 2 的 性 质 同 红 霉 素 一 样, 在 样 品 处 理 过 程 中 分 解 性 质 同 红 霉 素 相 同, 因 此 采 用 红 霉 素 -13 C 2 做 内 标 物 提 高 了 红 霉 素 定 量 的 准 确 性 该 方 法 国 内 外 未 见 报 导 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 和 试 剂 高 效 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 仪 :HPLC-TSQ QUANTUMN ACESSES(Themo ELECTRON CORPERATION), 离 心 机 :TD5A-WS 上 海 湘 仪 离 心 机 厂 ), 均 质 机 :FLUKO( 上 海 弗 鲁 克 流 体 机 械 制 造 有 限 公 司 ), 旋 转 蒸 发 仪 :RE- 70

19 52A( 上 海 亚 荣 生 化 仪 器 厂 ), 固 相 萃 取 装 置 :SUPELCO 红 霉 素 A: 纯 度 95(Dr.Ehrenstorfer Gmbh), 红 霉 素 同 位 素 标 记 物 (N,N-Dimethyl -13 C 2 ): 纯 度 95( 美 国, 剑 桥 ) 乙 腈 甲 醇 : 液 相 色 谱 纯 (SIGMA 公 司 ) 正 己 烷 磷 酸 氢 二 钠 : 分 析 纯 ( 上 海 国 药 公 司 ) 乙 酸 : 液 相 色 谱 纯 (SIGMA 公 司 ) Oasis HLB 固 相 萃 取 柱 (500mg/3mL):Waters 公 司, 使 用 前 分 别 用 10 ml 甲 醇 10mL 水 5 ml 2% 氯 化 钠 溶 液 和 5 ml 0.1 mol/l 磷 酸 氢 二 钠 (PH=8) 溶 液 活 化, 保 持 柱 体 湿 润 红 霉 素 和 红 霉 素 标 记 物 标 准 储 备 溶 液 : 分 别 准 确 称 取 红 霉 素 标 准 物 质 和 红 霉 素 内 标 物 10.0 mg, 用 甲 醇 溶 解 并 分 别 定 容 至 100 ml 红 霉 素 标 准 中 间 溶 液 : 取 一 定 量 红 霉 素 储 备 溶 液, 用 甲 醇 逐 级 稀 释 配 制 成 200 ng/ml 标 准 中 间 溶 液 内 标 工 作 液 : 准 确 吸 取 一 定 量 内 标 储 备 液, 用 甲 醇 逐 级 稀 释 配 成 100 ng/ml 的 内 标 工 作 液 混 合 标 准 工 作 液 : 准 确 吸 取 一 定 量 标 准 中 间 溶 液 和 内 标 工 作 液, 用 (30+70) 甲 醇 + 水 溶 液 配 成 1.0 ng/ml 5.0 ng/ml 10.0 ng/ml 25.0 ng/ml 50.0 ng/ml ng/ml 红 霉 素 混 合 标 准 工 作 溶 液, 此 标 准 工 作 液 中 均 含 有 10 ng/ml 的 内 标 物, 使 用 前 配 制 1.2 分 析 条 件 液 相 色 谱 分 析 条 件 色 谱 柱 :Thermo Hypersil C18 柱 2.1*150mm,3.5µm, 柱 箱 温 度 :25, 流 速 :0.3mL/min, 进 样 量 :25µL; 流 动 相 : 甲 醇 +0.1mmol/L 乙 酸 水 溶 液, 梯 度 洗 脱 条 件 见 表 1 表 1 流 动 相 梯 度 洗 脱 条 件 质 谱 分 析 条 件 离 子 化 模 式 : 大 气 压 电 喷 雾 离 子 源 (ESI), 正 离 子 扫 描, 采 用 多 反 应 检 测 (SRM) 模 式, 喷 雾 电 压 :4700v, 鞘 气 压 力 :37psi, 辅 助 气 压 力 :5 psi, 离 子 传 输 毛 细 管 温 度 :300, 源 内 碰 撞 诱 解 离 电 压 :8v, 碰 撞 气 压 力 : 1.5mTorr, 红 霉 素 及 红 霉 素 同 位 素 定 性 离 子 对 定 量 离 子 对 及 碰 撞 能 量 见 表 样 品 处 理 方 法 制 样 鱼, 去 鳞 去 皮, 沿 脊 背 取 肌 肉 ; 虾, 去 头 去 壳 去 肠 腺, 取 肌 肉 部 分 ; 蟹 甲 鱼 等 取 可 食 部 分, 样 品 充 分 搅 碎 混 匀 -18 以 下 冷 冻 保 存 备 用 71

20 1.3.2 提 取 和 去 脂 将 样 品 解 冻, 称 取 5g 样 品 ( 准 确 至 0.01g) 置 于 50 ml 离 心 管 中, 加 入 100μL 内 标 工 作 液 和 15 ml 乙 腈, 立 即 搅 拌 将 其 分 散 开, 超 声 提 取 5 min, 震 荡 提 取 5 min, 以 4000 r/min 离 心 10 min, 将 上 清 液 移 入 另 一 50 ml 离 心 管 中, 加 入 2.0g 氯 化 钠 和 15mL 正 己 烷, 震 荡 10min, 以 4000 r/min 离 心 10 min, 弃 去 正 己 烷, 取 出 约 12 ml 乙 腈 于 100 ml 梨 形 瓶 中, 35 减 压 蒸 干 向 梨 形 瓶 中 加 入 7mL 0.1 mol/l 磷 酸 氢 二 钠 缓 冲 溶 液, 使 残 渣 充 分 溶 解, 然 后 加 入 4mL 的 正 己 烷, 混 合 1 min, 将 溶 液 倒 入 离 心 管 中,6000r/min 离 心 5min, 弃 去 正 己 烷 层, 下 层 溶 液 再 加 4mL 的 正 己 烷, 按 上 法 重 复 操 作 一 次 净 化 将 磷 酸 氢 二 钠 缓 冲 溶 液 加 入 到 固 相 萃 取 柱 中, 用 5mL 磷 酸 盐 缓 冲 溶 液 清 洗 离 心 管, 并 将 溶 液 加 入 柱 中, 待 样 液 全 部 流 出 后, 分 别 用 10 ml 水 和 5 ml (4+6) 甲 醇 + 水 溶 液 洗 柱, 弃 去 全 部 流 出 液, 固 相 萃 取 柱 用 真 空 泵 抽 干 60min, 用 8mL 甲 醇 洗 脱, 洗 脱 液 接 收 至 100 ml 梨 形 瓶 中,35 减 压 蒸 干 用 1 ml (3+7) 甲 醇 + 水 溶 液 溶 解 残 渣, 过 0.2µm 样 品 过 滤 头 后, 供 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 测 定 1.4 红 霉 素 及 红 霉 素 同 位 素 标 记 物 多 反 应 检 测 质 谱 图 2 方 法 评 价 方 法 回 收 率 及 精 密 度 在 确 定 检 测 方 法 后, 我 们 分 别 以 阴 性 的 大 黄 鱼 虾 鲈 鱼 和 河 蟹 为 测 试 对 象, 进 行 加 标 回 收 率 实 验, 以 考 察 方 法 72

21 的 适 用 性 实 验 采 用 5g 样 品 中 分 别 加 入 5ng 25ng 和 100ng 的 红 霉 素, 同 时 加 入 10ng 的 内 标 物, 红 霉 素 的 加 标 量 相 当 于 1µg/kg 5µg/kg 和 20µg/kg, 回 收 率 及 精 密 度 测 定 结 果 见 表 3 由 表 3 可 以 看 出, 不 论 何 种 品 种, 红 霉 素 在 加 标 浓 度 分 别 为 1µg/kg 5µg/kg 和 20µg/kg 时, 回 收 率 均 大 于 80%, 相 对 标 准 偏 差 小 于 10% 由 此 可 以 看 出 该 方 法 满 足 药 残 检 测 的 要 求 表 4 为 不 同 批 次 不 同 加 标 浓 度 的 回 收 率 测 定 结 果, 从 表 中 可 以 看 出 : 该 方 法 操 作 稳 定, 重 复 性 好, 批 间 相 对 标 准 偏 差 小 于 5% 方 法 检 测 限 方 法 的 定 量 检 出 限 是 指 在 保 证 具 有 一 定 可 靠 性 ( 准 确 度 和 精 密 度 ) 的 前 提 下, 分 析 方 法 能 够 测 定 出 的 样 品 中 药 物 的 最 低 浓 度 加 标 回 收 率 实 验 结 果 表 明, 本 方 法 红 霉 素 的 定 量 检 出 限 可 达 到 1.0µg/kg 方 法 线 性 范 围 及 标 准 曲 线 线 性 范 围 : 配 置 不 同 浓 度 红 霉 素 标 准 溶 液 1ng/mL 5ng/mL 10ng/mL 25 ng/ml,50ng/ml 100ng/mL, 此 标 准 溶 液 系 列 中 均 含 有 10 ng /ml 的 红 霉 素 标 记 物, 红 霉 素 在 1ng/mL-100ng/mL 的 范 围 内 呈 线 性 关 系, 相 关 系 数 为

22 References 1. 中 华 人 民 共 和 国 农 业 部 公 告 第 235 号 2. Official Journal of the European Communities Comminssion Regulation(EC) No.1181/ SN 出 口 肉 中 红 霉 素 的 残 留 量 的 测 定 4. P. Edder, L.Coppex,A.Cominoli C. Corvi.Analysis of erythromycin and oleandomycin residues in food by high- performance liquid chromatography with fluorometric detection.food Additives and Contaminants, 19(3): , J.Sastre Torano,H.-J.Guchelaar,Quantitative determination of the macrolide antibiotics erythromycin, roxithromycin, azithromycin and clarithromycin in human serum by high-performance liquid chromatography with 9-fluorenylmethyloxycarbonyl chloride and fluorescence detection. Journal of Chromatography B,720: , Stanley M.Billedeau,Thomas M.Heinze,Liquid Chromatography. Analysis of Erythromycin in Salmon Tissue by Electrochemical Detection with Confirmation by Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J.Agric. Food Chem. 2003, 51, E.Dreassi, P.Corti, F.Bezzini, High-performance liquid chromatographic assay of erythromycin from biological matrix using electrochemical or ultraviolet detection. Analyst 125, , GB/T 畜 禽 肉 中 林 可 霉 素 竹 桃 霉 素 红 霉 素 替 米 考 星 泰 乐 菌 素 克 林 霉 素 螺 旋 霉 素 吉 它 霉 素 交 沙 霉 素 残 留 量 的 测 定 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 74