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1 工 艺 技 术 食 品 科 学 2, Vol., No. 响 应 面 优 化 超 声 辅 助 提 取 羊 栖 菜 中 无 机 砷 张 金 玲,, 钟 耀 广 *, 万 金 庆 2, 乔 勇 进 (. 上 海 海 洋 大 学 食 品 学 院, 上 海 水 产 品 加 工 及 贮 藏 工 程 技 术 研 究 中 心, 上 海 2; 2. 上 海 市 农 业 科 学 院 农 产 品 保 鲜 加 工 研 究 中 心, 上 海 2) 摘 要 : 采 用 盐 酸 作 为 提 取 剂, 超 声 辅 助 提 取 法 对 羊 栖 菜 中 的 无 机 砷 进 行 提 取, 氢 化 物 发 生 - 原 子 荧 光 光 谱 法 (HG- AFS) 测 定 羊 栖 菜 中 的 无 机 砷 为 了 优 化 羊 栖 菜 中 无 机 砷 的 提 取 工 艺, 在 单 因 素 试 验 基 础 上, 利 用 Box-Behnken 试 验 设 计 原 理 和 响 应 面 分 析 法, 以 荧 光 强 度 为 响 应 值, 选 取 浸 提 液 浓 度 超 声 提 取 温 度 和 提 取 时 间 个 因 素, 研 究 各 因 素 及 其 交 互 作 用 对 荧 光 强 度 的 影 响 结 果 显 示 : 无 机 砷 的 最 佳 提 取 条 件 为 浸 提 液 浓 度.mol/L 提 取 温 度. 提 取 时 间 2.min, 在 此 条 件 下, 检 测 所 得 荧 光 强 度 为., 通 过 计 算 得 无 机 砷 含 量 为.8mg/kg 关 键 词 : 原 子 荧 光 法 ; 羊 栖 菜 ; 无 机 砷 ; 超 声 提 取 ; 响 应 面 Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of Inorganic Arsenic in Sargassum fusiforme (Harv.) by Response Surface Methodology ZHANG Jin-ling,ZHONG Yao-guang, *,WAN Jin-qing,QIAO Yong-jin 2 (. College of Food Science and Technology, Shanghai Engineering Research Center of Aquatic Product Processing and Preservation, Shanghai Ocean University, Shanghai 2, China;2. Agricultural Products Storage and Processing Research Center, Shanghai Academy of Agriculture Science, Shanghai 2, China) Abstract:Ultrasonic-assisted extraction was utilized to extract inorganic arsenic from Sargassum fusiforme (Harv.) by hydrochloric acid. Hydride generation atomic fluorescence spectrometry (HG-AFS) was used for the determination of inorganic arsenic. Based on the single factor tests, the Box-Behnken central composite design and response surface methodology (RSM) were adopted to obtain the optimal conditions for the extraction of inorganic arsenic from Sargassum fusiforme (Harv.), using fluorescence intensity as the response value and the extraction concentration, extraction temperature and time as the factors. The results showed that the optimum extraction conditions of inorganic arsenic were the extraction concentration. mol/l, extraction temperature. and time 2. min. Under these conditions, the fluorescence intensity was., and the content of inorganic arsenic was.8 mg/kg. Key words:atomic fluorescence spectrometry (AFS);Sargassum fusiforme (Harv.);inorganic arsenic;ultrasonicassisted extraction;response surface methodology 中 图 分 类 号 :O. 文 献 标 志 码 :A 文 章 编 号 :2-(2)-- doi:./spkx2--2 羊 栖 菜 广 泛 分 布 于 我 国 沿 海 地 区, 是 一 种 营 养 丰 富 的 食 用 藻 类, 并 且 具 有 多 种 药 用 价 值 [], 但 羊 栖 菜 中 高 含 量 的 砷 对 人 体 危 害 很 大 在 自 然 界 中, 砷 以 无 机 砷 和 有 机 砷 两 种 形 式 存 在, 各 种 价 态 与 形 态 的 砷 化 物 毒 性 相 差 很 大 [2-], 其 中,As 2 O 属 剧 毒 物, 据 上 海 市 卫 生 防 疫 站 对 小 鼠 的 LD 口 服 实 验 得 出, 无 机 砷 中 的 As 2 O 含 量 为 22.~2.mg/kg, 而 有 机 砷 中 甲 基 胂 酸 锌 的 含 量 折 算 成 As 2 O 进 行 比 较, 其 毒 性 小 了 倍 多, 毒 性 相 对 较 低 [] 因 而, 目 前 国 际 上 常 以 无 机 砷 含 量 进 行 卫 生 学 评 价 羊 栖 菜 等 海 藻 类 物 质 对 砷 的 富 集 较 强 [], 海 水 中 砷 含 量 为 ~mg/kg, 羊 栖 菜 能 将 砷 浓 缩 ~ 万 倍, 据 朱 亚 [] 尔 等 报 道, 羊 栖 菜 中 无 机 砷 含 量 为.mg/kg,GB 22 2 食 品 中 污 染 物 限 量 中 规 定 海 藻 中 无 机 砷 不 大 于.mg/kg [], 羊 栖 菜 中 无 机 砷 含 量 常 常 超 标, 所 以, 在 羊 栖 菜 的 利 用 和 加 工 中 必 须 及 时 检 测 和 有 效 地 控 制 无 机 砷 含 量 无 机 砷 的 检 测 中 关 键 问 题 是 无 机 砷 的 有 收 稿 日 期 :22-- 基 金 项 目 : 上 海 市 科 委 工 程 中 心 建 设 项 目 (DZ228) 作 者 简 介 : 张 金 玲 (8 ), 女, 硕 士 研 究 生, 研 究 方 向 为 食 品 安 全 zhangjinling2@.com * 通 信 作 者 : 钟 耀 广 ( ), 男, 教 授, 博 士, 研 究 方 向 为 食 品 安 全 与 功 能 食 品 ygzhong@shou.edu.cn

2 8 2, Vol., No. 效提取 提取时既要破坏对无机砷有吸附 配合作用的有..2 机质 使提取完全 又要避免在提取过程中 试样中有机 测量条件 仪器测量参数见表 砷转化成无机砷[8] 用盐酸浸提能破坏有干扰的有机质 表 同时 盐酸可与无机砷生成待测的气态砷化氢的中间产物 Table 氯化砷 所以采用盐酸浸提法是可取的[-] 响应面法(response surface methodology RSM)是 仪器参数 利用合理的试验设计方案 采用多元二次回归方程拟合 多个因素与多个响应值之间的函数关系 通过回归方程 寻求最佳工艺参数 [] 目前 响应面分析法被广泛用于 提取工艺优化的研究 例如吴功庆等 [2] 采用响应面分 析法对月季花多糖提取工艺进行优化研究 Sinha等 [] 采用响应面法对花瓣中天然染料的提取工艺进行优化研 究 董旭等 []研究了响应面优化法用纤维素酶提取山核 桃蒲多酚类物质 建立了四因素三水平的响应面设计方 法 得到纤维素酶法提取山核桃蒲多酚的二次多项数学 模型 目前 超声辅助法提取羊栖菜中无机砷的研究未见 报道 本实验采用该法对羊栖菜中无机砷进行提取 并 通过响应面分析法对相关工艺参数进行了优化 为羊栖 菜的开发利用提供理论依据. 材料与方法 材料与试剂 羊栖菜样品产于浙江温州 mol/l盐酸 2g/mL硼氢化钾+.g/mL氢氧化 钠溶液 临用前现配 g/ml硫脲+g/ml抗坏血 酸溶液 临用前现配 砷标准溶液 编号GBW(E)822.g/L 上海 市计量测试技术研究院 砷标准使用液 吸取砷标准溶 光电倍增管负高压/V 原子化器高度/mm 条件 2 8 屏蔽气流量/(mL/min) 读数时间/s 条件 8 灯电流/mA 载气流量/(mL/min) 延迟时间/s 测量方式. 标准曲线 样品处理 将羊栖菜(鲜样含水量约8%)样品捣碎 称取.2g(称 准至.g)左右于2mL具塞比色管中 用mol/L盐酸溶 液定容 混匀 置于预热过的超声波中 使样品充分 浸提 取出冷却 过滤 若混浊再次过滤 获得待测 溶液.. 样品测定 取待测溶液mL于mL具塞比色管中 加g/mL 硫脲+g/mL抗坏血酸溶液mL 正辛醇 8滴 用去 离子水定容 摇匀放置2min后待测 根据..2节调整仪 器工作参数 预热2 min后开始测量 依次进行标准 系列测量和样品测量 同时做试剂空白实验.. 标准系列绘制 吸取一定量砷标准储备液(.μg/mL)稀释配制 μg/L的系列砷标准溶液 分 别加入g/mL硫脲+g/mL抗坏血酸溶液mL 正辛醇 8滴 用.mol/L的盐酸定容后混匀 静置 2min 测定其荧光强度 以荧光强度(y)为纵坐标 无 机砷质量浓度(x ng/ml)为横坐标 作得标准曲线为 y=.8x 8.2(R2=.).. 无机砷含量计算 试样中无机砷含量参照以下公式进行计算 天仪器有限公司 专用砷编码空心阴极灯 h2( ρ ρ2) hhm 北京吉 式中 X为试样中无机砷含量/(mg/kg) ρ 为试样测 北京有色金 定液中无机砷的质量浓度/(ng/mL) ρ2为试剂空白质量浓 属研究总院 SKHP型科导超声波清洗器 上海科 导超声仪器有限公司. 方法.. X= 仪器与设备 AFS-型顺序注射双道原子荧光光度计 仪器参数.. 液用.mol/L盐酸稀释至.μg/mL 实验所用玻璃仪器用 2mol/L硝酸浸泡2h以上 实验用水为去离子水.2 原子荧光法测量参数 Working condition for AFS 度/(ng/mL) m为试样的质量/g 2 结果与分析 原理 在一定的超声波条件下 用盐酸浸提羊栖菜中的无 机砷 在浸提后的溶液中加入抗坏血酸-硫脲 把五价砷 单因素试验结果 浸提液浓度对荧光强度的影响 还原成三价砷 在酸性介质中 以硼氢化钾或硼氢化钠 砷元素对酸的要求不是很高 在盐酸介质中有较稳 为还原剂 将三价砷转化为砷化氢 由载气(高纯氩气)带 定的荧光强度 分别采用 mol/l优级纯的盐 入石英原子化器 受热分解为原子态砷 在特种砷空心 酸溶液用超声波(工作频率kHz 功率密度.W/cm2 温 阴极灯的照射下产生原子荧光 荧光强度与一定浓度范 度 )提取同一种羊栖菜样品2min 在相同仪器条件 围的砷溶液呈正比 与标准系列比较定量[-] 下测定荧光强度 结果见图 当盐酸浓度为mol/L时

3 2, Vol., No. 后 提取液的荧光强度趋于稳定 因此实验选择提取时 全 荧光强度小 当盐酸浓度超过mol/L时 仪器的稳 定性和重现性变差 荧光强度变小[8] 所以 本实验选 间为2min 2.2 响应面试验结果 用mol/L的盐酸为提取剂 2.2. 荧光强度较高 盐酸浓度过小 则提取的无机砷不完 根据单因素试验结果 确定最佳条件为浸提液盐酸 浓度mol/L 提取温度 提取时间2min 在此基础 上根据Box-Behnken试验设计原理 综合单因素试验所得 结果 选取浸提液浓度(A) 提取温度(B) 提取时间(C) 个因素 进行响应面分析 试验设计因素编码及水平见 表2 试验设计及结果见表 Ⲥ䝌 ᑺ/(mol/L) 图 Fig. 果如图2所示 随着提取温度的升高 羊栖菜中无机砷提取 液的荧光强度也升高 但当温度高于 后 溶液的荧光 强度没有显著增加[] 因此实验选择提取温度为 图2 2.. 因素 A浸提液浓度/(mol/L) B提取温度/ C提取时间/min 在样品用量一定 超声波工作频率kHz 功率密度.W/cm2的条件下提取2min 改变提取温度进行实验 结 2 试验设计因素编码及水平 Variables and their coded values for Box-Behnken design 浸提液浓度对荧光强度的影响 Effect of hydrochloric acid concentration on the 提取温度对荧光强度的影响 Fig.2 表2 Table 2 fluorescence intensity 2..2 模型的建立及显著性检验 ᦤপ ᑺ/ć 提取温度对荧光强度的影响 Effect of temperature on the fluorescence intensity 表 Table 试验号 水平 2 2 Box-Behnken试验结果 Results of Box-Behnken central composite experimental A浸提液浓度 B提取温度 C提取时间 荧光强度 提取时间对荧光强度的影响 表 回归模型的方差分析及显著性检验 Analysis of variance and significance test of the regression model 实验 结果见图 随着超声提取时间的延长 羊栖菜中 方差来源 模型 A B C AB AC BC A2 B2 C2 残差 失拟项 纯误差 总离差 平方和 无机砷提取液的荧光强度增加 当提取时间延长到2min 注 *. 显著(P.). 极显著(P.) Table 图 Fig. 2 2 ᦤপᯊ䯈/min 提取时间对荧光强度的影响 Effect of extraction time on the fluorescence intensity 在样品用量一定 超声波工作频率kHz 功率密度.W/cm2 温度 条件下 采用不同的提取时间进行 自由度 均方 F值 P值 显著性 *

4 2, Vol., No. 由表可知 整体模型的显著性由F检验来判定 F=. 回归模型的R2. 表明回归模型的拟合 度很好 响应值的.%是由所选变量引起的 显著性 水平P. 表明模型极显著 此外 模型方差失拟项 P.22. 不显著 说明这种试验方法可靠 回 归方程对试验结果拟合情况较好 从表可以看出 所考 察的因素A B及C所对应的P值均小于. 说明浸提液 浓度 提取温度 提取时间对于荧光强度有显著影响 且 显著性大小的排序为浸提液浓度 提取温度 提取时间 利用Design-Expert统计软件对表中试验数据进行回 归拟合 由Box-Behnken程序计算得到以下回归方程 Y=.28.A 8.B 8.8C.AB B ᦤপ ᑺ/ć C ᦤপᯊ䯈/min পᯊ ᑺ/ć. 䯈/m প ᦤ B in C ᦤপᯊ䯈/min B ᦤপ ᑺ/ć 各因素交互作用对荧光强度的响应面和等高线 Response surface and contour plots showing the effects of extraction time and temperature on fluorescence intensity 2. 验证实验 按照响应面分析法设计优化无机砷提取的最佳工... /L) mol.. প ᑺ/( ᑺ/ć ᦤ A Bᦤ.2... 艺条件 对响应面分析法的可靠性重复进行次平行实 验发现 荧光强度分别为 和. 荧光强度的平均值为.(无机砷含 量为.mg/kg) 与理论预测值.(无机砷含量为.8mg/kg)的相对误差为.8% A ᦤ ᑺ/(mol/L).. Cᦤ Fig. 2. A ᦤ ᑺ/(mol/L) 图 AC 2.2BC 2.8A2.B2.C 响应面分析 根据回归方程 作响应曲面图 考察所拟合的响应 曲面的形状 分析浸提液浓度 提取温度 提取时间对 荧光强度的影响 响应曲面及其等高线如图所示 从响 应面的最高点和等值线可以看出 在所选的范围内存在 极值 即是响应面的最高点和等值线的中心 为进一步 求得各因素的最优条件 对回归方程进行数学处理 令 一阶偏导数为 求得A B C所对应的编码值为...8 将该条件代入模型方程 得荧光强度为. 根据模型计算出的无机砷最佳提取条件为 浸提 液浓度.mol/L 提取温度. 提取时间2.min Cᦤ /L).. mol পᯊ.. ᑺ/( 䯈/m in ᦤ A 讨 论 本研究采用超声波辅助法提取羊栖菜中无机砷 与传统的国标水浴法提取相比 该方法有很多优点 水 浴法需要在 提取8h 超声波辅助法在 提取仅需 2min 提取时间短 温度较低 具有方便 快速 节能 等优点 本方法检测羊栖菜中无机砷含量为.8mg/kg 国标水浴法为.8mg/kg 该法得到的数据与国标法相 近 因此 超声辅助法提取效果好 方法可行性强.2 超声辅助提取法能较好地提取出羊栖菜中的无机 砷 但由于产地不同 季节不同 羊栖菜中无机砷含量 也会稍有差异 有待进一步研究 经检测羊栖菜中的无

5 工 艺 技 术 食 品 科 学 2, Vol., No. 机 砷 含 量 高 于 其 他 海 藻 ( 海 带 紫 菜 等 ) [2], 所 以 食 用 未 经 加 工 过 的 羊 栖 菜 一 般 需 要 长 时 间 用 水 浸 泡, 以 降 低 无 机 砷 含 量. 当 浸 提 液 酸 浓 度 比 较 高 时, 经 过 仪 器 测 量 的 荧 光 强 度 不 稳 定, 平 行 实 验 波 动 较 大. 本 实 验 采 用 的 超 声 清 洗 机 是 槽 式 超 声 波 清 洗 机, 其 频 率 是 固 定 的, 今 后 有 待 从 超 声 频 率 以 及 超 声 声 强 超 声 发 射 方 式 ( 探 头 式 和 槽 式 ) 等 方 面 进 一 步 开 展 研 究 结 论. 超 声 波 辅 助 法 提 取 羊 栖 菜 中 无 机 砷, 与 传 统 的 国 标 水 浴 法 提 取 相 比, 优 点 较 多 该 法 提 取 时 间 短 温 度 较 低, 具 有 方 便 快 速 节 能 等 优 点.2 本 实 验 研 究 了 个 单 因 素 对 超 声 辅 助 提 取 无 机 砷 的 荧 光 强 度 影 响 后, 再 采 用 Box-Behnken 试 验 对 因 素 和 水 平 进 行 优 化, 得 出 最 佳 提 取 工 艺 条 件 为 浸 提 液 盐 酸 浓 度.mol/L 超 声 波 提 取 温 度. 超 声 波 提 取 时 间 2.min, 在 此 工 艺 条 件 下, 荧 光 强 度 的 理 论 值 为., 经 验 证 的 实 际 测 得 值 为., 相 对 误 差 为.8% 参 考 文 献 : [] CHEN Xiaoming, NIE Wenjian, YU Guoqing. Antitumor and immunomodulatory activity of polysaccharides from Sargassum fusiforme[j]. Food and Chemical Toxicology, 22, (/): -. [2] ILGEN A G, RYCHAGOV S N, TRAINOR T P. Arsenic speciation and transport associated with the release of spent geothermal fluids in Mutnovsky field (Kamchatka, Russia)[J]. Chemical Geology, 2, 288(/): -2. [] GENG Wenhua, KOMINE R, OHTA T, et al. Arsenic speciation in marine product samples: comparison of extraction HPLC method and digestion-cryogenic trap method[j]. Talanta, 2, (2): -. [] 靳 敏, 夏 玉 宇. 食 品 检 验 技 术 [M]. 北 京 : 化 学 工 业 出 版 社, 2: -. [] DIAZ O, TAPIA Y, MUNOZ O, et al. Total and inorganic arsenic concentrations in different species of economically important algae harvested from coastal zones of Chile[J]. Food and Chemical Toxicology, 22, (/): -. [] 朱 亚 尔, 李 俊, 李 士 敏. 不 同 产 地 的 几 种 海 藻 中 砷 的 形 态 和 含 量 分 析 [J]. 环 境 化 学, 2, 2(): 8-8. [] 中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会. GB 22 2 食 品 中 污 染 物 限 量 [S]. 北 京 : 中 国 标 准 出 版 社, 2. [8] MORETTO A L, CADORE S. Determination of arsenic in food samples by hydride generation atomic absorption spectrometry[j]. Mikrochimica Acta, 2, (/): 2-2. [] 崔 昆 燕, 谢 美 琪. 氢 化 物 发 生 - 原 子 荧 光 光 谱 法 测 定 贻 贝 中 的 砷 [J]. 光 谱 实 验 室, 2, 2(): 8-. [] SZKODA J, ZMUDZKI J, GRZEBALSKA A. Determination of arsenic in biological material by hydride generation atomic absorption spectrometry method[j]. Bull Vet Inst Pulawy, 2, (2): [] WANG Qiang, ZHONG Kui. Optimization of ultrasonic extraction of polysaccharides from dried longan pulp using response surface methodology [J]. Carbohydrate Polymers, 2, 8(): -2. [2] 吴 功 庆, 易 运 红, 张 嘉 骏. 响 应 面 分 析 法 对 月 季 花 多 糖 提 取 工 艺 的 优 化 [J]. 贵 州 农 业 科 学, 2, (): -. [] SINHA K, SAHA P D, DATTA S. Extraction of natural dye from petals of flame of forest (Butea monosperma) flower: process optimization using response surface methodology (RSM)[J]. Dyes and Pigments, 22, (2): [] 董 旭, 杜 先 锋. 响 应 面 法 优 化 纤 维 素 酶 提 取 山 核 桃 蒲 多 酚 类 物 质 [J]. 食 品 科 学, 2, (): -. [] KARADJOVA I B, LAMPUGNANI L, ONOR M, et al. Continuous flow hydride generation atomic fluorescence spectrometric determination and speciation of arsenic in wine[j]. Spectrochimica Acta (Part B): Atomic Spectroscopy, 2, (): [] ZHANG Ni, FU Na, FANG Zitong, et al. Simultaneous multi-channel hydride generation atomic fluorescence spectrometry determination of arsenic, bismuth, tellurium and selenium in tea leaves[j]. Food Chemistry, 2, 2(): [] LEAL L O, FORTEZA R, CERDA V. Speciation analysis of inorganic arsenic by a multisyringe flow injection system with hydride generation-atomic fluorescence spectrometric detection[j]. Talanta, 2, (2): -8. [8] 苗 雪 原. 流 动 注 射 - 氢 化 物 发 生 - 原 子 吸 收 光 谱 法 测 定 食 品 中 的 无 机 砷 [J]. 理 化 检 验 : 化 学 分 册, 2, (): -2. [] 钱 宇 红. 超 声 波 提 取 原 子 荧 光 光 度 法 测 定 紫 菜 中 的 无 机 砷 含 量 [J]. 化 学 分 析 计 量, 28, (): -. [2] 陈 辉, 于 平 胜, 刘 振 林. 海 苔 中 无 机 砷 测 定 方 法 的 对 比 [J]. 现 代 预 防 医 学, 2, (): 2-2;.