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1 生 物 工 程 学 报 Chinese Journal of Biotechnology 范 翠 英 等 / 人 蛋 白 酶 体 亚 基 PSMB1 的 重 组 表 达 纯 化 及 在 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 体 外 筛 选 中 的 应 用 February 25, 2012, 28(2): Chin J Biotech, All rights reserved 生 物 技 术 与 方 法 233 PSMB1 范 翠 英 1,2, 冯 利 兴 2, 张 冬 梅 2, 潘 素 娜 1,2, 刘 璇 2, 果 德 安 2, 樊 金 玲 1 1 河 南 科 技 大 学 食 品 与 生 物 工 程 系, 河 南 洛 阳 中 国 科 学 院 上 海 药 物 研 究 所, 上 海 范 翠 英, 冯 利 兴, 张 冬 梅, 等. 人 蛋 白 酶 体 亚 基 PSMB1 的 重 组 表 达 纯 化 及 在 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 体 外 筛 选 中 的 应 用. 生 物 工 程 学 报, 2012, 28(2): Fan CY, Feng LX, Zhang DM, et al. Expression, purification of poteasome subunit PSMB1 and application in screening of possible proteasome inhibitors. Chin J Biotech, 2012, 28(2): 摘 要 : 蛋 白 酶 体 是 真 核 细 胞 中 的 一 类 多 亚 基 蛋 白 酶 复 合 物, 它 在 胞 内 蛋 白 质 降 解 的 泛 素 - 蛋 白 酶 体 通 路 中 起 关 键 作 用 重 组 表 达 蛋 白 酶 体 的 活 性 亚 基 可 以 用 于 在 体 外 筛 选 寻 找 具 有 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 作 用 的 化 合 物 将 人 蛋 白 酶 体 催 化 亚 基 (PSMB1)cDNA 的 编 码 区 ( 全 长 726 bp) 克 隆 至 原 核 表 达 载 体 pet28a(+), 构 建 重 组 质 粒 pet28a-psmb1, 转 化 大 肠 杆 菌 BL21(DE3), 通 过 1 mmol/l IPTG,20 过 夜 诱 导, 获 得 相 对 分 子 量 约 为 27 kda 的 重 组 蛋 白, 采 用 IMAC 亲 和 层 析 柱 纯 化 重 组 蛋 白, 纯 化 后 的 重 组 蛋 白 纯 度 超 过 95% 重 组 蛋 白 酶 解 后 经 NanoLC-MS/MS 鉴 定 表 明 所 表 达 的 融 合 蛋 白 氨 基 酸 序 列 完 全 正 确 在 体 外 BIAcore 分 析 中, 重 组 蛋 白 表 现 出 对 不 同 化 合 物 的 选 择 性 结 合 能 力, 其 中 与 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 雷 公 藤 红 素 的 结 合 较 强,10 μmol/l 的 雷 公 藤 红 素 与 重 组 蛋 白 的 结 合 达 到 27 RU, 并 且 具 有 良 好 的 浓 度 依 赖 型 本 研 究 建 立 了 表 达 纯 化 人 蛋 白 酶 体 催 化 亚 基 PSMB1 的 方 法, 并 应 用 于 具 有 蛋 白 酶 体 抑 制 活 性 化 合 物 的 体 外 筛 选 关 键 词 : PSMB1, 原 核 表 达,BIAcore, 体 外 筛 选 Expression, purification of poteasome subunit PSMB1 and application in screening of possible proteasome inhibitors Cuiying Fan 1,2, Lixing Feng 2, Dongmei Zhang 2, Suna Pan 1,2, Xuan Liu 2, De an Guo 1, and Jinling Fan 1 1 College of Food & Engineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang , Henan, China Received: June 28, 2011; Accepted: August 29, 2011 Corresponding author: Xuan Liu. Tel: ; Fax: ; lillianliucn@yahoo.com.cn Jinling Fan. fan @yahoo.com.cn

2 234 ISSN CN /Q Chin J Biotech February 25, 2012 Vol.28 No.2 2 Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai , China Abstract: Proteasome is a multi-subunit protease complex in eukaryocytes, and plays an important role in ubiquitin-proteosome pathway. Recombinant proteasome can be used to screen proteasome inhibitors. In this study, recombinant plasmid of pet28a-psmb1 was constructed by inserting human proteasome catalytic subunit (PSMB1) cdna (726bp) into the prokaryotic expression vector pet28a(+), and transforming the plasmid into E. coli BL21(DE3) cells for expression. After overnight induction (1 mmol/l IPTG, 20 C), an expected protein band with molecular weight of 27 kda was observed on SDS-PAGE gel. The recombinant protein was then purified through affinity chromatography, and the purity is more than 95%. The amino acid sequence of the recombinant protein was validated by NanoLC-MS/MS. The data from in vitro BIAcore analysis showed that the recombinant PSMB1 could bind to celastrol. The binding affinity between PSMB1 and 10 μmol/l celastrol was more than 27RU. Keywords: PSMB1, prokaryotic expression, BIAcore, screening in vitro 泛 素 - 蛋 白 酶 体 通 路 (Ubiquitin-proteosome pathway) 是 真 核 细 胞 中 蛋 白 质 降 解 的 重 要 途 径 蛋 白 酶 体 (Proteasomes) 普 遍 存 在 于 所 有 真 核 细 胞 的 细 胞 核 和 细 胞 质 中, 最 常 见 的 蛋 白 酶 体 的 形 式 是 26S 蛋 白 酶 体, 由 一 个 20S 催 化 亚 基 与 2 个 19S 调 节 亚 基 组 成, 对 肽 键 的 裂 解 作 用 是 通 过 20S 催 化 亚 基 N 末 端 氨 基 酸 残 基 的 亲 和 反 应 来 完 成 [1] 拟 降 解 的 靶 蛋 白 经 过 泛 素 化 后, 先 被 19S 亚 单 位 识 别, 随 后 进 入 20S 催 化 中 心 被 降 解 成 3~22 个 氨 基 酸 片 段 并 释 放 出 游 离 的 泛 素 [2] 由 于 蛋 白 酶 体 参 与 降 解 细 胞 内 多 种 目 标 靶 蛋 白, 因 此 其 功 能 调 节 可 以 影 响 基 因 转 录 细 胞 周 期 信 号 转 导 及 细 胞 凋 亡 等 多 种 生 理 过 程, 对 基 因 的 转 录 翻 译 细 胞 的 增 殖 分 化 及 恶 变 均 有 重 要 影 响 [3-4] 因 此 蛋 白 酶 体 将 成 为 影 响 细 胞 功 能 的 重 要 药 物 靶 标 [5] 例 如, 寻 找 能 够 与 20S 催 化 亚 基 单 位 共 价 结 合, 进 而 改 变 其 酶 切 位 点 活 性 的 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 已 成 为 近 年 来 恶 性 肿 瘤 治 疗 的 研 究 热 点 第 一 个 进 入 临 床 的 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 是 英 国 剑 桥 Millennium Pharmaceuticas 公 司 的 二 肽 硼 酸 盐 类 药 物 硼 替 佐 米 (Bortezomib) 这 是 一 种 缓 慢 作 用 于 糜 蛋 白 酶 位 点 的 可 逆 抑 制 剂 还 有 2 种 处 于 临 床 前 研 究 的 新 药,salinosporamide A (NPI-0052, 圣 地 亚 哥 ) 和 PR-171 (Proteolix, 旧 金 山 ) 其 中 salinosporamide A 是 口 服 药 物, 它 不 同 于 硼 替 佐 米, 是 一 种 自 然 提 取 物, 类 似 于 乳 胞 素, 能 够 不 可 逆 地 作 用 于 蛋 白 酶 体 的 活 性 亚 基, 而 且 其 对 蛋 白 酶 体 催 化 活 性 的 抑 制 具 有 特 异 性 PR-171 是 一 种 合 成 的 能 够 不 可 逆 地 作 用 于 糜 蛋 白 酶 位 点 的 抑 制 剂, 来 源 于 环 氧 霉 素, 是 目 前 已 知 的 选 择 性 最 强 的 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 重 组 表 达 蛋 白 酶 体 的 活 性 亚 基, 可 以 用 于 在 体 外 高 通 量 快 速 地 筛 选 可 能 具 有 蛋 白 酶 体 抑 制 作 用 的 化 合 物 本 研 究 构 建 了 蛋 白 酶 体 20S 催 化 亚 基 PSMB1 ( 全 长 726 bp) 的 表 达 质 粒, 在 原 核 表 达 系 统 中 实 现 PSMB1 的 可 溶 性 表 达, 利 用 固 相 化 金 属 亲 合 层 析 (Immobilized metal-affinity chromatography,imac) 柱 对 表 达 产 物 纯 化, 获 得 了 纯 度 较 高 的 重 组 蛋 白 质 谱 鉴 定 证 实 所 表 达 的 重 组 蛋 白 氨 基 酸 序 列 完 全 正 确 BIAcore

3 范 翠 英 等 / 人 蛋 白 酶 体 亚 基 PSMB1 的 重 组 表 达 纯 化 及 在 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 体 外 筛 选 中 的 应 用 235 (Biomolecular interaction analysis) 分 析 表 明 PSMB1 重 组 蛋 白 对 不 同 化 合 物 表 现 出 差 异 的 结 合 能 力 本 研 究 为 建 立 以 蛋 白 酶 体 为 分 子 靶 点 筛 选 特 异 性 抑 制 剂 的 体 外 筛 选 模 型 提 供 了 纯 化 的 PSMB1 重 组 蛋 白 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 菌 株 和 质 粒 大 肠 杆 菌 菌 株 DH5α/BL21 (DE3) 购 自 北 京 全 式 金 生 物 有 限 公 司 表 达 载 体 pet28a (+) 由 本 实 验 室 保 存 PSMB1 cdna 购 于 Thermo 公 司 酶 和 主 要 试 剂 EcoR Ⅰ Hind Ⅲ 限 制 性 内 切 酶 购 于 北 京 NEB 公 司 T4 DNA 连 接 酶 Taq 酶 PCR 试 剂 盒 均 购 于 TaKaRa 公 司 质 粒 提 取 及 纯 化 试 剂 盒 购 于 博 大 泰 克 生 物 基 因 技 术 有 限 公 司 PCR 扩 增 引 物 及 DNA 测 序 由 上 海 英 骏 生 物 技 术 有 限 公 司 完 成 IPTG 卡 那 霉 素 为 鼎 国 生 物 技 术 有 限 公 司 产 品 固 相 化 金 属 亲 合 层 析 (Immobilized metal-affinity chromatography, IMAC) 柱 购 自 上 海 Bio-Rad 公 司 二 硫 苏 糖 醇 (DTT) 和 碘 乙 酰 胺 为 Sigma 公 司 产 品, 甲 酸 (FA) 购 自 美 国 TEDIA 公 司, 胰 蛋 白 酶 (Trypsin) 购 自 美 国 (Promega) 公 司, 乙 腈 为 色 谱 纯 (Honeywell) 其 他 试 剂 均 为 国 产 分 析 纯 其 他 试 剂 均 为 分 析 纯 NanoLC-MS/MS 分 析 仪 器 Tempo nano MDLC 色 谱 系 统 质 谱 仪 (4000 QTRAP LC-MS/MS) 美 国 Applied Biosysterms 公 司 ;C18 反 相 分 析 柱,MICHROM Magic C18 5 μm 100Å mm 150 mm 美 国 MICHROM 公 司 1.2 方 法 表 达 载 体 pet28a-psmb1 的 构 建 根 据 GenBank 中 PSMB1 基 因 的 编 码 序 列 (Accession No. NM_ ) 及 表 达 载 体 pet28a (+) 的 多 克 隆 酶 切 位 点, 设 计 特 异 性 引 物 : 上 游 :5' CGGAATTCATGTTGTCCTCTAC AGC CATGTATTC-3' ( 下 划 线 为 EcoR Ⅰ 酶 切 位 点 ) 下 游 :5' CCCTCGAGCGTCCTTCCTTAA GGAAACAGTTTCCT-3' ( 下 划 线 为 Xho Ⅰ 酶 切 位 点 ) 以 PSMB1 cdna ( 全 长 726 bp) 为 模 板, 扩 增 出 目 的 基 因 PCR 反 应 程 序 为 :94 预 变 性 2 min;94 30s,58 30s,72 1 min,30 个 循 环 ;72 延 伸 5 min 胶 回 收 纯 化 的 PCR 产 物 采 用 EcoR Ⅰ Xho Ⅰ 双 酶 切, 再 经 过 电 泳 回 收 纯 化 后 与 经 过 同 样 处 理 的 pet28a (+) 连 接, 连 接 产 物 转 化 大 肠 杆 菌 DH5α 感 受 态 细 胞, 利 用 卡 那 霉 素 抗 性 筛 选 阳 性 克 隆, 挑 选 单 菌 落, 小 提 质 粒 后 经 PCR 及 双 酶 切 分 析 验 证 后, 进 行 DNA 测 序 鉴 定 重 组 蛋 白 的 可 溶 性 表 达 将 构 建 成 功 的 重 组 质 粒 pet28a-psmb1 转 化 感 受 态 的 大 肠 杆 菌 BL21 (DE3), 挑 选 单 菌 落, 接 种 于 5 ml LB/Km (50 μg/ml) 液 体 培 养 基, 扩 大 培 养 至 OD 600 约 0.8 左 右, 加 入 终 浓 度 1.0 mmol/l IPTG 诱 导 培 养 (20 ), 每 隔 1 h 分 别 取 样,5 h 后 剩 余 菌 体 过 夜 诱 导 次 日, 离 心 收 集 菌 体, 进 行 SDS-PAGE 分 析 其 中 以 不 加 诱 导 剂 的 菌 体 为 对 照 目 的 蛋 白 的 纯 化 及 NanoLC-MS/MS 分 析 诱 导 表 达 的 菌 体 经 离 心 收 集 后, 将 沉 淀 cjb@im.ac.cn

4 236 ISSN CN /Q Chin J Biotech February 25, 2012 Vol.28 No.2 重 悬 于 预 冷 的 裂 解 缓 冲 液 (300 mmol/l KCl, 50 mmol/l KH 2 PO 4,5 mmol/l 咪 唑,pH 8.0), 超 声 破 碎, r/min 离 心 30 min 后 收 集 上 清, 经 0.45 μm 膜 过 滤 后 用 Profinity IMAC 柱 纯 化 亲 合 柱 先 用 结 合 缓 冲 液 平 衡 10 个 柱 体 积, 上 样 流 速 为 1 ml/min, 然 后 依 次 用 含 10 mmol/l 30 mmol/l 咪 唑 的 洗 涤 缓 冲 液 洗 去 柱 子 上 非 特 异 性 结 合 的 蛋 白, 脱 盐 缓 冲 液 (137 mmol/l NaCl,2.7 mmol/l KCl,4.3 mmol/l Na 2 HPO 4, 8.1 mmol/l KH 2 PO 4,pH 7.4) 脱 盐, 最 后 用 含 250 mmol/l 咪 唑 的 洗 脱 缓 冲 液 洗 脱 目 的 蛋 白 依 次 收 集 穿 透 液 (1A) 洗 杂 液 (1B) 洗 杂 液 (1C) 洗 脱 液 (1D), 纯 化 的 蛋 白 经 超 滤 浓 缩 后 以 Bradford 测 定 蛋 白 含 量, 得 到 最 终 的 目 的 蛋 白 12% SDS-PAGE 分 析 目 的 蛋 白 NanoLC-MS/MS 分 析 切 取 胶 内 目 标 蛋 白 条 带, 用 含 30% 乙 腈 / 100 mmol/l (NH 4 ) 2 CO 3 脱 色, 真 空 干 燥 脱 水 将 新 配 制 的 100 mmol/l DTT 的 100 mmol/l 碳 酸 氢 铵 溶 液 加 入 脱 色 干 燥 后 的 胶 片 管 内, 使 胶 片 水 化 56 水 浴, 还 原 l h, 弃 去 DTT 溶 液, 加 入 乙 腈 放 置 5 min 吸 去, 真 空 干 燥 15 min 加 入 100 μl 55 mmol/l 碘 乙 酰 胺 的 100 mmol/l 碳 酸 氢 铵 溶 液, 烷 基 化 半 胱 氨 酸 残 基 上 的 巯 基 室 温 暗 室 中 放 置 l h, 弃 去 上 清 液, 重 复 上 述 步 骤 在 完 全 脱 水 的 胶 片 中 加 入 10 ng/μl 胰 蛋 白 酶 液 适 量,4 放 置 30 min 使 酶 液 完 全 吸 收, 再 补 加 25 mmol/l 碳 酸 氢 钱 缓 冲 液 适 量,37 孵 育 过 夜 加 入 100 μl 60% 乙 腈 /0.1 FA, 超 声 提 取 15 min, 吸 取 上 清 液, 反 复 3 次, 合 并 3 次 提 取 液, 真 空 浓 缩 至 干 采 用 API 4000 Qtrap 串 联 四 极 杆 - 线 性 离 子 阱 质 谱 仪 与 在 线 Tempo nano MDLC 色 谱 系 统 相 连, 样 品 以 5 μl/min 的 流 速 进 样,300 nl/min 流 速 冲 洗 脱 盐 流 动 相 A 液 :98% 水,2% 乙 腈, 0.1% 甲 酸 ; 流 动 相 B 液 :2% 水,98% 乙 腈, 0.1% 甲 酸 液 动 相 洗 脱 梯 度 :5% 2 min,5%~ 10% 6 min,10%~30% 42 min,30%~50% 10 min,50%~95% 15 min,95% 20 min, 95%~5% 5 min,5% 5 min MS 选 用 IDA (Information dependent aequisition) 阳 离 子 模 式, 仪 器 参 数 设 置 如 下 :Curtain gas (20),Ionspray voltage (2 300 V),Ion source gas (30),Interface heater temperature (150 ),Collision gas (High), Declustering potential (80),Entrance potential (10) and Collision cell exit potential (15) 第 1 级 四 极 杆 和 第 3 级 四 极 杆 扫 描 分 辨 率 设 置 为 unit ; 选 择 目 标 离 子 传 输 窗 口 为 0.7 Da; 每 对 离 子 对 处 理 时 间 为 50 ms BIAcore 分 析 重 组 PSMB1 与 雷 公 藤 红 素 的 结 合 活 性 BIAcore 技 术 是 基 于 一 种 表 面 等 离 子 共 振 (Surface plasmon resonance technology,spr) 的 物 理 光 学 现 象 的 生 物 传 感 器 分 析 技 术, 它 利 用 全 反 射 时 入 射 光 可 以 和 金 属 表 面 的 等 离 子 发 生 共 振 的 原 理, 探 测 生 物 分 子 之 间 是 否 发 生 作 用 以 及 反 应 的 动 力 学 参 数 在 研 究 两 分 子 的 相 互 作 用 时, 将 一 种 分 子 固 定 在 传 感 器 表 面, 而 另 一 种 分 子 的 溶 液 流 过 其 表 面, 两 种 分 子 的 结 合 会 使 传 感 器 表 面 的 折 射 率 改 变, 从 而 检 测 两 分 子 间 的 相 互 作 用 本 研 究 通 过 氨 基 偶 联 方 法 将 PMSB1 偶 联 到 CM5 芯 片 的 FC4 通 道 上 HBS-EP 作 为 工 作 缓 冲 液,PMSB1 用 10 mmol/l NaAC (ph 4.13) 1 15 稀 释 芯 片 表 面 用 0.2 mol/l EDC ( 活 化 剂 ) 和

5 范 翠 英 等 / 人 蛋 白 酶 体 亚 基 PSMB1 的 重 组 表 达 纯 化 及 在 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 体 外 筛 选 中 的 应 用 mmol/l NHS ( 活 化 剂 ) 1 1 混 合 以 10 μl/min 的 流 速 进 样 7 min, 然 后 注 射 受 体 溶 液, 以 1 mol/l 乙 醇 胺 (ph 8.5), 进 样 7 min, 封 闭 活 化 的 芯 片 表 面 用 HBS-EP 缓 冲 液 稀 释 待 测 配 体 浓 度 为 1 µmol/l 和 10 µmol/l, 离 心 后 自 动 进 样, 检 测 不 同 浓 度 配 体 与 受 体 的 结 合 活 性 对 有 结 合 活 性 的 配 体 进 行 详 细 的 动 力 学 实 验 2 结 果 2.1 PSMB1 基 因 的 PCR 扩 增 PCR 扩 增 PSMB1 cdna, 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 3.5 g/l 上 样 20 μg, 几 乎 无 杂 带, 蛋 白 纯 度 大 于 95% ( 图 4) 2.5 NanoLC-MS/MS 分 析 PSMB1 重 组 蛋 白 从 SDS-PAGE 胶 上 切 取 PSMB1 融 合 蛋 白 片 段, 胶 内 酶 解 后, 进 入 NanoLC-MS/MS 质 谱 分 析, 实 验 获 得 的 MS/MS 数 据 由 ProteinPilot 3.0 软 件 数 据 库 进 行 自 动 处 理, 蛋 白 鉴 定 置 信 度 设 置 为 95%, 共 检 测 到 34 个 肽 段 如 表 1 所 示 表 明 所 表 达 的 蛋 白 即 为 PSMB1 融 合 蛋 白 可 见 一 条 大 小 约 为 726 bp 的 DNA 条 带, 与 预 期 结 果 一 致 ( 图 1) 2.2 表 达 载 体 pet28a-psmb1 的 构 建 及 鉴 定 成 功 构 建 重 组 表 达 质 粒 pet28a-psmb1, 经 EcoR Ⅰ Xho Ⅰ 双 酶 切 后, 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 析 可 见 约 726 bp 和 bp 两 条 带, 与 预 期 结 果 相 符 ( 图 2) 2.3 重 组 蛋 白 PSMB1 的 诱 导 表 达 pet28a-psmb1 转 化 宿 主 菌 BL21 (DE3), 图 1 PCR 产 物 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 图 Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of PCR products. 1: DNA marker (Marker Ⅲ); 2: PCR product of PSMB1. IPTG 诱 导 后, 经 12% SDS-PAGE 分 析 可 见 一 条 分 子 量 约 为 27 kda 的 明 显 的 新 增 表 达 条 带 根 据 表 达 条 带 的 浓 度 变 化 趋 势 选 择 过 夜 诱 导 为 最 佳 培 养 时 间 ( 图 3) 2.4 表 达 蛋 白 的 纯 化 重 组 蛋 白 利 用 IMAC 柱 亲 和 纯 化, 依 次 用 不 同 浓 度 的 咪 唑 洗 脱, 分 别 收 集 穿 透 液 洗 杂 液 洗 杂 液 2 洗 脱 液 进 行 SDS-PAGE 分 析 在 上 清 与 洗 脱 液 洗 脱 后 的 回 收 液 中 均 发 现 目 标 蛋 白, 大 小 约 为 27 kda, 与 预 期 结 果 吻 合 纯 化 后 的 蛋 白 经 超 滤 离 心 后,Bradford 测 定 蛋 白 含 量 为 图 2 重 组 质 粒 pet28a-psmb1 酶 切 鉴 定 Fig. 2 Identification of recombinant plasmid pet28a-psmb1 by enzyme digestion. 1: marker III; 2 3: pet28a-psmb1 digested with EcoR I and Xho I. cjb@im.ac.cn

6 238 ISSN CN /Q Chin J Biotech February 25, 2012 Vol.28 No.2 图 3 PSMB1 的 诱 导 表 达 Fig. 3 Induced expression of PSMB1. 1,10: marker; 2: total protein before induction; 3 9: total protein in 1 6 hours after induction; 10: total protein overnight induction. 图 4 PSMB1 重 组 蛋 白 的 纯 化 Fig. 4 Purification of PSMB1 recombinant protein. 1: marker; 2: precipitate of cell lysate; 3: culture supernatant; 4: flowthrough (A); 5: wash (B); 6: wash (C); 7: concentrated purification protein (D). 图 5 是 表 1 中 序 列 为 DVFISAAER DVYTGDALR (MH 2+ =999.39) 的 MS/MS 分 析 结 果 2.6 重 组 蛋 白 PSMB1 与 雷 公 藤 红 素 的 体 外 结 合 BIAcore 初 筛 结 果 显 示, 不 同 的 化 合 物 ( 配 体 ) 与 受 体 PSMB1 的 结 合 能 力 各 不 相 同, 结 果 见 表 2 其 中, 雷 公 藤 红 素 (Celastrol) 与 受 体 PSMB1 最 强, 响 应 值 达 27RU, 且 表 现 出 浓 度 依 赖 性 不 同 浓 度 的 雷 公 藤 红 素 ( µmol/l) 与 PSMB1 之 间 的 相 互 作 用 如 图 6 所 示 图 中 从 上 到 下 的 曲 线 依 次 是 浓 度 由 高 到 低 的 雷 公 藤 红 素 在 PSMB1 表 面 流 过 的 响 应 值 用 Biacore3000 分 析 软 件 中 的 1 1 Langmuir 结 合 模 型 对 图 6 的 曲 线 进 行 拟 合, 得 到 k a (1/Ms) 值 为 15.7,k d (1/s) 值 为 ,K D (μmol/l) 为 903,Chi 2 为 1.09

7 范 翠 英 等 / 人 蛋 白 酶 体 亚 基 PSMB1 的 重 组 表 达 纯 化 及 在 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 体 外 筛 选 中 的 应 用 239 表 1 重 组 PSMB1 蛋 白 NanoLC-MS/MS 鉴 定 结 果 Table 1 Identification of PSMB1 recombinant protein by NanoLC-MS/MS Number Sequence Score 1 AGGSASAMLQPLLDNQVGFK 20 2 AMTTGAIAAMLSTILYSR 24 3 DVFISAAERDVYTGDALR 14 4 GAVYSFDPVGSYQR 19 5 KNMQNVEHVPLSLDR 19 6 LTDKTVIGCSGFHGDCLTLTK 16 7 LVKDVFISAAER 17 8 MYKHSNNKAMTTGAIAAMLSTILYSR 18 9 RFFPYYVYNIIGGLDEEGKG TVIGCSGFHGDCLTLTK DVFISAAER EGIREETVSLR EGIREETVSLRK FISAAERDVYTGDALR PLLDNQVGFK FFPYYVYNIIGGLDEEGK TTGAIAAMLSTILYSR SLDRAMRLVKDVFISAAER LKMYKHSNNKAMTTGAIAAMLSTILYSR RFFPYYVYNIIGGLDEEGKGAVYSFDPVGSYQR AMLSTILYSRRFFPYYVYNIIGGLDEEGK DVFISAAERDVYTGDALR FSPYVFNGGTILAIAGEDFAIVASDTR KNMQNVEHVPLSLDR NMQNVEHVPLSLDR RFFPYYVYNIIGGLDEEGK KHDKSASDALR KRQSPEPSPVTLGR DSLNSDCLTSFKITDLGK AENTRLNAELLK HSNNKAMTTGAIAAMLSTILYSR NGFLLDGFPR SVPAAEPEYPK KEPKNLVWRDVSLGQTSRTPR 10 cjb@im.ac.cn

8 240 ISSN CN /Q Chin J Biotech February 25, 2012 Vol.28 No.2 图 5 肽 段 DVFISAAERDVYTGDALR (MH 2+ = ) 的 MS/MS 图 谱 Fig. 5 The MS/MS spectra from one of the identified peptides is shown (DVFISAAERDVYTGDALR (MH 2+ =999.39) ). 表 2 不 同 配 体 与 PSMB1 的 结 合 能 力 比 较 Table 2 The comparation of binding ability between different ligands and PSMB1 Ligands MW Response unit (RU) GA Clestrol Bufalin BF BF211-HCl 讨 论 本 研 究 选 取 带 有 六 聚 组 氨 酸 标 签 的 pet28a (+) 原 核 表 达 载 体, 实 现 了 PSMB1 在 大 肠 杆 菌 图 6 celastrol 与 PSMB1 结 合 的 BIAcore 分 析 Fig. 6 BIAcore analysis of interactions between celastrol and PSMB1. BL21 (DE3) 内 的 可 溶 性 表 达 由 于 pet28a (+) 载 体 N 端 带 有 His-tag 标 签, 可 以 直 接 采 用 Ni + 亲 和 层 析 实 现 重 组 蛋 白 的 纯 化, 且 组 氨 酸 标 签 相 对 较 小, 对 融 合 蛋 白 结 构 影 响 小, 不 需 要 从 蛋 白 中 切 除 目 的 蛋 白 经 IPTG 诱 导 后 以 可 溶 性 形 式 表 达, 再 利 用 His 亲 和 柱 对 PSMB1 重 组 蛋 白 直 接 进 行 纯 化, 一 步 法 纯 化 可 达 到 95% 以 上 的 纯

9 范 翠 英 等 / 人 蛋 白 酶 体 亚 基 PSMB1 的 重 组 表 达 纯 化 及 在 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 体 外 筛 选 中 的 应 用 241 度, 可 直 接 用 于 BIAcore 分 析, 筛 选 潜 在 的 具 有 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 活 性 的 化 合 物 在 本 研 究 中, 对 重 组 PSMB1 融 合 蛋 白 的 氨 基 酸 序 列 的 鉴 定 采 用 的 是 NanoLC-MS/MS 方 法, 蛋 白 鉴 定 置 信 度 设 置 为 95% 该 检 测 方 法 与 常 规 的 Western blotting 等 方 法 相 比, 检 测 快 速 灵 敏 准 确, 极 大 地 提 高 了 鉴 定 结 果 的 可 靠 性 此 外, 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 筛 选 主 要 采 用 连 续 荧 光 监 测 法, 通 过 测 定 蛋 白 酶 体 活 性 来 寻 找 对 蛋 白 酶 活 性 影 响 的 化 合 物, 但 该 方 法 不 能 确 证 化 合 物 是 否 与 蛋 白 酶 体 发 生 结 合, 以 及 与 哪 个 亚 基 结 合 本 研 究 中 利 用 BIAcore 直 接 检 测 蛋 白 酶 体 亚 基 与 化 合 物 小 分 子 之 间 的 相 互 作 用, 进 而 筛 选 特 异 性 蛋 白 酶 体 抑 制 剂, 无 需 借 助 任 何 标 记 物 ( 酶 标 或 荧 光 底 物 ) 也 不 需 要 对 所 研 究 蛋 白 质 做 任 何 修 饰 即 可 监 测 生 物 分 子 之 间 的 相 互 作 用 [6] BIAcore 结 果 还 可 以 提 供 关 于 结 合 反 应 的 动 态 过 程 数 据, 且 测 量 周 期 短, 这 些 都 是 其 他 技 术 无 法 比 拟 的 雷 公 藤 红 素 (Celastrol) 又 名 南 蛇 藤 醇, 是 从 雷 公 藤 根 部 分 离 到 的 三 萜 类 色 素 [7] 近 年 来 因 为 其 具 有 广 谱 的 抗 炎 和 抗 氧 化 作 用, 被 广 泛 地 应 用 于 哮 喘 自 身 免 疫 性 及 神 经 性 疾 病 的 治 疗 [8-15] 雷 公 藤 红 素 还 可 以 抑 制 肿 瘤 细 胞 增 殖 并 诱 导 其 死 亡 [16-18] 有 报 道 指 出, 雷 公 藤 红 素 可 以 显 著 抑 制 大 鼠 20S 中 的 β 5 催 化 亚 基 及 PC-3 LNCaP 细 胞 中 的 26S 蛋 白 酶 体 活 性 [19], 但 其 分 子 机 制 还 不 太 清 楚 本 研 究 发 现 雷 公 藤 红 素 可 以 作 用 于 人 20S 蛋 白 酶 体 中 的 PSMB1 催 化 亚 基 这 一 发 现 为 进 一 步 深 入 研 究 雷 公 藤 红 素 抑 制 蛋 白 酶 体 活 性 的 分 子 机 制 提 供 了 研 究 方 向 总 之, 本 研 究 建 立 了 重 组 表 达 纯 化 人 蛋 白 酶 体 亚 基 PSMB1 的 方 法, 并 初 步 试 用 于 体 外 筛 选 具 有 蛋 白 酶 体 抑 制 作 用 的 化 合 物 本 研 究 结 果 为 建 立 快 速 高 通 量 的 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 筛 选 平 台 奠 定 了 基 础, 同 时 也 有 助 于 对 已 知 的 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 进 行 作 用 机 制 研 究 REFERENCES [1] 顾 光 华, 孔 祥. 泛 素 蛋 白 酶 体 通 路 以 及 蛋 白 酶 抑 制 剂 对 NF-κB 信 号 通 路 作 用 的 研 究 进 展. 实 用 临 床 医 药 杂 志, 2009, 13(5): [2] Glickman MH, Ciechanover A. The ubiquitinproteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction. Physiol Rev, 2002, 82(2): [3] Ciechanover A. Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin proteasome system and onto human diseases and drug targeting. Cell Death Differ, 2005, 12(9): [4] Smalle J, Vierstra RD. The ubiquitin 26S proteasome proteolytic pathway. Annu Rev Plant Biol, 2004, 55(1): [5] Adams J. The proteasome: a suitable antineoplastic target. Nat Rev Cancer, 2004, 4(5): [6] Deng HW, Guo Y, Sun Y, et al. A novel small molecule ligand for epidermal growth factor receptor targeting. Prog Biochem Biophys, 2005, 32(2): 邓 宏 伟, 郭 妍, 孙 烨, 等. 靶 向 表 皮 生 长 因 子 受 体 的 全 新 小 分 子 配 体 筛 选. 生 物 化 学 与 生 物 物 理 进 展, 2005, 32(2): [7] 程 薇, 马 保 根, 张 茵, 等. 雷 公 藤 红 素 抗 肿 瘤 研 究 进 展. 中 国 医 药, 2008, 3(6): [8] Tao X, Younger J, Fan FZ, et al. Benefit of an extract of Tripterygium wilfordii Hook F in patients with rheumatoid arthritis: a double-blind, placebo-controlled study. Arthritis Rheum, 2002, 46(7): [9] Li H, Jia YF, Pan DJ, et al. Effect of tripterine on cjb@im.ac.cn

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