吉林农业大学学报 2012 年 5 月学生命科学学院生化研究室保存限制性内切酶 Xho Ⅰ EcoRⅠ HindⅢ XbaⅠ SacⅠ PstⅠ 逆转录酶 T 4 DNA 连接酶 Taq 聚合酶 dntp RNA 提取试剂盒质粒提取试剂盒凝胶回收试剂盒等均购自 TaKaRa 公司, 反转录试

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1 吉林农业大学学报 2012,05 玉米 MAPK5 基因片段的克隆及 RNA 干扰载体的构建崔喜艳 1,2, 刘晶 2, 丁志鑫 2, 郝东云 1 ** 1. 中国农业科技东北创新中心, 长春 ;2. 吉林农业大学生命科学学院, 长春摘要 : 采用 RT-PCR 方法从玉米品种 B73 幼苗中克隆出促分裂原活化蛋白激酶基因 5(MAPK5) 的 cdna 部分片段 (691bp), 与 GenBank 已发表的玉米 MAPK5(AB016802) 同源性达 97% 重新设计带酶切位点的引物, 克隆出长度为 281bp 的正反向片段使用 DNA 重组技术, 用 pcambia3300 质粒构建了玉米 MAPK5 的 RNAi 载体关键词 : 促分裂原活化蛋白激酶 ; 基因克隆 ; 干扰载体中图分类号 :Q785 文献标识码 :A 文章编号 : (2012) 网络出版地址 : Cloning of Maize MAPK5 Gene Fragment and Its Construction of RNA Interfering Vector CUI Xi-yan 1,2,LIU Jing 2,DING Zhi-xin 2,HAO Dong-yun 1 1.Northeast Agricultural Research Center of China, Changchun ; 2.College of Life Sciences, Jilin Agricultural University,Changchun ,China Abstract: The partial cdna(691 bp)of mitogen-activated protein kinase five(mapk5) gene was cloned from seeding of maize cultivar B73 by RT-PCR. Sequence homology analysis showed that it shared the high similarity (97%) with maize MAPK5 that has been submitted to GenBank ( AB016802). To construct the RNAi vector of Maize MAPK5, primers with restriction endonuclease recognition sites were designed to amplify the 281 bp forward and reverse fragments of MAPK5, and the resulting PCR products were then inserted into the plasmid pcambia3300 by DNA recombinant technology. This RNAi vector lays a foundation for further study of MAPK5 involved in MAPK cascades pathway of maize. Key words: mitogen-activated protein kinase; gene cloning; interference vector 玉米 ( Zea mays L.) 是世界上三大粮食作物之一, 也是最重要的饲料作物, 在世界粮食生产中占有重要地位随着世界人口的不断增加, 工业化程度的提高, 粮食短缺表现出越来越严峻的趋势, 玉米品种改良已成为当务之急常规育种很难在短时间内获得玉米新品种, 利用基因工程技术培育稳定高产品种, 是当前国际上植物基因工程研究的前沿之一 [1] 近年来 RNA 干扰技术迅猛发展, 被广泛应用于各种生物基因功能鉴定和基因表达调控等各个领域, 并已在水稻玉米小麦马铃薯等多种作物的研究中得到成功应用 [2-7] 在利用 RNAi 干扰技术进行作物品质改良时, 要得到可稳定遗传的转基因植株, 构建 RNA 干扰载体是必不可少的步骤 [8-9] MAPK 级联系统是细胞传递和放大特异的细胞外信号, 并在胞质和核内产生相应生理和生化反应的重要信号转导系统已知植物 MAPK 激酶级联途径在介导激素反应细胞增殖和分化以及各类胁迫应答过程中扮演着重要角色 [10] 目前在玉米中已发现的 MAPK 基因共有 10 余种,MAPK5 主要和低温胁迫有关本试验利用载体 phannibal 和 pcambia3300 构建玉米 MAPK5 的 RNA 干扰载体, 从而进一步研究 MAPK5 在玉米 MAPK 级联途径中的功能 1 材料与方法 1.1 试验材料本试验所用的材料为玉米自交系 B73; 质粒 :pmd18-t 购自 TaKaRa 公司 ; 载体 phannibal 和 pcambia3300 及大肠杆菌菌株 JM109 由吉林农业大基金项目 : 吉林省博士后科研项目启动经费资助 [ 吉人社办字 (2009) 第 100 号 ]; 吉林省科技发展计划项目 ( ) 作者简介 : 崔喜艳, 女, 博士, 副教授, 研究方向 : 生物化学与分子生物学收稿日期 : 网络出版时间 : :59 ** 通讯作者

2 吉林农业大学学报 2012 年 5 月学生命科学学院生化研究室保存限制性内切酶 Xho Ⅰ EcoRⅠ HindⅢ XbaⅠ SacⅠ PstⅠ 逆转录酶 T 4 DNA 连接酶 Taq 聚合酶 dntp RNA 提取试剂盒质粒提取试剂盒凝胶回收试剂盒等均购自 TaKaRa 公司, 反转录试剂盒购自 Promega 公司, 其他试剂均为国产或进口分析纯试剂 1.2 方法植物总 RNA 的提取取经 4 处理 3 h 的玉米幼苗 1 g, 在液氮中研磨成粉, 迅速放入 1.5 ml 离心管中加入 1mL Trizol 混匀, 按试剂盒操作,-70 冰柜保存总 RNA 第一链 cdna 的合成按 Promega 试剂盒操作如下 : 取 2.5μL 的总 RNA, 加入 OligdT 2.0μL, DEPC H 2 O 5.5μL,70 5 min 后冰浴 5 min; 再依次加入下列各种成分 :5 倍 AMV Buffer 5.0 μl, 10mMdNTP 2.5μL,RNasin 0.5 μl,amv 0.5 μl, DEPC H 2 O 6.5 μl,42 60 min,95 5 min,-20 冰柜保存 cdna MAPK5 基因的克隆分别以玉米 cdna 第 1 链为模板, 用引物如下 :RT-PCR 上游引物 S1: TCTGCTCGGCGGTCAACTRT-PCR 下游引物 A1: GGGTGACGAGGAAGTTGG 正向带 XhoⅠ 酶切位点上游引物 P1: CCGCTCGAGTATCCGCCAACTTCCTCG; 正向带 EcoR Ⅰ 酶切位点下游引物 P2 : CCGGAATTCCAGGGTTGAATGCAAGAGC; 反向带 Hind Ⅲ 酶切位点上游引物 P3 : CCCAAGCTTCAGGGTTGAATGCAAGAGC; 反向带 Xba Ⅰ 酶切位点下游引物 P4 : GCTCTAGATATCCGCCAACTTCCTCG 反应条件 :50 μl 反应体系,94 预变性 5 min,94 变性 30 s,47 退火 40 s,72 延伸 2 min,30 次循环后,72 延伸 10 min RT-PCR 扩增 MAPK5 部分片段利用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒将 PCR 产物纯化回收, 连接到 pmd18-t, 转化大肠杆菌 DH5-α 感受态细胞, 挑选阳性克隆子经 PCR 和酶切鉴定后, 送至上海生工测序将扩增的 MAPK5 部分片段与 GenBank 已发表的玉米 MAPK 基因家族的其他 MAPK 基因序列比对, 选择 MAPK5 中与其他相似比小于 71.9% 的序列, 重新设计引物, 获得构建 MAPK5 RNAi 的正向及反向片段中间载体的构建构建含有 MAPK5 正反向序列的中间载体, 具体构建过程见图 1 图 1 中间载体的构建 Fig. 1. Construction of middle vector RNAi 干扰载体构建含有 MAPK5 正反向序列的 RNAi 干扰载体, 构建过程见图 ,May

2 玉米 MAPK5 片段的克隆以 cdna 为模板, 用 S1 和 A1 为引物, 进行 RT-PCR 反应用 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物, 发现有 1 条大小约 691 bp 的 DNA 条带 ( 图 4), 与预测的片段大小基本一致测序结果见图 5 结果与 Genbank 已发表的玉米 MAPK5 的序列同源性为 97%, 证明

3 崔喜艳等 : 玉米 MAPK5 基因片段的克隆及 RNA 干扰载体的构建图 2 植物 RNAi 载体的构建 Fig.2. Construction of plant RNAi vector 2 结果与分析 2.1 总 RNA 的提取琼脂糖凝胶电泳, 结果见图 3, 所提取的总 RNA 有 3 条电泳带, 从上到下分别为 28SrRNA 18SrRNA 和 5SrRNA, 条带清晰, 浓度比例符合要求, 经紫外分光光度计 OD 260 / OD 280 检测, 吸光度值为 2.01, 表明提取的 RNA 完整性较好, 纯度高, 可用于反转录和 RT-PCR 2.2 玉米 MAPK5 片段的克隆以 cdna 为模板, 用 S1 和 A1 为引物, 进行 RT-PCR 反应用 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物, 发现有 1 条大小约 691 bp 的 DNA 条带 ( 图 4), 与预测的片段大小基本一致测序结果见图 5 结果与 Genbank 已发表的玉米 MAPK5 的序列同源性为 97%, 证明 PCR 结果正确 M. DL2000 Marker ;1 总 RNA Total RNA 图 3 总 RNA 的琼脂糖凝胶电泳结果 Fig.3. The agarose gel electrophoresis of total RNA. M. DL2000 Marker ;1. PCR 产物 PCR products 图 4 MAPK5 片段的琼脂糖凝胶电泳结果 Fig.4. The agarose gel electrophoresis of MAPK5 fragment 吉林农业大学学报

4 中间载体的构建将正向片段用 XhoⅠ 和 EcoRⅠ 进行双酶切, 切下的片段用 T 4 DNA 连接酶连接到经同样双酶切的 phannibal 载体上, 构建质粒 phannibal- 正向 MAPK5 将验证正确的质粒 phannibal- 正向 MAPK5 与反向片段分别用 HindⅢ 和 XbaI 进行双酶切, 用 T 4 DNA 连接酶 16 过夜连接, 构建质粒

4 吉林农业大学学报 2012 年 5 月图 5 MAPK5 片段序列 Fig.5. The sequence of MAPK5 fragment 2.3 玉米 MAPK5 正向与反向片段序列 PCR 结果以 cdna 为模板, 分别用带酶切位点正反向上下游引物, 进行 RT-PCR 反应用 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物, 获得大小约 281 bp 的 DNA 条带 ( 图 6), 与预测的片段大小一致测序结果与其他玉米 MAPK 结构基因相比对见图 7, 同源性仅为 36%, 符合构建 RNAi 载体的要求 2.4 中间载体的构建将正向片段用 XhoⅠ 和 EcoRⅠ 进行双酶切, 切下的片段用 T 4 DNA 连接酶连接到经同样双酶切的 phannibal 载体上, 构建质粒 phannibal- 正向 MAPK5 将验证正确的质粒 phannibal- 正向 MAPK5 与反向片段分别用 HindⅢ 和 XbaI 进行双酶切, 用 T 4 DNA 连接酶 16 过夜连接, 构建质粒 phannibal- 正向 - 反向 MAPK5 的中间载体 M. DL2000 Marker;1. 正向 PCR 产物 Positive PCR products 2. 反向 PCR 产物 Inverse PCR products 图 6 玉米 MAPK5 基因正向与反向 PCR 产物 Fig.6. The positive PCR products and reverse PCR products of maize MAPK5 gene 2.5 玉米 MAPK5-RNAi 植物载体的构建及验证图 7 玉米 MAPK5 构建 RNAi 片段与其它 MAPK 基因比对结果 Fig.7. The comparison of RNAifragment constructing from maize MAPK5 with the other MAPK gene 2012,May

崔喜艳等 : 玉米 MAPK5 基因片段的克隆及 RNA 干扰载体的构建程和作物品种改良的发展, 标志着 RNAi 将成为研究植物功能基因不可缺少的工具目前已从玉米中克隆了许多 MAPKs 的基因 [14], 但其级链上游的 MAPKK 和 MAPKKK 还不清楚, 而且玉米中 MAPK 级链反应通路尚未明确本试验利用的是酶切连接的方法构建玉米 MAPK5 沉默载体,

载体和目的片段的凝胶回收产物 The 获得转基因玉米材料提供了载体 reclamation product of gel of vector and target fragment 图 8

5 崔喜艳等 : 玉米 MAPK5 基因片段的克隆及 RNA 干扰载体的构建程和作物品种改良的发展, 标志着 RNAi 将成为研究植物功能基因不可缺少的工具目前已从玉米中克隆了许多 MAPKs 的基因 [14], 但其级链上游的 MAPKK 和 MAPKKK 还不清楚, 而且玉米中 MAPK 级链反应通路尚未明确本试验利用的是酶切连接的方法构建玉米 MAPK5 沉默载体, 目的是通过转基因的方式将 MAPK5-RNAi 转入玉米受体材料中, 从而为研究 MAPK5 在玉米 MAPK 级联途径中的功能奠定了基础, 而且还为进一步用生物技术 M. λ-hindⅢ Marker;1. 载体和目的片段的凝胶回收产物 The 获得转基因玉米材料提供了载体 reclamation product of gel of vector and target fragment 图 8 重组质粒的酶切验证参考文献 Fig.8. Identification of enzyme digestion of recombinant plamid 将中间载体和 pcambia3300 分别进行 PstⅠ 和 SacⅠ 双酶切后, 用 T 4 DNA 连接酶 16 过夜连接, 构建玉米 MAPK5-RNAi 植物载体玉米 MAPK5-RNAi 植物载体经 PstⅠ 和 SacⅠ 双酶切,0.8% 琼脂糖凝胶电泳可见长度为 3.6 kb 的片段及 8.3 kb 的 pcambia3300 载体 ( 图 8) 在上海生工测序, 分别测出载体 pcambia3300 中 CaMV35SpolyA 的序列和连接上的正反向目的片段的序列, 证明 MAPK5 基因 RNAi 载体构建成功 3 讨论 RNAi 现象的发现及其在生物中存在的普遍性, 并且其作用机制和生物学功能已经初步阐明 Wesley [11] 等在多种植物中进行了大规模的 RNAi 抑制基因表达的分析, 证明该策略可广泛应用于植物功能基因组学的研究他们还发现在绝大多数植物中, 带发夹结构的 dsrna 具有较高的沉默效率,RNAi 片段的长度在 98~853 nt 之间都是可行的 Wesley 研究表明, 自我互补的发夹 (hprna) 结构在植物上会有效的产生基因沉默现象当发夹结构中反向重复序列中间的核酸序列是内含子时, 基因沉默效率会很高 RNAi 成功用于构建转基因马铃薯等重要经济作物的报道也日益增多 [12] [13] Schweizer 等将表达载体 hprna 和 ihprna 转入到玉米大麦和小麦中, 证实了 RNA 干涉在谷类作物中确实能够抑制一些选择标记和报告基因的表达通过 RNAi 技术必将会推进植物基因工 [1] 王富德. 简论玉米品种改良目标和技 [J]. 杂粮作物,2001,21(6): 7-9. [2] Daisukemiki,Ko Shimamoto. Smiple RNAi vectors for stable and transient suppression of gene function in rice [J].Plant and Cell Physiology, 2004, 4: [3] 胡旭霞, 刘耀光. 植物 RNA 干涉载体的构建及其在水稻基因表达沉默中的应用 [J]. 分子植物育种,2006,4(5): [4] 柴晓杰, 王丕武, 关淑艳, 等. 应用 RNA 干扰技术降低玉米支链淀粉含量 [J]. 植物生理与分子生物学学报,2005,31(6): [5] 李加瑞, 赵伟, 李全梓, 等.Waxy 基因的 RNA 沉默使转基因小麦种子中直链淀粉含量下降 [J]. 遗传学报,2005,32(8): [6] Abbottd,Wangmb,Water House P A. A single copy of a virus-derived transgene encoding hairpin RNA gives mix munity to barley yellow dwarfvirus[j]. Molecular Plant Pathology,2000,1(6): [7] 郭志鸿, 张金文, 王蒂, 等. 用 RNA 干扰技术创造高直链淀粉马铃薯材料 [J]. 中国农业科学,2008,41(2): [8] 杨明, 付汉江, 铁轶, 等. 两种高效 RNA 干涉载体系统的构建及应用 [J]. 生物化学与生物物理进展,2005,32(4): [9] 刘晓庆, 丁志鑫, 刘晶, 等.2 种 PCR 方法扩增大豆 rbcs 启动子 5 侧翼序列比较 [J]. 吉林农业大学学报,2011,35(5): [10] 陈娅斐, 冯斌, 赵小明, 等.MAPK 级联途径在植物信号转导中的研究进展 [J]. 植物学通报,2005,22(3): [11]Wesley S V, Helliwell C A, Smith N A, et,al.construct design for efficient, effective and high-throughput gene silencing in plants[j].the Plant Journal, 2001, 27(6): [12] 郭志鸿, 张金文, 王蒂, 等. 用 RNA 干扰技术创造高直链淀粉马铃薯材料 [J]. 中国农业科学,2008,41(2): [13]Schweizer P, Pokorny J, Schulze L P. Double-stranded RNA interferes with gene function at the single-cell level in cereals[j]. Plant Journal, 2000, 24: [14] 王金香, 蒋明义, 马芳芳, 等. 玉米促分裂原激活蛋白激酶 ZmMPK7 基因的表达特性及功能分析 [J]. 南京农业大学学报,2011,34(1): 吉林农业大学学报

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材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌