316 中国油料作物学报 2017,39(3) RNAi(RNAinterference) 已经广泛应用于基因功能验证关闭基因表达等方面 Fire 等首次利用 RNAi 技术在秀丽隐杆线虫 (Caenorhabditiselegans) 中对特定基因的表达进行了干扰, 且双链 RNA 干扰技术比单

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1 中国油料作物学报 ChineseJournalofOilCropSciences 2017,39(3): doi: /j.issn 大豆 Kti 基因 ihprna 种子特异性表达载体的构建及转化宋冰 1,2, 孟灵思 1, 李勃 2, 王丕武 1 1, 付永平 (1. 吉林农业大学农学院, 吉林长春,130118;2. 吉林市农业科学院, 吉林长春,132101) 摘要 : 大豆 Kunitz 型胰蛋白酶抑制剂 (trypsininhibitor,kti) 是大豆品质的主要营养抑制因子之一, 培育低 Kti 含量的大豆品种是提升大豆品质的关键本研究采用 RT-PCR 技术克隆得到大豆 Kti 基因的核心保守序列, 并构建成种子特异性表达的具有 Kti 基因反向重复结构的 RNAi 载体, 利用农杆菌介导法侵染大豆品种吉林 30 子叶节, 通过潮霉素筛选和 PCR 检测, 获得 4 株转基因阳性植株 RT-PCR 检测表明, 构建的种子特异性 RNAi 载体可以在转基因植株的种子中特异表达, 且 Kti 基因表达量均有降低 ; 通过胰蛋白酶抑制剂活性检测发现, 转基因大豆籽粒中胰蛋白酶抑制剂活性平均降低了 77.5% 为进一步评价 RNAi 技术对大豆 Kti 基因的表达调控效果奠定良好基础关键词 : 大豆 ;Kti 基因 ;RNA 干扰 ; 遗传转化 ;RT-PCR; 种子特异表达中图分类号 :S565.1,S336 文献标识码 :A 文章编号 : (2017) Constructionandtransformationofseed-specificexpresionRNAi vectorofkunitztripsininhibitorgenefrom soybean SONGBing 1,2,MENGLing-si 1,LIBo 2,WANGPi-wu 1,FUYong-ping 1 (1.ColegeofAgriculture,JilinAgriculturalUniversity,Jilin130118,China; 2.JilinCityAcademyofAgriculturalSciences,Jilin132101,China) Abstract:Kunitztrypsininhibitor(Kti)fromsoybeanisoneofthemaininhibitivefactorsofnutrition.Soy beanbreedingwithlowcontentoftrypsininhibitorwasthekeytopromotethesoybeanquality.inthisstudy,we clonedtheconsensussequenceofktigeneinsoybeanseedsbyrt-pcr.then,thernaivectorforsilencedkti genewasreconstructedandtransformedtosoybean(jilin30)byagrobacterium tumefaciens-mediatedmethod. FourpositivetransgenicplantswereobtainedbyhygromycinscreeningandPCRidentification.RT-PCRanalyses revealedthatktimrnawasspecificalyexpresedatalowlevelintransgenicsoybeanseeds,andtheactivityof Kunitztrypsininhibitorwasdecreasedabout77.5%.ItprovidedafoundationforfurtherevaluationofRNAitech nologyforsoybeanktigeneregulation. Keywords:soybean;Ktigene;RNAinterference;genetictransformation;RT-PCR;seed-specificexpres sion Kunitz 型胰蛋白酶抑制剂 (Kunitztrypsininhibi tor,kti) 是大豆主要的营养抑制因子之一 [1], 可抑制畜禽小肠胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性, 降低畜禽对饲料蛋白质的消化吸收, 从而引起畜禽生长停滞及畜禽胰腺肥大和增生等症状 [2,3] 因此, 创制没有或者低含量胰蛋白酶抑制剂的大豆新种质, 可有效提高大豆的营养价值和加工品质目前, 多采用物理 ( 加热 ) 方法来减少豆制品中蛋白酶抑制剂的含量 [4], 但此方法同时会使大豆蛋白变性而降低营养价值而用常规育种方法来改良大豆蛋白酶抑制剂含量不但时间长 [5], 而且受种质资源的限制, 改良空间有限收稿日期 : 基金项目 : 吉林省科技发展计划项目 ( JH, JC); 吉林农业大学校内启动基金 ( ); 吉林市科技局项目 ( ) 作者简介 : 宋冰 (1980-), 男, 吉林长春人, 博士, 主要从事作物及食用菌分子育种, song @126.com 通讯作者 : 付永平 (1981-), 女, 吉林长春人, 博士, 主要从事作物分子育种研究, yongpingfu81@126.com

2 316 中国油料作物学报 2017,39(3) RNAi(RNAinterference) 已经广泛应用于基因功能验证关闭基因表达等方面 Fire 等首次利用 RNAi 技术在秀丽隐杆线虫 (Caenorhabditiselegans) 中对特定基因的表达进行了干扰, 且双链 RNA 干扰技术比单链 RNA 对产物影响的效果要好 [6] 近年来,RNAi 技术已经成功地应用在大豆 (Glycinemax ) [7,8] 棉花 (Gosypiumhirsutum) [9] 水稻 (Oryzasa tiva) [10] 小麦 (Triticumaestivum) [11] 和马铃薯 (Sola numtuberosum) [12] 等多种作物的遗传改良中本文利用基因工程手段克隆大豆 Kti 型胰蛋白酶抑制剂基因, 构建具有 Kti 基因的种子特异性 RNAi 载体, 利用农杆菌介导法将载体转化到大豆中, 为进一步培育缺失 Kti 型胰蛋白酶抑制剂的优质大豆新种质奠定基础 1 材料与方法 1.1 材料大豆品种吉林 30,pBI121,pCAMBIA1301-7αP, 大肠杆菌 DH5α, 根癌农杆菌 EHA105 均由吉林农业大学生物技术中心提供 TotalRNAExtrac tionkit TaqDNAPolymerase dntpmixture DL2000 Marker pmd18-t 克隆载体 DNA 回收试剂盒 T4 连接酶质粒提取试剂盒限制性内切酶 (EcoRⅠ HindⅢ XbaⅠ PstⅠ 和 BstEⅡ) 基因组 DNA 提取试剂盒购自 TaKaRa 和 Themoscientific 公司其它生化试剂琼脂糖 EDTA Tris 酵母浸粉胰蛋白胨等购自北京鼎国公司引物由北京鼎国生物技术公司合成 1.2 方法大豆 Kti 基因 RNAi 片段和功能性内含子间隔序列的克隆根据 GenBank 已发表的 Kti1 基因 Kti2 基因和 Kti3 基因序列的同源部分设计引物 ( 表 1), 选取 322bp 的核心片段作为 Kti 基因的 RNA 干扰序列 ; 以成熟中后期的大豆籽粒为材料, 利用 To talrnaextractionkit 提取大豆总 RNA, 反转录成 cdna, 稀释 10 倍后, 以其为模板 PCR 扩增大豆 Kti 基因的 RNA 干扰片段 ( 正义片段和反义片段 ) 利用质粒提取试剂盒提取植物表达载体 pbi121 的质粒 DNA, 以其为模板,PCR 扩增作为功能性内含子间隔序列的 GUS 基因片段, 引物见表 1 PCR 扩增体系为 50μL,10 Bufer5μL,MgCl 2 5μL,dNTPMixture(10mmol/L)1μL, 上下游引物 20pmol/L 各 1μL,cDNA(100ng/μL)4μL/ 质粒 DNA 1μL,Taq 酶 (5U/mL)0.3μL, 灭菌 ddh 2 O 补足 50μL 扩增程序为 :94 变性 5min,94 变性 40s, 47 (Kti 基因的正义片段和反义片段 )/54 (GUS 基因片段 ) 退火 40s,72 延伸 50s,32 个循环, 后延伸 10min Primername 表 1 引物序列 Table1 PrimerSequences Sequence KtiZ1 5 GGGTCTAGAGTCAGACATAACAGCAT3 (XbalⅠ) KtiZ2 5 TTTCTGCAGTTCATCATCAGAAACTC3 (PstⅠ) GUSS 5 TTTCTGCAGTGTGATATCTACCCGCTTC 3 (PstⅠ) GUSAS 5 TTTAAGCTTGGTTTTTCACCGAAGTTCA 3 (HindⅢ) KtiF1 5 GGGAAGCTTTTCATCATCAGAAACTC3 (HindⅢ) KtiF2 5 TTGGGTTACCGTCAGACATAACAGCAT3 (BstEⅡ) hpt1 5 GGTTTCCACTATCGGCGAG3 hpt2 5 GGCGAAGAATCTCGTGCT3 EF-1αS 5 -TGTTGCTGTTAAGGATTTGAAGCG-3 EF-1αAS 5 -AGACACAGAGTACAGAAAAGAAAC-3 将扩增得到的 Kti 基因的正义片段反义片段和 GUS 基因片段的 PCR 产物经电泳检测后, 切胶回收与 pmd18-t 克隆载体连接, 转化大肠杆菌 DH5α 的感受态细胞, 挑取单克隆, 经 PCR 和双酶切鉴定后交由公司测序大豆 Kti 基因 RNA 干扰载体的构建根据植物中 ihprna 原理, 以植物表达载体 pcam BIA1301 为基础, 首先利用限制性内切酶 EcoRⅠ 和 XbaⅠ 将 CaMV35S 启动子替换为大豆种子特异启动子 7αP [13], 第二步用 PstⅠ 和 HindⅢ 插入作为功能性内含子间隔序列的 GUS 基因, 构建中间表达载体 p7αp-gus; 第三步利用限制性内切酶 XbaⅠ 和 Pst Ⅰ 插入 Kti 基因正义片段 KtiZ, 最后用 HindⅢ 和 BstEⅡ 插入 Kti 基因反义片段 KtiF, 从而构建成 Kti 基因的 RNA 干扰载体 p7αp-gus-ktis, 载体构建结构如图 1 图 1 ihprna 种子特异性表达载体 p7αp-gus-ktis 的 T-DNA 区 Fig.1 T-DNAofRNAiconstructsofihpRNAseed-specificexpresedvectorp7αP-GUS-KtiS

宋冰等 : 大豆 Kti 基因 ihprna 种子特异性表达载体的构建及转化 317 1.2.

0 时, 收集菌体, 用 MS 液体培养基悬浮, 待用 1.2.4 RNAi 载体在大豆中的遗传转化利用农杆菌工程菌侵染大豆子叶节, 转化的外植体在含有潮霉素的筛选培养基中培养一个月左右 ; 待丛生芽长至 1~2cm 时小心切下, 转入伸长培养基进行培养 ; 待芽长到 3~4cm 时, 移入生根培养基中进行生根培养 ; 待长出 3~4 条健壮的根后进行移栽, 培养至结荚 1.2.5 转基因植株的 PCR 检测提取再生植株及非转化植株的基因组 DNA, 利用潮霉素抗性基因 Hpt 的特异性引物 ( 表 1) 进行 PCR 检测,PCR 扩增反应体系和条件 ( 除循环数增加到 40 个之外 ) 同 1.

3 宋冰等 : 大豆 Kti 基因 ihprna 种子特异性表达载体的构建及转化农杆菌工程菌的构建和制备利用质粒提取试剂盒提取 RNAi 载体 p7αp-gus-ktis 的质粒 [14] DNA, 通过冻融法将其转入根癌农杆菌感受态细胞 EHA105 利用 Kti 基因的特异性引物对转化的单菌落进行 PCR 鉴定 ( 反应体系及反应条件同上 ) 将经验证后的单菌落接种于含有 100μg/mL 卡那霉素的 YEP 液体培养基中, 当 OD 600 值在 0.5~1.0 时, 收集菌体, 用 MS 液体培养基悬浮, 待用 RNAi 载体在大豆中的遗传转化利用农杆菌工程菌侵染大豆子叶节, 转化的外植体在含有潮霉素的筛选培养基中培养一个月左右 ; 待丛生芽长至 1~2cm 时小心切下, 转入伸长培养基进行培养 ; 待芽长到 3~4cm 时, 移入生根培养基中进行生根培养 ; 待长出 3~4 条健壮的根后进行移栽, 培养至结荚转基因植株的 PCR 检测提取再生植株及非转化植株的基因组 DNA, 利用潮霉素抗性基因 Hpt 的特异性引物 ( 表 1) 进行 PCR 检测,PCR 扩增反应体系和条件 ( 除循环数增加到 40 个之外 ) 同转基因植株的 RT-PCR 检测利用 Total RNAExtractionKit 提取试剂盒提取转基因阳性植株和未转化植株的叶片和未成熟籽粒总 RNA, 然后反转录成 cdna, 以此为模板, 通过 RT-PCR 方法扩增大豆胰蛋白酶抑制剂 Kti 基因, 伸长因子 EF-1α 基因作为内参,PCR 条件同 [15,16] 转基因植株胰蛋白酶抑制剂检测参照 AACC 方法进行测定, 将大豆样品粉碎脱脂后, 放入戍烷 : 己烷 (1 1) 中浸提, 浸出液稀释 100 倍, 利用结晶的胰蛋白酶抑制剂作为标准品制备标准曲线,BAPA 为反应底物, 在分光光度计下测定样品和标准品的吸光度试样胰蛋白酶抑制剂活性按如下公式计算 : TIM = TIV V F m 式中 :TIM 为试样中胰蛋白酶抑制剂活性 (U/g); TIV 为单位体积试样浸出液中胰蛋白酶抑制剂活性 (U/mL);V 为试样浸出液总体积, 单位为毫升 (ml);f 为稀释倍数 ;m 为试样质量, 单位为克 (g) 2 结果与分析 2.1 大豆 Kti 基因 RNA 干扰片段和功能性内含子间隔区 GUS 基因片段的克隆分别含有大豆 Kti 基因和功能性内含子间隔区 GUS 基因片段的重组克隆载体的 PCR 和酶切检测 ( 图 2) 结果表明,PCR 扩增分别得到 322bp 的大豆 Kti 基因 RNA 干扰片段和 1007bp 的功能性内含子间隔区 GUS 基因片段, 与已知序列同源性达到 100%, 符合下游 RNAi 载体构建的实验设计要求注 :A:pMD18-T-KTiZ;B:pMD18-T-GUS;M:DNAMarkerDL- 2000;1: 双酶切产物 ;2:PCR 产物 Note:A:pMD18-T-KTiZ;B:pMD18-T-GUS;M:DNAMarkerDL -2000;1:Digestedproductofrecombinantclonedvector;2:PCRprod uct 图 2 重组克隆载体的 PCR 和酶切鉴定结果 Fig.2 PCRandrestrictionidentification ofrecombinantclonedvector 2.2 大豆 Kti 基因 RNAi 种子特异性干扰表达载体 p7αp-gus-ktis 的构建和鉴定对大豆 Kti 基因 RNA 干扰载体 p7αp-gus- KtiS 进行 PCR 和双酶切检测的结果如图 3 所示, 大豆种子特异性启动子 7αP 下游已经分别插入目标基因 Kti 的正反向重复片段, 且 Kti 基因片段被克隆在间隔序列 GUS 的两端, 表明具有 Kti 基因的 RNAi 种子特异性干扰表达载体 p7αp-gus-ktis 构建成功注 :A:PCR 鉴定结果 ;M:DNAmarkerDL-2000;1:Kti 基因 ;2:GUS 基因 ;3.7αP 基因 B: 酶切鉴定结果 ;M:DNAmarkerDL-2000;1: GUS 基因 ;2:KtiZ 基因 ;3:KtiF 基因 Note:A:PCRidentification;M:DNAmarkerDL-2000;1:Ktigene;2: GUSgene;3.7αPgene;B:Restrictionidentification;M:DNA marker DL-2000;1:GUSgene;2:KtiZgene;3:KtiFgene 图 3 p7αp-gus-ktis 的 PCR 鉴定和酶切鉴定 Fig.3 PCRandrestrictionidentification ofp7αp-gus-ktisvector 2.3 转基因阳性植株的获得农杆菌转化 p7αp-gus-ktis 菌落的 PCR 结

318 中国油料作物学报 2017,39(3) 果如图 4 所示, 得到一条与预期大小相符的约 320bp 的特异条带, 表明含有 Kti 基因 RNAi 载体的农杆菌工程菌构建成功然后利用其侵染大豆子叶节 ( 图 5), 获得一批抗性植株潮霉素抗性基因的 PCR 检测结果如图 6 所示, 从 4 株抗性植株中扩增出了约 900bp 的特异性条带, 与阳性对照在同一位置,

4 PCRidentificationofRNAivector inagrobacterium EHA105 注 :A: 预培养 ;B: 共培养 ;C: 筛选培养 ;D: 伸长培养 ;E: 生根培养 ;F: 温室培养

5 Agrobacterium tumefaciensmediatedmethod 后期的转基因大豆籽粒的总 RNA, 利用 RT-PCR 检测 Kti 基因的表达情况, 检测结果见图 7 注 :M:DNAMarkerDL-2000;1: 阴性对照 ;2: 阳性对照 ;3~6: 转基因植株 Note:M:DNA MarkerDL-2000;1:Negativecontrolofnon-trans

4 318 中国油料作物学报 2017,39(3) 果如图 4 所示, 得到一条与预期大小相符的约 320bp 的特异条带, 表明含有 Kti 基因 RNAi 载体的农杆菌工程菌构建成功然后利用其侵染大豆子叶节 ( 图 5), 获得一批抗性植株潮霉素抗性基因的 PCR 检测结果如图 6 所示, 从 4 株抗性植株中扩增出了约 900bp 的特异性条带, 与阳性对照在同一位置, 而一些抗性植株和对照品种无此带, 表明大豆 Kti 基因 RNAi 表达载体转化成功, 获得转基因阳性植株 4 株注 :M:DNAMarkerDL-2000;1~4: 农杆菌重组转化子 Note:M:DNAMarkerDL-2000;1-4:Agrobacteriumrecominants 图 4 农杆菌工程菌的 PCR 鉴定 Fig.4 PCRidentificationofRNAivector inagrobacterium EHA105 注 :A: 预培养 ;B: 共培养 ;C: 筛选培养 ;D: 伸长培养 ;E: 生根培养 ;F: 温室培养 Note:A:Pre-diferentitioncultivation;B:Co-cultivation;C:Screening;D:Shootelongation;E:Rooting;F:Cultivationingreenhouse 图 5 农杆菌介导的大豆遗传转化 Fig.5 Agrobacterium tumefaciensmediatedmethod 后期的转基因大豆籽粒的总 RNA, 利用 RT-PCR 检测 Kti 基因的表达情况, 检测结果见图 7 注 :M:DNAMarkerDL-2000;1: 阴性对照 ;2: 阳性对照 ;3~6: 转基因植株 Note:M:DNA MarkerDL-2000;1:Negativecontrolofnon-trans formedplant;2:positivecontrol;3-6:transgenicplants 图 6 转 p7αp-gus-ktis 的转基因植株 PCR 检测 Fig.6 PCRanalysisoftransgenicplants withp7αp-gus-ktis 2.4 T 1 转基因种子的 RT-PCR 检测分别提取 T 1 转基因植株的叶片和处于成熟中注 :CK: 未转基因植株 ;K1~K4: 转 p7αp-gus-ktis 植株 Note:CK:Non-transformedplantasnegativecontrol;K1-K4:Trans genicplantwithp7αp-gus-ktis 图 7 转基因植株 Kti 基因的 RT-PCR 检测 Fig.7 RT-PCRanalysisofKtigeneintransgenicplants 从图中可以发现, 在内参基因表达量基本相同的情况下, 内源 Kti 型胰蛋白酶抑制剂基因在非转

5 宋冰等 : 大豆 Kti 基因 ihprna 种子特异性表达载体的构建及转化 319 基因植株叶片和籽粒中都正常表达, 而在转基因植株的籽粒中 mrna 的表达量明显下降, 但是在叶片中并没有发生改变, 以上结果说明单价 ihprna 种子特异性表达载体的 RNAi 表达构件在种子特异性启动子的控制下在转基因植株中能正常转录, 并分别导致内源 Kti 型胰蛋白酶抑制剂基因 mrna 仅在大豆籽粒中发生降解 2.5 T 1 转基因种子胰蛋白酶抑制剂检测取转基因阳性植株的成熟大豆籽粒, 检测籽粒中胰蛋白酶抑制剂的活力结果表明, 转基因大豆种子的胰蛋白酶抑制剂活力与对照 (100%) 相比有明显的下降, 转 Kti 型 ihprna 种子特异性表达载体的转基因种子平均活性为 22.5%, 降低了 77.5%, 见表 2 以上结果说明 ihprna 种子特异性表达载体的 RNAi 表达构件在种子特异性启动子的控制下有效地表达了 sirna, 从而抑制了内源性胰蛋白酶抑制剂 mrna 的翻译, 使胰蛋白酶抑制剂明显降低此外, 转同一个 RNAi 表达载体的转基因植株后代单株间胰蛋白酶抑制剂含量的下降也存在差异表 2 转基因植株胰蛋白酶抑制剂活性检测 Table2 Activityoftrypsininhibitorintransgenicplants 编号 Code CK K1 K2 K3 胰蛋白酶抑制剂活性 /% Activityoftrypsininhibitor 100a 50bc 8d 20cd K4 12d 注 :CK 为非转基因对照, 吉林 30;K1~K4 为转基因植株 Note:CK:Jilin30;K1-K4aretransgenicplants 3 讨论在利用 RNAi 技术沉默内源靶基因表达时, 一般选取靶基因的 5 非编码区编码区和 3 非编码区都可沉默目的基因的表达大豆 Kti 是由多基因家族组成, 编码区保守性强本实验选取 Kti 基因的编码区, 构建 RNAi 表达载体, 期望利用 RNAi 技术同时沉默 Kti 基因家族中的多个基因在作物品质改良中, 利用 RNAi 技术的关键是构建高效的可转录为 hprna 或 dsrna 的 RNAi 表达载体目前, 主要有两种方式构建 RNAi 表达载体 :1) 目标基因的 cdna 片段被插入在功能性内含子间隔序列的两端, 通过头头相连或尾尾相连, 产生自我互补的 hprna( 分子内 dsrna) 结构 2) 在目标基因片断上下游各加一个启动子, 内源转录时 2 条互补的 RNA 单链形成 dsrna 本实验采用第一种方法, 即在种子特异性启动子 7αP 下游置于反向重复序列, 中间隔有 GUS 基因序列, 形成 ihprna 载体本研究应用本室建立的一套农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化系统实现了对 RNAi 表达载体的遗传转化对转基因植株的潮霉素筛选分析和分子检测证明,RNAi 表达载体的完整构件经 T-DNA 介导完整地进入了大豆基因组利用这一系统可在较短的周期内获得较高的转化率, 而且重复率较好经 RT-PCR 检测表明, 内源 Kti 型胰蛋白酶抑制剂基因在转基因植株的籽粒中 mrna 的表达量明显下降, 但叶片中表达量没有降低, 这说明构建的种子特异性 RNAi 表达载体能够在种子中特异表达, 同时使内源 Kti 型胰蛋白酶抑制剂基因 mrna 在大豆籽粒中发生了降解此外, 经检测转 Kti 型 RNAi 表达载体的转基因种子, 胰蛋白酶抑制剂活性平均降低了 77.5%, 这与 RT-PCR 检测的结果基本一致, 证明此载体成功地降低了胰蛋白酶抑制剂的表达 4 结论选取大豆 Kti 基因同源性保守部分, 成功构建了大豆 Kti 基因种子特异性表达的 RNA 干扰载体, 经农杆菌侵染大豆子叶节后, 获得 4 株转基因阳性植株, 经 RT-PCR 分析后表明,ihpRNA 种子特异性表达载体的 RNAi 表达载体可以在种子中特异表达, 进而降解了大豆种子中的胰蛋白酶抑制剂 ; 通过检测转基因大豆籽粒中胰蛋白酶抑制剂含量发现, 籽粒中的胰蛋白酶抑制剂平均降低了 77.5%, 这一结果为大豆中有害物质的清除和精深加工的发展提供了技术和理论支持参考文献 : [1] LaskowskiM J,KatoI.Proteininhibitorsofproteinases [J].AnnuRevBiochem,1980,49: [2] RackisJJ.Biologicalandphysiologicalfactorsinsoy beans[j].journalam OilChem Soc,1974,51(1): [3] 贺英, 曹旺斌, 杨丽杰, 等. 大豆抗营养因子对生长蛋鸡生产性能氮代谢和小肠内胰蛋白酶活性 [J]. 中国畜牧杂志,1998(5):5-8. [4] 李素芬, 杨丽杰, 霍贵成. 膨化处理对全脂大豆抗营养因子及营养价值的影响 [J]. 畜牧兽医学报,2001,32 (3): [5] 韩粉霞, 丁安林, 孙君明. 缺失 Kunitz 胰蛋白酶抑制剂和脂肪氧化酶 2 3 的大豆新品种中黄 16 的选育 [J]. 遗传学报,2002,29(12):

6 320 中国油料作物学报 2017,39(3) [6] FireA,XuSQ,MontgomeryM K,etal.Potentand specificgeneticinterferencebydouble-strandedrnain Caenorhabditiselegans[J].Nature,1998,391(19): [7] ChenY,ZhouXR,ZhangZJ,etal.Developmentof higholeicoilcropplatforminflaxthroughrnai-media tedmultiplefad2genesilencing[j].plantcelreports, 2015,34(4): [8] NunesAC,ViannaGR,CuneoF,etal.RNAi-medi atedsilencingofthemyo-inositol-1-phosphatesyn thasegene(gmmips1)intransgenicsoybeaninhibited seeddevelopmentandreducedphytatecontent[j].plan ta,2006,224(1): [9] SunilkumarG,CampbelLM,PuckhaberL,etal.Engi neeringcotonseedforuseinhumannutritionbytisue- specificreductionoftoxicgosypol[j].appliedbiologi calsci,2006,103(48): [10] QiaoF,YangQ,WangCL,etal.Modificationofpla ntheightviarnaisuppresionofosga20ox2genein rice[j].euphytica,2007,158(1-2): [11] 李根英, 夏兰芹, 夏先春, 等.Pina 和 Pinb 融合基因表达载体的构建及其在硬粒小麦中的转化 [J]. 中国农业科学,2007,40(7): [12] 郭志鸿, 张金文, 王蒂, 等. 用 RNA 干扰技术创造高直链淀粉马铃薯材料 [J]. 中国农业科学,2008,41 (2): [13] 付永平, 张君, 王丕武, 等. 大豆 BBi 基因 ihprna 种子特异性表达载体的构建 [J]. 西北农林科技大学学报 ( 自然科学版 ),2010,38(1): [14] HofenR,WilmitzerL.Storageofcomptentcelsfor Agrobacterium transformation[j].nucleicacidsre search,1988,16:9877. [15] 傅翠真, 吕耀昌. 豆类中胰蛋白酶抑制剂活性测定与初步分析 [J]. 大豆科学,1992,11(3): [16] 商务部谷物油脂化学所 ( 译 ). 美国谷物化学家协会审批方法 (AACC 方法 )( 第八版 )[M] ( 责任编辑 : 王丽芳 )

材料方法载体构建转基因植株的获得

材料方法载体构建转基因植株的获得生物技术通报唐宏琨曾洪梅杨秀芬邱德文通过根癌农杆菌介导转化法将含有激发子基因的植物表达载体转化三生烟获得了转基因烟草植株用检测确认了阳性转化株用杂交和杂交进一步证实了基因的整合转录和表达对代转基因阳性株进行接种试验结果显示与非转基因对照相比表达的烟草叶片枯斑数量减少表明蛋白激发子基因的表达提高了转基因烟草对的抗性激发子基因烟草转化材料

316 中国油料作物学报 2017,39(3) RNAi(RNAinterference) 已经广泛应用于基因功能验证 关闭基因表达等方面 Fire 等首次利用 RNAi 技术在秀丽隐杆线虫 (Caenorhabditiselegans) 中对特定基因的表达进行了干扰, 且双链 RNA 干扰技术比单

316 中国油料作物学报 2017,39(3) RNAi(RNAinterference) 已经广泛应用于基因功能验证关闭基因表达等方面 Fire 等首次利用 RNAi 技术在秀丽隐杆线虫 (Caenorhabditiselegans) 中对特定基因的表达进行了干扰, 且双链 RNA 干扰技术比单