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缠阳
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1 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (7): 罂粟 COR 和 BBE 基因 RNAi 载体构建及烟草转化 1, 陆艳梅 2 1,, 张金文 2*, 魏玉洁 3 1,, 魏贵民 2, 张艳红 4, 高宜峰 1, 2 (1. 甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室, 甘肃兰州 ; 2. 甘肃农业大学农学院, 甘肃兰州 ; 3. 甘肃省农垦农业研究院, 甘肃兰州 ; 4. 甘肃省中医学院, 甘肃兰州 ) 摘要 : 本研究通过 RNAi 技术, 使用发卡 RNA 结构沉默罂粟可待因酮还原酶 (COR) 与小檗碱桥酶 (BBE) 基因的表达采用 RT-PCR 技术克隆得到 COR 和 BBE 基因全序列, 同源性比较结果显示, 它们与 GenBank 中已报道的 COR 和 BBE 基因高度同源 ; 按照 RNAi 设计原则, 筛选出了 COR 和 BBE 基因靶标序列, 并采用重叠 PCR 法将其拼接成 643 bp 的融合基因, 以中间载体 phannibal 和植物表达载体 pcepsps 为基础, 构建 ihprna 植物表达载体, 用农杆菌介导法将目的基因转入烟草中, 共获得转基因植株 78 株, 通过 PCR 检测从中筛选出了 17 株阳性植株, 可初步确定目的基因已经整合到烟草基因组中关键词 : 罂粟 ; COR 和 BBE 基因 ; RNAi; 转化中图分类号 : S336 文献标识码 : A 文章编号 : (2013) Construction and tobacco transformation of COR and BBE genes hairpin RNA vector of Papaver somniferum LU Yan-mei 1, 2, ZHANG Jin-wen 1, 2*, WEI Yu-jie 3, WEI Gui-min 1, 2, ZHANG Yan-hong 4, GAO Yi-feng 1, 2 (1. Gansu Key Lab of Crop Improvement & Germplasm Enhancement, Lanzhou , China; 2. College of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou , China; 3. Agricultural Research Academy of Gansu Reclamation, Lanzhou , China; 4. Gansu College of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou , China ) Abstract: The gene expressions of codeinone reductase (COR) and berberine bridge enzyme (BBE) in Papaver somniferum were blocked by RNA hairpin of RNA interference (RNAi). The complete sequences of COR and BBE genes were cloned by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), the results of homology comparison revealed that the cloned COR and BBE genes had high homology with the other gene family members reported in the GenBank. The target sequences of COR and BBE genes were screened in accordance with the design principle of RNAi, a 643 bp fusion gene was obtained by the method of overlapping PCR, then plant expression vector ihprna was constructed based on intermediate vector phannibal and plant expression vector pcepsps. With that 78 transgenic plants were obtained through Agrobacterium-mediated and 17 positive plants were screened by PCR, that could initially indicate that the target fragments of COR and BBE gene had been integrated into tobacco genome. Key words: Papaver somniferum; COR and BBE gene; RNA interference; genetic transformation 罂粟 (Papaver somniferum L.) 是重要的药用植收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( ); 教育部博士学科点研究基金项目 ( ); 甘肃省卫生厅重点中医药科技项目 (2008HDTC02). * 通讯作者 Tel: , jwzhang305@163.com 物 [1], 原产于小亚西亚, 为一年生草本植物 [2], 主要用于麻醉镇痛药物吗啡 (morphine) 和可待因 (codeine) 的生产 [3], 罂粟壳所含的主要生物活性成分为吗啡类生物碱, 久服易成瘾 [4], 而吗啡生物合成途径中的中间生物碱蒂巴因 (thebaine) 和网状番荔枝碱 (reticuline) 等生物碱具有更为重要的医用价值 [5 7], 如蒂巴因虽

2 1170 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (7): 无直接生物活性, 但却是一些药物如羟可酮等合成的重要中间体, (R) 或 (S) 网状番荔枝碱是用于制造各种抗疟和抗癌活性药物的前体物已有的研究报道 [1, 6, 8], 调控酪氨酸到 (S)- 网状番荔枝碱合成的 6 个酶已经被克隆, 同时也克隆出了吗啡合成支路中的两个基因其中, 小檗碱桥酶 (berberine bridge enzyme, BBE) 和可待因酮还原酶 (codeinone reductase, COR) 被认为是可待因吗啡合成的关键酶, 在血根碱合成过程中, BBE 催化第一个关键步骤 (S)- 网状番荔枝碱 ( (S)-reticuline) 到 (S)- 金色紫堇碱 ( (S)-scoulerine) 的合成, COR 催化分支中倒数第二个步骤吗啡的合成 [9], 同时抑制这两个酶基因 (BBE 和 COR) 的表达, 阻断 (S)- 网状番荔枝碱 ( (S)-reticuline) 那可丁 (narcotine) 可待因酮 (codeinone) 可待因 (codeine) 吗啡酮 (morphinone) 吗啡 (morphine) 等反应, 由此产生的反馈抑制作用有可能使网状番荔枝碱 (reticuline) 和蒂巴因 (thebaine) 等的积累增加 [10] 同时, COR 是吗啡生物合成代谢途径中最近的一个可调控酶 [2], 该酶对调节吗啡合成代谢途径的中间生物碱含量具有非常重要的意义采用基因沉默技术, 阻断吗啡合成过程中的关键酶基因, 理论上可以提高中间代谢物的含量 [5] [6] 在 Allen 等的研究中, 构建了以 COR 为靶标的 RNA 干扰载体, 并转化罂粟, [10] 结果显示网状番荔枝碱积累量增加 ; 在梁倩倩等的研究中, 构建了以 BBE-COR 融合基因为靶标的 RNA 干扰载体, 将干扰载体转化野生罂粟, 检测发现在转基因野生罂粟中 COR 和 BBE 基因的转录和表达受到抑制, 结果使吗啡合成途径中间物质积累由此说明, 以 COR BBE 为靶标构建 RNA 干扰载体可以达到提高吗啡合成途径中中间代谢物含量的目的 RNA 干扰 (RNA interference, RNAi) 现象普遍存在于植物和动物中, 是一种古老的且进化上高度保守的基因调节机制, 这一机制对于验证未知基因功能调节基因表达保护生物体免受病毒侵害具有重要意义, 已应用于多种粮食作物油料作物经济作物的基因功能鉴定品质改良和抗性研究等方面 [11], 并在肿瘤基因治疗中也有应用 [12] 本课题组梁倩倩和任丽蓉已在之前的研究中均成功构建过以 BBE- COR 融合基因为靶标的 ihrnai 植物表达载体, 其中, 在梁倩倩的研究中, 是以 part27 为基础载体的, 转化罂粟以后获得大量转化苗, 在抗性植株筛选时工作量大 ; 在任丽蓉的研究中, 是以 pcambia1300 为基础载体的, 并对野生罂粟进行了转化, 初步研究表明草丁膦抗性不敏感, 且干扰效果不佳鉴于此, 本实验根据 RNAi 靶标序列选择的原则, 重新筛选内源基因 COR 和 BBE 基因的敏感位点, 重新构建了以草甘膦为抗性的, 以内源 COR 和 BBE 基因为靶标的 RNAi 植物表达载体, 并利用农杆菌介导法将表达载体转化模式植物烟草, 以鉴定对吗啡合成代谢调控的效果, 为培育新型罂粟种质资源建立基础材料与方法材料实验所用材料野生罂粟试管苗幼叶由本课题组保存质粒 phannibal pcepsps 和 E. coli K12 菌株由甘肃农业大学张金文教授提供, 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成, 限制性内切酶和 Taq DNA 聚合酶购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司, T-Vector PCR 产物克隆试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司, 总 RNA 提取试剂盒 (DP419) cdna 第一链合成试剂盒 (KR104) 和凝胶回收试剂盒购自 Tiangen 公司, 其他试剂均为进口或国产分析纯罂粟总 RNA 提取与 cdna 合成用天根总 RNA 提取试剂盒 (DP419) 提取罂粟总 RNA, 并用天根 cdna 第一链合成试剂盒 (KR104) 将总 RNA 反转录成 cdna 备用, 严格按照试剂盒说明书进行操作可待因酮还原酶和罂粟小檗碱桥酶基因引物设计及克隆根据 GenBank 中注册的 COR (AF108432) 和 BBE (AF025430) 序列, 按照碱基互补配对原则, 采用 Oligo 6.0 分析软件进行引物设计 ( 表 1) COR BBE 基因的 PCR 扩增产物均在 1% 的琼脂糖凝胶电泳后, 用凝胶回收试剂盒回收预期大小片段与载体 pucm-t 连接, 对重组质粒进行 PCR 及限制性内切酶酶切鉴定, 并将筛选的重组子送到上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序, 正确克隆命名为 pu-cor 和 pu-bbe COR 和 BBE 基因敏感片段的选择与引物设计首先, 通过 E-RNAi 网站和 dkfz.de/ [11, 13], 选择 COR 基因编码区内长度为 294 bp 片段 ( 表 2) 和 BBE 基因编码区内长度为 291 bp 片段 ( 表 3) 根据 GenBank 中注册的 COR (AF108432) 和 BBE (AF025430) 序列, 按照碱基互补配对原则, 采用 Oligo 6.0 分析软件进行引物设计 ( 表 1), 分别设计用于扩增 COR-T1 片段和 BBE-T2 片段及 COR-T12 的特异引物, 其中扩增 COR-T1 的引物为 CU-11 CD-12, 扩增 BBE-T2 的引物为 BU-21 BD-22, 扩增 COR-T12 的引物为 CU-11 CD-13 为了便于后续载体的构建, 在 CU-11 中添加了 XbaⅠ 和

3 陆艳梅等 : 罂粟 COR 和 BBE 基因 RNAi 载体构建及烟草转化 1171 Table 1 Primers used in this study Name of primer Sequence (From 5' to 3') Note COR1 GAAAAACGGAGAGTAATGGTGT COR full-lenth COR2 GACAGTCCTCACTTACCATCTA BBE1 ATGATGTGCAGAAGCTTAACAT BBE full-lenth BBE2 CU-11 CD-12 CD-13 CTACAATTGCTTCAACATGTAAA GC TCTAGA CTCGAG TAAGCTTGAAGCCAGGGAAG XbaⅠ XhoⅠ ACAGTCGGACACCAACTACGGCTCCCAAAA CTGAG GC ATCGAT GGTACC CTACGGCTCCCAAAACTGAG ClaⅠ KpnⅠ COR-T1 (COR s CDS from 504 to 794) COR-T12 (COR s CDS from 504 to 794) BU-21 TTTTGGGAGCCGTAGTTGGTGTCCGACTGT TGGTA BBE-T2 (BBE s CDS from 370 to 658) BD-22 GC ATCGAT GGTACC GATGAAGCGTGTTCGATTCC ClaⅠ KpnⅠ Table 2 The choice of COR target Target sirnas [19 nt] On-target Off-target No-target Efficient sirna Avg efficiency score Low regions CAN Table 3 The choice of BBE target Target sirnas [19 nt] On-target Off-target No-target Efficient sirna Avg efficiency score Low regions CAN XhoⅠ 限制性酶切位点, 在 BD-22 中添加了 ClaⅠ 和 KpnⅠ 限制性酶切位点 COR-T12 区段的亚克隆 COR-T12 区段亚克隆扩增以 pmd-t/cor ( 含 COR) 质粒为模板, 以 CU-11 和 CD-13 为引物进行扩增 PCR 扩增产物在 1% 的琼脂糖凝胶电泳后, 用凝胶回收试剂盒回收预期大小片段与载体 pucm-t 连接, 对重组质粒进行 PCR 及限制性内切酶酶切鉴定, 并将筛选的重组子送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序, 正确克隆命名为 pu-c1 COR-T1 和 BBE-T2 基因保守片段的融合 COR-T1 和 BBE-T2 片段的融合采用重叠 PCR 的方法 COR-T1 基因片段的扩增以 pmd-t/cor ( 含 COR) 质粒为模板, 以 CU-11 CD-12 为引物 ; BBE-T2 基因片段的扩增以 pmd-t/bbe ( 含 BBE) 质粒 DNA 为模板, 以 BU-21 BD-22 为引物第二轮 PCR 不加入引物, 只加入 COR-T1 和 BBE-T2 基因的扩增产物, 两个片段 (COR-T1 和 BBE-T2) 的融合以第二轮 PCR 产物为模板, CU-11 BD-22 为引物扩增 PCR 扩增产物分别在 1% 的琼脂糖凝胶电泳后, 用凝胶回

4 1172 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (7): 收试剂盒回收预期大小片段与载体 pucm-t 连接, 对重组质粒进行 PCR 及限制性内切酶酶切鉴定, 并将筛选的重组子送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序, 正确克隆命名为 pu-c1t pu-b2t pu-c1b2 COR 和 BBE 基因 ihprna 载体的构建 COR 和 BBE 基因 ihprna 载体的构建过程如图 1 中间载体 phc1 phc1b2 的构建以 phannibal 为中间载体, 用 Kpn I 和 Xho I 分别对 pu-c1 和 phannibal 进行双酶切, 从 pu-c1/kpn Ⅰ+ XhoⅠ 产物中回收小片段 ( 靶标 COR-1, 322 bp), 从 phannibal/ KpnⅠ + XhoⅠ 产物中回收片段 ( 只有一条带, phan- NIBAL 线状分子 ), 将回收的靶标 COR-T12 与 phannibal 线状分子连接, 导入宿主菌 E. coli K12 GM2163, 得到重组克隆 phc1-f; 按上述方法, 将 COR-T1-BBE-T2 片段 ( 大小为 595 bp) 正向插入到 phannibal, 得到 phc1b2-f 同理, 以 phc1-f 为基础载体, 用 XbaⅠ 和 ClaⅠ, 分别对 pu-c1 Figure 1 Construction of RNA interference vectors pcec1r and pcec1b2r 和 phc1-f 进行双酶切, 从 pu-c1/xbaⅠ + ClaⅠ 产物中回收小片段 (COR-1, 322 bp), 从 phc1-f/xbaⅠ + ClaⅠ 产物中回收片段 ( 只有一条带, phc1-f 线状分子 ), 将回收的靶标 COR-1 与 phc1-f 线状分子连接, 导入宿主菌 E.coli K12 GM2163, 得到中间载体 phc1; 运用同样的方法, 将 COR-T1-BBE- T2 ( 大小为 609 bp) 反向插入到 phc1b2-f, 得到中间载体 phc1b2 构建 RNAi 植物表达载体 pcec1r pcec1b2r 的用 SacⅠ 和 PstⅠ, 分别对 phc1 和 pcepsps 进行双酶切, 从 phc1/sacⅠ + PstⅠ 产物中回收小片段 (ihprna-cor1, 约 bp), 从 pcepsps/sacⅠ + PstⅠ 产物中回收片段 ( 只有一条带, pcepsps 线状分子, bp), 将回收的 ihprna-cor1 与 pcepsps 线状分子连接, 导入宿主菌 E.coli K12 GM2163, 得到 RNAi 载体 pcec1r; 按上述方法, 将 phc1b2 中的 ihprna 表达单元 ( 约 bp) 插入到 pcepsps, 得到 RNAi 载体 pcec1b2r 根癌农杆菌转化 [14] 用 CaCl 2 冻融法将 RNA 干扰植物表达载体 pcec1r pcec1b2r 导入农杆菌 LBA4404 中, 用于植物转化烟草外植体的转化及植株再生采用叶盘法进行转化 [15] 将烟草无菌苗健壮叶片切割成 0.5 cm 2 的 [16] 小块, 浸入参照文献制备的农杆菌菌液中, 浸染 0.5~5 min 取出叶盘后, 用无菌滤纸吸干菌液, 将叶盘背光面朝下平放在附有 2 mg L 1 6-BA mg L 1 NAA 的 MS 培养基上, 置于 28 暗培养 2 天后转移至附有 2 mg L 1 6-BA mg L 1 NAA mg L 1 Kan mg L 1 Cef 的 MS 培养基上, 于 25 左右每天 16 h 光照下培养, 每 1~2 周转接 1 次待分化 1~2 cm 的芽叶, 将其切下插入附有 100 mg L 1 Kan mg L 1 Cef 生根培养基中, 于 25 左右每天 16 h 光照条件下诱导生根, 获得转基因植株转基因烟草的 PCR 和对除草剂抗性的检测 [17] 采用 CTAB 法提取转基因烟草植株及未转基因对照烟草的叶片总 DNA, 分别以 CU-11 CD-13 和 CU-11 BD-22 为引物进行 PCR 检测, 以野生型烟草的 DNA 植株为阴性, 含有目的片段的大肠杆菌质粒 DNA 为阳性对照对 pcec1r pcec1b2r 干扰载体转化的植株进行抗除草剂检测时, 将转基因烟草和野生型烟草无菌苗的茎段 ( 含有一个腋芽 ) 放在含有 4.5 mg L 1 的草甘膦的 MS 培养基上萌发, 观察生长状况及对除草剂的抗性

陆艳梅等 : 罂粟 COR 和 BBE 基因 RNAi 载体构建及烟草转化 1173 结果 1 总 RNA 的提取及 COR BBE 基因的克隆以罂粟叶片为材料, 采用植物总 RNA 提取试剂盒提取总 RNA ( 图 2) 以特异引物 COR1/COR2 进行 PCR 扩增, 得到 1 000 bp 左右的 DNA 片段 ( 图 3A, 1),

与预期的片段大小相符质粒 pu- COR 经测序表明, 与 GenBank 注册的罂粟 COR 基因 (AF108432) 相应区段序列同源性达 99.

2), 与预期的 BBE 基因大小相符 ; 用 PstⅠ/BamHⅠ 双酶切重组质粒 pu-bbe, 得到约 1 600 bp 的条带 ( 图 4B, 1), 与预期的片段大小相符质粒 pu-bbe 经测序表明, 与 GenBank 注册的罂粟 BBE 基因 (AF025430) 相应区 Figure 4 Electrophoresis of

M: DNA marker DL2000; A-1: PCR product with BBE1/BBE2; A-2: PCR amplification with BBE1/BBE2 of pu-bbe; B-1: pu-bbe digested by Pst Ⅰ/ BamHⅠ 段序列同源性达 99.

5B, 1), 与预期的 COR-T12 分子大小相符质粒 pu-c1 经测序表明, 与 GenBank 注册的罂粟 COR 基因 (AF108432) 相应区段序列同源性达 99.

5 陆艳梅等 : 罂粟 COR 和 BBE 基因 RNAi 载体构建及烟草转化 1173 结果 1 总 RNA 的提取及 COR BBE 基因的克隆以罂粟叶片为材料, 采用植物总 RNA 提取试剂盒提取总 RNA ( 图 2) 以特异引物 COR1/COR2 进行 PCR 扩增, 得到 bp 左右的 DNA 片段 ( 图 3A, 1), 此片段大小与报道的可待因酮还原酶基因序列相当以 COR1/COR2 为引物, 对重组克隆载体 pu- COR 进行 PCR 检测, 得到约 bp 左右的特异条带 ( 图 3B, 1), 与预期的 COR 基因大小相符 ; 用 PstⅠ/ BamHⅠ 双酶切重组质粒 pu-cor, 得到约 bp 的条带 ( 图 3B, 2), 与预期的片段大小相符质粒 pu- COR 经测序表明, 与 GenBank 注册的罂粟 COR 基因 (AF108432) 相应区段序列同源性达 99.1%, 说明已成功克隆到罂粟 COR 基因以特异引物 BBE1/BBE2 进行 PCR 扩增, 得到 bp 左右的 DNA 片段 ( 图 4A, 1), 此片段大小与报道的小檗碱桥酶基因序列相当以 BBE1/BBE2 为引物, 对重组克隆载体 pu-bbe 进行 PCR 检测, 得到约 bp 左右的特异条带 ( 图 4A, 2), 与预期的 BBE 基因大小相符 ; 用 PstⅠ/BamHⅠ 双酶切重组质粒 pu-bbe, 得到约 bp 的条带 ( 图 4B, 1), 与预期的片段大小相符质粒 pu-bbe 经测序表明, 与 GenBank 注册的罂粟 BBE 基因 (AF025430) 相应区 Figure 4 Electrophoresis of product by PCR and analysis of recombinant plasmid pu-bbe. M: DNA marker DL2000; A-1: PCR product with BBE1/BBE2; A-2: PCR amplification with BBE1/BBE2 of pu-bbe; B-1: pu-bbe digested by Pst Ⅰ/ BamHⅠ 段序列同源性达 99.0%, 说明已成功克隆到罂粟 BBE 基因 2 COR 和 BBE 基因靶标序列的克隆以特异引物 CU-11/CD-13 进行 PCR 扩增, 得到 300 bp 左右的 DNA 片段 ( 图 5A, 1), 此片段大小与已知 COR-T12 区段大小相近用 KpnⅠ/XhoⅠ 双酶切重组载体 pu-c1, 得到约 300 bp 的片段 ( 图 5B, 1), 与预期的 COR-T12 分子大小相符质粒 pu-c1 经测序表明, 与 GenBank 注册的罂粟 COR 基因 (AF108432) 相应区段序列同源性达 99.4%, 说明已成功亚克隆到罂粟 COR-T12 区段 Figure 2 Electrophoregram of extracted total RNA from opium poppy leaves Figure 5 Electrophoresis of product by PCR and restrict digestion analysis of pu-c1, pu-c1t and pu-b2t. M: DNA marker DL2000; A-1: PCR product with CU-11/CD-13; A-2: PCR product with CU-11/CD-12; A-3: PCR product with BU-21/ BD-22; B-1: pu-c1 digested by Kpn I/Xho I; B-2: pu-c1t digested by Kpn I/Xho I; B-3: pu-b2t digested by Kpn I/Xho I Figure 3 Electrophoresis of product by PCR and analysis of pu-cor. M: DNA marker DL2000; A-1: PCR product with COR1/COR2; B-1: PCR product with COR1/COR2; B-2: pu- COR digested by Pst Ⅰ/ BamHⅠ 以特异引物 CU-11/CD-12 进行 PCR 扩增, 得到 300 bp 左右的 DNA 片段 ( 图 5A, 2), 此片段大小与已知 COR-T1 基因大小相近用 KpnⅠ/XhoⅠ 双酶切重组载体 pu-c1t, 得到约 300 bp 的片段 ( 图 5B, 2), 与预期的 COR-T1 基因大小相符质粒 pu-c1t 经测序表明, 与 GenBank 注册的罂粟 COR 基因 (AF108432) 相应区段序列同源性达 99.1%, 说明已成功亚克隆到

1174 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (7): 1169 1177 罂粟 COR-T1 以特异引物 BU-21/BD-22 进行 PCR 扩增, 得到 300 bp 左右的 DNA 片段 ( 图 5A, 3), 此片段大小与已知 BBE-T2 基因大小相近用 KpnⅠ/XhoⅠ 双酶切重组载体 pu-b2t, 得到约 300 bp 的片段 (

5%, 说明已成功亚克隆到罂粟 BBE-T2 3 融合基因结果以特异引物 CU-11/BD-22 进行 PCR 扩增, 得到 600 bp 左右的 DNA 片段 ( 图 6A, 1), 此片段大小与已知融合基因 COR-BBE 大小相近以 CU-11/BD-22 为引物, 对重组克隆载体 pu-c1b2t 进行 PCR 检测, 得到约 600 bp 左右的特异条带 ( 图 6A, 2),

1%, 说明已成功得到融合基因 COR-BBE Figure 7 PCR and restrict analysis of recombinant plasmid phc1-f.

M: DNA marker DL2000; 1: Recombinant plasmid phc1 digested by XbaⅠ/XhoⅠ; 2: Recombinant plasmid phc1b2 by XbaⅠ/ XhoⅠ; 3: Recombinant plasmid phc1 digested by KpnⅠ; 4: Recombinant plasmid phc1b2 by

M: DNA marker DL2000; A-1: PCR product with CU-11/BD-22; A-2: PCR amplification with CU-11/BD-22 of pu-c1b2t; B-1: Recombinant plasmid pu-c1b2t digested by KpnⅠ/XhoⅠ 4 COR 和 BBE 基因 ihprna 载体的构建与检测 4.

6 1174 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (7): 罂粟 COR-T1 以特异引物 BU-21/BD-22 进行 PCR 扩增, 得到 300 bp 左右的 DNA 片段 ( 图 5A, 3), 此片段大小与已知 BBE-T2 基因大小相近用 KpnⅠ/XhoⅠ 双酶切重组载体 pu-b2t, 得到约 300 bp 的片段 ( 图 5B, 3), 与预期的 BBE-T2 基因大小相符质粒 pu-b2t 经测序表明, 与 GenBank 注册的罂粟 BBE 基因 (AF025430) 相应区段序列同源性达 99.5%, 说明已成功亚克隆到罂粟 BBE-T2 3 融合基因结果以特异引物 CU-11/BD-22 进行 PCR 扩增, 得到 600 bp 左右的 DNA 片段 ( 图 6A, 1), 此片段大小与已知融合基因 COR-BBE 大小相近以 CU-11/BD-22 为引物, 对重组克隆载体 pu-c1b2t 进行 PCR 检测, 得到约 600 bp 左右的特异条带 ( 图 6A, 2), 与预期的融合基因 COR-BBE 大小相符 ; 用 KpnⅠ/XhoⅠ 双酶切重组载体 pu-c1b2t, 得到约 600 bp 的片段 ( 图 6B, 1), 与预期的融合基因 COR-BBE 大小相符测序结果表明, 该序列与目的基因的相应区段同源性达 97.1%, 说明已成功得到融合基因 COR-BBE Figure 7 PCR and restrict analysis of recombinant plasmid phc1-f. M: DNA marker DL2000; A-1: PCR amplification with CU-11/CD-13; B-1: Recombinant plasmid phc1-f digested by KpnⅠ/XhoⅠ Figure 8 Restrict digestion analysis of phc1, phc1b2. M: DNA marker DL2000; 1: Recombinant plasmid phc1 digested by XbaⅠ/XhoⅠ; 2: Recombinant plasmid phc1b2 by XbaⅠ/ XhoⅠ; 3: Recombinant plasmid phc1 digested by KpnⅠ; 4: Recombinant plasmid phc1b2 by KpnⅠ Figure 6 Electrophoresis of product by PCR and analysis of recombinant plasmid pu-c1b2t. M: DNA marker DL2000; A-1: PCR product with CU-11/BD-22; A-2: PCR amplification with CU-11/BD-22 of pu-c1b2t; B-1: Recombinant plasmid pu-c1b2t digested by KpnⅠ/XhoⅠ 4 COR 和 BBE 基因 ihprna 载体的构建与检测 4.1 中间载体 phc1 phc1b2 的构建与检测中间载体 phc1 的构建与检测以 CU-11/ CD-13 为引物, PCR 检测重组质粒 phc1-f, 扩增出一条大约 300 bp 的特异条带 ( 图 7A, 1); 用 KpnⅠ/ XhoⅠ 双酶切 phc1-f ( 图 7B, 1), 从图中可以看到一条大约 300 bp 的条带, 与目的片段大小相符检测结果表明已成功构建了 phc1-f 用 XbaⅠ/XhoⅠ KpnⅠ 分别双酶切重组质粒 phc1 ( 图 8), 从图中可以看到 3 泳道一条大约 bp 的条带, 1 泳道一条大约 750 bp 的条带, 与已知片段大小均相符检测结果表明已成功构建了 phc 中间载体 phc1b2 的构建与检测以 CU-11/ BD-22 为引物, PCR 检测重组质粒 phc1b2-f, 扩增出一条大约 600 bp 的特异条带 ( 图 9A, 1); 用 KpnⅠ/ XhoⅠ 双酶切 phc1b2-f ( 图 9B, 1), 从图中可以看到一条大约 600 bp 的条带, 与目的片段大小相符检测结果表明已成功构建了 phc1b2-f 用 XbaⅠ/XhoⅠ KpnⅠ 分别双酶切重组质粒 phc1b2 ( 图 8), 从图中可以看到 4 泳道一条大约 bp 的条带, 2 泳道一条大约 750 bp 的条带, 与已知片段大小均相符检测结果表明已成功构建了 phc1b2 4.2 以 COR BBE 为靶标的 RNAi 植物表达载体 pcec1r pcec1b2r 的构建与检测以 COR 为靶标的 RNAi 载体 pcec1r 的构建与检测以 CU-11 为引物, PCR 检测重组质粒 pcec1r, 扩增出一条大约 bp 的特异条带 ( 图 10A, 1); 并用 XhoⅠ 单酶切 pcec1r ( 图 10B, 1), 从图中可以看

陆艳梅等: 罂粟 COR 和 BBE 基因 RNAi 载体构建及烟草转化 1175 Figure 9 PCR analysis of recombinant plasmid phc1b2-f.

M: DNA marker DL2000; A-1: PCR amplification with CU-11; B-1: Recombinant plasmid pcec1r digested by XhoⅠ; B-2: XhoⅠ Recombinant plasmid pcec1b2r by XhoⅠ; C-1: Recombinant plasmid pcec1b2r digested

2 转基因植株除草剂抗性对 pcec1r pcec1b2r 转化的烟草植株进行抗以 COR BBE 为靶标的 RNAi 载体 pcec1b2r 除草剂实验时, 以 4.

7 陆艳梅等: 罂粟 COR 和 BBE 基因 RNAi 载体构建及烟草转化 1175 Figure 9 PCR analysis of recombinant plasmid phc1b2-f. M: DNA marker DL2000; A-1: PCR amplification with CU-11/ BD-22; B-1: Recombinant plasmid phc1b2-f digested by KpnⅠ/ Figure 10 Restrict digestion analysis of pcec1r, pcec1b2r. M: DNA marker DL2000; A-1: PCR amplification with CU-11; B-1: Recombinant plasmid pcec1r digested by XhoⅠ; B-2: XhoⅠ Recombinant plasmid pcec1b2r by XhoⅠ; C-1: Recombinant plasmid pcec1b2r digested by SacⅠ/PstⅠ; C-2: Recombinant 到, 1 泳道两条较小的条带分别约为和 bp; plasmid pcec1r by SacⅠ/PstⅠ 用 SacⅠ/PstⅠ双酶切 pcec1r (图 10C, 2), 2 泳道有一条大约 bp 的条带, 酶切结果均与已知片段大小相符检测结果表明已成功构建了 pcec1r 5.2 转基因植株除草剂抗性对 pcec1r pcec1b2r 转化的烟草植株进行抗以 COR BBE 为靶标的 RNAi 载体 pcec1b2r 除草剂实验时, 以 4.5 mg L 1 浓度的草甘膦作为筛选用 XhoⅠ单酶切 pcec1b2r (图 10B, 压, 在此浓度下, 对照植株逐渐白化死亡, 转基因植 2), 从图中可以看到, 2 泳道 3 条较小的条带分别约株正常生长, 叶片呈绿色, 说明烟草已整合外源目的为和 bp; 用 SacⅠ/PstⅠ双酶切基因, 为转基因植株的构建与检测 pcec1b2r (图 10C, 1), 1 泳道有 1 条大约 bp 的条带, 酶切结果均与已知片段大小相符检测结果表明已成功构建了 pcec1b2r 5 转基因烟草的获得及检测讨论在吗啡合成途径中, 由 L-酪氨酸 (S)-网状番荔枝碱蒂巴因吗啡合成过程中, 由小檗碱转基因烟草的获得及 PCR 检测合酶调控那可丁的合成, 由可待因酮还原酶调控可工程菌浸染后的烟草叶盘经共培养选择培养及待因吗啡的合成, 若干扰了这两个酶的表达, 理论生根培养后, 分别得到无菌抗性苗 78 株 PCR 检测上会降低那可丁吗啡的含量, 从而提高中间产物和无菌苗, 结果 (图 11) 表明, 携带有外源基因的转基网状番荔枝碱等生物碱的积累, 所以通过基因工程因烟草可以扩增目的条带, 而非转基因植株和阴性植手段阻断或降低该类前体物质的合成有望提高罂粟株没有扩增出相应大小的产物其中有 17 株无菌苗为中生物碱的含量 5.1 阳性植株, 转化率达到 21.8% 其中 pcec1r 转化植目前, RNAi 技术在国内外的研究中均有报道, 如株 9 株, 占总转基因植株的 52.9%; pcec1b2r 转化在 Wesley 等[18]的研究中, 以 phannibal 为中间载植株 8 株, 占总转基因植株的 47.1% 体, 构建 RNA 干扰载体用于检测新小杆线虫基因的 Figure 11 PCR detection of regenerated plants. M: DNA marker DL2000; A-1: Negative control; A-2: Positive control; A-3 7: Regenerated plants; B-1: Negative control; B-2: Positive control; B-3 7: Regenerated plants

8 1176 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (7): [5, 10, 19] 功能 ; 梁倩倩分别以可待因酮还原酶小檗碱桥酶基因和 COR-BBE 融合基因为靶标, 采用 RNAi 技术抑制相应基因的表达, 结果表明 RNAi 干扰载体对吗啡生物合成途径具有一定的干扰抑制作用, 但关于转基因植株内源 COR 和 BBE 基因的表达及其调 [20] 控未做进一步的研究 ; 任丽蓉构建了以 BBE-COR 融合基因为靶标的 RNA 干扰载体, 建立了有效的筛 [21] 选体系, 有效去除非转化体的干扰 ; Fujii 等以 BBE 为靶标, 用具有 BBE 基因反向重复序列的 RNAi 载体转化罂粟, 结果转基因植株内源 BBE 基因表达受到抑制 [18] Wesley 等评价了使用不同 RNA 干扰载体构建获得基因表达受抑制转基因植株的比例, 以含有两个反向重复序列中间夹一个内含子所形成 ihprna 结构的 RNA 干扰载体沉默效果最好, 平均效率高达 [22] 90% 以上关于发卡结构中内含子的选择, 有研究认为, 如果用有功能的内含子替代该环区 (spacer), 则能进一步提高该结构对靶基因的沉默效率因此, 本实验使用了中间载体 phannibal, 将目的片段按正反方向插入内含子的两端, 然后再将其一起转入到 pcepsps 载体 pcepsps 载体为 pcambia1300 的衍生载体, 将其中的潮霉素抗性基因 (hyg) 替换为草甘膦抗性基因 (epsps) 草甘膦 (glyphosate) 是一种施用于叶片的广谱的非选择性的有机磷类除草剂它对于许多一年生和多年生杂草都有极强的控制能力由于其很容易被土壤微生物所分解, 所以它在土壤中无残留 [23] 采用 RNAi 技术, 在干扰片段的选择上具有很大的可塑性, 因为 120~1 000 bp 的片段都可以有效抑制靶标基因的表达 [18, 24] 在本课题组之前的研究中均利用 BLAST 及分子生物学软件 DNAStar 对基因的 cdna 序列同源性进行分析比较, 分别从基因中筛选和克隆到一段高度保守的片段, 本实验则使用和 dkfz.de/ [11, 13] 网站重新设计了靶标序列, 分别选择 COR 基因 291 bp BBE 基因 289 bp 的靶标序列作为干扰片段, 同时, 在干扰片段两侧添加 XbaⅠ XhoⅠ 和 KpnⅠ ClaⅠ 限制性酶切位点, 通过一次扩增两次酶切即可同时获得两条正反向的干扰片段, 从而减少了酶切连接转化的工作量构建的 RNAi 干扰载体理论上能够沉默相应基因家族的所有成员, 并将干扰载体转化模式植物烟草中在烟草中存在多种生物碱, 其中烟碱 ( 尼古丁 ) 是烟草中含量较多的一种生物碱 [25], 其次是去甲基烟碱新烟草碱假木贼碱等烟草转化证明该载体可用, 为下一阶段通过转基因技术开展遗传改良培育具有高活性生物碱的新型罂粟种质资源建立了基础 References [1] Unterlinner BR, Kutchan TM. Molecular cloning and functional expression of codeinone reductase: the penultimate enzyme in morphine biosynthesis in the opium poppy Papaver somniferum [J]. Plant J, 1999, 18: [2] Wang SM. Opium poppy, coca and cannabis [J]. Bull Biol ( 生物学通报 ), 2000, 35: [3] Ye K, Ke Y, Joshi HC, et al. Opium alkaloid noscapine is an antitumor agent that arrests metaphase and induces apoptosis in dividing cells [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95: [4] Hao HY, Guo JX, Shun QS, et al. Determination of 3 bioactive alkaloids in the Chinese drug Pericarpium Papaveris by HPLC and HPCE [J]. Acta Pharm Sin ( 药学学报 ), 2000, 35: [5] Liang QQ, Wei YJ, Zhang JW, et al. Cloning and transformation of COR gene of Papaver nudicaule [J]. Acta Bot Boreal- Occident Sin ( 西北植物学报 ), 2009, 29: [6] Allen RS, Millgate AG, Chitty JA, et al. RNAi mediated replacement of morphine with the nonnarcotic alkaloid reticuline in opium poppy [J]. Nat Biotechnol, 2004, 22: [7] Shukla S, Singh SP, Yadav HK, et al. Alkaloid spectrum of different germplasm lines in opium poppy (Papaver somniferum L.) [J]. Gen Resour Crop Evol, 2006, 53: [8] David AB, Peter JF. Berberine bridge enzyme, a key branchpoint enzyme in benzylisoquinoline alkaloid biosynthesis, contains a vacuolar sorting determinant [J]. Planta, 2001, 213: [9] Joenel A, David AB, Vincent R, et al. Sanguinarine biosynthesis is associated with the endoplasmic reticulum in cultured opium poppy cells after elicitor treatment [J]. Plant Physiol, 2005, 11: [10] Liang QQ, Zhang JW, Wei YJ, et al. Construction of RNAi expression vector by fusion gene fragments of BBE and COR from Papaver nudicarule [J]. J Chin Biotechnol ( 中国生物工程杂志 ), 2009, 29: [11] Ma J, Liu YL, Wang PW. The progress of RNAi in plant [J]. Chin J Oil Crop Sci ( 中国油料作物学报 ), 2008, 30: [12] Fei LN, Wang QZ, Xu RA. Combinatorial RNAi and its application in cancer gene therapy [J]. Acta Pharm Sin ( 药学学报 ), 2012, 47:

9 陆艳梅等 : 罂粟 COR 和 BBE 基因 RNAi 载体构建及烟草转化 1177 [13] Thomas H, Michael B. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents-2010 update [J]. Nucleic Acids Res, 2010, 11: [14] Gu JT, Zhao HM, Liu ZL, et al. Genetic transformation of Trifolium repens using Agrobacterium tumefaciens and transgenic plant regeneration with high efficiency [J]. Acta Pratac Sin ( 草业学报 ), 2007, 16: [15] Sun YR. Genetics Problems Pool ( 遗传学指南 ) [M]. Changsha: Hunan Science of Technology Press, 1989: [16] Wang B, Peng DX, Sun ZX, et al. Regeneration of transgenic Ramie plants expressing green fluorescent protein mediated by Agrobacterium tumefaciens [J]. Acta Agron Sin ( 作物学报 ), 2007, 33: [17] Yang JF, Guo ZF. Cloning and characteristics of 9- cisepoxycarotenoid dioxygenase gene (SgNCED1) from Stylosanthes guianensis [J]. Acta Pratac Sin ( 草业学报 ), 2007, 16: [18] Wesley SV, Helliwell CA, Smith NA, et al. Construct design for efficient, effective and high-throughput gene silencing in plants [J]. Plant J, 2001, 27: [19] Liang QQ, Zhang JW, Wei YJ, et al. Cloning of BBE gene of Papave somniferum and construction of its RNAi expression vector [J]. J Gansu Agric Univ ( 甘肃农业大学学报 ), 2009, 12: [20] Ren LR, Zhang JW, Wei YJ, et al. Construction of RNAi expression vector and tranformation in Papaber nudicarule [J]. Biotechnol Bull ( 生物技术通报 ), 2011, 8: [21] Fujii N, Inui T, Iwasa K, et al. Knockdown of berberine bridge enzyme by RNAi accumulates (S)-reticuline and activates a silent pathway in cultured California poppy cells [J]. Transgenic Res, 2007, 16: [22] Smith NA, Singh SP, Wang MB. Total silencing by intronspliced hairpin RNA [J]. Nature, 2000, 407: [23] Wang GL, Fang HY. Plant Genetic Engineering Principles and Techniques ( 植物基因工程 ) [M]. Beijing: Science Press, 1998: 22. [24] Li JM. Chemical elements and clinical study of tobacco [J]. Occu Health ( 职业与健康 ), 2006, 22: [25] Sayaka H, Shinichiro O, Eri A, et al. The effects of spacer sequences on silencing efficiency of plant RNAi vectors [J]. Plant Cell Reports, 2007, 5:

材料方法载体构建转基因植株的获得

材料方法载体构建转基因植株的获得生物技术通报唐宏琨曾洪梅杨秀芬邱德文通过根癌农杆菌介导转化法将含有激发子基因的植物表达载体转化三生烟获得了转基因烟草植株用检测确认了阳性转化株用杂交和杂交进一步证实了基因的整合转录和表达对代转基因阳性株进行接种试验结果显示与非转基因对照相比表达的烟草叶片枯斑数量减少表明蛋白激发子基因的表达提高了转基因烟草对的抗性激发子基因烟草转化材料