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1 核糖与脱氧核糖的结构 : 第二讲染色体与 DNA(1) 核糖每个核苷酸由磷酸 核糖 碱基三部分构成 脱氧核糖 五种碱基的结构 : N NH 2 N N N H 腺嘌呤 A NH 2 O 鸟嘌呤 G O N HN HN O N O N O N H H H 胞嘧啶 C 尿嘧啶 U 胸腺嘧啶 T 原核细胞的 DNA 存在于拟核之中, 每个原核细胞一般只有一个染色体, 每个染色体含有一个双链环状 DNA 基因组 Genome: 生物体中所有的染色体 染色体的特征 : 分子结构相对稳定, 能够自我复制, 指导蛋白质的合成, 产生可遗传的变异 染色体包括 DNA 蛋白质 RNA 三部分 1) 蛋白质 : 分为组蛋白和非组蛋白 i) 组蛋白是染色体的结构蛋白, 有 H1 H2A H2B H3 H4 五种, 与 DNA 构成核小体 H1 处于接头位置, 其余处于中心位置 ;H3 和 H4 保守性最高 组蛋白的特性 : 进化上的极端保守性, 无组织特异性, 肽链上氨基酸分布不对称 ( 碱性氨基酸在 N 端, 疏水基团在 C 端 ), 存在较普遍的修饰 ( 甲基化 乙酰化 磷酸化 泛素化 ) 组蛋白的修饰主要发生在 N 端 这些修饰携带了大量的表观遗传信息 甲基化 : 由组蛋白甲基化转移酶 (HMT) 催化, 发生在赖氨酸和精氨酸残基上, 与基因激活和基因沉默相关 是最普遍且最重要的修饰 乙酰化 : 由组蛋白乙酰基转移酶 (HAT)/ 组蛋白去乙酰化酶 (HDAC) 催化, 发生在赖氨酸上, 高乙酰化时转录活化, 低乙酰化时转录抑制

2 其他修饰 : 磷酸化 泛素化 腺苷酸化 ADP 核糖基化等 组蛋白密码 : 被专一识别的修饰信息 组蛋白修饰的作用机制 : 通过影响组蛋白和 DNA 双链的亲和性, 改变染色质的疏松或凝集状态 ; 或通过影响转录因子与启动子的亲和性来发挥基因调控作用 ii) 非组蛋白 : 作用主要是酶催化 遗传信息的保持和表达调节 染色体的结构支持体 HMG 蛋白 ( 高速泳动族蛋白 ): 与 DNA 结合但不牢固, 也可与 H1 作用, 可能与 DNA 的超螺旋有关 DNA 结合蛋白 ( 螺旋失稳蛋白 DNA 解链蛋白 单链 DNA 结合蛋白 ): 解链酶的一类, 与单链 DNA 亲和力大 2)DNA: 含有大量重复序列, 功能 DNA 序列被非功能 DNA 隔开 C 值 : 一种生物单倍体基因组 DNA 的总量 C 值悖论 :C 值与种系进化的复杂程度不一致 DNA 序列分为三类 : 不重复序列 ( 结构基因 ), 中度重复序列 (rrna,trna, 组蛋白基因 ), 高度重复序列 ( 卫星 DNA) 蛋白质的编码区域只占人类基因非常小的部分 转录产物主要是 ncrna 人与黑猩猩的基因差异来源于非编码 RNA; 人个体间的单倍体基因组差异绝大多数存在于非编码 RNA 中 ncrna 的功能 :rrna,trna,snrna( 参与 RNA 成熟过程 ),snorna( 将 U 转变为 Ψ),miRNA( 基因表达与转录的调控 ), 端粒酶 RNA( 参与端粒的构建 ) 由 DNA 和组蛋白组成的染色质纤维细丝是由许多核小体连接而成的念珠状结构 T m 值 : 解链温度, 取决于 GC 含量 溶液中的离子强度 DNA 的均一性 核小体 Nucleosome: 染色质的基本单位,146bpDNA+ 组蛋白八聚体 核小体核心 +H1 染色小体 + 连接 DNA 核小体染色质的压缩 : 核小体 10nm 纤维 30nm 纤维 ( 螺线管 ) 超螺旋 染色质染色质压缩的重要性 : 使 DNA 能够存在于细胞中, 使 DNA 免受损害, 细胞分裂时 DNA 的分离更有效, 同时促进基因表达与基因重组 真核生物基因组的结构特点 : 基因组庞大, 存在大量的重复序列, 大部分为非编码序列, 转录产物为单顺反子, 存在断裂基因 ( 有内含子 ), 存在大量的顺式作用元件, 存在大量的 DNA 多态性 ( 单核苷酸多态性和串联重复序列多态性 ), 具有端粒 原核生物基因组的结构特点 : 基因简单, 主要为单拷贝基因, 整个染色体几乎全部为功能基因和调控序列, 几乎每个基因序列与编码蛋白序列成线性对应, 存在转录单元, 产物为多顺反子, 存在重叠基因 DNA 的结构

3 一级结构 : 通过 3, 5 - 磷酸二酯键形成的四种核苷酸的排列顺序 二级结构 : 两条多核苷酸链反向平行形成的双螺旋结构 碱基互补配对原则 :A-T,G-C 由 Watson 和 Crick 提出基本特点 : 反向平行的双螺旋, 脱氧核糖和磷酸交替排列, 碱基在内侧通过氢键形成碱基对, 有大沟和小沟 三种 DNA 的二级结构 :B-DNA( 常见 ),A-DNA( 转录状态 ),Z-DNA( 左手螺旋 ) 三级结构 :DNA 双螺旋进一步扭曲盘绕形成的特定空间结构, 主要是超螺旋结构, 分为正超螺旋与负超螺旋, 在拓扑异构酶的作用下可相互转变 细菌的质粒 DNA 在天然状态下以负超螺旋为主, 利用电场迁移率 : 超螺旋 DNA> 线性 DNA> 开环 DNA 的特点来判断质粒是否被破坏 第三讲染色体与 DNA(2) 半保留复制 : 保证了 DNA 在代谢上的稳定性 复制叉 replication fork: 复制起点呈叉子状 复制子 replicon: 生物体的复制单位 一个复制子只有一个复制起点 细菌 病毒和线粒体都是作为单个复制子复制的 ; 真核生物基因组含有多个复制子 原核生物 DNA 的复制 (E. coli): 大肠杆菌为环形染色体, 有一个单一的复制起点, 复制与解链同时进行, 且为双向等速复制,θ 环型复制 所有 DNA 聚合酶的合成方向都是 5 3 半不连续复制模型 : 前导链的连续复制与滞后链的不连续复制 冈崎片段 Okazaki fragment DNA 复制的基本过程 1) 复制的起始 E. coli 的 oric 复制原点参与 DNA 复制起始和引发的蛋白 :DNA 解旋酶, 单链结合蛋白 (SSB),DNA 拓扑异构酶, 引物酶 解旋酶催化双螺旋的解链 SSB 与单链 DNA 结合阻止分子间碱基对的形成 拓扑异构酶移去复制叉前段的正超螺旋 引物酶 ( 一种 RNA 聚合酶 ) 合成一段短的 RNA 序列, 提供 3 -OH 2)DNA 链的延伸需要的蛋白质 :DNA 聚合酶, 滑动夹,RNA 酶,DNA 连接酶 DNA 聚合酶具有持续合成能力 滑动夹可以提高 DNA 聚合酶的持续合成能力 RNA 酶移除 RNA 引物 DNA 连接酶补全缺口 3) 复制的终止复制叉遇到 20bp 重复性终止子序列 (Ter) 时,Ter-Tus 复合物能阻挡复制叉的前进 两个方向的复制叉到达后在 DNA 拓扑异构酶的作用下释放子链 DNA

4 大肠杆菌中的 DNA 聚合酶 :I II III IV V DNA Pol I: 具有 3 5 外切酶活性, 保证了 DNA 复制的准确性 ;5 3 外切酶活性可用于切除冈崎片段的 5 引物, 保证连接酶将片段连接起来 DNA Pol II: 修复 DNA DNA Pol III: 二聚体, 聚合活性强, 是大肠杆菌 DNA 复制的主导聚合酶 DNA Pol IV 和 DNA Pol V: 在 SOS 修复过程中发挥功能 DNA 聚合酶的共同点 : 以 dntp 为底物, 需要镁离子激活, 需模板链和引物链, 按 5 3 方向延伸 真核生物 DNA 的复制 : 多个复制起点, 只在 S 期进行, 复制子相对较小 真核生物的复制子称为自主复制序列 (ARS), 包括数个复制起始必须的保守区 真核生物复制的起始需要起始点识别复合物 (ORC) 的参与,ORC 结合于 ARS 哺乳动物细胞中主要有 5 种 DNA 聚合酶 (α β γ δ ε) 聚合酶 α 主要参与引物合成 聚合酶 β 主要在 DNA 损伤的修复中起作用 聚合酶 γ 在线粒体 DNA 的复制中发挥作用 聚合酶 δ 主要负责 DNA 的复制 聚合酶 ε 与后随链的合成有关, 在核苷切除与碱基修复中起作用 突变 mutation: 持久的 可遗传的 DNA 碱基序列的改变 替换突变 substitution mutation 转换 transition: 嘌呤或嘧啶的自身转换 (A 和 G,C 和 T) 颠换 transversion: 嘌呤和嘧啶之间的相互转换 移码突变 frameshift: 缺失 deletion 或插入 insertion 校读 proofreading(e. coli DNA Pol I 和 DNA Pol III, 动物的聚合酶 δ 和 ε): 保证复制中的序列准确 DNA 修复错配修复 mismatch repair(mmr): 保存母链 ( 被甲基化 ), 修正子链切除修复 excision repair 碱基切除修复 base-excision repair(ber): 糖苷水解酶识别, 形成 AP 位点 ;AP 核酸内切酶切除 AP 位点 ;DNA 聚合酶修复 ;DNA 连接酶连接缺口 核苷酸切除修复 nucleotide-excision repair(ner):dna 切割酶切除损伤片段 ;DNA 解链酶移去损伤片段 ;DNA 聚合酶修复 ;DNA 连接酶连接缺口 双链断裂修复 double-strand break repair(dsb repair) 同源重组修复 homologous recombinant repair: 复制后修复, 重新启动停滞的复制叉 非同源末端连接 non-homologous end joining(nhej): 修复蛋白将断裂末端拉近, 直接由 DNA 连接酶接合 DNA 直接修复 direct repair SOS 系统 SOS response 转座 transposition 转座子 transposon(tn) 分为两种 : 插入序列和复合型转座子 插入序列 insertional sequence(is): 不含有宿主基因, 末端具有反向重复序列, 转座

5 时带有正向重复序列, 基本只有一个可读框 复合型转座子 composite transposon: 两翼为相同或相似的 IS, 带有宿主基因, 可由 IS 调节转座能力 自主性转座子 autonomous transposon: 具有自主剪接和转座的功能 非自主性转座子 nonautonomous transposon: 不能单独转座, 在含有同家族的自主性转座子时可依靠其提供的转座酶 ( 反式作用蛋白 ) 成为相同的自主性转座子 玉米的 Ac-Ds 转座系统 :Ac 为自主性转座子, 不引起基因断裂, 可通过提高浓度抑制 Ds 的转座 ;Ds 为非自主性转座子, 可引起基因断裂 转座的遗传学效应 : 引起插入突变, 产生新的基因, 产生染色体畸变, 引起生物进化 单核苷酸多态性 single nucleotide polymorphism(snp): 基因组中由于单个核苷酸的突变引起的多态性, 是基因组中最简单最常见的多态性形式, 具有很高的遗传稳定性, 已成为第三代遗传标记 基因编码区 SNP(cSNP) 同义 csnp:snp 导致的编码序列不影响蛋白质的氨基酸序列 非同义 csnp:snp 导致蛋白质序列的改变 基因调控区 SNP(pSNP) 基因间随机非编码区 SNP(rSNP) 单倍型 haplotype: 位于染色体上某一区域的一组相关联的 SNP 等位位点 相邻 SNP 的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代 SNP 的应用 : 人类单倍型图的绘制,SNP 与疾病易感基因的相关性分析, 指导用药与药物设计 第四讲生物信息的传递 ( 上 ) 从 DNA 到 RNA(1) 基因表达包括转录 transcription 和翻译 translation 两个阶段, 转录是基因表达的核心步骤, 翻译是基因表达的最终目的 转录与复制的差异 :RNA 由核糖核苷酸构成 ;RNA 聚合酶不需要引物 ;RNA 产物不与模板链保持碱基配对 ; 转录过程的精确度低 RNA 主要以单链形式存在于生物体内 RNA 可以自身折叠形成局部双螺旋 : 发夹 hairpin 凸结构 bulge 环结构 loop 等 RNA 中在不连续的碱基间发生配对, 形成假结 pseduoknot 非 Watson-Crick 配对 :G-U 对, 存在于 RNA 中

6 编码链 coding strand, 有意义链 sense strand, 正链 positive strand,crick 链 Crick strand; 模板链 template strand, 反义链 antisense strand, 负链 negative strand,watson 链 Watson strand 转录单元 transcription unit: 转录成 RNA 的一段 DNA 序列, 从启动子 promoter 开始, 到终止子 terminator 结束 RNA 聚合酶 : 利用 DNA 模板合成 RNA 启动子 promoter:rna 聚合酶结合以启动转录的 DNA 区域 起始位点 startpoint(startsite):rna 中第一个碱基所对应的 DNA 终止子 terminator: 使 RNA 聚合酶终止转录的 DNA 序列 上游 upstream: 与转录方向相反的序列方向 下游 downstream: 与转录方向相同的序列方向 初级转录物 primary transcript: 转录单元生成的未修饰的 RNA 产物 RNA 合成的特点 : 按 5 3 方向, 以反义链 ( 模板链 ) 为模板 转录的基本过程 : 1) 模板识别 RNA 聚合酶与启动子相互作用并结合 真核生物的 RNA 聚合酶需要一些被称为转录调控因子的辅助蛋白质按特定顺序结合于启动子上,RNA 聚合酶才能与之相结合并形成复杂的前起始复合物 (PIC) 2) 转录起始起始位点为 +1; 转录起始到形成 9 个核苷酸是通过启动子阶段, 通过启动子的时间越短, 转录起始的频率越高 流产式起始 : 合成并释放 2-9 个核苷酸 转录延伸复合物 : 释放 σ 亚基,RNA 聚合酶离开启动子区进入正常延伸 RNA 聚合酶与启动子形成封闭复合物 closed complex,dna 仍为双链 DNA 解开部分双链, 形成开放复合物 open complex 结合两个 NTP, 形成三元复合物 ternary complex 3) 转录延伸 RNA 聚合酶的校对功能焦磷酸化编辑 : 通过加入 PPi 催化错误的核糖核苷酸离去, 然后插入新的核糖核苷酸 水解编辑 : 聚合酶倒退并切开 RNA 产物, 去除含有错误的序列 4) 转录终止终止子通常含有自我互补区域, 在 RNA 产物中可以形成茎环结构或发夹结构 i)rho 非依赖型终止子序列 ( 内在终止子 intrinsic terminator) 两个序列原件 : 一段短的反向重复序列 ; 一段 4~8 个 A-T 对 可转录出茎环结构, 阻止 RNA 聚合酶的前进 多个 A-T 对转录后配对成最弱的 A-U 碱基对, 便于解离 ii) 依赖于 ρ 因子的终止只含有自我互补区域 ρ 因子具有 ATPase 的活性, 催化 NTP 水解促使新生 RNA 链从三元复合物中离去 穷追 hot pursuit 模型

7 RNA 聚合酶 : 转录过程中最关键的酶 ; 以双链 DNA 为模板, 需要镁离子 / 锰离子为辅助因子, 不需要任何引物, 以 5 3 方向合成 RNA 链, 缺乏 3 5 外切酶活性 RNA 聚合酶的功能 : 识别启动子 ; 使 DNA 在启动子处解旋成单链 ; 确定转录方向和模板链 ; 识别终止子停止转录 E. coli 中只有一个 RNA 聚合酶, 由五种亚基 (α,β,β,ω,σ) 聚成聚合酶全酶 α 亚基 : 与核心酶的组装有关, 参与 RNA 聚合酶和调节因子的相互作用 β 和 β 亚基 : 组成了聚合酶的催化中心 σ 因子 : 负责模板链的选择和转录的起始, 是启动子识别的关键的酶 使聚合酶从核心酶转变为聚合酶全酶 真核生物的 RNA 聚合酶有三类, 结构比大肠杆菌 RNA 聚合酶复杂, 在细胞核中的位置不同, 负责转录的基因不同, 对 α- 鹅膏覃碱的敏感性也不同 RNA 聚合酶 I: 位于核仁, 转录产物为 rrna, 对 α- 鹅膏覃碱不敏感 RNA 聚合酶 II: 位于核质, 转录产物为 hnrna(mrna 的前体 ), 对 α- 鹅膏覃碱敏感 RNA 聚合酶 III: 位于核质, 转录产物为 trna snrna, 对 α- 鹅膏覃碱存在物种特异性 转录抑制剂 : 模板结合抑制剂 ( 放线菌素 D, 烷化剂, 溴化乙锭 ) 和聚合酶抑制剂 ( 利福霉素, 链霉溶菌素,α- 鹅膏覃碱 ) 利福霉素 细菌全酶, 链霉溶菌素 细菌核心酶, 放射线素 D 真核 Pol I( 和 DNA 结合, 阻止延伸 ),α- 鹅膏覃碱 真核 Pol II( 和 Pol II 结合 ) 线粒体和叶绿体中存在不同的 RNA 聚合酶, 不受 α- 鹅膏覃碱抑制 转录单元 transcription unit 转录起始位点 transcription start site: 在原核中 90% 为嘌呤, 两侧通常是 C-T, 位置固定 启动子 promoter: 位于结构基因 5 端上游的保守 DNA 序列, 能活化 RNA 聚合酶, 具有转录起始的特异性 原核生物的启动子 : -10 区 (Pribnow 区 ):TATAAT, 易于解链, 与 RNA Pol 紧密结合, 形成开放启动复合体, 使 RNA Pol 定向转录 如果将 TATAAT 变成 AATAAT 就会发生下降突变 down mutation, 如果增加 Pribnow 区的共同序列, 就会发生上升突变 up mutation -35 区 (Sextama 区 ):TTGACA,RNA Pol 的识别位点, 只有 σ 亚基才能识别, 为转录选择模板链 -10 区域 -35 区的最佳距离大约是 16~19bp, 过大或过小都会降低转录活性 原核生物启动子的共同特点 : 结构典型, 都含有识别 结合 起始三个位点 ; 序列保守 ; 位置和距离都比较固定 ; 直接和多聚酶相结合 ; 常和操纵子相邻 ; 都在控制基因的 5 端 ; 决定转录的启动和方向 真核生物的启动子 : 核心元件 :TATA box(hogness 区 ):-25~-30bp; 起始子 initiator(inr): 转录起始位点附近上游启动子元件 (UPE):CAAT box:-70~-80 区,CCAAT 序列 ; GC box:-80~-110 区,GCCACACCC 或 GGGCGGG 序列上游启动子元件也叫上游激活序列 (UAS) TATA 区 : 使转录精确地开始

8 CAAT 区和 GC 区 : 控制转录的起始频率, 不参与起始位点的确定远上游序列 far upstream sequence: 增强子 enhancer:~200bp 特点 : 远距离效应 ; 无方向性 ; 顺式调节 ; 无物种和基因的特异性 ; 具有组织特异性 ; 有相位性 ( 与 DNA 的构象有关 ); 有的增强子可以对外部信号产生反应 真核生物启动子的特点 : 有多种元件 ; 结构不恒定 ; 位置 序列 距离和方向都不完全相同 ; 有的存在远距离调控元件 ( 如增强子 ); 这些元件具有控制转录效率和选择起始位点的作用 ; 不直接和 RNA Pol 结合 第五讲生物信息的传递 ( 上 ) 从 DNA 到 RNA(2) 原核与真核生物的转录产物比较 : 原核生物只有一种 RNA 聚合酶参与转录, 初始转录产物大多是编码序列, 与蛋白质的氨基酸序列成线性关系 ; 初始转录产物不需要加工就可以形式翻译模板的功能 ; 转录和翻译发生在同一个细胞空间, 这两个过程几乎是同步的 真核生物中有三种以上 RNA 聚合酶参与转录, 初始转录产物含有内含子序列, 需要经过剪接 修饰等加工才能成为成熟的 mrna; 真核细胞 mrna 的合成和功能表达发生在不同的空间和时间范畴内 原核与真核生物的 mrna 的比较 : 原核生物 mrna 的半衰期短, 大多以多顺反子的形式存在,5 端无帽子结构,3 端没有或只有较短的 poly-a 结构 原核生物常以 AUG( 或 GUG UUG) 作为起始密码子 原核生物起始密码子上游有一段保守的 SD 序列 ( 或核糖体结合位点 ribosome binding site,rbs) 真核生物的 mrna 以单顺反子的形式存在,5 端存在帽子结构,3 端大多有 poly-a 尾巴 基因的分子生物学定义 : 产生一条多肽链或功能 RNA 所必须的全部核苷酸序列 5 端的帽子结构 : 通过 5 5 磷酸二酯键在原初 mrna 的 5 端扣一个 G, 由鸟苷转移酶催化, 是 GTP 与 5 - 三磷酸腺苷 ( 或鸟苷 ) 的缩合产物, 帽子结构常常被甲基化, 是蛋白质合成起始信号的一部分 零类帽子 cap0: 鸟苷酸 -7- 甲基转移酶催化, 发生在 G( 第一位核苷酸 ) 上 1 类帽子 cap1:2 -O- 甲基转移酶催化, 发生在原第一位 ( 现第二位 ) 核苷酸上 2 类帽子 cap2: 以 cap1 为底物生成, 发生在原第二位 ( 现第三位 ) 核苷酸上帽子结构的功能 : 帮助 mrna 越过核膜, 保护 5 不被核酶降解, 翻译时供 IF-3 和核糖体识别 3 端的 poly-a 尾巴 : 除组蛋白基因外, 真核生物 mrna 的 3 末端都具有 poly-a, 由多聚 A 聚合酶催化, 在转录之后被加上 在 poly-a 上游 11~30nt 处有一保守序列 AAUAAA, 对于初级转录产物的准确切割及加多聚 A 是必须的 poly-a 的功能 : 帮助 mrna 进入细胞质, 提高 mrna 在细胞质中的稳定性, 可促进核糖体的有效循环 Poly(A) - : 不含有 poly-a 尾巴的 mrna, 约 1/3 编码了不同形式的组蛋白 真核基因大多是断裂的, 由多个内含子 intron 和外显子 exon 间隔排列而成 RNA 剪接 : 发生在核中, 由剪接体催化

9 内含子类型 :GU-AG( 细胞核, 前体 mrna) AU-AC I 类内含子 ( 细胞核, 前体 rrna, 细胞器 RNA, 少数细菌 RNA) II 类内含子 ( 细胞器 RNA, 部分细菌 RNA) III 类内含子 双内含子 trna 前体中的内含子 GU-AG 法则 (Chambon 法则 ): 内含子的边界序列是很短的保守序列 GU-AG GU-AG 法则不适用于线粒体 叶绿体的内含子, 也不适用于酵母的 trna 基因 细胞核 mrna 的结构特点 : 左边的剪接位点为供体 donor 位点, 右边的剪接位点为受体 acceptor 位点 边界序列 : 完全符合 GU-AG 法则 分枝点序列 : 位于 3 端上游 18~50nt 处,PyNPyPuAPy,A 为 100% 保守, 具有 2 -OH 内含子 5 端有一保守序列与 U1snRNA 的 5 端的保守序列互补 核 mrna 的剪接 : 核内 mrna 前体分子与蛋白质结合, 形成 snrnp 复合物 ; 每个内含子的 5 和 3 两段的复合物成对连结, 产生剪接体 spliceosome 细胞核中的小分子 RNA 称为细胞核小 RNA(snRNA) 细胞质中的称为细胞质小 RNA(scRNA) 在自然状态下, 它们以核糖核蛋白颗粒 (snrnp 和 scrnp) 的形式存在, 俗称 snurps 和 scyrps 核仁中存在着一类小 RNA 叫做核仁小 RNA(snoRNA), 在 rrna 的加工中起作用 snrna 参与剪接过程, 并与其他蛋白一起构成剪接体 剪接体由约 150 种蛋白 5 种 snrna(u1,u2,u4,u5 和 U6) 和前体 mrna 构成 snrnp 在剪接中的作用 : 识别 5 剪接位点和分枝点 ; 按需要连接这两个位点 ; 催化 ( 或帮助催化 )RNA 的剪接 剪接过程 : 前体 mrna 剪接前体 剪接体 3 剪接位点 : 从 5 向下游出发, 分枝点后富嘧啶区 3 下游的第一个 AG 一般说来, 剪接效率 :CAG=UAG>AAG>GAG 增加剪接位点选择准确性的两种机制 : 1. 新合成的 RNA 分子遇到 5 剪接位点时,RNA Pol II 携带的加工 RNA 的蛋白质就从其 C 端转移到 RNA 上, 等待着与下一个 3 剪接位点的剪接体成分相互作用, 减少外显子遗漏的可能性 2. 一种 SR 蛋白结合到外显子的外显子剪接增强子 (ESE) 上, 并与剪接机器的组分相互作用, 将其引导到附近的剪接位点, 确保优先识别邻近外显子的剪接位点, 防止使用错误的剪接位点 可变剪接 alternative splicing: 选择性越过某些外显子或某个剪接点进行变位剪接 拓展了基因所携带的遗传信息

10 RNA 的 5 种剪接模式 : 正常情况, 外显子遗漏, 外显子延伸, 内含子保留, 可变剪接 自我剪接内含子 self-splicing intron:i II 类内含子 I 类内含子 : 边界序列为 5 U-G 3, 具有中部核心结构, 可以转变为真正的核酶有一个保守的二级结构, 含有一个结合鸟苷或鸟苷酸的口袋 ; 有一段内在指导序列 IGS, 与 5 剪接位点的序列配对, 确定鸟苷亲核攻击的位置过程 : 自由鸟苷酸的 3 -OH 攻击内含子 5 端, 从上游切开 RNA; 上游外显子的自由 3 - OH 攻击内含子 3 端, 使内含子被完全切开 ; 上下游两个外显子形成磷酸二酯键 II 类内含子 : 边界序列为 5 GU-AG 3, 无需鸟苷的辅助, 但需镁离子 过程与核 mrna 内含子的剪切类似 过程 : 分枝点 2 -OH 攻击 5 端, 从上游切开 RNA, 形成套索结构 ; 上游外显子的 3 -OH 攻击内含子 3 端, 使套索结构解离 ; 上下游两个外显子形成磷酸二酯键 三种剪接反应都是通过两次连续的转酯反应进行的 trna 的剪接 :trna 核酸内切酶切割内含子,RNA 连接酶连接外显子 ;trna 核苷酸转移酶在 3 - 端添加 CCA; 核苷酸修饰 rrna 的剪接 : 大小 rrna 从共同的 RNA 前体切割并释放 RNA 编辑 : 主要是 mrna 的加工方式, 在 RNA 转录后改变序列, 导致遗传信息的改变 位点特异性脱氨基作用 :C 由脱氨酶催化成 U 引导 RNA(gRNA) 指导的尿嘧啶的插入或删除 (G-U 配对 ) grna 有三个区域 : 锚区 ( 引导 grna 到达需要编辑的区域 ), 编辑区 ( 决定哪里需要插入 U),poly-U 骨架 编辑机制 :grna 存在一些未能配对的腺嘌呤缺口, 为插入 U 提供模板

11 RNA 编辑的生物学意义 : 校正作用 ; 调控翻译 ( 构建或去除起始密码子和终止密码子 ); 扩充遗传信息 RNA 的再编码 :RNA 编码和读码方式的改变, 可以从一个 mrna 产生多种相互关联又不同的蛋白质 核糖体程序性 +1/-1 移位 :mrna 读码发生 +1/-1 的移位核糖体跳跃 : 越过 50 个核苷酸终止子通读 : 硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸 一组特殊的 RNA 结合蛋白标示 mrna 已成熟, 可以运送到细胞质中 mrna 从细胞核到细胞质的转运具有高度的选择性 外显子连接复合体 EJC,poly-A 结合蛋白, 帽子结合蛋白 mrna 最终被细胞降解 其分子寿命取决于 mrna 的核苷酸序列 (3 UTR) 以及产生该种 mrna 的细胞类型 mrna 的不同寿命协助细胞决定每种蛋白质的合成水平 合成水平较高的蛋白质是由较长寿命的 mrna 翻译而来的 ; 低水平表达的蛋白或表达水平随信号快速改变的蛋白, 往往是由寿命较短的 mrna 合成的 核酶 ribozyme: 具有催化功能的 RNA 分子, 特异性地剪切底物 RNA, 阻断基因表达 核酶的锤头结构包括三个茎环区, 有一个 个保守核苷酸构成的催化中心, 核酶分为剪切型核酶 ( 只剪不接 ) 合剪接型核酶 ( 又剪又接 ) 核酶的生物学意义 : 对 RNA 的重要功能有了新的认识 ; 对中心法则的重要修正, 说明 RNA 既是遗传物质又是酶 ; 为生命起源的研究提供了新思路 第六讲生物信息的传递 ( 下 ) 从 mrna 到蛋白质 (1) 翻译 translation: 将 mrna 链上的核苷酸从一个特定的起始位点开始, 按每 3 个核苷酸代表一个氨基酸的原则, 依次合成一条多肽链 遗传密码 :mrna 上每 3 个核苷酸翻译成多肽链上的一个氨基酸, 这 3 个氨基酸成为一个三联子密码 密码子 codon: 代表一个氨基酸或一个终止信号的三联核苷酸起始密码子 initiation codon: 通常是 AUG 开放阅读框 ORF: 决定蛋白的编码形式, 由一个起始密码子开始, 到一个终止密码子为止 ; 一个 RNA 可以以三种阅读框进行翻译, 往往只有一种编码实际信息终止密码子 termination codon: 通常是 UAG,UAA,UGA 同义密码子 synonymous codon: 对应于同一氨基酸的密码子遗传密码的性质 : 连续性 ( 三联子密码是非重叠且连续的 ), 简并性 ( 一种以上密码子编码同一个氨基酸 ), 普遍性 ( 生物界基本共用同一套遗传密码 ) 与特殊性 ( 遗传密码并非总是通用 ) trna 的反密码子在核糖体内通过碱基的反向配对与 mrna 上的密码子相互作用 Crick 的摆动假说 (wobble hypothesis): 前两对严格遵守碱基配对, 第三对有一定的自由度 因此某些 trna 可以识别 1 个以上的密码子 一个 trna 识别的密码子的个数是由反密码子的第一位碱基决定的

12 trna: 为三联密码子翻译成氨基酸提供了接合体, 为准确地将所需氨基酸运送到核糖体上提供了运送载体, 因此又被称为第二遗传密码 一级结构 : 长度 60~95nt;15 个恒定残基和 8 个半恒定残基, 在二级结构和三级结构中起到重要的作用 ; 含有修饰碱基 二级结构 : 三叶草结构, 含有 4 个臂,3 个环 受体臂 acceptor arm: 由两端的配对序列形成的杆状结构,3 端有未配对的 CCA,A 的 2 或 3 -OH 可以被氨酰化 D 臂 (D 环 ): 含有二氢尿嘧啶 (dihydrouracil), 存在多个可变核苷酸位点 反密码子臂 anticodon loop: 含有三联反密码子,5bp 臂 +7bp 环 TΨC 臂 : 含有这三个核苷酸,Ψ 为拟尿嘧啶 可变臂 ( 多余臂 )variable arm trna 中含有丰富的稀有碱基, 多数分布在非配对区, 对于维持反密码子的稳定性及密码子 反密码子间的配对很重要 三级结构 :L 型三级结构, 由二级结构中未配对碱基间的三级氢键形成 受体臂顶端的碱基位于一个端点, 反密码子臂的反密码子环处于另一个端点 这个结构满足了蛋白质合成过程中对 trna 的各种要求 trna 的功能 : 模板 mrna 只能识别特异的 trna; 氨基酸本身不能识别密码子, 只有结合到 trna 上形成 AA-tRNA, 才能被带到 mrna- 核糖体复合物上 trna 的种类 : 起始 trna( 特异性识别 mrna 上起始密码子, 真核生物为甲硫氨酸 Met, 原核生物的甲硫氨酸必须首先甲酰化才能参与蛋白质的生物合成 ), 延伸 trna, 同工 trna ( 代表相同氨基酸的不同 trna, 一个同工 trna 组专一于同一氨酰 -trna 合成酶 ), 校正 trna( 通过改变反密码子区校正无义突变和错义突变 ) 氨酰 -trna 合成酶 (ARS): 催化氨基酸与 trna 结合的特异性酶 第一步 : 氨基酸活化生成酶 - 氨酰腺苷酸复合物 ; 第二步 : 氨酰基转移到 trna 3 末端的 2 或 3 -OH 上 蛋白质合成的真实性决定于 ARS 是否能使氨基酸与对应的 trna 相结合 ;ARS 既要识别 trna 又要识别氨基酸, 它对于两者具有高度的转移性 ARS 利用校读功能提高精确性 核糖体 ribosome: 由几十种蛋白质和多种 rrna 形成的颗粒, 即可游离存在, 也可与内质网结合, 形成微粒体 真核生物中, 大多数正在进行翻译的核糖体都直接或间接与细胞骨架结构关联, 或与内质网膜结构相连 ; 细菌核糖体大都通过 mrna 固定在核基因组上 沉降系数 S(Svedberg): 用于描述沉积速度的单位, 由形状和大小而非质量决定 大肠杆菌核糖体的小亚基含有 21 中蛋白 (S 1 ~S 21 ), 大亚基含有 36 种蛋白 (L 1 ~L 36 ) 核糖体循环 ribosome cycle: 核糖体的大小亚基结合 翻译 mrna 大小亚基分离多聚核糖体 polyribosome( 或 polysome): 大大加速蛋白质的合成速度, 提高了 mrna 的利用率

13 原核生物 : 核糖体 70S = 大亚基 50S (5S + 23S + 蛋白质 )+ 小亚基 30S(16S + 蛋白质 ) 真核生物 : 核糖体 80S = 大亚基 60S(5.8S + 5S + 28S + 蛋白质 ) + 小亚基 40S(18S + 蛋白质 ) 5S rrna: 细菌 5S rrna 含有 120 个核苷酸 ( 革兰氏阴性菌 ) 或 116 个核苷酸 ( 革兰氏阳性菌 ) 含有两个高度保守区域, 一个是 CGAAC, 与 trna 的 TΨC 环相互作用, 是 5S 与 trna 相互识别的序列 ; 另一个是 GCGCCGAAUGGUAGU, 可能是 5S 与 23S 相互作用的位点 16S rrna: 含有少量修饰碱基, 位于原核生物小亚基内, 结构十分保守, 一段保守序列与 mrna 5 端翻译起始区的 SD 序列互补, 另一段保守序列在 30S 与 50S 结合中起作用 23S rrna: 有一段保守序列可能与 trna Met 的结合有关, 另一端序列可能与 5S 的结合有关 5.8S rrna: 真核生物大亚基特有, 含有修饰碱基, 可能与 trna 的识别有关 核糖体的小亚基负责对模板 mrna 序列的特异性识别 ; 大亚基负责携带氨基酸及 trna 核糖体存在三个重要位点 :A 位点 ( 新的 ARS 的结合位点 ),P 位点 ( 肽酰 -trna 的结合位点 ),E 位点 ( 释放去氨酰 -trna) 只有 fmet-trna fmet 能与 P 直接结合, 其余 trna 必须通过 A 到达 P, 再通过 E 离开 第七讲生物信息的传递 ( 下 ) 从 mrna 到蛋白质 (2) 蛋白质的生物合成 : 1) 氨基酸的活化 : 氨基酸在氨酰 -trna 合成酶 (ARS) 的作用下生成活化氨基酸 同一个 ARS 可以把相同氨基酸加到两个或多个带有不同反密码子的 trna 上 2) 翻译的起始 : 在模板 mrna 的 5 端形成核糖体 -mrna- 起始 trna 复合物, 同时将 ( 甲酰 ) 甲硫氨酸放入核糖体的 P 位点 细菌的翻译起始 : 大小亚基, 模板 mrna,fmet-trna fmet,gtp, 镁离子, 翻译起始引子 (IF-1,IF-2,IF-3)

14 i)30s 与 IF-1 IF-3 结合, 通过 SD 序列与 mrna 相结合 ; ii) 在 GTP 和 IF-2 的作用下,fMet-tRNA fmet 进入小亚基的 P 位点, 反密码子与起始密码子配对 ; iii) 与 50S 结合,GTP 水解, 释放翻译起始因子 IF-1 防止 trna 结合到小亚基未来的 A 位点 ;IF-2 是 GTP 酶, 催化 fmet-trna fmet 和小亚基的结合, 阻止其他 trna 与小亚基结合 ;IF-3 结合于小亚基并阻止其与大亚基结合, 同时协助 30S 完成对 mrna 起始位点 (SD 序列 ) 的互补 真核生物的翻译起始特点 : 核糖体较大, 有较多的起始因子, 其 5 端的帽子结构和 3 端的 poly-a 结构都参与形成翻译起始复合物, 而且 Met-tRNA Met 不发生甲酰化 40S 亚基对 mrna 起始密码子的识别通过扫描完成 40S 起始复合物中的帽子结合蛋白 eif-4e 能识别帽子结构并形成复合物, 起到稳定 mrna 与 40S 的结合的作用 Kozak 的扫描模型 : 真核生物的核糖体从 mrna 的 5 端向核糖体结合位点扫描, 直至遇到 AUG 发生较为稳定的相互作用 此过程依赖于 ATP 当核糖体完成了通过 poly-a 而环化的 mrna 的翻译, 新释放的核糖体被理想地置于同一 mrna 的起始位点上, 提高了 mrna 的翻译效率 3) 肽链的延伸 : 需要起始复合物,ARS, 延伸因子,GTP, 镁离子, 肽基转移酶 i) 新的 ARS 结合到 A 位点 :ARS 先与延伸因子 EF-Tu 和 GTP 形成复合物, 然而结合到 A 位点后释放 Tu-GDP, 通过延伸因子 Ef-Ts 再生, 进行下一轮循环 因为 EF-Tu 只能与 fmet-trna 以外的 ARS 作用, 因此起始 trna 不会结合到 A 位点 ii) 肽键的形成 : 在肽基转移酶的作用下,P 位的氨基酸移动到 A 位上, 由于构象的变化导致大亚基的移动, 两个 trna 移动到大亚基的 E 位和 P 位, 但在小亚基中依然处于 P 位和 A 位 核糖体排除错误氨酰 -trna 的机制 : a. 只有当密码子与反密码子正确配对时,16S 的两个腺嘌呤残基与配对碱基对的小沟间形成额外的氢键 ; b. 正确的碱基配对使得结合氨酰 trna 的 EF-Tu 与结合中心相互作用, 诱发 GTP 的水解和 EF-Tu 的释放 ; c. 只有配对正确的氨酰 trna 在肽键形成过程中旋入正确位置, 才能保持与核糖体的结合 核糖体也是核酶, 肽键的形成是由 23S 催化的 iii) 移位 : 通过 EF-G 介导的 GTP 水解供能, 使两个 trna 完全进入 E 位和 P 位,mRNA 上的 A 位空出, 进入下一轮肽链延伸 核糖体沿 mrna 移动与肽基 -trna 的移位, 两个过程时偶联的 原核生物在肽链延伸中需要 3 个延伸因子 :EF-Tu(EF1A),EF-Ts(EF1B),EF-G(EF2) 真核生物需要 eef-1 和 eef-2 4) 肽链的终止 : 需要 GTP, 终止密码子, 释放因子释放因子 RF 识别终止密码子并与之结合, 水解 P 位上的多肽链与 trna 之间的二酯键, 释放新生的肽链, 同时 RF 具有 GTP 酶活性, 催化 GTP 水解, 使肽链与核糖体分离 核糖体的大小亚基解体, 蛋白质合成终止 I 类释放因子 ( 细菌中的 RF1,RF2, 真核细胞中的 erf1): 识别终止密码子, 并催化肽链从 P 位释放 ; II 类释放因子 ( 细菌中的 RF3, 真核细胞中的 erf3): 刺激 I 类释放因子从核糖体中解离

15 蛋白质前体的加工 : 新生的多肽链需经过加工修饰才能转变为活性蛋白质 N 端 fmet 或 Met 的切除 : 无论真核或是原核生物, 其 N 端的甲硫氨酸往往在多肽合成完毕之前就被切除 细菌中由脱甲酰化酶水解 二硫键的形成 : 通过两个半胱氨酸的氧化形成, 对稳定蛋白质的天然构象具有重要作用 特定氨基酸的修饰 : 磷酸化, 糖基化, 甲基化, 乙酰化, 泛素化, 类泛素化, 羟基化, 羧基化等 磷酸化 phosphorylation: 由多种蛋白激酶 (protein kinase) 催化, 发生在丝氨酸 苏氨酸和酪氨酸的侧链 糖基化 : 蛋白质侧链上的天冬氨酸 丝氨酸 苏氨酸加上糖基形成, 主要可能发生在内质网 所有分泌蛋白和膜蛋白几乎都是糖基化蛋白 切除新生肽链中的非功能片段 蛋白质的折叠 : 首先形成二级结构, 然后进一步形成三级结构, 对于寡聚蛋白质仍需进一步形成四级结构 分子伴侣 molecular chaperone: 一类序列上没有相关性但有共同功能的保守性蛋白质, 在细胞内能帮助其他多肽进行正确的折叠 组装 运转和降解 1) 热休克蛋白 heat shock protein: 一类应激反应性蛋白, 包括 HSP70 HSP40 和 GrpE 三类, 广泛存在于原核和真核细胞中, 三者共同作用促使某些能自发折叠的蛋白质形成正确的天然构象 2) 伴侣素 chaperonin: 包括 HSP60 和 HSP10( 原核中的同源物为 GroEL 和 GroES), 主要是为非自发性折叠蛋白提供能折叠成天然结构的微环境 分子伴侣的作用 : 防止或消除肽链的错误折叠, 增加功能性蛋白的折叠产率而非加快折叠速度, 且不参与最终产物的形成 蛋白质合成抑制剂 : 嘌呤霉素 链霉素 四环素 氯霉素 红霉素 5- 甲基色氨酸 环己亚胺 白喉毒素 蓖麻蛋白 干扰素和其他核糖体灭活蛋白等 抑制剂的作用原理 : 阻止 mrna 与核糖体的结合 ( 氯霉素 ), 阻止 AA-tRNA 与核糖体的结合 ( 四环素 ), 干扰 AA-tRNA 与核糖体结合而产生错读 ( 链霉素 新霉素 卡那霉素等 ), 阻止肽酰转移酶作用于核糖体, 阻止核糖体的移动, 作为竞争性抑制剂抑制蛋白质的合成 链霉素是一种碱性三糖, 作用于 30S 亚基, 可以以多种方式抑制原核生物的核糖体 : 1) 干扰 fmet-trna 与核糖体的结合, 阻止蛋白质合成的正确起始 2) 导致 mrna 的错读 嘌呤霉素是 AA-tRNA 的类似物, 不需要延伸因子就可以结合于 A 位点, 从而抑制 AAtRNA 的进入, 通过氨基与肽链反应, 形成一个 3 羧基端带有嘌呤霉素的肽, 肽酰嘌呤霉素随后从核糖体上解离 因此, 嘌呤霉素通过提前释放肽链来抑制蛋白质的合成 针对原核细胞核糖体的抑制剂 : 氯霉素 四环素 红霉素 卡那霉素 针对真核细胞核糖体的抑制剂 : 放线菌酮 针对两种细胞核糖体的抑制剂 : 潮霉素 嘌呤霉素 链霉素 蓖麻毒素 第八讲生物信息的传递 ( 下 ) 从 mrna 到蛋白质 (3) 大部分蛋白质在细胞质中的核糖体合成的, 小部分蛋白质是由线粒体 叶绿体中的核糖体合成的 真核细胞蛋白质的两种运转机制 : 翻译运转同步机制 (co-translational): 蛋白质的合成和运转是同步发生的, 涉及分泌蛋白

16 和膜蛋白翻译后运转机制 (post-translational): 蛋白质从核糖体释放后才发生运转, 涉及细胞器发育的蛋白和膜蛋白跨膜运转需要的特殊结构 : 进入内质网或线粒体的蛋白质与易位子结合后被跨膜转运 ; 载体蛋白与要进入过氧化物酶体的蛋白与载体在细胞质内结合, 通过膜上的通道在另一侧释放 ; 核蛋白与载体结合后, 通过巨大的核孔通道进入细胞核 翻译运转同步机制 : 蛋白质定位信息存在于自身结构中, 并通过与膜上特殊受体的相互作用得以表达 ( 信号肽假说 ) 信号肽 signal peptide: 进入内质网内腔的蛋白质均带有信号肽, 在起始密码子后, 位于 N 端, 一般带有 个疏水氨基酸,N 端附近有带正电荷的氨基酸,C 端靠近蛋白酶切割位点处常常有数个极性氨基酸, 离切割位点最近的氨基酸往往带有很短的侧链 信号肽在合成之后便与膜上的特定受体相互作用, 产生通道, 允许这段多肽在延长的同时穿过膜结构 ( 边翻译边跨膜 ) 信号肽可以在信号识别蛋白 (SRP) 的帮助下进入到糙面内质网中 SRP: 一种小的 RNA- 蛋白质复合体, 可以识别信号肽和核糖体, 并导致该多肽合成的暂时停止 随后,SRP- 信号肽 - 核糖体复合物即被引向糙面内质网的膜并与 SRP 的受体 停靠蛋白 (DP) 相结合, 然后多肽恢复合成, 信号肽部分通过膜上的核糖体受体及蛋白运转复合物跨膜进入内质网 信号肽的作用 : 完整的信号肽是保证蛋白质运转的必要条件, 但仅有信号肽还不足以保证蛋白质运转的发生, 还要求运转蛋白质在信号序列以外的部分有相应的结构变化 并非所有的运转蛋白质都有可降解的信号肽, 信号序列的切除也不是运转所必需的 翻译后运转机制线粒体蛋白质的跨膜运转被运转的蛋白质以前体形式存在, 由成熟蛋白质和位于 N 端的前导肽 leader peptide 组成 运转时, 外膜上的 Tom 受体复合蛋白识别与 Hsp70 或 MSF 等分子伴侣结合的待转运多肽, 通过 Tom 和 Tim 组成的膜通道进入线粒体 能量来源于线粒体 Hsp70 引发的 ATP 水解和膜电位差 前导肽的特点 : 带正电荷的碱性氨基酸含量丰富, 有重要作用 ; 缺少带负电荷的酸性氨基酸 ; 羟基氨基酸的含量高 ; 有形成两亲 α- 螺旋结构的能力 前导肽的不同部位可能在蛋白质跨膜运转中发挥不同的作用, 含有 止运入 肽段的前导肽会使所运转的多肽定位于膜上 叶绿体蛋白质的跨膜运转叶绿体多肽上某些特定位点结合于只有叶绿体膜上才有的特异受体位点 叶绿体定位信号肽一般有两个部分, 第一部分决定该蛋白质能否进入叶绿体基质, 第二部分决定该蛋白质能否进入类囊体 可溶性的活性蛋白水解酶位于叶绿体基质内, 这是鉴别翻译后运转的指标之一 核定位蛋白的运转机制 核孔复合体 (NPC) 是细胞核内外进行物质交换的主要通道 相对分子质量较小的蛋白质可以自由通过 NPC 或采取被动扩散的方式进入细胞核 ; 相对分子质量较大的蛋白质则需通

17 过主动运转进出细胞核, 这些蛋白质需要在其氨基酸序列上带有特殊的核定位信号序列 (NLS) 和出核信号序列 (NES), 才能被相应的和运转蛋白所识别 出核信号序列 (NES): 疏水性氨基酸富集, 能够被出核因子 CRM1 识别 核定位序列 (NLS): NLS 可位于核蛋白的任何部位, 为了重复定位, 一般不被切除 ; 由含水的核孔通道来鉴别 蛋白质向核内运输需要核运转因子 (importin)α β 和一个低分子量 GTP 酶 (Ran) 经典 NLS: 单分型 ( 富含碱性氨基酸的短肽, 被入核因子识别 ), 双分型 ( 由两簇碱性氨基酸组成, 之间被 10~12 个非保守氨基酸间隔 ) 非经典 NLS1:IκBα 核定位蛋白跨细胞核的过程 :α 和 β 组成异源二聚体,α 亚基结合 NLS, 形成的蛋白复合物在核孔依靠 Ran GTP 酶水解 GTP 提供能量进入细胞核, 之后 α 和 β 解离, 核蛋白与 α 亚基解离,α 和 β 再次回到细胞质中, 进行下一轮蛋白质运转 细菌蛋白质有共转运和后转运两种方式 细菌新肽链的 N 端同样有信号肽 肽链与细胞质中的分子伴侣 SecB 结合后, 运送到细胞膜运转复合物 SecA-SecYEG 上, SecA 结合 ATP 并嵌入细胞膜中, 使得与 SecA 结合的肽段到达胞外 ; 然后 SecA 利用自身的 ATP 水解酶的活性水解 ATP 并回到胞内结合新的一段新生肽 ;SecA 再与新的 ATP 结合, 如此反复将整个肽段运转出细胞 蛋白质的降解 : 真核蛋白的降解依赖于泛素 Ubiquitin 泛素调控的蛋白质降解不仅能清除错误的蛋白质, 对细胞生长周期 DNA 复制以及染色体结构都有重要的调控作用 将要被去除的蛋白质被泛素共价标记, 蛋白酶体作用于被标记的蛋白质 在大肠杆菌中依靠 Lon 酶来实现 成熟蛋白 N 端的第一个氨基酸对蛋白质的降解有着举足轻重的影响, 当其为甲硫氨酸 甘氨酸 丙氨酸 丝氨酸 苏氨酸和缬氨酸时表现稳定, 当其为赖氨酸 精氨酸时表现最不稳定 泛素化 ubiquitylation: 在泛素激活酶 结合酶 连接酶等作用下, 通过异肽键将泛素与赖氨酸的 ε- 氨基结合 泛素是一个具有 76 个氨基酸残基的高度保守蛋白 存在着 7 个赖氨酸残基 (K48,K63, K6,K11,K29,K33,K27) 泛素化过程 : 泛素激活酶 E1 粘附在泛素分子尾部 Cys 残基上激活泛素,E1 酶再将泛素转移到泛素结合酶 E2 上,E2 酶和不同种类的泛素连接酶 E3 共同识别靶蛋白, 对其进行泛素化修饰 泛素化也可在去泛素酶 (DUB) 的催化下逆转 泛素激活酶 E1: 在 ATP/ 镁离子的作用下形成泛素硫醇酯, 然后将激活的泛素转移到 E2 上 泛素结合酶 E2: 在结合泛素后, 和 E3 结合 泛素连接酶 E3: 真核细胞中 E3 酶主要有两种, 一种是 HECT E3( 通过 E3 上的半胱氨酸残基介导泛素从 E2 转移到 E3 在转移到蛋白 ), 一种是 RING E3( 泛素直接从 E2 转移到蛋白 ) 去泛素化 deubiquitination 小泛素相关修饰物修饰 SUMOylation: 将 SUMO 共价连接到蛋白的赖氨酸残基 通常提高底物蛋白的稳定性, 同时影响蛋白质的亚细胞定位, 参与细胞内多条代谢途径 同样需要 E1 E2 E3 三步过程, 而且整个过程是可逆的

18 类泛素化修饰 NEDDylation:NEDD8 是一种和泛素结构类似的分子, 具有较高的保守性, 同样需要 E1 E2 E3 介导一系列的酶促反应, 该过程也是可逆的 主要作用是调节蛋白质之间的相互作用, 调节转录因子的活性, 拮抗泛素化等 第九讲分子生物学研究法 ( 上 ) DNA RNA 及蛋白质操作技术 (1) 模式生物的特点 : 能够代表生物界的某一大类群 ; 对人体和环境无害, 容易获得并易于在实验室内饲养和繁殖 ; 世代短 子代多 遗传背景清楚 ; 容易进行实验操作, 特别具有遗传的操作手段和表型分析的方法 常见的模式生物 : 大肠杆菌, 酿酒酵母, 拟南芥, 果蝇, 海胆, 非洲爪蟾, 线虫, 斑马鱼, 小鼠 大肠杆菌的优势 : 容易培养, 能适应环境中多变的化学条件, 繁殖很快 ; 为单细胞生物, 所有 DNA RNA 和蛋白质合成的机器都包含在同一空间 ; 只有一条染色体 ; 具备易于进行遗传交换的系统, 便于进行定点突变 构建含多种突变的菌株 ; 可以自主复制, 细菌质粒可用作克隆载体 酿酒酵母的优势 : 单细胞真核生物, 基因组较小, 基因数目较少 ; 可快速繁殖 ; 具备真核细胞的主要特征 ; 单倍体和双倍体细胞的存在促进了酿酒酵母的遗传分析 ; 在酵母中容易产生精确的突变 ; 细胞在生长时改变形态 ; 在转录和基因调控 DNA 复制 重组 翻译 剪接等研究中非常重要 拟南芥的优势 : 能在室内大量生长, 生长速度快 ; 基因组是目前已知植物基因组中最小的, 已完成全序列的测定 ; 容易获得各种代谢功能的缺陷型 黑腹果蝇的优势 : 生活周期很短 ; 用 P 因子做载体可将重组 DNA 引入到正常果蝇株中, 制备携带外源 DNA 的转基因果蝇简便易行 ; 果蝇的基因与在人类中对应的基因有惊人的相似性 海胆 : 最早被使用的模式生物, 易于得到大量的受精卵, 同步发育, 胚体透明, 孵化速度快 非洲爪蟾 : 卵母细胞体积大, 数量多, 易于显微操作, 易于生化分析 秀丽隐杆线虫 : 比果蝇小且更简单的多细胞动物, 生活周期很短, 易于培养, 由相对较少 研究得深入的细胞谱系组成 斑马鱼 : 用于研究脊椎动物发育的模式生物, 基因与人类基因的相似度有 87%, 胚胎透明, 可以在活体中观察细胞的运动以及它们随发育进行而发生改变的特征, 其胚胎突变体是研究胚胎发育分子机制的优良资源 小鼠 : 基因组与人类 99% 同源, 生理生化和发育过程和人类相似 ; 在小鼠和人类之间存在大量的同线性 ; 易于通过同源重组建立人类疾病的小鼠模型 基因工程 : 在体外将核酸分子插入病毒 质粒或其他载体分子, 构成遗传物质的新组合, 使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达

19 限制性核酸内切酶 restriction endonuclease(re): 识别特定的脱氧核苷酸序列, 切割特定位点, 可产生两个相同的粘性末端或平末端 能被 RE 识别的切割部位都具有回文序列 DNA 连接酶 : 包括 E coli DNA 连接酶和 T 4 DNA 连接酶 E coli DNA 连接酶只能连接粘性末端,T 4 DNA 连接酶可连接粘性末端和平末端 ( 效率较低 ) 载体 vector: 作为运载工具将目的基因导入受体细胞中, 在受体细胞内对目的基因进行大量复制 包括细菌的质粒, 病毒等 表达载体需具备的几个条件 : 有一到多个不同的限制酶切位点 (MCS), 对受体细胞无害, 能在宿主细胞内复制并稳定地保存, 具有某个筛选标记, 便于利用含抗生素的培养基进行鉴别和筛选 同时含有一个复制起始点, 且大小适中, 便于操作 puc 质粒载体 : 来自 pbr322 质粒的复制起点 (ori), 氨苄青霉素抗性基因 (amp r ), 大肠杆菌 lacz 启动子及编码 α- 肽链的 DNA 序列, 称为 lacz 基因 位于 lacz 基因 5 端有一段多克隆位点 (MCS), 一旦外源基因插入 lacz 的功能就会被破坏 蓝白斑筛选 : 含 X-gal 培养基中非转化菌落为蓝色, 含有重组 DNA 分子的菌落为白色 pet 系列质粒 :E coli 中克隆表达重组蛋白功能最强大的系统, 常用 amp r+ 和 kan r+ 作为筛选标记 常用真核表达载体 : 增强型绿色荧光蛋白表达载体 pegfp-n3 重组载体必须通过细菌转化 transformation 的过程将其导入宿主细胞才能保证重组 DNA 分子的增值 细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态 为提高效率, 可对受体菌进行物理或化学处理, 增加其获取 DNA 的能力, 这种经过处理的细胞叫做感受态细胞 competent cell CaCl 2 法 : 快速生长期的大肠杆菌置于 0 预处理的低渗氯化钙溶液中, 转移到 42 下做短暂热刺激, 即可吸收外源 DNA 电击法 : 对数中期的大肠杆菌冷至 4 后离心, 洗菌后用 10% 的甘油悬浮, 然后进行电击, 在细胞膜上造成小凹陷, 形成疏水孔洞 ; 随着跨膜电压增加, 大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞, 介质中的 DNA 进入细胞 转染 transfection: 真核细胞由于外源 DNA 掺入而获得新的遗传标志的过程 瞬时转染 : 外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色体中, 因此在一个宿主细胞中存在多个拷贝, 产生高水平表达 稳定转染 ( 永久转染 ): 既可以整合到宿主染色体中, 也可能作为一种游离体 episome 存在, 转入量低但整合率高 转染的主要方法 : 感染性病毒颗粒感染宿主细胞 ; 脂质体法 显微注射法 磷酸钙共沉淀法及 DEAE- 葡聚糖法等非病毒载体的方式导入细胞 ; 物理方法 DEAE- 葡聚糖法 : 利用其正电性吸引带负电的核酸结合后靠近细胞膜而被摄取, 用于瞬时表达 磷酸钙共沉淀法 : 将 DNA 与氯化钙混合, 加入到 PBS 中形成 DNA 磷酸钙沉淀, 通过细胞膜的内吞作用摄入 DNA, 适用于瞬时表达和稳定表达 人工脂质体法 : 阳离子脂质体和带负电的核酸结合形成复合物, 复合物被内吞进入细胞质, 随后 DNA 复合物被释放进入细胞核内, 同时适用于瞬时表达和稳定表达 物理转染方法 : 显微注射 ( 费力但高效 ), 电穿孔, 基因枪

20 核酸凝胶电泳原理 : 带负电的核苷酸链依靠无反应活性的稳定的介质和缓冲液, 在电场中以一定的迁移率从负极移到正极 电场迁移率与电场强度和分子的净电荷数成正比, 与片段大小成反比 同等分子量的核酸分子, 构型紧密的比开环的迁移要快 主要的凝胶基质 : 聚丙烯酰胺 ( 分辨力高, 但分辨范围窄 ), 琼脂糖 ( 分辨力低, 但分辨范围宽 ) 凝胶的浓度越高, 空隙越小, 分辨能力越强 琼脂糖凝胶电泳的参数 : 缓冲液, 凝胶, 加样, 电泳条件, 染色和观察 溴化乙锭 (EB) 染色 : 在紫外光下呈橘黄色, 实验后需净化处理 RNA 的分离 : 琼脂糖凝胶电泳 (RNA 变性凝胶电泳 ) RNA 在局部会形成双链的二级结构或三级结构, 因此需要在变性条件下进行电泳, 上样前使用甲醛 乙二醛 羟甲基汞等变性剂处理, 用吖啶橙染色 聚合酶链式反应 (PCR): 快速扩增 DNA 序列最常用的方法 模板 DNA 为基因组片段 :genomic PCR 模板 DNA 为 cdna:rt-pcr PCR 需要的物质 : 模板 DNA, 引物 (DNA),Taq DNA 聚合酶,dNTP PCR 步骤 : 变性 ( 解链 ), 退火 ( 引物与模板结合 ), 延伸 ( 合成 DNA 链 ) PCR 的特点 : 特异性强, 敏感性高, 快速, 简便, 可扩增 RNA 和 cdna, 对起始材料要求低, 有一定程度的单核苷酸碱基错误掺入 引物的设计原则 : 最大限度提高扩增效率和特异性, 尽可能减少非特异性扩增 实时定量 PCR(qRT-PCR): 通过连续监测荧光信号的强弱变化来测定特异性产物的量 非序列特异性荧光染料 SYBR Green I 只和双链 DNA 结合, 混合在 PCR 反应液中的荧光探针在与大片段 DNA 结合后被激发出荧光, 随着片段的延长, 结合 DNA 的荧光探针增加, 被激发的荧光增强 TaqMan 探针是一段带有两个不同荧光基团的单链 DNA, 结合到靶 DNA 序列上, 随着 PCR 反应的进行,TaqMan 探针被降解, 切下来的荧光基团没有荧光淬灭的束缚, 会发出荧光 以 10~15 个循环的荧光值作为阈值或基线,Ct 值是产物荧光强度首次超过阈值时 PCR 反应的循环数, 它与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系, 利用标准曲线, 可以确定样品中待检测靶 DNA 的绝对含量 第十讲分子生物学研究法 ( 上 ) DNA RNA 及蛋白质操作技术 (2) 蛋白质纯化利用的特性 : 分子大小, 分子性状, 带电特性, 溶解特性, 与配体特异性结合的不同, 吸附性质, 变性和复性 利用分子量大小进行分离 : 透析 ( 利用半透膜使盐杂质通过半透膜交换到外面 ), 超滤 ( 在一定的压力下, 使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的播磨, 而大分子不能通过 ), 凝胶过滤 ( 分子筛层析 ), 离心利用分子形状进行分离 : 梯度离心, 电泳利用电荷进行分离 : 电泳, 离子交换层析利用溶解度进行分离 : 盐析法 ( 高浓度盐离子破坏蛋白质分子表面的水墨, 同时影响蛋白质分子的电荷, 从而引起蛋白质沉淀, 通常不会引起蛋白质的变性 ), 有机溶剂沉淀法, 等电

21 点沉淀法利用配体特异性结合进行分离 : 免疫亲和层析, 生物亲和层系, 金属螯合亲和层析利用变性和复性进行分离 : 尿素变性复性从包涵体中纯化原核表达蛋白 蛋白质分离纯化的一般步骤 : 前处理 ( 细胞破碎 ) 粗分级 细分级 1) 材料破碎 : 机械剪碎, 研磨, 反复冻融, 超声破碎, 高压匀浆, 酶解 2) 蛋白质的提取 : 尽可能多提取目的蛋白, 避免因热 ph 有机试剂 金属离子 蛋白酶造成活性丢失, 选择合适的 ph 离子强度提取液 :ph 缓冲液, 离子强度 ( 动物 NaCl, 植物 KCl), 还原剂, 蛋白酶抑制剂, 金属离子螯合剂温度 :0~4 3) 粗分级 ( 浓缩目标蛋白, 去除大量杂质 ): 硫酸铵分级沉淀, 有机溶剂分级沉淀, 超速离心, 等电点沉淀, 透析, 超过滤, 蛋白质结晶等 4) 细分级 ( 根据蛋白质的特征进一步纯化 ): 层析, 电泳层析 chromatography 分子筛层析 gel filtration chromatography( 凝胶过滤, 分子排阻层析 ): 以多孔性凝胶材料为支持物, 分子大小不同的蛋白受到的阻滞作用不同而先后流出介质 : 葡聚糖 glucose, 琼脂糖 agarose, 聚丙烯酰胺 acrylamide, 纤维素 cellulose 离子交换层析 ion exchange chromatography: 利用蛋白质和带电凝胶作用力的差别介质 : 惰性支持物 : 琼脂糖, 葡聚糖带电基团 : 羧甲基 ( 负电 ), 二乙基氨基 ( 正电 ) 平衡离子 : 氢离子或钠离子 ( 平衡负电 ), 氢氧根离子或氯离子 ( 平衡正电 ) 阳离子交换 : 凝胶带负电, 蛋白质带正电阴离子交换 : 凝胶带正电, 蛋白质带负电疏水作用层析 hydrophobic interaction chromatography: 蛋白质表面的疏水基团与介质的疏水配体的可你相互作用, 高浓度的盐会增强相互作用, 低浓度的盐会减弱相互作用亲和层析 affinity chromatography: 利用蛋白质与配体专一性识别并结合的特性电泳 electrophoresis SDS- 聚丙烯酰氨凝胶电泳 (SDS-PAGE): 利用 SDS 的阴离子消除了电荷差异 ; 不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度相同, 长轴长度与分子量成正比等电聚焦电泳 isoelectric focusing(ief): 利用两性电解质在凝胶中制造 ph 梯度, 电泳时蛋白质将迁移到等电点处双向电泳 two dimensional electrophoresis: 第一向为 IEF, 第二向为 SDS-PAGE 优点 : 技术最成熟, 容量大, 灵敏度高, 分辨率很高, 定量效果好, 重复性好, 可比较差异, 直观, 可以同时获得等电点和分子量 缺点 : 蛋白质有偏好性, 胶内蛋白质后处理复杂, 总灵敏度不高, 动态范围不宽提高分辨率的方法 : 样品分步提取和预分级, 加长一向胶的长度, 窄区带 ph 梯度 IPG, 新型电泳体系 蛋白质的纯化原则 : 确定目标, 充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性, 确定活性测定方法, 尽量减少纯化步骤, 减少每步操作时间, 减少添加物, 早期除去降解物, 每步使用不同的纯化方法 蛋白质含量的测定 : 凯氏定氮法, 紫外吸收法 ( 芳香族氨基酸在 280nm 处有最大吸收 ), 分

22 光光度法 ( 考马斯亮蓝法等 ) 蛋白质的纯度鉴定 : 色谱纯 ( 单一洗脱峰 ), 电泳纯 ( 单一电泳条带 ), 结晶纯 ( 晶体 ) Western Blot( 蛋白质免疫印迹实验 ): 检测样品中是否存在蛋白抗原蛋白质的空间结构分析二级结构 : 圆二色谱法三维结构 :X 射线晶体衍射法 ( 晶体结构 ), 核磁共振 ( 溶液结构 ), 冷冻电镜 蛋白质组学 proteomics: 研究某一物种 个体 器官 组织或细胞在特定条件 特定时间所表达的全部蛋白质图谱 基因组是确定的, 每个个体只有一个基因组 ; 蛋白质组却会发生显著的变化 蛋白质表达谱 : 全谱蛋白质差异表达谱 : 差异谱蛋白质翻译后修饰 : 修饰谱蛋白质相互作用 : 功能谱蛋白质结构 : 结构谱 2D-DIGE( 双向荧光差异凝胶电泳 ): 极大地提高了结果的准确性 可靠性和重复性 缺点 : 标记过程中的共价修饰和荧光探针猝灭可能改变某些蛋白的性质 ; 标记蛋白间轻微分子量的差异会导致分离后蛋白质的后续分析出现偏差 ; 需特别的扫描仪和荧光染料, 成本较高 蛋白质质谱分析技术 : 有基质辅助的激光解吸电离 - 飞行时间质谱 (MALDI-TOF) 和电喷雾质谱 (ESI-MS) MALDI-TOF: 飞行时间由肽段的质荷比决定, 回收感兴趣的蛋白点, 进行胰蛋白酶胶内酶解, 收集酶解肽段 一级质谱是将酶解后的肽段按质荷比和强度进行解析, 形成肽指纹图谱 (PMF), 一个母离子峰代表一种肽段, 强度代表了肽段的多少 ; 二级质谱是挑选一级质谱中有代表性的母离子峰以诱导碰撞解离 (CID) 的方式打碎, 形成肽段碎片指纹图谱 (PFF), 然后结合一级 PMF 和二级 PFF 数据, 获得蛋白质的具体信息 蛋白质及核酸相互作用技术凝胶阻滞实验 electrophoretic mobility shift assay(emsa): 蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合, 电泳时这种复合物比无蛋白结合的探针在凝胶中涌动的速度慢 DNaseI 足迹实验 : 测定 DNA 结合蛋白在 DNA 上的准确结合位点 以上两个技术都不足以反应生理条件下 DNA 与蛋白质相互作用的真实情况 染色体免疫沉淀技术 chromatin immunoprecipitation(chip): 在生理条件下把细胞内的 DNA 和蛋白质交联在一起, 超声波将染色质打碎, 用所要研究的目的蛋白的特异性抗体沉淀交联复合物 第十一讲分子生物学研究法 ( 上 ) DNA RNA 及蛋白质操作技术 (3) 酵母双杂交系统 yeast two-hybrid system: 利用真核生长转录因子的 DNA 结合结构域和转录激活结构与, 分别与目标蛋白 X 及可能与目标蛋白发生作用的蛋白 Y 相连, 共同转入酵母细胞 ; 如果 X 和 Y 发生相互作用, 那么转录因子原来分开的两部分会结合, 形成完整的活

23 性形式从而激活下游报告基因, 通过检测报告基因的产物就可以判断两种蛋白是否发生作用 优点 : 接近于体内环境, 瞬时 不稳定的两两相互作用也可以被检测到, 且与内源蛋白的表达无关 局限性 : 不能研究具有自激活性质的蛋白 ; 只能检测两个蛋白之间的相互作用 ; 检测的相互作用需发生在细胞核内 ; 假阳性率高 串联亲和纯化 tandem affinity purification(tap): 蛋白 A+ 烟草蚀文病毒 TEV 酶识别的酶切位点 +CBP( 钙调素结合多肽 ), 用来纯化识别相互作用蛋白 优点 : 不需要过多的背景知识就可以得到大量含靶蛋白的复合体 ; 蛋白表达及与复合物的结合都接近生理水平, 是一种检测体内蛋白相互作用的方法 且 TAP 采用两步亲和纯化, 提高了纯化产物的特异性 局限性 : 增加了蛋白纯化步骤, 蛋白回收率低 ; 加上蛋白后标签暴露不充分, 影响标签与亲和柱的结合 ; 标签可能会影响蛋白的表达水平 ; 存在内源蛋白的竞争 ; 存在蛋白污染问题 体外 pull-down: 利用 GST 融合蛋白作为探针, 再利用谷胱甘肽琼脂糖球珠沉淀 GST 融合蛋白来确定相互作用的蛋白 一般在得到目标蛋白的抗体前, 或发现抗体干扰蛋白质 - 蛋白质之间的相互作用时, 可以使用 GST 沉降技术 该方法只用于确定体外的相互作用 等离子表面共振 SPR: 待检测蛋白与诱饵蛋白相互作用, 使诱饵蛋白结合的金属膜的折射率上升, 从而导致共振角度的改变 而角度的改变与蛋白质浓度呈线性关系 优点 : 可实时监测, 无需标记 ; 可以在很宽泛的化学和物理条件下进行检测 ; 可以精确测定热力学和动力学参数 ; 适用于具有不同范围亲和力的相互作用的检测 体外蛋白质相互作用技术 : 体外 pull-down, 等离子表面共振 SPR,Far Western 印迹技术, 蛋白芯片 细胞内蛋白质相互作用技术 : 酵母双杂交, 免疫共沉淀 CoIP, 荧光共振能量转移法 FRET 免疫共沉淀 co-immunoprecipitation(co-ip): 在非变性条件下裂解细胞, 完整细胞内存在的蛋白质 - 蛋白质相互作用被保留下来 用 X 的抗体免疫沉淀 X, 那么与 X 相互结合的 Y 也可以被沉淀下来 缺点 : 检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质 - 蛋白质相互作用, 两种蛋白质的结合可能不是直接结合, 灵敏度没有亲和色谱高, 且必须获得高亲和力 特异性好的抗体 荧光共振能量转移法 FRET: 需要有荧光给体和荧光受体, 要求给体的发射光谱与受体的吸收光谱有部分重叠, 而与受体的发射光谱尽量不重叠 条件 : 给体和受体在合适的距离, 给体的发射光谱与受体的吸收光谱有重叠 ( 能量匹配 ), 给体与受体的偶极具有一定的空间取向 ( 偶极耦合 ) 常用的探针 : 荧光蛋白, 有机染料和镧系染料应用 : 活细胞内检测蛋白激酶活性, 研究膜蛋白, 研究细胞内分子之间相互作用 第十二讲分子生物学研究法 ( 下 ) 基因功能研究技术 (1) 核酸杂交 hybridization: 两个不同来源的互补单链多聚核苷酸之间的碱基配对过程 放射性同位素用于标记核酸分子

24 分子生物学研究中常用的放射性同位素 : 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 60 Co 标记 DNA 的两种方法 : 在被标记的前体物存在的情况下合成 DNA; 在一个完整的 DNA 分子末端加上一个标签 分子杂交类型 :Southern 杂交 (DNA 与核酸探针杂交 ),Northern 杂交 (RNA 与核酸探针杂交 ),Western 杂交 ( 蛋白质与蛋白质杂交 ) 基因芯片 (DNA chip): 能同时检测大量靶基因表达, 从而迅速准确地在基因组水平上阐述不同生物组织或细胞中各种转录水平的变化规律 原位杂交技术 in situ hybridization(ish): 用放射性或非放射性标记的特异性探针与被固定的组织切片反应, 产生杂交分子可以通过放射性标记或酶促免疫显色, 对该基因表达产物做出定性定量分析 分为 RNA 和染色体原位杂交两类 荧光原位杂交 fluorescence in situ hybridization(fish): 对探针做特殊的修饰标记, 用原位杂交与靶染色体特异结合, 再通过与荧光素分子偶联的单克隆抗体来确定该 DNA 序列在染色体上的位置 高通量测序技术 high-throughput sequencing: 又叫二代测序或深度测序 利用高通量测序对转录组进行测序被称为 RNA-seq, 可以更全面地揭示出生物个体在特定时刻和特定组织的全局基因表达状况 RNA-seq 的特点 : 数字化信号, 高灵敏度, 重复性好, 起始样品少, 检测范围广, 可以进行任意物种的全基因组分析 缺陷 : 测序费用高 ; 分析软件开发的不彻底, 造成测序数据的浪费 ; 平台测序长度不够大 RNAi(RNA interference): 利用双链小 RNA 高效 特异性降解细胞内同源 mrna, 从而阻断靶基因表达, 使细胞出现靶基因缺失的表型 双链 DNA 被 Dicer 加工后降解成小分子干扰核糖核酸 (sirna) 并定位于目标 mrna, sirna 的反义链参与指导合成 RISC, 再由 RISC 介导切割目的 mrna 中与 sirna 反义链互补的区域, 从而实现干扰靶基因表达的功能 基因定点突变 site-directed mutagenesis: 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列, 用于研究某个 ( 些 ) 氨基酸残基对蛋白质结构 功能的影响 主要采用两种 PCR 方法进行定点突变 : 重叠延伸技术, 大引物诱变法优点 : 突变体回收率高, 可在任何位点引入突变, 可在同一试管完成所有反应, 快速简便 正向遗传学 forward genetics: 从一个突变体的表型出发, 研究基因型, 进而找出该基因的编码序列 反向遗传学 reverse genetics: 从基因序列出发, 推测表现型, 进而推导出该基因的功能 基因敲除 gene knock-out: 又称基因打靶, 通过外源 DNA 与染色体 DNA 之间的同源重组, 进行精确的定点修饰和基因改造, 具有专一性强 染色体 DNA 可与目的片段共同稳定遗传等特点 完全基因敲除 : 通过同源重组完全消除细胞或个体中的靶基因活性 条件型基因敲除 ( 不完全基因敲除 ): 通过定位重组实现特定时间和空间的基因敲除

25 基本步骤 : 基因载体的构建 ( 替换型载体, 插入型载体 ),ES 细胞的获得, 目的基因的导入 ( 电穿孔法, 显微注射法 ), 选择筛选已击中的细胞 (PNS 法 ), 得到纯合体并研究表型 常用的筛选方法 : 遗传筛选法 ( 正向筛选, 正负双向筛选 ),PCR 筛选法 正负筛选法 (PNS 法 ): 正向选择基因处于功能区, 负向选择基因置于目的基因外侧, 通常致死 基因敲除的方法 : 利用同源重组进行基因敲除条件性基因敲除法 conditional gene targeting: 将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特殊阶段 常用的条件型定位重组系统 :Cre/LoxP 系统诱导性基因敲除 : 同样利用 Cre/LoxP 系统, 但利用控制 Cre 表达的启动子活性或 Cre 酶活性具有可诱导的特点, 通过诱导剂基于时间的控制, 从而在 LoxP 动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰目的的基因敲除 优点 : 可以人为控制基因突变时间, 避免因基因突变导致死胎的问题利用随机插入突变进行基因敲除核酸酶介导的基因编辑 (ZFN,TALEN,CRISPR/Cas)