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端黏钭
7 years ago
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1 原核与真核生物 mrna 的特征比较原核生物中 : mrna 的转录和翻译发生在同一个细胞空间, 这两个过程几乎是同步进行的真核细胞中 : 真核细胞 mrna 的合成和功能表达发生在不同的空间和时间范畴内 mrna 以较大分子量的前体 RNA 出现在核内, 只有成熟的相对分子质量明显变小并经化学修饰的 mrna 才能进入细胞质, 参与蛋白质的合成

2 mrna 的组成 : 编码区 (coding region): 从起始密码子 AUG 开始经一连串编码氨基酸的密码子直至终止密码子 5 端上游非编码区 (5 UTR): 位于 AUG 之前不翻译的区域 3 端下游非编码区 (3 UTR) : 位于终止密码子之后不翻译的区域

3 原核生物 mrna 的特征半衰期短许多原核生物 mrna 以多顺反子的形式存在原核生物 mrna 的 5 端无帽子结构,3 端没有或只有较短的多聚 (A) 结构

4 1. 半衰期短原核生物中,mRNA 的转录和翻译是在同一个细胞空间里同步进行的, 蛋白质合成往往在 mrna 刚开始转录时就被引发了大多数细菌 mrna 在转录开始 1 分钟后就开始降解 mrna 降解的速度大概只有转录或翻译速度的一半

5 2. 许多以多顺反子的形式存在 : 原核细胞的 mrna( 包括病毒 ) 有时可以同时编码几个多肽 Prokaryotic mrna (polycistrionic)

6 单顺反子 mrna (monocistronic mrna): 只编码一个蛋白质的 mrna 多顺反子 mrna(polycistronic mrna): 编码多个蛋白质的 mrna

7 3. 原核生物 mrna 的 5 端无帽子结构,3 端没有或只有较短的多聚 (A) 结构原核生物起始密码子 AUG 上游有一被称为 Ribosome Binding Site (RBS) 或 SD 序列 (Shine Dalgarno sequence) 的保守区, 因为该序列与 16S-rRNA 3 端反向互补, 所以被认为在核糖体 -mrna 的结合过程中起作用

8 4. 原核生物常以 AUG( 有时 GUG, 甚至 UUG) 作为起始密码子 ; 真核生物几乎永远以 AUG 作为起始密码子

9 真核生物 mrna 的特征 Noncoding sequence 单顺反子形式存在 5 端存在帽子结构绝大多数具有多聚 (A) 尾巴

10 真核生物 mrna 的结构模式 Eukaryotic mrna (monocistrionic)

11 基因的分子生物学定义 : 产生一条多肽链或功能 RNA 所必需的全部核苷酸序列! A gene can be defined as following: The entire nucleic acid sequence that is necessary for the synthesis of a functional polypeptide or RNA molecule.

12 1. 真核生物 mrna 的 5 端存在帽子结构真核生物基因转录一般从嘌呤起始, 其 5 端大都经过修饰

13 5 Capping 通过 5 5 磷酸二酯键在原初 mrna 的 5 端倒扣一个 G 包括三个连续的酶促反应 5 末端加上鸟苷是由鸟苷转移酶催化的帽子结构是 GTP 和原 5 三磷酸腺苷 ( 或鸟苷 ) 缩合反应的产物 mrna 的帽子结构常常被甲基化, 是蛋白质合成起始信号的一部分加帽反应发生的很早

14 真核生物 mrna 的帽子结构零类帽子 (cap0): 第一个甲基出现在所有真核细胞的 mrna 中 ( 单细胞真核生物 mrna 主要是这个结构 ), 由鸟苷酸 -7 甲基转移酶催化, 称为零类帽子鸟苷酸 -7 甲基转移酶 1 类帽子 (cap1): 如在第二个核苷酸 ( 原 mrna 5 第一位 ) 的 2 -OH 位上加另一个甲基, 这步反应由 2 -O- 甲基转移酶完成一般把有这两个甲基的结构称为 1 类帽子真核生物中以这类帽子结构为主 2 类帽子 (cap2): 在某些生物细胞内, mrna 链上的第三个核苷酸的 2 -OH 位也可能被甲基化, 因为这个反应只以带有 1 类帽子的 mrna 为底物, 所以被称为 2 类帽子只占有帽 mrna 总量的 10%- 15% 以下

15 帽子结构的功能 (1) 有助于 mrna 越过核膜, 进入胞质 ; (2) 保护 5 不被核酶降解 ; (3) 翻译时供 IFⅢ( 起始因子 ) 和核糖体识别, 是翻译所必需的

16 2. 绝大多数真核生物 mrna 具有多聚 (A) 尾巴除组蛋白基因外, 真核生物 mrna 的 3 末端都有多聚 (A) 序列, 其长度因 mrna 种类不同而变化, 一般为个左右由多聚 (A) 聚合酶催化的 ; 它是在转录后加上的 ; Poly(A) 被特异的蛋白质 PABP 结合

17 在高等生物中 ( 酵母除外 ) 在 poly(a) 上游 11-30nt 处有一特殊序列 AAUAAA, 这一序列是高度保守的对于初级转录产物的准确切割及加多聚 (A) 是必需的

18 Polyadenylation and termination 1. CPSF (cleavage and polyadenylation specificity factor) & CstF (cleavage stimulation factor) bind to the poly-a signal, leading to the RNA cleavage. 2. Poly-A polymerase (PAP) adds ~ 200 As at the 3 end of the RNA, using ATP as a substrate.

19 多聚腺苷化 (polyadenylation) 反应要经过 2 个阶段 (1) 首先将一个短的寡聚 A 序列 (10nt) 加到 3 端, 此反应绝对依赖于 AAUAAA 序列, 这是由 poly(a) 聚合酶在特殊因子指导下完成的 (2) 寡聚 A 尾巴延伸到 240nt 的长度此反应并不需要 AAUAAA 序列, 但需要一个识别寡聚 A 并指导 poly(a) 聚合酶延伸的刺激因子

20 多聚 (A) 的功能是 mrna 由细胞核进入细胞质所必需的形式 ; 它大大提高了 mrna 在细胞质中的稳定性 mrna 刚从细胞核进入细胞质时, 其多聚 (A) 尾巴一般比较长, 随着 mrna 在细胞质内逗留时间延长, 多聚 (A) 逐渐变短消失,mRNA 进入降解过程它可促进核糖体的有效循环

21 Poly-A in the 3 end promotes the efficient recycling of ribosomes

22 Poly (A) - 尽管大部分真核 mrna 有 poly (A) 尾巴, 细胞中仍有多大 1/3 没有 poly (A) 的 mrna, 将其称为 Poly (A) 约 1/3 的 Poly (A) mrna 编码了不同形式的组蛋白

23 Poly(A)+ RNA can be separated from other RNAs by fractionation on Sepharose-oligo(dT)

24 在动物细胞中,mRNA 的表达需转录修饰加工核质转运和翻译

25 一组特殊的 RNA 结合蛋白标示 mrna 已成熟, 可以运送到细胞质中

26 内含子的剪接编辑及化学修饰

27 RNA 中的内含子真核基因大多是断裂的 : 一个基因可由多个内含子和外显子间隔排列而成内含子在真核基因中所占的比例很高, 甚至超过 99% 非编码区 Exons ( 外显子 ): the coding sequences Introns ( 内含子 ) : the intervening sequences

28 部分人类基因中内含子序列所占的比重分析基因长度 (kb) 内含子数量内含子所占比重 (%) 胰岛素 ß- 球蛋白血清蛋白胶原蛋白组分 VII VIII 因子萎缩性肌强直因子 >99

29 剪接 (Splicing) RNA splicing: removal of introns and joining of exons. It takes place in the nucleus before the mature mrna can be exported to the cytoplasm. Catalyzed by spliceosome (RNA +protein)

30 真核细胞 RNA 转录 mrna 的前体 ( 核不均一 RNA, hnrna) 5 加帽和 3 酶切加多聚腺苷酸 RNA 的剪接连续的可译框 (ORF) (open reading frame) 通过核孔进入细胞质蛋白质合成的模板

31 RNA splicing 可通过体外凝胶电泳进行分析

32 RNA 加工过程及其生理功能加工过程推测的生理功能加帽子反应 mrna 从细胞核向细胞质运转, 翻译起始加多聚 A 反应转录终止, 翻译起始和 mrna 降解 RNA 的剪接 RNA 的切割从 mrna, trna 和 rrna 分子中切除内含子从前体 RNA 中释放成熟 trna 和 rrna 分子

33 真核基因平均含有 8-10 个内含子, 前体分子一般比成熟 mrna 大 4-10 倍内含子的功能及其在生物进化中的地位是一个引人注目的问题

34 生物体内的各种内含子内含子类型细胞内定位 GU-AG 细胞核, 前体 mrna ( 真核 ) AU-AC 细胞核, 前体 mrna( 真核 ) I 类内含子细胞核, 前体 rrna( 真核 ), 细胞器 RNA, 少数细菌 RNA II 类内含子细胞器 RNA, 部分细菌 RNA III 类内含子双内含子细胞器 RNA 细胞器 RNA trna 前体中的内含子细胞核,tRNA 前体 ( 真核 ) GU-AG 或 AU-AC 分别代表了不同内含子的 5 和 3 边界序列

35 内含子剪接异常引起疾病地中海贫血病人的珠蛋白基因中, 大约有 1/4 的核苷酸突变发生在内含子的 5 或 3 边界保守序列上, 或者直接干扰了前体 mrna 的正常剪接慢性进行性溶血性贫血

36 断裂基因发现不久,Crick(1978 年 ) 就提出了一系列发人深思的问题 : (1) 剪切作用若是通过酶来进行的, 那么这种剪接酶是怎样识别 RNA 上特定的位点? (2) 剪切酶有没有特异性? 对不同的 RNA 是否需要不同的酶? (3) 切除的 RNA 是以线状还是环状存在的? 切下的 RNA 的命运将如何?

37 Chambon 等分析比较了大量结构基因的内含子切割位点, 发现有 2 个特点 : (1) 内含子的两个末端并不存在同源或互补 (2) 连接点具有很短的保守序列, 亦称边界序列 100 种内含子的 5 端都是 GU;3 端都是 AG, 因此称为 GU-AG 法则 (GU-AG rule), 又称为 Chambon 法则

38 A 脊椎动物前体 mrna 中常见内含子剪接所必需的保守序列两个剪接位点的序列是不同的 : 左边的剪接位点称供体 (donor) 位点, 右边的剪接位点称受体 (acceptor) 位点

39 GU-AG 法则 (GU-AG rule) 不适用于线粒体叶绿体的内含子, 也不适用于酵母的 trna 基因

40 核 mrna 结构特点 1. 边界序列 : 其边界序列是完全符合 GU-AG 法则 2. 分枝点序列 : 具有分枝点序列, 位于内含子 3 端上游 18-50nt 处, 序列为 Py 80 NPy 87 Pu 75 APy 95, 其中 A 为百分之百的保守, 且具有 2 -OH 3. 内含子 5 端有一保守序列 (5 GUAAGUA3 ) 可以和 U1 snrna 的 5 端的保守序列 3 CAUUUCAU5 互补

41 核 mrna 的剪接转录产生的核内 mrna 前体分子与蛋白质结合, 形成 RNA 和蛋白质组成的 snrnp 复合物 (ribonucleo-protein protein) 随着 RNA 链的延伸, 每个内含子 5 和 3 两端的复合物成对联结, 产生 60S 的颗粒剪接体 (spliceosome), 进行 RNA 前体分子的剪接

42 细胞核中的小分子 RNA 称为细胞核小 RNA(small nuclear RNA, snrna); 位于细胞质中的称为细胞质小 RNA (small cytoplasmic RNA, scrna) 在自然状态下, 它们以核糖核蛋白颗粒 (SnRNP 和 scrnp) 的形式存在, 俗称 snurps 和 scyrps 在核仁中也存在着一类小的 RNA, 称为核仁小 RNA (small nucleolar RNA, snorna), 它们在 rrna 的加工中起作用 snrna 参与剪接过程, 并与其它蛋白一起构成一个大的颗粒复合体, 称为剪接体 (splicesome)

43 Spliceosome ( 剪接体 ) Catalyzes pre-mrna splicing in nucleus. The spliceosome comprises about 150 proteins (splicing factors etc.) and five snrnas (U1, U2, U4, U5 and U6),and the pre-mrna being assembled. The complexes of snrna and proteins are called small nuclear ribonuclear proteins (snrnp)

44 Three roles of snrnps in splicing 1. Recognizing the 5 splice site and the branch site. 2. Bringing those sites together. 3. Catalyzing (or helping to catalyze) the RNA cleavage. RNA-RNA, RNA-protein and proteinprotein interactions are all important during splicing.

45 真核生物 mrna 前体中内含子剪接过程示意图由 U1 snrna 以碱基互补的方式识别 mrna 前体 5 剪接点, 由结合在 3 剪接点上游富嘧啶区的 U2AF(U2 auxiliary factor) 识别 3 剪接点并引导 U2 snrnp 与分支点相结合, 形成剪接前体 (pre-spliceosome) 剪接前体进一步与 U4 U5 U6 snrnp 三聚体相结合, 形成剪接体

46 The lariat ( 套索 ) is an intermediate in RNA splicing in which a circular structure with a tail is created by a 5-2 bond. The branch site ( 分支点 ) is a short sequence just before the end of an intron at which the lariat intermediate is formed in splicing by joining the 5 nucleotide of the intron to the 2 position of an Adenosine.

47 Biochemical steps of pre-mrna splicing Step 1: a cut is made at the 5 splice site, separating the left exon and the right intron-exon molecule. Step 2: cutting at the 3 splice site releases the free intron in lariat form, while the right exon is ligated (spliced) to the left exon.

48 哺乳动物细胞中 mrna 前体上的 snrnp 是从 5 向下游扫描, 选择在分支点富嘧啶区 3 下游的第一个 AG 作为剪接的 3 受点 AG 前一位核苷酸可以影响剪接效率, 一般说来, CAG=UAG>AAG>GAG 如果 mrna 前体上同时存在几个 AG, 可能发生剪接竞争

49 内含子的变位剪接 Alternative Splicing 在高等真核生物个体发育或细胞分化过程中可以有选择性地越过某些外显子或某个剪接点进行变位剪接, 产生出组织或发育阶段特异性 mrna 脊椎动物中大约有 5% 的基因能以这种方式进行剪接, 保证各同源蛋白质之间既具有大致相同的结构或功能域, 又具有特定的性质差异, 进而拓展了基因所携带的遗传信息

50 Drosophila DSCAM gene can be spliced in 38,000 alternative ways Alternative splicing ( 可变剪接 ): some pre-mrnas can be spliced in more than one way, generating alternative mrnas.

51 α- 原肌球蛋白基因可以以不同方式剪接

52 Different ways of alternative splicing

53 Self-splicing introns -I II 类内含子带有这些内含子的 RNA 本身具有催化活性, 能进行内含子的自我剪接 Autosplicing (Self-splicing, 自我剪接 ) describes the ability of an intron to excise itself from an RNA by a catalytic action that depends only on the sequence of RNA in the intron.

54 Self-splicing introns fold into a specific conformation catalyze the chemical reaction using metal ions as cofactors

55 There are two classes of selfsplicing introns: group I self-splicing introns group II self-splicing introns.

56 I 类内含子 (group I intron) 的结构特点 1. 其边界序列为 5 U-G 3 2. 内含子中具有中部核心结构 (Central core structure that contains a guaninebinding pocket and internal guide sequence) I 类内含子常分布于低等真核生物的细胞器中, 如四膜虫绒泡菌的 rrna 等

57 I 类内含子的自我剪接过程自由鸟苷酸的 3 -OH 作为亲核基团攻击内含子 5 端的磷酸二酯键, 从上游切开 RNA 链上游外显子的自由 3 - OH 作为亲核基团攻击内含子 3 位核苷酸上的磷酸二酯键, 使内含子被完全切开上下游两个外显子通过新的磷酸二酯键相连

58 Ⅱ 类内含子 (group II intron) 和 I 类内含子剪接不同 ; 和核 mrna 内含子的剪切有些相似, 但也有不同之处 Ⅱ 类内含子分布在 : 酵母 mtrna, 细胞色素氧化酶的 α 亚基,β 亚基, 玉米 mitochondrial RNA (mtrna),trna 真核 mrna 前体中

59 Ⅱ 类内含子的剪接无需鸟苷的辅助, 但需镁离子的存在

60 II 类内含子的自我剪接过程分枝点腺苷酸的 2 -OH 作为亲核基团攻击内含子 5 端的磷酸二酯键, 内含子 5 的边界序列上的 G 以 5 磷酸和分枝点 A 的 2 -OH 形成磷酸二酯键, 从而产生了套索 (lariat) 结构上游外显子的 3 -OH 作为亲核基团攻击内含子 3 位核苷酸上的磷酸二酯键, 使套索结构完全解离上下游两个外显子通过新的磷酸二酯键相连

61 几种不同内含子剪接反应的区别酵母 trna I 类内含子 Ⅱ 类内含子核 mrna 前体边界顺序无 5 U -G 3 5 GU- AG 3 5 GU-AG 3 特殊顺序 C( 茎上 )- G( 环上 ) 内部引导顺序分支点序列分支点序列,5 外显子顺序二级结构茎环构象核心结构 5 6 功能区连接体基因外的成分内切酶, 连接酶自由鸟苷, 镁离子镁离子 U1U2,U4,U5,U6 能量要求 ATP 不不 ATP 中间型分子半分子 trna 环状 L-19 IVS 套索套索

62 The chemistry of group II intron splicing and RNA intermediates produced are the same as that of the nuclear pre-mrna.

63 三类剪接反应都是通过两次连续的转酯反应进行的第一次转酯反应中, 由一个游离的 2 - 羟基提供, 发动对 5 外显子 - 内含子连接点的攻击第二次转酯反应中, 已经释放的外显子末端的游离 3 - 羟基接着攻击 3 内含子 - 外显子的连接点

64 RNA 的编辑和化学修饰 RNA 的编辑 (RNA editing) 是某些 RNA, 特别是 mrna 的一种加工方式它导致了 DNA 所编码的遗传信息的改变

65 RNA 的编辑 (RNA editing) 编辑 (editing) 是指转录后的 RNA 在编码区发生碱基的加入, 丢失或转换等现象介导 RNA 编辑的两种机制 : 位点特异性脱氨基作用 ; 引导 RNA 指导的尿嘧啶插入或删除

66 A specifically targeted C residue within mrna is converted into U by the deaminase ( 脱氨酶 ). The process occurs only in certain tissues or cell types and in a regulated manner.

67 哺乳动物载脂蛋白基因转录产物的编辑肝中剪接的 mrna 编码含 4563 aa 的蛋白质肠 mrna 有 UAA 密码子在第 2153 位密码子终止合成

68 哺乳动物中 RNA 编辑的实例组织靶标 RNA 所改变的碱基结果肝脏, 肠载脂蛋白 B C U 谷氨酰胺密码子终止子肌肉半乳糖苷酶 U A 苯丙氨酸密码子酪氨酸睾丸, 肿瘤等 Wilms 肿瘤基因 -1 U C 亮氨酸密码子脯氨酸肿瘤神经纤维瘤基因 -1 C U 精氨酸密码子终止子脑谷氨酸受体蛋白 A I 多个谷氨酸密码子精氨酸

69 RNA 编辑的另一种形式是尿苷酸的缺失和添加研究发现, 利什曼原虫属细胞色素 b mrna 中含有许多独立于核基因的尿嘧啶残基, 而特异性插入这些残基的信息来自指导 RNA(guide RNA)

70 指导 RNA(guide grna) 1990 年, L.Simpsom 等在研究锥虫线粒体 mrna 时发现了一类新的小分子 RNA: 可以和 mrna 分子被编辑的部分发生非常规的互补,G-U 配对, 对 mrna 前体分子的编辑起了指导作用, 故称其为指导 RNA(guide grna)

71 grnas Having three regions: anchor directing the grnas to the region of mrnas it will edit. editing region determining where the Us will be inserted poly-u stretch

72 指导 RNA 和 RNA 的编辑机制指导 RNA 与被编辑区及其周围部分核酸序列虽然有相当程度的互补性, 但该 RNA 上存在一些未能配对的腺嘌呤, 形成缺口, 为插入尿嘧啶提供了模板反应完成后, 指导 RNA 从 mrna 上解离下来, 而 mrna 则被用做翻译的模板

73 RNA 编辑的生物学意义 (1) 校正作用 (2) 调控翻译通过编辑可以构建或去除起始密码子和终止密码子 (3) 扩充遗传信息

74 RNA 的再编码 RNA 的再编码 (RNA recoding): RNA 编码和读码方式的改变, 可以从一个 mrna 产生两种或多种相互关联但又不同的蛋白质, 可能是蛋白质合成的一种调节机制核糖体程序性 +1/-1 移位 :mrna 的读码信号发生 +1/-1 移位核糖体跳跃 : 核糖体跳过 50 个核苷酸终止子通读 : 硒代半胱氨酸 (21 st aa) 和吡咯赖氨酸 (22 nd aa )

75 mrna Transport Once processed, mrna is packaged and exported from the nucleus into the cytoplasm for translation Movement from the nucleus to the cytoplasm is an active and carefully regulated process. The damaged, misprocessed and liberated introns are retained in the nucleus and degraded.

76 A typical mature mrna carries a collection of proteins that identifies it as being ready for transport. Export takes place through the nuclear pore complex. Once in the cytoplasm, some proteins are discarded and are then imported back to the nucleus for another cycle of mrna transport. Some proteins stay on the mrna to facilitate translation.

77 核酶 (ribozyme) 核酶是指一类具有催化功能的 RNA 分子, 通过催化靶位点 RNA 链中磷酸二酯键的断裂, 特异性地剪切底物 RNA 分子, 从而阻断基因的表达 ribozyme 是核糖核酸和酶两个词的缩合词

78 RNA as Catalysts Tom Cech In 1982 Tom Cech and his research group announced that an RNA molecule from Tetrahymena, a single-celled pond organism, cut and rejoined chemical bonds in the complete absence of proteins. This discovery of self-splicing RNA provided the first exception to the longheld belief that biological reactions are always catalyzed by proteins. The RNA subunit in the RNaseP Altman

79 核酶的锤头结构该酶包括三个茎环区, 其间有一个个保守核苷酸构成的催化中心 N 代表该位置上可以为任意碱基, 箭头代表切割部位, H 代表除了 G 以外的核苷酸在类病毒中, 茎 III 的顶部并没有被环连接起来

80 锤头进行自我切割类病毒和拟病毒形成一种锤头状二级结构, 具有催化活性当酶链被引入细胞时, 它可与底物链配对, 并将其切割为基因治疗提供了新的策略

81 核酶是具有催化活性的 RNA 分子

82 核酶的分类剪切型核酶 : 只剪不接 ; 剪接型核酶 : 又剪又接, 具有序列特异的内切核酸酶 RNA 连接酶等多种酶的活性

83 核酶的生物学意义核酶的发现使我们对 RNA 的重要功能又有了新的认识核酶是继逆转录现象之后对中心法则的又一个重要修正, 说明 RNA 既是遗传物质又是酶核酶的发现为生命起源的研究提供了新思路, 也许曾经存在以 RNA 为基础的原始生命照这么说, 蛋白质世界也可能 ( 仅仅是可能 ) 起源于 RNA 世界!

84 Thank You

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<4D F736F F F696E74202D203620B7D6D7D3C9FACEEFD1A720B5DAC8FDD5C220444E41B5C4D7AAC2BC20D7AAC2BCD6D5D6B9BACD524E41B1E0BCAD2E 分子生物学第三章生物信息的传递 ( 上 ) 从 DNA 到 RNA 第五节原核和真核生物转录产物比较第六节原核和真核生物 MRNA 的特征比较第七节真核生物 RNA 的转录后加工第八节 RNA 的编辑再编码及化学修饰夏玉琼 10/12/2017 2 目录原核和真核生物转录产物比较原核和真核生物 mrna 的特征比较真核生物 RNA 的转录后加工 RNA 的编辑再编码及化学修饰 3 原核生物和真核生物转录产物比较