生化背稿

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1 PKU CCME CLUD 1 脂类 定义 : 一类低溶于水而溶于非极性溶剂的有机分子, 大多数脂质是脂肪酸酯及其衍生物 分类 : 1 单纯脂质: 甘油酯, 脂肪酸的甘油酯, 蜡, 长链脂肪酸和长链醇或者固醇 2 复合脂: 分子中取出含有脂肪酸和醇外, 还有非脂成分, 可分为磷脂和糖脂 3 衍生脂质: 由单纯脂质或复合脂衍生而来 生物学作用 1 贮存能量: 负责储能的脂质称为贮存脂质 2 作为生物膜的骨架成分: 屏障作用, 使膜两侧的亲水物质不能自由通过, 亦称为结构脂质 3 具有转移和重要生物活性: 具有重要的生物活性, 称为活性脂质 脂肪酸结构特点 :1. 脂肪酸的碳链长 4-36 个碳, 碳数为偶数 ;2. 脂肪酸分喂饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸 ;3. 不饱和脂肪酸 : 单不饱和脂肪酸 : 双键在 C9-C10 间 ( 9), 顺式 (cis), 个别为反式多不饱和脂肪酸 : 以 9 为中心, 双键位于 9 和末位 C 之间, 往往不共轭不饱和脂肪酸的表示方法 : 碳数和双键数之间用冒号隔开, 双键位置用 右标数字表示, 若双键为反式 trans, 以 t 为符号 多不饱和脂肪酸 PUFA 1 必需 PUFA: 指人体需要但是自身不能合成的脂肪酸 长链脂肪酸中 9 以后的双键都是人体不能合成的 ; 主要有两种 : 亚油酸和亚麻酸 磷脂甘油磷脂的结构 1. Sn- 系统规则 :1)C1 位为潜手性 S 碳,C3 位是潜手性 R 碳,Fisher 投影式,C2- 在左, 三个 C 顺序编号 ;2)Sn 写在母体化合物 - 甘油前面 2. 结构 甘油磷脂的一般性质 :1. 为白色蜡状固体, 溶于大多数含水非极性溶剂, 难溶于无水丙酮, 见空气易氧化, 变成黑褐色 ;2 两亲物质, 可成膜 ;( 脂质常见的结构, 单分子层, 双分

2 PKU CCME CLUD 2 子层, 微团, 微囊 )3. 被磷脂酶专一性水解 常见的甘油磷脂 (1) 磷脂酰胆碱 (PC)1,2- 二酰基 -sn- 甘油 -3- 磷酰胆碱, 俗称卵磷脂 (lecithin), 3-sn- 磷脂 酰胆碱, 为细胞膜中最丰富的脂质之一 它的头基为胆碱, 是代谢中的一种甲基供体 (2) 磷脂酰乙醇胺 (PE) 头基为乙醇胺, 又称脑磷脂, 胆氨 (3) 磷脂酰丝氨酸 (PS) 头基是丝氨酸, 分子净电荷为 -1; (4) 磷脂酰肌醇 (PI) 头基为肌醇, 三这可在体内转化 (5) 磷脂酰甘油 (PG) 头基为甘油

3 PKU CCME CLUD 3 醚甘油磷脂 (1) 缩醛磷脂 :sn-1 位含顺 -α,β 不饱和醚 (cis), 头基可为胆碱 乙醇胺和 Ser (2) 血小板活化因子 鞘磷脂 : 由鞘胺醇, 脂肪酸, 磷酸胆碱或磷酸乙醇胺组成 1 鞘氨醇

4 PKU CCME CLUD 4 2 神经酰胺 : 当脂肪酸通过酰胺键和鞘胺醇的 C2 位 -2 相连时, 叫做神经酰胺 3 鞘磷脂 : 神经酰胺 C1 位的 - 与磷酸胆碱或磷酰乙醇胺缩合成的化合物叫做鞘磷脂 胆固醇 : 结构特点 :C3:,C17:8-10 碳的烷烃, 真核生物细胞脂膜中维持生物膜的流 动性和正常的透过能力 生物膜的组成与结构生物膜的组成和性质 : 生物膜即指细胞外周膜和内膜系统的统称, 由膜脂, 膜蛋白, 糖类组成 1 膜脂脂质有磷脂, 糖脂, 胆固醇磷脂 : 构成生物膜的基质, 包括甘油磷脂和鞘磷脂 磷脂分子的两亲性, 使之在生物膜中呈双分子排列, 构成脂双层糖脂 : 质膜都含糖脂, 大多为鞘氨醇的衍生物胆固醇 : 对生物膜中脂质的流动性和渗透性有一定的调节作用, 是脊椎动物膜流动性的关键调节剂

5 PKU CCME CLUD 5 2 膜蛋白 ( 外周蛋白和内在蛋白 ) 外周蛋白 : 分布于膜的脂双层表面, 与膜分子通过静电力和其它非共价力相连, 溶于水, 易分离内在蛋白 : 靠疏水相互作用与膜相连, 全部或部分埋在脂双层疏水区或横跨脂双层 疏水相互作用 : 生物大分子的非极性疏水侧链之间, 有相互趋近的作用脂质为膜蛋白提供 了合适的环境, 也是膜蛋白表现功能所必需的 生物膜的分子结构 1 生物膜分子间作用力: 疏水相互作用, 静电力, 范德华力 2 生物膜结构的主要特征 (1) 膜组分的不对称分布 : (2) 生物膜的流动性流动性是生物膜的主要特征, 是生物膜表现其功能的基础, 物质运送, 信息传递, 细胞融合等功能的实现都依赖于膜的流动而进行 1 膜脂的流动性 : 膜脂的流动性主要取决于磷脂分子 当温度在相变温度上下变动时, 磷脂会发生相变运动方式有 : 膜内侧向扩散或者移动 ; 在脂双层中翻转 ; 烃链绕 C-C 键旋转 ; 围绕与膜平面垂直的轴左右摆动 ; 围绕与莫平面垂直的轴旋转影响因素 :1. 脂肪酸的链长和不饱和度, 链越长越易排列, 不饱和度越大越不易排列 ;2. 胆固醇, 真核生物膜流动性的关键调节剂 ;3. 其他 : 膜蛋白, 鞘磷脂含量, 温度,p, 离子强度, 金属离子等 生物膜的物质运送生物膜的主要功能 :1. 分隔细胞, 细胞器 ;2. 物质运送 ;3. 能量转化 ;4. 信息的识别和传递生物膜的主动运送和被动运送 : 被动运输 : 物质从高浓度一侧顺浓度梯度的方向, 通过膜运输到低浓度一侧的过程特点 : 运输速率取决于物质在膜两侧的浓度差和物质分子的大小, 所带电荷和在脂双层中溶解性 ; 运输过程不消耗能量主动运输 : 物质逆浓度梯度方向或逆电化学梯度的方向运输过程特点 : 具有专一性, 饱和性, 方向性, 选择性抑制, 和需要提供能量 小分子物质的运输 a +,K + - 泵 : 细胞内外存在离子梯度差, 胞内高 K+, 低 a+, 胞外高 a+, 低 K+, 这是其作用的 a-k 泵就是分布于膜上的 a+,k+-atp 酶 生理意义, 维持细胞的膜电位, 成为可兴奋细胞, 是神经 肌细胞等的活动基础, 可调节细胞的体积和驱动某些细胞中糖和氨基酸的运送

6 PKU CCME CLUD 6 构像变化假说 :1.a+ 与 atp 酶结合,2. 胞质侧 atp 酶被 atp 磷酸化, 磷酸基团转移到酶上, 3. 诱导 atp 酶发生构象变化,na 被运送至胞外,4.K 在胞外结合到酶上的 K 结合位点,5. 酶 去磷酸化,6. 回到原来构象,K 通过膜释放到细胞质侧 生物大分子的跨膜运输 胞吐作用细胞内物质先被囊泡裹入形成分泌泡, 然后与细胞质膜接触, 融合并向外释放 被裹入的物质 胞吞作用细胞从外界摄入的大分子或颗粒逐渐被质膜的一小部分包围, 内陷, 然后从质 膜上脱落, 形成含有摄入物 脂肪酸的氧化脂肪酸的代谢在线粒体内进行, 要进入线粒体基质才能开始代谢过程 ( 一 ) 脂肪酸的活化 : 通过通过脂酰辅酶 A 合酶 ( 脂肪酸硫激酶 ) 催化, 脂肪酸与 CoA 结合形成脂酰 -CoA 进入线粒体基质开始 β- 氧化 ( 特点 :ATP 直接生成 AMP 来供能 ) ( 二 ) 脂肪酸进入线粒体当活化了的脂肪酸分子为小于 10 个碳的脂酰 CoA, 容易穿过线粒体内膜 ; 大于 10 个碳的分子有一个特殊的运送机制 : 需要碱的参与 ( 穿过时,CoA 已不是原先的 CoA) ( 三 ) 脂肪酸的 β - 氧化 ( 反应式和酶 ) 脂肪酸的 β- 氧化循环由四个步骤组成 : 氧化 水合 氧化 断裂第一步 : 氧化反应 : 脂酰 -CoA 氧化脱氢形成反式 -Δ 2 - 烯酰 -CoA : 脂酰 CoA 脱氢酶

7 PKU CCME CLUD 7 第二步 : 水合反应反式 -Δ 2 - 烯酰 -CoA 水合形成 L-3- 羟脂酰 -CoA, 烯酰 CoA 水合酶第三步 : 氧化反应 :L-3- 羟脂酰 -CoA 的 - 氧化成酮, 生成 β- 酮脂酰 -CoA, 同时产生一分子 AD,L-3- 羟脂酰 -CoA 脱氢酶第四步 :β- 酮脂酰 -CoA 与另一分子 CoA 作用产生一分子乙酰 -CoA 和一分子减少两个 C 的脂酰 -CoA, 硫解酶每完成一次循环生成 14 个 ATP, 共生成 14n-2 个 atp(2 个开始时活化 ) ( 四 ) 脂肪酸氧化的能量估算 7x14-2=106 不饱和脂肪酸的氧化 1 单不饱和脂肪酸的氧化 : 需要一个异构酶将 β -γ 位双键异构化为反式 α -β 双键 特点 : 以烯酰 -CoA 异构酶取代脱氢酶 ; 少生成一个 FAD 2 2 多不饱和脂肪酸的氧化 : 与单不饱和脂肪酸相比, 降解过程还需要增加一个酶 :2,4- 二烯酰 -CoA 还原酶, 先还原, 在异构, 减少一个 FAD2 3 奇数 C 脂肪酸的氧化 : 最后产物是丙酰 -CoA 丙酰 -CoA 可经三步反应转化为琥珀酰 -CoA, 然后进入 TCA 循环, 4 乙酰 -CoA 的最终代谢 :1 进入 TCA;2 作为胆固醇生物合成中的前体分子 ;3 作为 脂肪酸合成的起始物 - 逆脂肪酸的氧化代谢的过程 4 转化为酮体

8 PKU CCME CLUD 8 核酸的组成和分类 核酸的基本结构单位是核苷酸, 核苷酸由核苷和磷酸组成, 核苷由碱基和戊糖组成 碱基和戊糖的化学结构 1 嘌呤碱基 ( 腺嘌呤和鸟嘌呤 ) 2 嘧啶碱基 DA: 胞嘧啶和胸腺嘧啶 RA: 胞嘧啶和尿嘧啶 3 稀有碱基 ( 缩写符号 结构 ) 修饰碱基, 也称稀有碱基, 绝大部分也都, 是嘌呤和嘧 啶类化合物 在 tra 中稀有碱基含量最多, 其甚至含有胸腺嘧啶 关于稀有碱基的缩写:a n1 n2,a 表示基团,n1 表示位置,n2 表示个数, 表示原先碱基缩写,hm 表示羟甲基,ac 表示乙酰基,m 甲基,mo 甲氧基,s 硫, 特殊的 DU5,6- 二轻尿嘧啶,iA,6 异戊烯基腺嘌呤 戊糖 :RA:D- 核糖 DA:D-2- 脱氧核糖 D-2-- 甲基核糖 核苷戊糖与碱基缩合而成的化合物称为核苷,- 糖苷键相连 1 核苷的分类按照戊糖种类的不同 : 核糖核苷, 脱氧核糖核苷,2-- 甲基核苷按照碱基的不同 : 嘌呤核苷和嘧啶核苷 核苷的结构特点核苷结构中糖基与碱基以 β - 糖苷键相连, 在空间结构上碱基与糖环平面互相垂直, 反式构象较顺式合适, 在 DA 双螺旋中碱基配对是以反式定位的 ; 碱基上的氨基或酮基可以互变异构为亚氨基或烯醇基 不同 p 条件下核苷有不同的解离态

9 PKU CCME CLUD 9 核苷酸 1 种类: 核苷的磷酸酯叫核苷酸, 分为核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两大类 2 核苷酸的结构: 多以 5 的形式存在, 3 多磷酸核苷酸: 核苷中的戊糖羟基被一分子磷酸酯化称单磷酸核苷酸, 也有二磷酸核苷和三磷酸核苷, 如除 5 外的羟基结合磷酸, 抑或磷酸被磷酰化 4 环核苷酸 : 还有一种核苷酸叫环核苷酸, 常见的环核苷 酸有 3,5 - 环化腺苷酸 (camp) 和 3,5 - 环化鸟苷酸 (cgmp), 在体内做调节分子和信号分子, 第二信使 核酸分子的结构及表示方法 1 结构: 核酸是由核苷酸通过 3,5 - 磷酸二酯键连, 接而成的线性分子 2 表示方法 1) 碱基表示法, 一般不使用 2) 核苷的表示法, 核苷一般以单字母表示,A G C U, 脱氧核苷以 da, dg, dc, dt 表示 ; 修饰成分的表示方法是在缩写符号左面以小写英文字母和数字注明取代基种类 数目和位置 3) 核苷酸的表示法在核苷符号左方的小写字母 p, 表示 5 - 磷酸酯, 在核苷符号右方的小写字母 p 表示 3 - 磷酸酯, 多磷酸酯以小写字母 p 的数目表示, 如 ppu:5 - 尿苷二磷酸 pppa:atp,ppgpp: 鸟苷四磷酸 3,5 - 环化核苷酸书写为 camp,cgmp 等 4) 核酸链的表示法从左到右从 5 端写到 3 端 竖线表示核酸的戊糖碳链,A G C T 表示碱基,p 代表磷酸基,p 引出的斜线一端与 C 3 相连, 另一端与 C 5 相连 DA 分子的碱基组成 1 A = T G = C, A+G=T+C 2 DA 的碱基组成具有特异性 :1. 不同物种的 DA 有自己独特的碱基组成 ;2. 同一物种的 DA 没有组织和器官的特异性, 也不随年龄 环境和营养状态变化 DA 的一级结构

10 PKU CCME CLUD 10 定义 :DA 的一级结构就是核苷酸在 DA 分子中的排列顺序原核生物基因 : 特点 : 基因是连续的, 没有内含子, 功能相关的基因会组成操纵子, 有共同的调节序列和控制序列, 重复序列很少真核生物基因 : 基因不连续, 含有内含子, 功能相关的基因不组成操纵子, 并且有大量重复序列, 进化程度越高的真核生物, 其调控序列和重复序列的比例越大 DA 的二级结构双螺旋结构的基本特征主链 : 两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴以右手螺旋相互盘绕而成 ; 磷酸核糖处于螺旋外侧, 是亲水性的, 糖环平面与中心轴平行 ; 碱基对 : 嘧啶和嘌呤配对 ( 几何形状 ), 碱基位于双螺旋内侧, 碱基平面与中心轴垂直, 两条核苷酸链依靠氢键维系 ( 碱基之间的疏水作用导致了碱基堆积, 碱基堆积力和碱基对之间的氢键稳定了双螺旋 ) 大沟和小沟 : 双螺旋表面有两条螺形凹沟, 深的称大沟, 宽 1.2nm, 深 0.8nm, 浅的称小沟, 宽 0.6nm, 深 0.75nm 结构 : 平均直径为 2nm, 相邻碱基对之间的距离, 也称碱基堆积距离是 0.34nm, 相邻碱基之间的夹角为 36, 每 10 个核苷酸形成一个螺旋, 螺距 3.4nm 双螺旋结构的类型 1) B-DA: 主要存在的天然 DA 的结构, 相对湿度为 92% 时得到的 DA 钠盐纤维, 这 种 DA 称 B 型 DA(B-DA) 2) A-DA: 当 DA 钠盐 ( 或钾盐 铯盐 ) 在相对湿度 75% 时,DA 就处于 A 型构象, 特点 : 由两条反向的多核苷酸链组成, 右手螺旋, 螺体宽而短, 碱基平面与螺旋轴有 19 的倾角, 上下两个碱基相差 2.56Å, 二个相邻碱基的夹角是 32.7, 螺距为 28Å, 大沟比小 沟深很多 3) Z-DA: 为左手螺旋, 所以它也称左旋 DA, 三螺旋 DA 在三股螺旋中, 通常是一条同型寡核苷酸与寡嘧啶核苷酸 - 寡嘌呤核苷酸双螺旋的大沟结合, 第三股核苷酸链与寡嘌呤核苷酸之间为同向平行, 第三股链的碱基可与 Watson-Crick 碱基对中的嘌呤碱基形成 oogsteen 氢键, 可以来自分子间, 也可以来自分子内 DA 的三级结构 DA 的三级结构指 DA 分子通过扭曲和折叠所形成的特定构象, 包括不同二级结构单元间的相互作用, 单链与二级结构的相互作用以及 DA 的拓扑特征超螺旋 : 正常的 DA 分子处于能量最低状态, 当分子产生额外张力时,DA 内部原子的位置会重排, 导致分子扭曲以抵消张力, 是三级结构的一种形式 环状 DA: 生物体内有些 DA 分子以双链环型 DA 形式存在, 如细菌染色体 DA, 质粒 DA, 细胞器 DA 等 DA 分子的一些重要特性 1 DA 分子的长度 : 真核生物的长于原核生物的 2 DA 分子的稳定性维持其稳定的因素 : 氢键 碱基堆积力 静电引力和范德华力碱基堆积力 : 相邻两个碱基之间可以产生 π-π 堆积, 层层堆积起来的碱基在螺旋内形成强大的疏水区,

11 PKU CCME CLUD 11 3 DA 分子的可塑性 : 由于热力学作用, 在溶液中,DA 骨架上的共价键转角会改变, 引起 DA 分子的弯曲, 缠绕或伸展 4 DA 分子结构中的碱基互变异构体 :DA 的化学性质与碱基上的氢原子位置相关, 碱基上的氢原子位置相对固定, 但在某些极端情况下, 碱基会有不同的解离态, 可能导致基因突变 p>12 R 2 R 2 RA 分子的组成及二级结构 1 RA 的组成 : 四种核苷酸 : 腺嘌呤核糖核苷酸, 鸟嘌呤核糖核苷酸, 胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸, 组成上的特点, 含有稀有碱基 2 RA 的二级结构 :RA 是核糖核苷酸通过 3,5 - 磷酸二酯键连接而成的线性分子, 无分支, 天然 RA 是单链线性分子, 局部区域可以碱基互补, 形成氢键, 从而形成双螺旋结构, 双螺旋区约占一半, 结构为 ADA RA 的类型 :tra,mra,rra mra: 负责接受 DA 分子的遗传密码信息 ( 即蛋白质中氨基酸排列顺序 ), 并以自身为模板合成蛋白质 tra: 在蛋白质生物合成过程中负责接受 转运和掺入氨基酸 rra: 是构成核糖体的重要成分, 而核糖体是蛋白质生物合成的场所 tra 1) tra 的特征 : 它在蛋白质生物合成的起始, 在 DA 的转录合成及其它代谢调节中均有重要作用 生物体内每一种氨基酸都有相应的一种或几种 tra 2) tra 的二级结构 : 个核苷酸,MW 约 25000, 沉降系数为 4S;2. 稀有碱基较多 ( 稀有碱基的作用 : 提高 tra 与 rra 和蛋白质等特定分子的识别能力, 并增强疏水作用 );3. 3 末瑞 ( 接受末端 ):CCA- 作用 : 接受活化的氨基酸 ;4. 5 末端 : pg. 或 pc. 5. 二级结构呈三叶草形, 叶柄是双螺旋区, 叶子为突环区 作用 三叶草的五部分 : 氨基酸臂 : 富含 G, 末端 CCA, 接受活化氨基酸二氢尿嘧啶环 :2 个二氢尿嘧啶 通过二氢尿嘧啶臂与其它部分相连反密码环 :7 个碱基, 环中部是反密码子, 通过反密码臂 (5bp) 和 tra 其它部分相连额外环, 中部突出, 可作为分类标志假尿嘧啶核苷 胸腺嘧啶核苷环,7bp, 通过 TψC 臂 (5bp) 和其他相连,tRA 分子与 5S rra 的结合和 tra 高级结构的维系有重要

12 PKU CCME CLUD 12 假尿苷 ψ, 是目前确定的糖苷键连接方式唯一与众 不同的核苷, 它是由嘧啶环的 C5 与核糖的 C1 形成 糖苷键 3)tRA 的三级结构 : 生物功能与三级结构密切相 关 mra: 不同的 mra 长度不同, 分子量变化很大, 平均分子量约 , 沉降系数 8S 原核生物 mra 的结构特点 : 为多顺反子结构, 即一条 mra 链上有多个编码区, 它以操纵子为转录单位,3 和 5 末端都有一段非翻译区, 原核生物的 mra 无修饰碱基真核细胞 mra 的结构特点 : 末端 Poly A 结构, 帮助 mra 从核内迁移到胞质, 与 mra 半寿期有关 ; 末端帽子 (cap) 结构,m 7 G 5 ppp 5 mpp, 作用, 抗 5 - 核酸外切酶的酶解, 保证翻译活性 ; 协助核糖体识别并结合 mra, 使翻译从 AUG 处开始, 保证蛋白质合成的正确性,3. 编码区和非编码区, 编码区是所有 mra 分子的主要结构部分, 包含蛋白质的信息 三联体密码在所有生物中通用, 存在 5 端和 3 端两个非编码区, 非编码区常常含有起调控作用的区域 ; 真核生物的 mra 为单顺反子 rra: 原核细胞中有三类 rra: 5S rra 16S rra 和 23S rra 真核细胞中有四类 rra:5s rra 5.8S rra 18S rra 和 28S rra DA 物化性质 : 极大的粘度 ; 易于断裂 ; 易形成纤维状物质 ; 在稀盐溶液中热变性 ; 熔点 高,RA 没有明显的物化特性 核酸的紫外吸收 :λmax =260nm, 在紫外区有强吸收 1 核酸具有紫外吸收 λmax =260nm, 在紫外区有强吸收 2 根据紫外吸收判断样品纯度: 纯的 DA A 260 /A 280 = 1.8; 纯的 RA A 260 /A 280 = 2.0, 不纯时显著降低 3 用摩尔磷消光系数 ε (p) 表示溶液中核酸的含量 : 核酸分子中碱基和磷原子含量相等, 可以用 P 的含量来表示核酸的含量 ;ε(p) = A/CL = 30.98A/WL (1) 核酸的 ε(p) 比核苷酸单体低 (2) 单链多核苷酸的 ε(p) 比双螺旋多核苷酸的 ε(p) 要高增色效应 : 核酸变性时,ε(P) 增加 ; 减色效应 : 当核酸复性时,ε(P) 降低 核酸的沉降特性 : 不同构象的分子沉降速度有很大差异 核酸的变性 复性及杂交变性 1 变性和降解变性 :DA 的变性过程是双螺旋结构被破坏, 物化性质发生改变的过程, 变性指核酸分子双螺旋区的氢键断裂, 双链解体成单链, 其间不涉及共价键的断裂, 核酸的降解指多核苷酸骨架上共价键的断裂, 因而引起核酸分子量的降低

13 PKU CCME CLUD 13 2 变性 DA 物化性质的改变 1) 粘度大大降低 2) 沉降速度提高 3) 浮力密度增大 4)260nm 处的紫外吸收增加 5) 比旋下降 6) 酸碱滴定曲线改变, 甚至不分失去活性 3 影响核酸变性的因素: 1) 热变性 : 提高温度破坏双螺旋区的氢键 2) 酸碱变性 : 改变溶液 p 值, 导致氢键和疏水相互作用被破坏 3) 化学试剂变性 : 有机溶剂 尿素 甲醛可以破坏疏水相互作用 3 DA 的熔解温度 Tm 通过加热使 DA 的双螺旋结构解旋 50% 时的温度影响因素 :1)DA 的均一性, 越均一, 范围越窄 2)G-C 含量越高,Tm 越高 3) 介质离子强度越大,Tm 越高, 范围越窄 4 RA 的变性特点 :Tm 较低, 变性 ; 曲线较宽 tra 的 Tm 较高 ; 双链 RA 的变性与 DA 相同 复性 : 在适当条件下, 变性 DA 的两条链重新缔合成双螺旋结构的过程影响因素 :1) 降温速度退火 : 变性 DA 缓慢冷却而复性的过程 2)DA 片段的大小 3)DA 的浓度 4) 核苷酸顺序的复杂程度 核酸的杂交 杂交 : 将异源 DA 在同一体系中同时变性, 如果异源 DA 彼此间有部分序列相同, 它们 在复性时会形成杂交分子 核酸的酸碱性质酸碱性质 : 核苷酸分子的酸性较强, 核酸也具有相对强的酸性, 核酸是两性电解质, 在不同 p 溶液中的解离程度不同 两性解离导致兼性离子的形成, 所以核酸也有等电点核酸的水解酸水解 : 糖苷键和磷酸二酯键都可以被酸水解 : 1) 糖苷键对酸更不稳定 2) 嘌呤碱基的糖苷键比嘧啶碱基易水解 3) 脱氧核糖与嘌呤碱基形成的糖苷键最不稳定碱水解 :DA 的磷酸酯比较稳定,RA 在碱性条件下会产生 2,3 - 环磷酸酯, 继而产生 2 - 核苷酸和 3 - 核苷酸酶水解 : 非特异性水解磷酸二酯键的酶称磷酸二酯酶, 特异性水解核酸的磷酸二酯酶叫核酸酶 : 核糖核酸酶, 脱氧核糖核酸酶, 核酸内切酶, 核酸外切酶 RA 的分离 :RA 的分离比 DA 复杂, 因为 RA 分子不稳定, 环境中到处存在 Rase, 很容易降解 RA, 提取 RA 时必须注意破坏 Rase 的活性 凝胶电泳 : 分离作用主要依赖于它们的分子量及分子构型, 而凝胶的类型及其浓度对被分离核酸的分子大小关系重大 影响电泳迁移率的因素 : 核酸分子大小 ;DA 的构象 ; 胶浓度 ; 电压或电流 ; 碱基组成, 温度 DA 的固相合成

14 PKU CCME CLUD 14 工作原理 : 固相载体用核苷衍生化, 进入合成循环, 通过偶连反应延长核苷酸链直至要求的链长度, 然后脱离循环, 过滤, 将核苷酸链从固相载体上脱下, 纯化后得到产品化学合成步骤 : 磷酰亚胺法 ( 特点 : 高效 ; 迅速 ; 起始物稳定 ) 第一步, 酸化 : 脱保护 DMT B + B 第二步 : 偶合, 链延长 B DMT B P (i-pr) 2 C 2 C 2 C DMT C 2 C 2 C B P B 第三步 : 保护, 目的是封闭任何未能参与反应的 5 - 第四步 : 氧化, 将亚磷酸酯氧化为稳定的磷酸三酯 DMT B B Ac DMT Ac B B C 2 C 2 C P B I2/2 C 2 C 2 C P B 粗产品用 Et- 3 2 处理, 事从模板上脱落, 产物用电泳或 PLC 纯化 聚合酶链反应 (PCR)( 体外快速扩增 DA 的一种生物技术, 是一种无细胞分子克隆法 ) 基本原理 : 与 DA 在生物体内的复制相仿区别 : 无法模拟复制叉替代 : 将 DA 变性, 使双链分开利用单链 DA 与引物退火过程中杂交产生 3 -, 然后在 DA 聚合酶作用下, 以 dtp 为底物, 合成模版链的互补链基本步骤 :1 设计合适的引物 2 优化反应条件 3 选择热循环温度 4 检测扩增

15 PKU CCME CLUD 15 结果 DA 测序 Sanger: 通过对互补链合成的控制了解序列信息原理 : 利用待测 DA 单链作模板, 在 DA 聚合酶催化下, 在四种脱氧核糖核苷三磷酸和 Mg 2+ 存在下, 合成 DA 片断, 再利用 2,3 - 双脱氧核苷三磷酸使 DA 合成终止于某一特定的碱基, 可以得到末端终止于某特定碱基的各种不同长度的 DA 片段, 最后进行电泳和放射自显影, 读出碱基顺序末端终止法 : 四组反应将分别得到终止于 A G C T 的长度不同的产物, 然后将四组片段分别进行电泳和放射自显影, 根据不同的迁移率, 可以完整地读出合成链的 DA 序列, 而这条合成链的互补链就是待测 DA 的核苷酸顺序 DA 的限制酶图谱 1 修饰和限制现象 E.coli K 株繁殖出来的噬菌体入 (K) 只能感染 E.coli K 株, 而不感染 E.Coli B 株, 该现象称 限制 现象被限制的噬菌体群体中也可能有极少的幸存个体, 这些个体可以在受限制的菌株中繁衍子代 此现象称 修饰 2 限制性内切酶识别并水解 DA 的某特定碱基序列, 特点 : 专一性非常强, 具有严格的碱基序列专一性, 能识别 DA 的特定位点 核酸和核苷酸的分解代谢核苷酸在代谢中的主要作用 1 核苷酸是核酸生物合成的前体 2 核苷酸衍生物是许多生物合成的活性中间物 3 ATP 是生物能量代谢中通用的高能化合物 4 腺苷酸是三种重要辅酶 (CoⅠ CoⅡ FM FAD 和 CoA) 的组分 5 某些核苷酸是代谢的调节物质 1 核苷酸的降解 核苷酶 : 核苷磷酸化酶 : 将核苷降解为含氮碱基, 同时生成戊糖的磷酸酯 核苷水解酶 : 水解核苷生成含氮碱基和戊糖 2 嘌呤碱的分解

16 PKU CCME CLUD 16 腺嘌呤的脱氨分解发生在核苷和核苷酸的水平上 ( 生成次黄嘌呤 ) 鸟嘌呤的脱氨分解主要是在鸟嘌呤脱氨酶的作用下进行的 鸟嘌呤 > 黄嘌呤 + 3 次黄嘌呤和黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下氧化成尿酸 3 嘧啶碱的分解 带氨基的嘧啶分解 2 胞嘧啶脱氨酶 AD(P) + + 二氢尿嘧啶脱氢酶 + AD(P) + 二氢嘧啶酶 2 2 C

17 PKU CCME CLUD 17 2 C 脲基丙酸酶 2 2 C + C 核苷酸的生物合成 1 从头合成途径 : 从一些简单的非碱基前体物质合成核苷酸 2 补救途径 : 利用外源或降解产生的碱基和核苷合成核苷酸 嘌呤核糖核苷酸的合成 从头合成 :C 2 甲酸盐 氨基酸 :Gln Asp 和 Gly 形成嘌呤环 次黄嘌呤核苷酸的合成 5- 磷酸核糖焦磷酸由 5- 磷酸核糖与 ATP 作用产生 次黄嘌呤核苷酸的合成分二个阶段 第一阶段 : 形成嘌呤碱基的咪唑环 1. 形成 5- 磷酸核糖胺 酶 : 磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶 结果在嘌呤环 9 位引入 原子, 特点是 : 核糖的构象变化,C1 位上的取代基转为 β 型 2. 生成甘氨酰胺核苷酸 酶 : 甘氨酸核苷酸合成酶 结果 : 掺入 Gly, 引入 C4,C5,7 特点 : 反应可逆,ATP 供能

18 PKU CCME CLUD 甲酰化产生甲酰甘氨酰胺核苷酸 酶 : 甘氨酰胺核苷酸转甲酰基酶, 结果生成 C8, 该 C 由甲酸盐提供 4. 生成甲酰甘氨眯核苷酸 酶 : 甲酰甘氨眯核苷酸合成酶 ; 5. 形成 5- 氨基咪唑核苷酸 结果 :Gln 提供 3 酶 : 氨基咪唑核苷酸合成酶 结果, 嘌呤碱的第一个环形成 第二阶段 : 完成嘌呤环形成次黄嘌呤核苷酸 6. 生成 5- 氨基咪唑 - 4- 羧酸核苷酸 酶 : 氨基咪唑核苷酸羧化酶 7. 形成 5- 氨基咪唑 - 4- (- 琥珀基 ) 氨甲酰核苷酸 结果 : 引入 C 2,C6 形成 ; 特点 : 反应可逆 酶 : 氨基咪唑琥珀基氨甲酰核苷酸合成酶 结果 :ASP 提供 1 位上的 1 原子 ; 特点 : 可逆 8. 脱琥珀酰基生成 5- 氨基咪唑 -4 氨甲酰核苷酸 酶 : 腺苷酸琥珀酸裂解酶 ; 特点 : 可逆 9. 甲酰化生成 5- 甲酰胺基咪唑 -4- 氨甲酰核苷酸 酶 : 氨基咪唑氨甲酰核苷酸转甲酰基酶, 结果, 甲酸盐提供了 C2 的碳 10. 环化形成次黄嘌呤核苷酸 酶 : 次黄嘌呤核苷酸合酶, 特点 : 反应可逆

19 PKU CCME CLUD 19 腺嘌呤核苷酸的合成 第一步 : 次黄嘌呤核苷酸与 Asp 反应生成腺苷酸琥珀酸 酶 : 腺苷酸琥珀酸合成酶, 特点 :GTP 提供能量 第二步 : 腺苷酸琥珀酸失去一分子延胡索酸形成腺嘌呤核苷酸 酶 : 腺苷酸琥珀酸裂解酶 鸟嘌呤核苷酸的合成 1. 氧化 : 次黄嘌呤核苷酸脱氢酶 酶 : 次黄嘌呤核苷酸脱氢酶 ;AD + 为辅酶,K + 为激活剂 2. 氨基化 酶 : 鸟嘌呤核苷酸合成酶 ;

20 PKU CCME CLUD 20 嘌呤核苷酸合成的补救途径 1 第一条补救途径 : 只有腺苷激酶 2 第二条补救途径 嘌呤核苷也可先分解成嘌呤碱基再通过上述途径形成核苷酸 嘌呤核苷酸生物合成的调节 产物的反馈抑制 : 嘌呤核苷酸的从头合成途径有三个调控位点, 最重要的控制位点是 5- 磷酸核糖胺的形成, 抑制 5- 磷酸核糖胺的形成 ( 磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶 ( 变构酶 ) ) 嘧啶核糖核苷酸的生物合成 从头合成途径 : 3 + C 2 + ATP + Asp > 嘧啶环 > 乳清苷酸 > 尿嘧啶核苷 酸 > 其他 尿苷酸的酶促合成共有 5 步反应 1. 氨甲酰磷酸将氨甲酰基转移给 Asp 形成氨甲酰天冬氨酸 2-2 P C C C 2 C 转氨甲酰酶 2 C C C C 2 C + Pi 酶 : 天冬氨酸转氨甲酰酶 2. 氨甲酰天冬氨酸环化生成二氢乳清酸 酶 : 二氢乳清酸酶 2 C C C 二氢乳清酸酶 C 2 C C + 2

21 PKU CCME CLUD 二氢乳清酸氧化生成乳清酸 酶 : 二氢乳清酸脱氢酶, 含铁的黄素酶 4. 乳清酸与 5- 磷酸核糖焦磷酸作用生成乳清苷酸, 此反应可逆 C P PPi 乳清苷酸焦磷酸化酶 PPi 2- C 3 P 酶 : 乳清苷酸焦磷酸化酶 (Mg 2+ 可以活化该反应 ) 5. 乳清苷酸脱羧形成尿嘧啶核苷酸 C 二氢乳清酸脱氢酶 AD + C 酶 : 乳清苷酸脱羧酶 胞嘧啶核苷酸的合成 :UTP >CTP 氨基由 Gln 提供,ATP 供能 补救途径 : 1) 由磷酸核糖转移酶催化直接由碱基形成 ( 只有尿嘧啶可行 ) 2) 尿嘧啶与 1- 磷酸核糖反应, 先形成尿苷, 再在尿苷激酶的作用下尿苷酸 ( 尿苷激酶能催化胞苷的磷酸化 ) 脱氧核糖核苷酸的合成 1. 核糖核苷酸的还原 DP (A G C U) >ddp (da dg dc du) 2. 胸腺嘧啶核苷酸 (dtmp) 的合成 3. 胸腺嘧啶核苷酸的合成由尿嘧啶脱氧核糖核苷酸 (dump) 甲基化得到 dump 可以由 C 乳清苷酸脱羧酶 尿嘧啶核苷二磷酸 2-3 P UDP 还原, 再通过尿嘧啶脱氧核苷三磷酸酶转变成 2-3 P dump -C 2

22 PKU CCME CLUD 22 DA 的复制复制 : 以 DA 分子为模板合成出相同分子的过程 转录 : 以 DA 分子为模板, 合成出具有互补核苷酸顺序的 RA 的过程 翻译 : 在 RA 指导下, 根据三联体密码规则合成出具有特定氨基酸顺序的蛋白质的过程 三联体密码规则 (triplet code): 核酸链上每三个核苷酸决定一个氨基酸 某些情况下,RA 也可以携带遗传信息, 如病毒 RA 能以自身为模板进行复制, 致癌 RA 病毒还能通过逆转录 (reverse transcription) 的方式将遗传信息传递给 DA DA 的半保留复制模板链 : 能提供合成一条互补链所需要的精确信息的核酸链 双链 DA 的两条链互为模板链 半保留复制 :( 依据 : 碱基配对原则 ) 定义 :DA 复制时, 氢键断裂, 双链分开, 每条链各自作为模板合成互补链, 最后得到结构完全一致的双链 DA, 而子代分子的一条链来自亲代分子, 另一条是新合成的结论 :DA 复制时, 原来的分子被分成二个亚单位, 分别构成子代分子的一半, 经多代复制后, 这些亚单位仍保持完整 DA 经多代复制仍可保持亚单位的完整是代谢稳定性的表现, 符合 DA 作为遗传物质的要求, 也是生物体利用半保留机制复制 DA 的原因之一 单链 DA 分子复制时通常也要先形成双链的复制形式 由此可见, 碱基配对是核酸分子间传递信息的结构基础 复制子和复制叉复制子 (replicon): 基因组能够独立进行复制的单位 复制的控制 : 复制子含有控制复制起始的起点, 可能还有终止复制的终点 复制的控制只表现在起始阶段, 一旦复制开始, 就会继续下去, 直至复制子完成复制 复制叉 : 新 DA 的合成与亲代 DA 的解链在同一部位同时进行, 使得 DA 复制生长点处形状为叉形, 称为复制叉 复制方向如果为双向, 则有两个复制叉或者生长点, 如果是单向的, 则只有一个复制叉或者生长点 原核生 DA 的复制 : 固定位置 ; 复制起始点只有 1 个, 复制方向单向或多向真核生物的复制 : 起始位置特定, 复制方向为单向或多向, 复制起点多个 取代环或 D- 环 (D loop) 方式 :( 环状 DA 复制时先复制其中一条, 完后在复制另一条 ) 特点 : 两条链的复制起点间隔一定距离, 两条链的合成是高度不对称的 DA 聚合酶和相关酶 DA 聚合酶的特点 : 催化已有链 5-3 延伸, 不能自身聚合 ; 需要引物 ;DA 聚合酶是模板指导的酶 ; 需要金属离子 DA 聚合反应五要素 : 底物 ; 模版 ; 引物 (3 - 的 RA( 体内 ) 或 DA( 体外 ) 短链 ); 金属离子 ( 镁 );DA 聚合酶 ( 催化底物加入引物链的 3 -) DA 聚合反应的特点 : 1) 以 dtp 为底物,dTP 提供碱基和能量 2) 接受模板的指导, 只有当进入的碱基能与模板形成 Watson-Crick 碱基对时,dTP 才能加入 3) 需要引物 3 - 的存在 4) 链生长方向为 5 3 5) 产物 DA 的性质与模板相同 ; 并且只取决于模板分子, 与聚合酶及底物的比例无关

23 PKU CCME CLUD 23 大肠杆菌 DA 聚合酶大肠杆菌共有 5 种不同的聚合酶, 称为 DA 聚合酶 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ DA 聚合酶 Ⅰ: 分子量 , 单一肽链, 含有一个 Zn 原子, 形状类似球体 在 37 下, 一分子 DA 聚合酶 Ⅰ 每分钟可以催化约 1000 个核苷酸聚合 DA 聚合酶 Ⅰ 是个多功能酶, 可以表现出多种酶活性 :ⅰ)DA 聚合酶活性 ;ⅱ)3 5 核酸外切酶活性 ;ⅲ)5 3 核酸外切酶活性 ( 双链 );ⅳ) 从 3 端使 DA 链发生焦磷酸解 ; ⅴ) 无机焦磷酸盐与脱氧核糖核苷三磷酸之间的焦磷酸基交换 3 5 外切酶活性具有核对功能, 对保持 DA 复制的忠实性具有十分重要的意义 2 次校对 :1) 聚合酶的选择作用 ;2)3 5 外切酶活性 DA 聚合酶 Ⅱ 和 Ⅲ: 酶 I 的复制幅度很慢, 不是真正的复制酶, 而是修复酶 DA 聚合酶 Ⅱ: 作用 : 以 dtp 为底物, 从 5 3 合成 DA, 引物为小缺口的双链 DA, 一分子酶每分钟催化约 2400 个核苷酸聚合具有 3 5 外切酶活性, 不具备 5 3 外切酶活力是修复酶 DA 聚合酶 Ⅲ: 由多个亚基组成 在 E.Coli 内真正起复制作用 DA 聚合酶 Ⅳ 和 Ⅴ: DA 聚合酶会停止复制, 而 DA 聚合酶 Ⅳ 和 Ⅴ 可以通过高突变率跳过障碍, 继续复制 主要功能 : 修复错误倾向, 它们可使修复准确性降低, 而导致高突变率 DA 连接酶 :DA 连接酶催化双链 DA 切口处的 5 - 磷酸基团和 3 - 共价连接生成磷酸 二酯键 连接反应需要能量,ATP 作能量 DA 的半不连续复制 DA 的半不连续复制 DA 在前导链上以 5 3 方向连续合成, 在滞后链上合成不连续, 且相反于复制叉前进方向 DA 在滞后链上以 5 3 方向形成许多不连续的小片段, 最后由 DA 连接酶连接成完整的 DA 链 DA 合成由 RA 引物引发 : (RA 酶催化的反应只需要模板, 不需要引物 ) 冈崎片段的合成 引物 :RA; 引物合成方向 :5 3, 与 DA 链互补 ; 催化引物合成的酶 : 引物合成酶 ; 引物长度 : 几个至十几个核苷酸 滞后链的合成 在 DA 聚合酶作用下, 从引物的 3 - 开始合成 DA 片段, 由 DA 聚合酶 Ⅰ 填补缺口, 消除引物, 最后由连接酶将各片段连接起来, 完成滞后链的合成 DA 复制的忠实性 : DA 聚合酶具有选择正确碱基的能力 ;DA 聚合酶具有自我核对功能 ; 消除 RA 引物 ( 不 好的拷贝, 被识别 ) DA 复制的拓扑性质 : 核酸的拓扑结构指核酸分子结构的空间关系

24 PKU CCME CLUD 24 DA 复制时首先要解开双链, 解链产生的扭曲张力不可能通过 DA 分子的高速旋转来释放, 而是通过拓扑异构酶来完成 DA 的复制过程复制有起始 延伸和终止三个阶段 ; 酶和蛋白质的协同作用, 它们分布在 DA 合成的生长点, 构成的复合物称复制体复制的起始 : 受其它蛋白的影响, 复制起点的部分序列变性, 成为开链复合物 ; 引物合成酶合成 RA 引物,DA 复制开始, 复制一旦发动, 通常会进行到底复制的延伸 : 前导链和滞后链的合成同时进行 ; 复制的终止 : 当两个复制叉在终止区相遇, 复制体解体, 两条亲代链解开, 但此时尚有 个碱基对未被复制, 它们将通过修复方式填补空缺 真核生物 DA 的复制真核生物 DA 复制的特点 :1) 复制速度比原核生物慢 ;2) 有多个复制起点, 可以分段复制 ;3) 复制完成前, 起点不再开始新的复制 ( 原核生物则可连续发动复制 ); 4) 采用更多的复制起点加速复制真核生物的 DA 聚合酶 : 真核生物的 DA 聚合酶有 α β γ δ 和 ε DA 聚合酶的共同性质 : 需要模板, 需要引物, 以 dtp 为底物, 依靠 Mg 2+ 激活, 链的延伸方向为 5 3 ; 主要区别 : 真核生物 DA 聚合酶一般无外切酶活力 DA 聚合酶 α: 具有引物合成酶的活性, 与 DA 聚合酶 δ 一起合成细胞核染色体 ; DA 聚合酶 β: 是修复酶 ; DA 聚合酶 γ: 是线粒体 DA 的合成酶 ; DA 聚合酶 ε: 是一种具有校对功能的修复酶, 相当于细菌 DA 聚合酶 Ⅰ; DA 聚合酶 δ: 有 3 5 外切酶活力, 有持续合成能力, 有校对功能 是真核生物 DA 复制的主要聚合酶 真核生物 DA 复制中前导链和滞后链的合成分别由两个 DA 聚合酶 δ 完成 真核生物 DA 的端粒结构真核生物染色体 DA 的两个末端都有一个特殊结构, 叫作端粒 (telomer), 该结构由许多成串的短的重复序列组成, 其中一条链富含 G, 互补链富含 C( 人的端粒为 TTAGGG) 功能 : 稳定染色体末端结构, 防止末端连接, 并且对线性分子可以补偿滞后链 5 - 末端 RA 引物消除后的空隙 端粒酶 : 逆转录酶, 分子内含一条 RA 链, 约 150 个碱基 DA 的端粒结构由端粒酶催化合成, 合成端粒结构时, 端粒酶以自身携带的 RA 5 端识别 DA 3 末端 端粒酶的作用 : 可以维持 DA 端粒结构的长度, 若端粒酶活性降低, 最终将导致细胞凋亡 端粒对细胞寿命有重要影响, 主要的肿瘤细胞都存在端粒酶活性 细胞周期 : 真核生物的细胞周期分四个时期 G1 S G2 M G1 期 :DA 复制准备期 细胞合成 DA 复制时所要求的蛋白质和 RA, 包括底物 DA 复制酶系 辅助因子和起始因子等 S 期 :DA 合成期 ( 约 7hr), 细胞 DA 开始复制, 顺序为先常染色质, 后异染色质 G2 期 : 细胞分裂准备期 ( 约为 4 小时 ), 有丝分裂前的准备期 M 期 : 有丝分裂期 ( 约 1hr), 细胞进行实质性的细胞分裂

25 PKU CCME CLUD 25 DA 的损伤及修复 DA 损伤的原因 : 复制时的碱基错配 ; 物理因素 ; 化学因素 ; 生物因素损伤 DA 的修复方式错配修复 :DA 复制时, 尽管聚合酶有双重校对功能, 仍然不能绝对避免随机的碱基错配, 而一旦错配发生, 就有可能导致基因突变 错配修复系统就是针对这种疏漏或其它原因导致的错配而进行的校正系统 主要有两步 :1) 模板链的识别关键 : 识别真正的模板链, 修复系统的识别能力来自于 DA 的自我标记 ;2) 修复过程 : 蛋白质 : 原核生物 :Mut L,Mut S; 真核生物 :hms 2 和 hml 1 直接修复 : 两个嘧啶碱基在光下的二聚作用 ; 光修复 ( 光激活 ) 和暗修复 ( 直接切除, 再合成 ) 切除修复 : 切除修复是指在一系列酶的作用下,DA 分子的损伤部位被识别和切除, 再以完整的链为模板修复合成出删除部分, 最后恢复 DA 正常结构的过程 参与切除修复的酶主要有 : 核酸内切酶 外切酶 聚合酶 连接酶 1) 碱基切除修复针对单个碱基缺陷进行的修复 2) 核苷酸切除修复当 DA 双螺旋结构变形较大时, 生物体采用核苷酸切除修复方式进行修复 核苷酸切除修复是由核酸内切酶在损伤部位两侧同时切开, 依靠解旋酶脱去切除部分, 再由聚合酶和连接酶修复 重组修复 : 结构损伤的 DA 复制时会跳过损伤部位, 子代链在相应处留下缺口, 并且无法以母链作模板, 于是它将同源 DA 的母链移至自身缺口处, 同源 DA 母链的缺口再通过聚合酶和连接酶修复, 该过程为重组修复, 也叫作复制后修复 ( 母链的损伤一直存在 ) 应急反应 (SS) 和易错修复应急反应 (SS): 许多能造成 DA 损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应, 称为应急反应

26 PKU CCME CLUD 26 RA 指导下的合成 逆转录逆转录指以 RA 为模板合成 DA 的过程, 催化逆转录反应的酶称 RA 指导的 DA 聚合酶 (RA-directed DA polymerase), 也称逆转录酶 (reverse transcriptase) 逆转录酶的性质逆转录酶具有与 DA 聚合酶相似的性质, 它催化的 DA 合成要求模板 引物 dtp Mg 2+ 或 Mn 2+, 链延长方向为 5 3 逆转录酶是一种多功能酶, 兼有三种酶活力 :1)RA 指导的 DA 聚合酶活力 利用 RA 作模板合成互补 DA;2)DA 指导的 DA 聚合酶活力 以新合成的 DA 为模板合成互补 DA;3)Rase 的活力 水解 RA-DA 分子中的 RA, 沿 3 5 和 5 3 方向起外切酶的作用 致癌病毒 RA 的逆转录过程致癌 RA 病毒都含有逆转录酶转录病毒的基因通常由两条相同的 (+)RA 链所组成, 当逆转录病毒侵染宿主细胞后, 病毒 RA 进入细胞, 开始逆转录过程 病毒 (+)RA( 模板 ) (-)DA (+)DA ssda 整合进入宿主染色体 DA 转录双链 DA 形成后, 即整合到宿主基因组中, 进入宿主的生活周期 整合是逆转录病毒生活周期中的必要步骤, 因为逆转录病毒 DA 只有在整合进宿主细胞的 DA 后才能转录 DA 指导下 RA 的合成 : 转录 :DA 指导下的 RA 的生物合成称为转录, 转录是以 DA 为模板通过 RA 聚合酶催化合成出与 DA 链碱基互补的 RA 链的过程 转录具有选择性 : 不同的时间, 不同的情况 RA 的转录过程 : RA 的转录从 DA 链上一个特定起点开始, 在终点处结束, 此转录区域称为一个转录单位 一个转录单位可以是一个基因, 也可以包含多个基因 1. 编码链和模板链

27 PKU CCME CLUD 27 生物体内的 DA 双链只有一条用于转录, 该链称模板链或负链 (- 链 ), 也叫有意义链 (sense strand), 另一条没有转录功能, 是编码链或正链 (+ 链 ), 也叫反意义链 (antisense strand) 在多基因的 DA 双链中, 每个基因的模板链并不总在同一条链上 编码链没 有转录功能, 但有复制功能 2. RA 转录的四要素 RA 转录通过 DA 指导的 RA 聚合酶来实现,RA 聚合酶以 TP 为底物, 需要 DA 链 作模板, 需要 Mg 2+ 促进聚合反应, 合成方向是 5-3, 焦磷酸分解提供的能量可推动反 应的进行 3. RA 转录与 DA 复制的区别 RA DA 酶 RA 聚合酶 DA 聚合酶 底物 TP dtp 引物 不需要 需要 模板 双链 DA 变性 DA 转录方式 全保留 半保留 RA 聚合酶的作用特点 : 与单链 DA 的结合不如与双链 DA 结合稳定 ; 具有解旋酶的作用, 自身可以局部解开双链 DA, 然后选择一条模板链合成相对应的 RA 链 ; 不需要引物 RA 聚合酶 1. 原核生物的 RA 聚合酶原核生物的 RA 聚合酶能催化所有类型的 RA 的生物合成 全酶 :5 个亚基 (α2ββ ς) 和 2 个 Zn 原子不含 ς 亚基的酶叫核心酶, 功能 : 类似于 DA 聚合酶, 延长已有的 RA 链, 但不能开始新的转录 只有全酶才能启动转录过程, 因此 ς 亚基也被称作转录过程的起始亚基 2. 原核生物 RA 聚合酶催化的转录反应转录过程 : 模板识别 转录起始 延伸 终止模板识别 RA 聚合酶在 ς 亚基引导下识别并结合启动子,DA 局部解链 起始阶段 在模板链上通过碱基配对合成最初的 RA 链 延伸阶段 核心酶向前移动,RA 链不断生长 终止阶段 RA 聚合酶到达基因转录终点,RA 和聚合酶从 DA 上脱落 ( us 因子识别终止子 ) 3. 真核生物的 RA 聚合酶根据它们对 α 鹅膏蕈碱的抑制作用不同, 可分为 RA 聚合酶 Ⅰ RA 聚合酶 Ⅱ 和 RA 聚合酶 Ⅲ 三类 1)RA 聚合酶 Ⅰ 对 α- 鹅膏蕈碱不敏感, 催化 rra 前体转录, 经加工后产生 5.8s 18s 和 28s rra 2)RA 聚合酶 Ⅱ 可被低浓度 ( mol/L)α- 鹅膏蕈碱抑制, 催化所有 mra 前体和大多数 snra 的转录 3)RA 聚合酶 Ⅲ 只被高浓度 ( mol/L)α- 鹅膏蕈碱抑制, 催化 tra 5srRA 和 snra 等小分子量 RA 的转录 真核生物 RA 聚合酶催化的转录过程与细菌类似, 但它不具有起始因子 ς 亚基, 不能启动转录过程 为了开始转录, 聚合酶首先要与各种转录因子在启动子上装配成活性转录复合物 转录过程经历的四个阶段分别是 : 装配 起始 延长和终止

28 PKU CCME CLUD 28 启动子和转录因子 : 启动子 :RA 聚合酶识别 结合和开始转录的一段 DA 序列, 启动子的结构不对称, 它能决定转录的方向转录因子 :RA 聚合酶开始转录所需要的辅助因子, 负责识别 DA 的作用位点或其它因子或 RA 聚合酶 启动子的共有序列 : 起点上游 -10bp 处有一个 6bp 的保守序列 TATAAT, 称 Pribnow box(-10 序列 ),-10 序列含较多 A-T 碱基对, 有利于 DA 局部解链 ;-10 序列的上游还有一个保守序列 TTGACA, 中心约在 -35bp 处, 叫作识别区或 -35 序列,-35 序列能够提供全酶的识别信号 ς 因子能直接和 -35 或 -10 序列结合 启动子的序列多种多样, 不同的 ς 因子识别不同的启动子 真核生物的启动子有三类, 分别由 RA 聚合酶 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 进行转录, 真核生物启动子通常 由一些短的保守序列组成 真核生物的启动子由转录因子而不是 RA 聚合酶识别, 多种转 录因子和 RA 聚合酶在起点处形成前起始复合物而促进转录 终止子和终止因子终止子 : 提供转录停止信号的 DA 序列 终止因子 : 协助 RA 聚合酶识别终止信号的辅助因子 抗终止因子 : 引起抗终止作用的蛋白质 抗终止因子能够阻止终止子的作用, 使酶越过终止子继续转录, 这一过程称为通读 DA 的转录终止信号可被 RA 聚合酶本身或其辅助因子识别, 终止信号位于已经转录的序 列当中 所有原核生物的终止子在终止点之前都有一个回文结构, 产生的 RA 可形成由茎 环组成的发夹结构, 此结构可使聚合酶减慢移动或暂停 RA 的合成 ρ 因子具有依赖于 RA 的 TPase 的活力, 当 ρ 与 RA 新生链结合时, 借助水解 TP 获得 的能量, 可以推动其沿 RA 链向前移动 当聚合酶遇到终止子而暂停时,ρ 就会追上酶, 两者相互作用的结果会使 RA 释放出来, 而 ρ 和 RA 聚合酶则离开 DA 转录过程的调控时序调控 : 在细胞生长 发育和分化过程中的不同阶段, 细胞会表达不同的基因 遗传信息按照一定的时间程序进行表达 适应调控 : 细胞根据内外条件不同表达不同的遗传信息, 基因的表达经历转录和翻译过程, 所以转录水平的调控是基因表达的关键环节 转录调控 : 主要发生在起始阶段和终止阶段 启动子是转录起始的控制部位, 启动子区存在调节因子结合位点, 当与调节因子结合时, 会促进 ( 正调节 ) 或抑制 ( 负调节 ) 转录的进行操纵子 (operon) 指细菌基因表达和调控的单位, 包括结构基因, 调节基因和由调节基因产物所识别的控制序列 通常在功能上彼此相关的编码基因串联在一起, 有共同的启动子并受操纵基因控制 当操纵基因与阻遏蛋白结合时, 邻近启动子的转录就被抑制 阻遏蛋白是负调控, 调节基因的产物可以是正调节因子, 也可以是负调节因子

29 PKU CCME CLUD 29 调节子 : 受一种调节蛋白控制的几个操纵子系统 综合性调控 : 如果一种调节蛋白控制几个不同代谢途径的操纵子, 构成一个复杂的调节网 络, 这样的调控系统称为综合性调控 终止子也是转录过程的可调控部位 在某些负责氨基酸合成的操纵子中有一类特殊序列 - 衰 减子, 该序列既是终止信号, 又是调节信号 真核生物与原核生物转录调节的主要区别 : 1) 原核生物功能相关的基因常常组织在一起构成操纵子, 作为基因表达和调节的单位 ; 真核生物没有操纵子, 每个基因拥有独立的启动子和调节元件各自转录 2) 与原核生物相比, 真核生物具有更多的上游调节元件, 并能独自活化基因 3) 无论是原核生物还是真核生物, 其转录受反式调节因子 ( 转录激活因子或抑制因子 ) 所调节, 受活性调节影响的调节因子在原核生物中以负调节为主, 而在真核生物中以正调节为主 4) 真核生物具有染色质结构, 基因活化前首先需要改变染色质状态 RA 生物合成的抑制剂 ( 结构 原理 ) 1. 嘌呤和嘧啶类似物化学结构与核酸的碱基类似, 能够抑制和干扰核酸的合成, 在体内的作用是 :1) 作为代谢拮抗物, 直接抑制与核苷酸生物合成有关的酶 ;2) 进入核酸分子中, 形成异常 DA 或 RA, 影响核酸功能, 并导致突变 S 2 硫鸟嘌呤 2.DA 模板功能的抑制剂 ( 烷基化试剂 ) 6- 巯基嘌呤在体内可转变为巯基核苷酸, 但不能进一步转变为 A 或 G, 从而抑制了嘌呤核苷酸的正常合成 8- 氮鸟嘌呤形成核苷酸后, 既可以抑制嘌呤核苷酸的生物合成, 还能够掺入 DA 或 RA 分子中, 抑制转录和翻译过程 5- 氟尿嘧啶进入体内能形成 F-dUMP, 该化合物抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶的活性, 使 T 的 合成受阻, 从而导致 DA 合成被抑制 2. DA 模板功能的抑制剂 ( 烷基化试剂 ) 与 DA 结合, 削弱使 DA 失去模板功能 2,6- 二氨基嘌呤烷基化试剂 使 DA 碱基烷基化, 烷基化后的碱基不稳定, 易被水解脱嘌呤, 从而削弱了 DA 的模板功 能, 干扰了 DA 的复制或者引起碱基错配 带双功能基团的烷基化试剂, 还会使 DA 双链 发生交联, 由此抑制模板功能 2 F 2 5- 氟尿嘧啶 6- 氮尿嘧啶 S 6- 巯基嘌呤

30 PKU CCME CLUD 30 RA 聚合酶的抑制剂 利福霉素, 不作用于 DA, 而特异地抑制细菌 RA 聚合酶活性, 因而抑制了细菌 RA 的 合成 在 RA 指导下 RA 和 DA 的合成 ( 一 ) RA 的复制 1. 噬菌体 Qβ RA 的复制本身就成为 mra, 可以进行病毒蛋白质的合成 ; 具有 mra 功能的链为正链, 互补链为负链 2. 病毒 RA 复制的主要方式 1) 病毒含正链 RA ( 噬菌体 Qβ 病毒 ) 2) 病毒含负链 RA 和复制酶 ( 狂犬病病毒 ) 3) 病毒含双链 RA 和复制酶 ( 呼肠孤病毒 ) 4) 致癌 RA 病毒 ( 白血病病毒 ) (+)RA (-)DA (±)DA mra ( 二 ) RA 的逆转录逆转录病毒通过病毒颗粒的表面蛋白和跨膜蛋白与宿主细胞融合, 将基因组 RA 和逆转录过程需要的引物及酶带入细胞质, 进行病毒 DA 的逆转录, 得到的 cda 进入细胞核, 依赖整合酶将 cda 整合到宿主染色体 DA 内成为前病毒 前病毒随宿主染色体 DA 复制和转录, 只有整合的前病毒 DA 转录出来的 mra 才能翻译出病毒蛋白质 翻译 : 以 mra 为模板合成蛋白质的过程 遗传密码 1. 遗传密码的基本特性 1) 密码的基本单位 : 密码的基本单位是按照 5 3 方向编码的不重叠 无标点的三联体密码子 不重叠 : 一个密码子的三个核苷酸不能再用其中任何一个核苷酸与前面或后面的核苷酸再组成新的密码子 ( 终止密码子 :UAA UAG UGA 起始密码子 :AUG(Met)) 2) 密码子的简并性除了色氨酸 Trp 和甲硫氨酸 Met 只有一个密码子编码外, 大多数氨基酸对应的密码子都不止一种 同一种氨基酸由两个或两个以上密码子编码的现象称密码子的简并, 编码相同氨基酸的密码子称同义密码子 密码简并的生物学意义 减少有害的突变, 有利于稳定物种 3) 密码子的变偶性 : 简并性一般只涉及第三位碱基, 所以密码子的专一性主要由前二位碱基决定 变偶性 : 第三位碱基可以在一定范围内变动而不影响所编码的氨基酸 3) 密码子的通用性 : 无论体内 体外, 从病毒到原核生物及至真核生物都可以近似使用

31 PKU CCME CLUD 31 同一套遗传密码 5) 密码的防错系统 : 生物体密码的编排具有防错功能 密码子编排中, 第三位碱基决定简并性, 第二位碱基常常可以决定氨基酸极性 此种功能可以使基因突变时不改变蛋白质结构, 或以物理性质最接近的氨基酸来取代, 以最大限度降低基因突变造成的影响 2. 基因突变的分子基础蛋白质结构变化的根本原因是 DA 分子结构的变化 基因突变 : 基因结构的改变 实质 :DA 碱基顺序 ( 密码子 ) 发生变化 结果 : 细胞合成的蛋白质可能不具有原来的生物功能 基突变分为四类 转换 : 同型碱基之间的置换, 即点突变, 是基因突变最普遍的方式 颠换 : 不同型碱基之间的置换 插入 : 在 DA 序列中插入一对或几对碱基 缺失 : 在 DA 序列中删除一对或几对碱基 碱基增删使得从碱基插入或删除的位点以后的密码子全部重新编排, 因而导致阅读框码的改变, 这叫做移码突变 移码突变常常是致死突变 与蛋白质生物合成有关的生物大分子 1. mra mra 以核苷酸的排列顺序储藏遗传信息, 它传递信息的手段是以自身为模板, 将密码子翻译成氨基酸, 合成肽链 遗传密码是连续阅读的, 组成读码框架 框架的 5 端以起始密码子 AUG 开始, 翻译出肽链的第一个氨基酸 - 蛋氨酸 ;3 端含一个或多个终止密码子 UAA UAG 和 UGA 以终止肽链合成 读码框架之外的序列叫非编码区, 它们常常可以调控信息的表达识别肽链的起始密码子 原核生物 : 在起始密码子上游安排一段特殊序列, 它们是核糖体的结合位点, 核糖体一旦与 mra 结合, 立刻可以正确识别附近的起始密码子从而发动翻译 真核生物 : 通过 mra 5 端的帽子结构增强核糖体对 mra 序列中核糖体进入部位的识别能力, 当核糖体能够正确地结合到核糖体进入部位, 就可以向 3 端逐一扫描至第一个起始密码子 AUG, 启动翻译过程 2.tRA :tra 在体内负责运送氨基酸 1)tRA 的接头作用 tra 相当于信息语言和功能语言之间的一个接头 两种语言之间的对应和翻译由 mra

32 PKU CCME CLUD 32 来完成, 而翻译的操作和两种语言间的连接由 tra 完成 tra 分子同时具有氨基酸结合部位和 mra 结合部位, 作为接头完成两种语言的转换,tRA 分子至少有四个位点与多肽合成有关 3 端 CCA 的氨基酸接受位点, 氨酰 tra 合成酶 识别位点, 核糖体识别位点, 反密码子位点 tra 凭借自身携带的反密码子识别 mra 上 的密码来运送氨基酸 识别专一性只与反密码子有关, 与所携带的氨基酸无关 2) 起始 tra (tra i Met ) 有一类功能特殊的 tra, 特异地识别 mra 上的起始密码子, 称起始 tra 起始 tra 都携带 Met, 所以新生肽链 末端均为 Met, 这类 tra 简写为 tra i Met 其它在蛋白质合成的延伸阶段起作用的 tra, 统称延伸 tra 原核生物蛋白质前体 端的 Met, 其 α-2 会被甲酰化, 得到甲酰甲硫氨酸 (fmet) 2. 核糖体及多核糖体核糖体 (ribosome) 是蛋白质生物合成的场所, 它是一个大的核糖核蛋白体, 是由几十种蛋白质和几种 RA 组成的一种亚细胞颗粒体 1) 核糖体的组成核糖体由一大一小两个亚基组成 原核细胞核糖体 大小亚基分别为 30S 和 50S,30S 亚基含 21 种蛋白质和一分子 16SrRA,50S 亚基含 34 种蛋白及 5S 和 23S rra 各一分子 真核细胞核糖体 大小亚基稍大, 分别为 40S 亚基和 60S 亚基 40S 亚基中含 30 多种蛋白质和一分子 18S rra;60s 亚基中有 50 多种蛋白质及 5S 28S rra 各一分子 哺乳类动物核糖体的 60S 大亚基中还有一分子 5.8S rra 2) 核糖体的结构两个亚基的接触面间空隙很大, 蛋白质的生物合成可能在这里发生 3) 多核糖体的结构多核糖体是由一个 mra 分子与一定数目的单个核糖体结合成的念珠状结构, 两个核糖体之间有一段裸露的 mra 多核糖体中每个核糖体可以独立完成一条肽链的合成, 所以多核糖体可以在一条 mra 上同时合成几条肽链, 使翻译效率得以提高 3. 氨酰 -tra 合成酶 2 2 P C C R AA-tRA 合成酶 P - R C C 2 tra 合成酶的特点 1) 具有很高的专一性 1 对氨基酸有极高的选择性 2 只作用于 L- 氨基酸, 不作用于 D- 氨基酸 3 专一性地识别与氨基酸相对应的 tra, 生成氨酰 -tra ( 氨酰 -tra 合成酶结构很复杂, 专一性极强 该酶有三个活性部位 :tra 识别部位 氨基酸识别部位 ATP 结合部位 ) 2) 具有纠错功能 ( 水解功能 ), 蛋白质生物合成的机制

33 PKU CCME CLUD 蛋白质合成的起始蛋白质的合成开始于起始复合物的形成, 首先是 mra 与核糖体 30S 亚基结合 原核细胞核糖体识别起始密码子的机制 mra 起始密码子 AUG 上游约 10 个碱基处的一段富含嘌呤的序列 (SD 序列 ) 与细菌 16S rra(30s 亚基 )3 端的 7 个嘧啶碱基互补 通过这种识别,mRA 与 30S 亚基结合, fmet 并且可以立刻发现附近的 AUG,AUG 再与 fmet-tra i 上的反密码子配对结合, 形成 30S 亚基 fmet-tra i fmet mra 复合物 然后 50S 亚基与复合物结合, 完成翻译的起始过程 起始过程需要起始因子的帮助,GTP 提供能量 2. 肽链的延伸 mra 的读码方向是 5 3, 肽链延伸方向是 端 C 端 肽链的延伸是诸多循环组成的过程, 每个循环都包括三个步骤 : 氨酰 - tra 的掺入 肽键形成和移位过程, 每次循环掺入一个氨基酸 ( 小基上 A 位点, 结合氨酰 tra,p 位点大基上, 结合的已形成的肽段和 tra 复合物 ) 1) 氨酰 -tra 的掺入 fmet 当 fmet-tra i 进入 A 位点, 完成起始过程后, 在 ATP 的作用下, 小亚基继续沿 mra 向 3 端移动一个密码子单位, 于是,fMet tra 占据了核糖体上的肽酰位点 (P 位点 ), 空着的氨酰位点 (A 位点 ) 则准备接受另一个氨基酸 -tra, 为肽链延伸作好了准备 肽链的延伸伴随着相应的氨酰 -tra 的反密码子与 AUG 相邻的密码子的识别过程 肽链 端第二个氨基酸由相应的 tra 携带, 通过识别 mra 的密码, 与 70S 核糖体 A 位点结合 2) 肽键的形成 Met 此时, 核糖体 P 位点由 Met-tRA i 占据,AA-tRA 携带第二个氨基酸进入 A 位点 3) 移位 (translocation) 当肽链在 A 位点上延长了一个氨基酸之后,P 位点的 tra 由于氨基酸的离去已无负载, 成为空的 tra, 自动离开核糖体 在移位因子催化下, 依靠 GTP 提供的能量, 核糖体可以沿 mra 从 5 3 相对移动一个密码子的距离 由于移动的结果, 原来的 A 位点成为现在的 P 位点, 并携带了一个二肽或多肽链, 而现在的 A 位点空出, 可以继续接受下一个与密码子对应的氨酰 -tra 如此每循环一次, 肽链增长一个氨基酸 3. 肽链的终止当肽链延伸过程循环至 mra 上出现终止密码子时, 终止密码子没有对应的 tra, 只有释放因子可以识别 A 位点上的终止密码子, 这将导致肽酰转移酶将水分子作为底物替

34 PKU CCME CLUD 34 代氨酰 -tra 进行水解反应, 然后肽链离去, 翻译过程结束 当新生肽链和 tra 离开核糖体,70S 核糖体立即与 mra 解离, 并且自身也解离成 50S 和 30S 亚基, 重新投入下一条肽链的合成 4. 蛋白质前体的加工 1) 切除 端的 Met 或 fmet: 蛋白质前体的 端永远是 fmet 或 Met, 需切去 端一个或几个氨基酸 2) 切除前体中不必需的肽段 : 如果前体分子的 C 端过长或内部肽段过长, 均需被切除 3) 形成二硫键 :mra 中没有胱氨酸的密码子, 但许多蛋白质含有胱氨酸二硫键, 需要通过二个半胱氨酸的 -S 氧化而来 4) 氨基酸的修饰 : 磷酰化 核糖体蛋白质, 糖基化 各种糖蛋白, 甲基化 组蛋白, 肌肉蛋白, 乙酰化 组蛋白, 羟基化 胶原蛋白