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梗裤刁
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1 蛋白质的生物合成氨基酸活化肽链的起始肽链的延伸肽链的终止新合成多肽链的折叠和加工

2 蛋白质合成各阶段的主要成分简表阶段必需组分 1. 氨基酸的活化 20 种氨基酸 20 种氨基酰 -trna 合成酶 20 种或更多的 trna ATP,Mg 肽链的起始 mrna N- 甲酰甲硫氨酰 -trna mrna 上的起始密码子 (AUG) 核糖体小亚基核糖体大亚基 GTP,Mg 2+ 起始因子 (IF-1,IF-2,IF-3) 3. 肽链的延伸功能核糖体 ( 起始复合物 ) AA-tRNA 伸长因子 GTP,Mg, 2+ 肽基转移酶 4. 肽链的终止 GTP mrna 上的终止密码子释放因子 (RF-1,RF-2,RF-3) 5. 折叠和加工参与起始氨基酸的切除修饰等加工过程的酶

3 1. 氨基酸的活化氨基酸必须在氨酰 -trna 合成酶的作用下生成活化氨基酸 AA-tRNA 20 种氨基酸 20 种氨酰 -trna 合成酶 20 种或更多的 trna ATP Mg 2+

4 * 同一氨酰 -trna 合成酶具有把相同氨基酸加到两个或更多个带有不同反义密码子 trna 分子上的功能真核生物起始 trna 是 Met-tRNA Met, 原核生物起始 trna 是 fmet-trna fmet trna 与相应氨基酸的结合是蛋白质合成中的关键步骤, 可确保多肽合成的准确性

5 2. 翻译的起始蛋白质合成的起始是指 : 在模板 mrna 编码区 5 端形成核糖体 - mrna- 起始 trna 复合物, 并将 ( 甲酰 ) 甲硫氨酸放入核糖体 P 位点

6 翻译的起始需要 mrna ( 甲酰 ) 甲硫氨酰 -trna mrna 上的起始密码子核糖体小亚基核糖体大亚基 GTP, Mg 2+ 起始因子

Three events must occur for translation to

ribosome; The ribosome must be precisely

7 Three events must occur for translation to be successfully initiated The ribosome must be recruited to the mrna; A charged trna must be placed into the P site of the ribosome; The ribosome must be precisely positioned over the start codon (This is critical).

8 翻译的起始原核生物 : 30 S 小亚基首先与 mrna 模板相结合, 再与 fmet-trna fmet 结合, 最后与 50 S 大亚基结合生成 70S mrna fmet-trna Met 起始复合物真核生物 : 40 S 小亚基首先与 Met-tRNA Met 相结合, 再与模板 mrna 结合, 最后与 60S 大亚基结合生成 80S mrna Met-tRNA trna Met 起始复合物

9 细菌的翻译的起始 30 S 小亚基模板 mrna fmet-trna fmet 3 个翻译起始因子,IF-1, IF-2, IF-3 GTP 50 S 大亚基 Mg 2+

10 A specialized trna (initiator trna) charged with a modified methionine (f-met) binds directly to the prokaryotic small subunit N- 甲酰甲硫氨酸

11 A special initiator trna starts the polypeptide chain

12 A model of initiation factor binding to the 30S ribosomal subunit IF1 防止 trna 结合到小亚基未来 A 位点的位置上 IF2 是 GTP 酶, 它与起始过程的 3 个主要成分相互作用, 催化 fmet-trna fmet i 和小亚基的结合, 并阻止其他负载 trna 与小亚基结合 IF3 结合于小亚基并阻止其与大亚基结合, 对新的循环至关重要

起始位点的性质, IF3 协助该亚基完成这种选择几乎所有原核生物 mrna 上都有一个 5 -AGGAGGU-3

13 The 16S rrna interacts with the ribosome binding site to position the AUG in the P site 30S 亚基具有专一性的识别和选择 mrna 起始位点的性质, IF3 协助该亚基完成这种选择几乎所有原核生物 mrna 上都有一个 5 -AGGAGGU-3 序列 (SD 序列 ), 这个富嘌呤区与 30S 亚基上 16S rrna 3 末端的富嘧啶区 5 - GAUCACCUCCUUA-3 相互补

14 细菌翻译的起始翻译起始复合物的形成 : 1. 30S 小亚基与翻译起始因子 IF-1, IF-3 结合, 通过 SD 序列与 mrna 模板相结合 2. fmet-trnatrna fmet 在 IF-2 的协同下进入小亚基的 P 位,tRNA 上的反密码子与 mrna 上的起始密码子配对 3. 带有 trna mrna 三个翻译起始因子的小亚基复合物与 50S 大亚基结合, 释放翻译起始因子

15 真核生物蛋白质生物合成的起始真核生物蛋白质生物合成的起始有其特点 : 核糖体较大, 有较多的起始因子, mrna 具有 m 7 GpppNp 帽子结构, mrna 分子 5 端的帽子和 3 端的多聚 A 都参与形成翻译起始复合物, Met-tRNA trna Met 不甲酰化, 40S 亚基对 mrna 起始密码子的识别经过扫描 (Scanning)

16 The 5 end of eukaryotic mrna is capped 真核 mrna 通过帽子结构 recruit 核糖体 (eif-4e 能专一地识别帽子结构 ), 起始反应. 帽子在 mrna 与 40 S 小亚基结合过程中起稳定作用. 带帽子的 mrna 5 端与 18 S rrna 的 3 端序列之间存在不同于带帽子的 mrna 5 端与 18 S rrna 的 3 端序列之间存在不同于 SD 序列的碱基配对型相互作用.

17 解开 mrna 末端的二级结构真核细胞内蛋白质合成的起始需要起始因子及一个特殊的起始 trna 43S 起始前复合体对 mrna 的识别是从对 5 帽结构的识别开始的该过程由 eif4f 介导 eif3 与 eif4f 相互作用募集 43S 起始前复合体到 mrna 上

18 Kozak 的扫描模型真核生物核糖体从 mrna 的 5 端 ( 帽子 ) 向包括 AUG 起始密码子的核糖体结合位点滑动依赖于 ATP G(A) 及 AUG 后面的 G 可十倍地影响翻译效率

19 真核细胞小亚基对起始 AUG 的识别由 eif4f 的 RNA 解旋酶所驱动起始密码子的识别是通过起始 trna 的反密码子和起始密码子之间的碱基配对作用 eif2 和 eif3 的脱离使得大亚基结合到小亚基上大亚基的结合刺激了 eif5b-gtp 的水解, 导致剩余起始因子释放

20 Translation initiation factors hold eukaryotic mrnas in circles 一旦核糖体完成了通过 poly-a 尾而环化的 mrna 的翻译, 新释放的核糖体被理想地置于同一 mrna 的起始翻译位点上, 提高 mrna 的翻译效率

21 3. 肽链的延伸生成起始复合物, 第一个氨基酸 (fmet/met-trna) 与核糖体结合以后, 肽链开始伸长按照 mrna 模板密码子的排列, 氨基酸通过新生肽键的方式被有序地结合上去肽链延伸中的每个循环都包括 : AA-tRNA 与核糖体结合 ; 肽键的生成 ; 移位

22 肽链的延伸需要功能核糖体 ( 起始复合物 ) AA-tRNA 伸长因子 GTP, Mg 2+ 肽基转移酶

23 1) 后续 AA-tRNA 与核糖体结合细菌中肽链延伸的第一步反应 : 新的氨酰 -trna 结合到 A 位该氨酰 -trna 首先与 EF- Tu GTP 形成复合物, 进入核糖体的 A 位, 水解产生 GDP 并在 EF- Ts 的作用下释放 GDP 并使 EF-Tu 结合另一分子 GTP, 进入新一轮循环

24 由于 EF-Tu 只能与 fmet-trna 以外的其他 AA-tRNA 起反应, 所以起始 trna 不会被结合到 A 位上, mrna 内部的 AUG 不会被起始 trna 读 mrna 内部的 AUG 不会被起始 trna 读出, 肽链中间不会出现甲酰甲硫氨酸

25 2) 肽键的生成在核糖体 mrna AA-tRNA 复合物中,AA-tRNA 占据 A 位,fMet- trna fmet 占据 P 位生长肽链的 C 端与 P 位的 trna 分离, 与新的氨基酸之间形成肽键构象的变化导致大亚基的移动, 使两个 trna 的 N 端移到大亚基的 E 和 P 位, 而在小亚基中它们仍位于 P 和 A 位

26 多肽链上肽键的形成缩合反应 Protein is synthesized in a N- to C- terminal direction Peptide bonds are formed by transfer of the growing peptide chain from peptidyl-trna trna to aminoacyl-trna.

27 核糖体利用多种机制选择排除错误的氨基酰 trna 入位 a. 只有当密码子和反密码子正确配对时,16S rrna 的两个腺嘌呤残疾与配对碱基对的小沟间形成额外的氢键 b. 正确的碱基配对使得结合氨基酰 trna 的 EF-Tu 与因子结合中心相互作用, 诱发 GTP 的水解和 EF-Tu 的释放 c. 只有碱基配正确的氨基酰 trna 在肽键形成过程中旋转进入正确位置, 才能保持与核糖体的结合

28 核糖体是核酶肽键的形成是由 23S rrna 组分催化的 : RNA 环绕着大亚基的肽转移酶中心 23S rrna 与处于 A 和 P 位点的 trna 的 CCA 末端之间的碱基配对, 帮助氨基酰 trna 的 α 氨基基团攻击结合于肽酰 -trna 的多肽的碳基团

29 3). 移位核糖体通过 EF-G 介导的 GTP 水解所提供的能量向 mrna 模板 3 末端移动一个密码子, 使两个 trna 完全进入 E 位和 P 位 ( 去氨酰 -trna 被挤入 E 位 ; 肽基 -trna 进入 P 位 ), mrna 上的第三位密码子对应于 A 位准备开始新一轮肽链延伸轮肽链延伸

30 用嘌呤霉素 (AA-tRNA 的结构类似物 ) 作为抑制剂做实验表明, 核糖体沿 mrna 移动与肽基 - trna 的移位这两个过程是耦联的肽链延伸是由许多个这样的反应组成的 : 原核生物中每次反应共需 3 个延伸因子,EF-Tu EF-Ts 及 EF-G, 真核生物细胞需 EF-1 及 EF-2, 消耗 2 个 GTP, 向生长中的肽链加上一个氨基酸

31 4. 肽链的终止需要 GTP mrna 上的终止密码子释放因子

32 4. 肽链的终止当终止密码子 UAA UAG 或 UGA 出现在核糖体的 A 位时, 没有相应的 AA- trna 能与之结合. 释放因子能识别这些密码子并与之结合, 水解 P 位上多肽链与 trna 之间的二酯键, 释放新生的肽链和 trna. 核糖体大小亚基解体, 蛋白质合成结束释放因子 RF 具有 GTP 酶活性, 它催化 GTP 水解, 使肽链与核糖体解离

33 释放因子 ( 终止因子 ) I 类释放因子 : 识别终止密码子, 能催化新合成的多肽链从 P 位点的 trna 中水解释放出来 ; II 类释放因子 : 在多肽链释放后刺激 I 类释放因子从核糖体中解离出来

34 细菌细胞 : RF1 (I 类 ) 能识别 UAG 和 UAA, RF2 (I 类 ) 识别 UGA 和 UAA 一旦 RF 与终止密码相结合, 它们就能诱导肽基转移酶把一个水分子而不是氨基酸加到延伸中的肽链上 RF3 (II 类 ) 与核糖体的解体有关真核细胞 : erf1 (I 类 ) 能识别三个终止密码子, erf3 (II 类 )

35 Overview of the events of translation Initiation Termination Elongation

36 Differences between bacteria and eukaryotes Bacteria Eukaryotes Ribosome: 30S+50S -> 70S Ribosome: 40S+60S-> 80S Few initiation factors: Many initiation factors IF-1(eIF1A), IF-2(eIF5B), IF- eif1, eif1a, eif2, eif2b, eif3, 3(?) eif4a, eif4b, eif4e, eif4f, Elongation factors eif4g, eif4h, eif5, eif5b, eif6 EF1A (EF-Tu), EF1B (EF-Ts), Elongation factors EF2 (EF-G) eef1, eef2 Release factors Release factors RF-1, RF2, RF3 erf1, erf3 mrna is not capped Most mrna is capped at 5 end and polyadenylated at 3 end Direct binding of 30S particle next to initiation codon (AUG) 40S particle is recruited to 5 cap at Shine-Dalgarno sequence, structure or poly(a) tail or an internal ribosome entry site (IRES) 5 -AGGAGGU-3 3 Translation is always (?) in Translation coupled to cytoplasm apart from transcription transcription

37 蛋白质前体的加工新生的多肽链大多数没有功能, 必须经过加工修饰才能转变为活性蛋白质蛋白质的前体加工包括 : N 端 fmet 或 Met 的切除二硫键的形成特定氨基酸的修饰切除新生肽链中的非功能片段

38 新生蛋白质经蛋白酶切割后变成有功能的成熟蛋白质左 : 新生蛋白质在去掉 N 端一部分残基后变成有功能的蛋白质右 : 某些病毒或细菌可合成无活性的多聚蛋白质, 经蛋白酶切割后成为有功能成熟蛋白

39 蛋白质前体的加工 1 N 端 fmet 或 Met 的切除无论原核生物还是真核生物,N 端的甲硫氨酸往往在多肽链合成完毕前就被一种氨肽酶切除

40 蛋白质前体的加工 2 二硫键的形成蛋白质的二硫键是蛋白质合成后通过两个半胱氨酸的氧化作用生成的二硫键的正确形成对稳定蛋白质的天然构象具有重要的作用

41 蛋白质前体的加工 3 特定氨基酸的修饰氨基酸侧链的修饰作用包括 : 磷酸化 ( 如核糖体蛋白质 ) 糖基化 ( 如各种糖蛋白 ) 甲基化 ( 如组蛋白 ) 乙酰化 ( 如组蛋白 ) 泛素化类泛素化羟基化 ( 如胶原蛋白 ) 羧基化等

42 磷酸化 (Phosphorylation) 主要由多种蛋白激酶催化, 发生在丝氨酸苏氨酸和酪氨酸等三种氨基酸的侧链 PKs (protein kinases) and PPs (protein phosphatases) mediate phosphorylation and dephosphorylation of proteins respectively.

43 糖基化糖蛋白主要是蛋白质侧链上的天冬氨酸丝氨酸苏氨酸残基加上糖基形成的 ; 内质网可能是蛋白质 N- 糖基化的主要场所所有的分泌蛋白和膜蛋白几乎都是糖基化蛋白质

44 4 切除新生肽链中非功能片段前胰岛素原蛋白翻译后成熟过程

45 蛋白质的折叠蛋白质折叠是翻译后形成功能蛋白质的必经阶段是一个复杂的过程 : 首先折叠成二级结构, 然后再进一步折叠盘绕成三级结构对于单链多肽蛋白质, 三级结构就已具有蛋白质的功能 ; 对于寡聚蛋白质, 仍需进一步组装成更为复杂的四级结构, 才能表现出天然蛋白的活性或功能

46 分子伴侣 (molecular chaperone) 分子伴侣是一类序列上没有相关性但有共同功能的保守性蛋白质, 它们在细胞内能帮助其它多肽进行正确的折叠组装运转和降解

47 分子伴侣控制蛋白质折叠时的相互作用蛋白质暴露的疏水区域能相互作用

48 伴侣蛋白在其内部对底物蛋白质进行折叠

49 分子伴侣的分类 (1) 热休克蛋白 (heat t shock protein) 它是一类应激反应性蛋白, 包括 HSP70 HSP40 和 GrpE 三族, 广泛存在于原核及真核细胞中三者协同作用, 促使某些能自发折叠的蛋白质正确折叠形成天然空间构象 (2) 伴侣素 (chaperonin) 包括 HSP60 和 HSP10( 原核细胞中的同源物分别为 GroEL 和 GroES), 它主要是为非自发性折叠蛋白提供能折叠形成天然结构的微环境

50 分子伴侣的作用伴侣分子在新生肽链折叠中的作用 : 防止或消除肽链的错误折叠, 增加功能性蛋白质折叠产率来发挥作用, 而非加快折叠反应速度, 分子伴侣本身并不参与最终产物的形成

51 蛋白质合成抑制剂蛋白质生物合成的抑制剂主要是一些抗生素, 如嘌呤霉素链霉素四环素氯霉素红霉素等此外,5-5 甲基色氨酸环已亚胺白喉毒素蓖麻蛋白和其他核糖体灭活蛋白都能抑制蛋白质的合成

52 蛋白质生物合成的抑制剂的作用原理阻止 mrna 与核糖体的结合 ; 阻止 AA-tRNA 与核糖体的结合 ; 阻止肽酰转移酶作用于核糖体 ; 干扰 AA-tRNA 与核糖体结合而产生错读 ; 阻止核糖体的移动 ; 作为竞争性抑制剂抑制蛋白质的合成.

53 链霉素链霉素是一种碱性三糖, 可以多种方式抑制原核生物核糖体 : 能干扰 fmet-trna 与核糖体的结合, 从而阻止蛋白质合成的正确起始, 也会导致 mrna 的错读若以多聚 (U) 作模板, 则除苯丙氨酸 (UUU) 外, 异亮氨酸 (AUU) 也会被掺入链霉素的作用位点在 30 S 亚基上

54 嘌呤霉素是 AA-tRNA 的结构类似物不需要延伸因子就可以结合在核糖体的 A 位上, 抑制 AA- trna 的进入它所带的氨基也能与生长中的肽链上的羧基反应生成肽键, 反应的产物是一条 3 羧基端挂了一个嘌呤霉素残基的小肽, 肽酰嘌呤霉素随后从核糖体上解离出来通过提前释放肽链来抑制蛋提前释放肽链来抑制蛋白质合成的

55 抗生素 : 目标和后果抗生素 / 毒素目标细胞分子目标后果氯霉素原核细胞 50S 亚基的肽基转移酶中心阻断 A 位点的氨基酰 trna 为进行肽基转移反应的正确定位四环素原核细胞 30S 亚基 A 位点抑制氨基酰 trna 结合到 A 位点潮霉素原核和真核细胞小亚基 A 位点附近阻挠 A 位点 trna 到 P 位点的移位嘌呤霉素原核和真核细胞大亚基的肽基转移酶中心链终止子 ; 模仿 A 位点的氨基酰 trna 的端, 作为新的多肽链的接受者红霉素原核细胞 50S 亚基的的多肽出口通道阻断成长中的多肽链从核糖体的出口, 阻遏翻译青霉素原核细胞作用于肽葡聚糖转肽酶抑制细菌细胞壁的合成链霉素原核细胞作用于 30S 亚基干扰氨基酰 trna 与核糖体的结合 ; 导致 mrna 的错读卡那霉素原核细胞作用于 30S 核糖体亚基干扰氨基酰 trna 与核糖体的结合, 使细菌蛋白质合成发生错误白喉毒素真核细胞化学修饰 EF-Tu 抑制 EF-Tu 的功能放线菌酮真核细胞 60S 亚基的肽基转移酶中心抑制肽基转移酶活性蓖麻毒素真核细胞 60S 亚基的肽基转移酶中心阻挠翻译因子 GTP 酶的活化

56 蛋白质运转机制由于细胞各部分都有特定的蛋白质组分, 因此合成的蛋白质必须准确无误地定向运送才能保证生命活动的正常进行

57 蛋白质在两种场所内合成大部分蛋白质是由细胞质中的核糖体合成的小部分蛋白质是由某些器官, 如线粒体叶绿体中的核糖体合成的在细胞质中合成的蛋白质根据其位置又分为 : 1 与膜结合的; 2 不与膜结合的

58 蛋白质怎样从合成的部位运送至功能部位的? 它们又是如何跨膜运送的? 跨膜之后又是依靠什么信息到达各自岗位?

59 两种运转机制 : 翻译运转同步机制 (co-translational) 某个蛋白质的合成和运转是同时发生的翻译后运转机制 (post-translational) ) 蛋白质从核糖体上释放后才发生的运转这两种运转方式都涉及到蛋白质分子内特定区域与细胞膜结构的相互关系

60 蛋白质合成和运转示意图进行翻译时运转的蛋白质 : 在合成过程中与内质网膜结合, 核糖体是膜结合的合成后, 蛋白质进入内质网, 经高尔基体后穿出细胞质膜如果这些蛋白质具有某种信号, 则可能驻留在运输途径中的某一环节, 也可直接定位于其它细胞器 ( 溶酶体等 ) 进行翻译后运转的蛋白质 : 在细胞质中游离核糖体上合成之后释放入细胞质, 其中一些具有线粒体定位信号或核定位信号

61 几类主要蛋白质的运转机制蛋白运转机制主要类型性质分泌蛋白质在结合核糖体上细胞因子生长因子免疫球蛋合成, 以翻译运转同步白卵蛋白水解酶激素等机制运输细胞器发育膜的形成蛋白质在游离核糖体上合成, 以翻译后运转机制运输两种机制兼有核叶绿体线粒体乙醛酸循环体过氧化物酶体等细胞器中的蛋白质质膜内质网类囊体中的蛋白质

62 翻译 - 运转同步机制蛋白质定位信息存在于自身结构中, 并通过与膜上特殊受体的相互作用得以表达, 即蛋白质通过其信号序列与膜或其它任何结构结合 --- 信号肽假说的基础蛋白质跨膜运转信号也是由 mrna 编码的

63 信号序列启动蛋白的运转信号序列 : 在起始密码子后, 有一段编码疏水性氨基酸序列的 RNA 区域, 这个氨基酸序列就被称为信号序列信号序列在结合核糖体上合成后便与膜上特定受体相互作用, 产生通道, 允许这段多肽在延长的同时穿过膜结构边翻译边跨膜运转

64 蛋白质通过其 N- 端的信号肽在内质网中运转到不同的细胞器绝大部分被运入内质网内腔的蛋白质都带有一个信号肽 (signal peptide), 位于蛋白质的氨基末端 (13-36 个残基 ): (1) 一般带有个疏水氨基酸 ; (2) 在靠近该序列 N- 端常常有 1 个或数个带正电荷的氨基酸 ; (3) 在其 C- 末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸, 离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链 ( 丙氨酸或甘氨酸 )

65 信号肽能够形成包括两个 α- 螺旋的发夹结构这一结构在信号识别颗粒 (signal recognition particle, 简称 SRP) 的帮助下插入到粗面内质网的膜中

66 signal recognition particle (SRP) SRP 是一个小的 RNA- 蛋白质复合体, 由约 300 个核苷酸的 7S RNA 和 6 种紧密结合的蛋白质 ( 分子量从 9~72KDa) 所组成在翻译过程中它能够识别信号序列, 指导核糖体到转运通道

67 SRP 可以分为两个结构域 : (1) 信号识别结构域 : 由 7S RNA 的大约第 100 至第 25 个核苷酸部分与 19KDa 54KDa 68KDa 和 72KDa 蛋白质所构成 (2) 延伸作用制动结构域 : 7S RNA 的其余部分 ( 相当于 Alu 序列 ) 与 9KDa 和 14KDa 蛋白质所构成, 其功能是使肽链的延伸暂停

68 SRP 和 DP 蛋白介导了蛋白质的跨膜运转过程 SRP( 信号识别蛋白 ) 能同时识别需要通过内质网膜进行运转的新生肽和自由核糖体, 并导致该多肽合成的暂时终止 ( 此时新生肽一般长约 70 个残基左右 ) SRP- 信号肽 - 多核糖体复合物即被引向内质网膜并与 SRP 的受体 Docking Protein( 停靠蛋白, 又称 SRP 受体蛋白 ) 相结合

69 SRP 和 DP 蛋白介导了蛋白质的跨膜运转过程蛋白质只有当 SRP 与 DP 相结合时, 多肽合成才恢复进行, 信号肽部分通过膜上的核糖体受体及蛋白运转复合物跨膜进入内质网内腔, 新生肽链重新开始延伸 SRP 与 DP 的结合很可能导致受体聚集而形成膜孔道, 使信号肽及与其相连的新生肽得以通过

70 蛋白质跨膜运转的信号肽假说及其运输过程

71 信号肽在蛋白质运输过程中的作用完整的信号肽是保证蛋白质运转的必要条件仅有信号肽还不足以保证蛋白质运转的发生还要求运转蛋白质在信号序列以外的部分有相应的结构变化信号序列的切除并不是运转所必需的并非所有的运转蛋白质都有可降解的信号肽信号肽 : 能启动蛋白质运转的任何一段多肽

72 新生蛋白质通过同步转运途径进入内质网内腔的主要过程

73 翻译后运转机制 1 线粒体蛋白质跨膜运转 2 前导肽的作用和性质 3 叶绿体蛋白质的跨膜运转

74 线粒体蛋白质的跨膜运转 1 被运转蛋白质大多数以前体形式存在 : 由成熟蛋白质和位于 N 端的前导肽 (leader peptide) p 组成 2 是一种需能过程 ; 来自线粒体 Hsp70 引发的 ATP 水解和膜电位差 3 运转时, 首先由外膜上的 Tom 受体复合蛋白识别与 Hsp70 或 MSF 等分子伴侣相结合为待运转多肽, 通过 Tom 和 Tim 组成的膜通道进入线粒体内腔

75 前导肽的作用与性质带正电荷的碱性氨基酸 ( 特别是精氨酸 ) 含量较为丰富, 分散于不带电荷的氨基酸序列之间 ; 缺少带负电荷的酸性氨基酸 ; 羟基氨基酸 (Ser 等 ) 含量较高 ; 有形成两亲 ( 既有亲水又有疏水部分 )α- 螺旋结构的能力

76 前导肽的不同区域可能在蛋白质跨膜运转过程中起不同的作用止运入肽段

77 叶绿体蛋白质的跨膜运转叶绿体多肽在胞质中的游离核糖体上合成后脱离核糖体并折叠成具有三级结构的蛋白质分子, 多某特定位点结合有叶体膜才多肽上某些特定位点结合于只有叶绿体膜上才有的特异受体位点

78 叶绿体定位信号肽一般有两个部分 : 第一部分决定该蛋白质能否进入叶绿体基质, 第二部分决定该蛋白能否进入类囊体

79 叶绿体蛋白质跨膜运转可溶性的活性蛋白水解酶位于叶绿体基质内, 这是鉴别翻译后运转的指标之一叶绿体膜上有识别叶绿体蛋白的特异性受体, 能够特异地与叶绿体蛋白的前体结合叶绿体蛋白质前体内可降解序列因植物和蛋白质种类不同而表现出差异

80 核定位蛋白的运转机制在细胞质中合成的蛋白质核孔细胞核

81 Nuclear pores are used for import and export

82 Nuclear pores are large symmetrical structures Nuclear pores appear as annular structures ( 环状八重对称结构 )

83 Transport receptors carry cargo proteins through h the pore A carrier protein binds to a substrate, moves with it through the nuclear pore, is released on the other side, and must be returned for reuse.

84 出核信号序列 NES (nuclear export sequences) NES: 疏水性氨基酸尤其是亮氨酸和异亮氨酸富集区域 CRM1 依赖型 : 被 CRM1 (chromosome region maintenance-1) 识别并结合, 从而携带蛋白出核此种出核能被 Leptomycine-B(LMB) 抑制 SHRIKESH SACHDEV, et al., MOLECULARAND CELLULAR BIOLOGY, 1998,

85 核定位序列 (NLS-Nuclear Localization Sequence) 为了核蛋白的重复定位, 这些蛋白质中的信号肽被称为核定位序列 (NLS) 一般都不被切除 NLS 可以位于核蛋白的任何部位蛋白质向核内运输过程需要核运转因子 (Importin)α β 和一个低分子量 GTP 酶 (Ran) 参与

86 核定位信号序列 NLS 经典 NLS 单分型 : 由 4~8 个 aa 组成的富含碱性氨基酸的短肽, K(K/R)X(K/R), 被入核因子识别并携带入核如 SV40-NLS ( 126 PKKKRKV 132 ) 双分型 : 由两簇碱性氨基酸组成, 两簇序列之间被 10~12 个非保守氨基酸残基间隔,R/K(X) RRKK 如 Nucleoplasmin: l KR-10aa-KKKL KKKL 171, P53: KR-12aa-KKK 321 非经典 NLS1: 如 I Bα, 包含于第二锚蛋白重复序列上, 疏水性氨基酸

87 核定位蛋白跨细胞核膜运转过程示意图 α 和 β 组成的异源二聚体是核定位蛋白的可溶性受体, 与核定位序列相结合的是 α 亚基这些蛋白组成的复合物停靠在核孔处, 依靠 Ran GTP 酶水解 GTP 提供的能量进入细胞核 α 和 β 亚基解离, 核蛋白与 α 亚基解离,α 和 β 分别通过核孔复合体回到细胞质中, 起始新一轮蛋白质运转

88 Bacteria use both co-translational and post-translational translocation Bacterial proteins may be exported either post-translationally or co-translationally, and may be located within either membrane or the periplasmic space, or may be secreted.

89 细菌中蛋白质的跨膜运转分子伴侣细胞膜运转复合物 SecA-SecYEGSecYEG

90 信号肽的功能

91 蛋白质的降解蛋白质降解是一个有序的过程 2004 年诺贝尔化学奖 : 阿龙切哈诺夫 ( 以色列 ) 阿夫拉姆赫尔什科 ( 以色列 ) 欧文罗斯 ( 美 ) 找到了人体细胞控制和调节某种人体蛋白质数量多少的方法他们发现, 人体细胞通过给无用蛋白质贴标签的方法, 帮助人体将那些被贴上标记的蛋白质进行废物处理, 使它们自行破裂自动消亡泛素调控的蛋白质降解具有重要的生理意义, 它不仅能够清除错误蛋白质, 对细胞生长周期 DNA 复制以及染色体结构都有重要的调控作用, 而且对于理解细胞的许多生理过程和新药的开发具有重要的意义

92 精细控制的蛋白质降解协助调控细胞内每种蛋白质的量 Active sites 大多数受损蛋白质在细胞质内, 由蛋白酶体所降解一个蛋白酶体含有一个中心圆柱个中, 由活性部位面向内腔的蛋白酶形成圆柱的两端各由大型蛋白质复合物塞住蛋白酶体如何选择细胞内的哪些蛋白质应进入圆柱并被降解?

93 泛素标记被降解的蛋白质将要被去除的蛋白质通过与被称为泛素的小蛋白共价结合而被标记, 蛋白酶体作用于被标记的蛋白质在大肠杆菌中, 许多蛋白质的降解是通过一个依赖于 ATP 的蛋白酶 ( 称为 Lon) 来实现的当细胞中存在有错误或半衰期很短的蛋白质时, 该蛋白酶就被激活每切除一个肽键要消耗两个分子 ATP

94 真核蛋白的降解依赖于一个只有 76 个氨基酸残基其序列高度保守的泛素 (Ubiquitin) 细胞内即将被降解的蛋白首先在 ATP 的作用下与泛素相连 ( 需要 E1( 连接泛素 ), E2( 负责将泛素从 E1 转移到底物 ), E3( 结合底物蛋白 ) 三个降解因子的参与 ), 并将该复合体运送到特定的蛋白降解体系 ( 蛋白酶体 ) 中直到完全降解

95 成熟蛋白 N- 端的第一个氨基酸 ( 除已被切除的 N 端甲硫氨酸之外, 但包括翻译后修饰产物 ) 在蛋白的降解中有着举足轻重的影响当某个蛋白质的 N 端是甲硫氨酸苷氨酸丙氨酸丝氨酸苏氨酸和缬氨酸时, 表现稳定其 N 端为赖氨酸精氨酸时表现最不稳定平均其 N 端为赖氨酸精氨酸时, 表现最不稳定, 平均 2-3 分钟就被降解了

96 蛋白质的半衰期与 N- 端氨基酸残基的关系稳定型残基 N- 端残基半衰期甲硫氨酸苷氨酸丙氨酸丝氨酸苏氨酸缬氨酸 >20h 不稳定型残基异亮氨酸谷氨酰胺 ~30min 酪氨酸谷氨酸脯氨酸 ~10min ~7min 亮氨酸苯丙氨酸 ~3min 天门冬酰胺赖氨酸精氨酸 ~2min

97 从 DNA 到蛋白质的产生需要很多步骤

98 泛素化 Ubiquitylation Ubiquitylation is the covalent attachment of ubiquitin to the ε-amino group of lysines via isopeptide bonds( 异肽键 ). Polymeric ubiquitin chains usually target proteins for proteasomal degradation, whereas monoubiquitylation can control various functions. A hierarchical cascade connecting an activating enzyme (E1) with several conjugating g enzymes (E2) and protein ligases (E3) mediates ubiquitin transfer to a protein.

99 Enzymes and reactions of the ubiquitin/proteasome system. The E1 catalyzes the formation of a ubiquitin thiol ester( 硫醇酯 )inan ATP-dependent reaction. The thiol-linked ubiquitin can then be transferred to an E2 in the conjugation reaction. The ligation reaction is promoted by ubiquitin ligases, or E3 proteins. Ubiquitination may be reversed by de-ubiquitinases (DUBs).

100 The crystal structures of E3 ligase and the complex of E3 ligase with its substrate SCFSkp2 E2 复合物的结构. DDB1 CUL4A ROC1 泛素连接酶与猴病毒 Zheng, et al., Nature, 2002, 5 的 V 蛋白复合物的晶体结构. 416:708.) Angers, et al., Nature, 2006, 443:590.

101 A Diverse Array of Ubiquitin Chain Linkages Can Lead to Different Outcomes for the Substrate Protein and Result in Different Cellular Responses

102 The regulation of p53 by the ubiquitin system illustrates the complex interplay between DUBs and E3 ligases By regulating p53 levels through their deubiquitinating activities, USP7 and USP2a y g g p g q g, may contribute to cancer pathogenesis. Therapeutic strategies that target these p53-specific DUBs are becoming important as cancer treatments.

103 TNF-receptor-1 and TLR4 IL-1- receptor-induced signaling pathways towards NF-kB activation

104 小泛素相关修饰物修饰 - 类泛素化修饰 (Sumoylation) SUMO (small ubiquitin-like modifier) modification is the covalent attachment of SUMO to lysine residues usually located within or near the consensus sequence ψ-k-x-e (where ψ, hydrophobic; x, any amino acid residue; K, lysine; E, glutamic acid). Although analogous to ubiquitin in biochemistry, the molecular role of SUMO conjugation is usually not the induction of protein degradation. Sumoylation rather alters protein interactions, protein localization liz and transport. rt Four different SUMO proteins have been discovered to date which are referred to as SUMO A hierarchical cascade connects the E1 activating enzyme AOS1-UBA2 with the E2 SUMO conjugase Ubc9, which catalyses the transfer of SUMO to a protein. E3 ligases enhance sumoylation in a more or less substrate-specific manner.

105 小泛素相关修饰物修饰 (Sumoylation) Ubiquitin and SUMO are synthesized as precursors and processed carboxyterminally by hydrolases s (vertical arrows) and are subsequently s conjugated to proteins involving activating (E1) and conjugating (E2) enzymes that form thioesters (S) with the modifiers.

106 Reversible modification of proteins by SUMO and its consequences ubiquitin Sumoylation either prevents ubiquitylation followed by degradation or results in the formation of protein complexes. Sumoylation requires AOS1/UBA2 and UBC9 enzymes; de-sumoylation is catalyzed by members of the ULP family.

107 SUMO 化修饰的生物学功能修饰许多在基因表达调控中其重要作用的蛋白 : 转录因子, 转录辅助因子和调控染色质结构的因子 (1) 影响蛋白的亚细胞定位 (2) 参与细胞内多条代谢途径蛋白质与蛋白质相互作用 DNA 结合信号转导核质运输转录因子激活等转录因子激活等

108 类泛素化修饰 Neddylation APPBP1/UBA3 UBC12 E3 Nd Nd ATP APPBP1/UBA3 s Nd UBC12 s Nd 底物 AMP+PPi PPi APPBP1/UBA3 UBC12 E3 NEDD8 (neural precursor cell-expressed ddevelopmentally tll downregulated 8) 分子是一类结构上与泛素相似的分子, 有 81aa, 参与蛋白质翻译后修饰, 这一过程被称为 Neddylation. Neddylation 的发生机制与泛素化相似, 需要 E1 E2 E3 介导的一系列酶促反应. Progress in Biochemistry and Biophysics 2009, 36(9): 1089~1094

109 类泛素化修饰 Neddylation Neddylation 是一个可逆的修饰过程, 分别在类泛素化 E3 连接酶和去 Neddylation 美的作用下完成 Neddylation 的通路 Progress in Biochemistry and Biophysics 2009, 36(9): 1089~1094

110 Proteins reported to be neddylated

111 Neddylation 的生物学功能与泛素化不同, Neddylation 修饰的蛋白质不像泛素化的蛋白质那样能被蛋白质酶体降解影响底物蛋白的稳定性, 而是仅作为一种活化信号. Neddylation 修饰的功能主要体现 : (1) 调节蛋白质之间的相互作用 (2) 调节转录因子的活性 (Mdm2, 2 p53 等 ) (3) 拮抗泛素化等.

112 NEDDylation 修饰研究展望 Neddylation 的 E2 酶只发现了一种 UBC12, 而泛素化有多种 E2 酶,Neddylation 是否还有其他的 E2? NEDD8 与泛素高度同源, 已知的 NEDD8 的 E3 酶只有几个, 并且目前发现的 E3 只对部分底物蛋白是必需的, 已知的能被 NEDD8 修饰的蛋白质也比被泛素修饰的蛋白质少得多, 更多的 Neddylation 修饰相关的 E3 连接酶? NEDD8 参与的 Neddylation 的过程关键位点是赖氨酸残基, 该残基同时也可以发生乙酰化甲基化和泛素化, 这些翻译后修饰的动态平衡与交互关系?

113 蛋白质泛素化和类泛素化修饰的生理效应 A) K48 的多聚泛素化 B) K63 的多聚泛素化 C) K29 的多聚泛素化 26S 蛋白酶体生理效应降解功能改变核孔复合物核内体的形成核内体溶酶体 D) 多聚泛素化 F) 偶联的单聚泛素化接合位点的形成 E) 单聚泛素化被修饰的蛋白转位 G) NEDDylation H) SUMOylation 细胞质细胞核

114 思考题 1. 遗传密码是怎样被破译的? 2. 遗传密码有那些特性? 简述密码的简并性生物体的生物学意义 3. 有几种终止密码子? 它们的序列和别名是什么? 4.tRNA 在组成和结构上有哪些特点? 5. 简述摆动学说 6.tRNA 是如何转运活化的氨基酸质 mrna 模板上的? 7. 原核与真核的核糖体组成有哪些异同点? 8. 什么是 SD 序列? 其功能是什么? 9. 核糖体有哪些活性中心? 10. 真核生物与原核生物在翻译的起始过程中有哪些区别? 11. 链霉素为什么能够抑制蛋白质的合成? 12. 哪些种类抗生素只能特异性地作用于原核生物核糖体? 哪些只作用于真核生物核糖体? 哪些既能抑制原核生物核糖体, 也能抑制真核生物核糖体 13. 什么是分子伴侣? 有哪些重要功能? 14. 什么是信号肽? 它在序列组成上有哪些特点? 有什么功能? 15. 简述叶绿体蛋白质的跨膜运转机制 16. 蛋白质有哪些翻译后的加工修饰? 其作用机制和生物学功能是什么? 17. 什么是核定位信号序列? 其主要功能是什么? 18. 什么是出核信号序列? 其序列组成由哪些特点? 主要功能是什么?

115 谢谢! 预祝大家期中取得好成绩!

蛋白质合成各阶段的主要成分简表阶段必需组分 1. 氨基酸的活化 20 种氨基酸 20 种氨基酰 -trna 合成酶 20 种或更多的 trna ATP,Mg 肽链的起始 mrna N- 甲酰甲硫氨酰 -trna mrna 上的起始密码子 (AUG AUG) 核糖体小亚基核糖体大亚基 G

蛋白质合成各阶段的主要成分简表阶段必需组分 1. 氨基酸的活化 20 种氨基酸 20 种氨基酰 -trna 合成酶 20 种或更多的 trna ATP,Mg 肽链的起始 mrna N- 甲酰甲硫氨酰 -trna mrna 上的起始密码子 (AUG AUG) 核糖体小亚基核糖体大亚基 G 蛋白质的生物合成氨基酸活化肽链的起始肽链的延伸肽链的终止新合成多肽链的折叠和加工蛋白质合成各阶段的主要成分简表阶段必需组分 1. 氨基酸的活化 20 种氨基酸 20 种氨基酰 -trna 合成酶 20 种或更多的 trna ATP,Mg 2+ 2. 肽链的起始 mrna N- 甲酰甲硫氨酰 -trna mrna 上的起始密码子 (AUG AUG) 核糖体小亚基核糖体大亚基 GTP,Mg