减色效应 (Hypochromatic effect) 随着 DNA 的复性,260nm 紫外线吸收值降低的现象 2) C 值反常现象 (C-value paradox) C 值是一种生物的单倍体基因组 DNA 的总量 真核细胞基因组的最大特点是它含有大量的重复序列, 而且功能 DNA 序列大多被不

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1 第二章染色体与 DNA 染色体 (chromosome) 是细胞在有丝分裂时遗传物质存在的特定形式, 是间期细胞染色质结构紧密包装的结果 真核生物的染色体在细胞生活周期的大部分时间里都是以染色质 (chromatin) 的形式存在的 染色质是一种纤维状结构, 叫做染色质丝, 它是由最基本的单位 核小体 (nucleosome) 成串排列而成的 原核生物 (prokaryote) :DNA 形成一系列的环状附着在非组蛋白上形成类核 染色体由 DNA 和蛋白质组成 蛋白质由非组蛋白和组蛋白 (H1,H2A,H2B,H3,H4) DNA 和组蛋白构成核小体 组蛋白的一般特性 :P24 1 进化上的保守性 2 无组织特异性 3 肽链氨基酸分布的不对称性 : 碱性氨基酸集中分布在 N 端的半条链上 4 组蛋白的可修饰性 : 甲基化 乙基化 磷酸化及 ADP 核糖基化等 5 H5 组蛋白的特殊性 : 富含赖氨酸 (24%)( 鸟类 鱼类及两栖类红细胞染色体不含 H1 而带有 H5) 组蛋白的可修饰性在细胞周期特定时间可发生甲基化 乙酰化 磷酸化和 ADP 核糖基化等 H3 H4 修饰作用较普遍,H2B 有乙酰化作用 H1 有磷酸化作用 所有这些修饰作用都有一个共同的特点, 即降低组蛋白所携带的正电荷 这些组蛋白修饰的意义 : 一是改变染色体的结构, 直接影响转录活性 ; 二是核小体表面发生改变, 使其他调控蛋白易于和染色质相互接触, 从而间接影响转录活性 2 DNA 1) DNA 的变性和复性 变性 (Denaturation) DNA 双链的氢键断裂, 最后完全变成单链的过程称为变性 增色效应 (Hyperchromatic effect) 在变性过程中,260nm 紫外线吸收值先缓慢上升, 当达到某一温度时骤然上升, 称为增色效应 融解温度 (Melting temperature,tm ) 变性过程紫外线吸收值增加的中点称为融解温度 生理条件下为 影响因素 :G+C 含量,pH 值, 离子强度, 尿素, 甲酰胺等 复性 (Renaturation) 热变性的 DNA 缓慢冷却, 单链恢复成双链

2 减色效应 (Hypochromatic effect) 随着 DNA 的复性,260nm 紫外线吸收值降低的现象 2) C 值反常现象 (C-value paradox) C 值是一种生物的单倍体基因组 DNA 的总量 真核细胞基因组的最大特点是它含有大量的重复序列, 而且功能 DNA 序列大多被不编码蛋白质的非功能 DNA 所隔开, 这就是著名的 C 值反常现象 ( 四 ) 核小体 (nucleosome): 用于包装染色质的结构单位, 是由 DNA 链缠绕一个组蛋白核 [(H2A H2B H3 H4)*2 的八聚体 构成的 1 原核生物基因组结构特点 基因组很小, 大多只有一条染色体 结构简炼 存在转录单元 (trnascriptional operon) 多顺反子 (polycistron) 重叠基因由基因内基因 部分重叠基因 一个碱基重叠组成 2 真核生物基因组结构特点 真核基因组结构庞大 3 109bp 染色质 核膜 单顺反子 基因不连续性断裂基因 (interrupted gene) 内含子 (intron) 外显子 (exon) 非编码区较多多于编码序列 (9:1) 含有大量重复序列 不重复序列 / 单一序列 : 在基因组中有一个或几个拷贝 真核生物的大多数基因在单倍体中都是单拷贝的 如 : 蛋清蛋白 血红蛋白等功能 : 主要是编码蛋白质 中度重复序列 : 在基因组中的拷贝数为 101~104 如 :rrna trna 一般是不编码蛋白质的序列, 在调控基因表达中起重要作用 高度重复序列 : 拷贝数达到几百个到几百万个 卫星 DNA:A T 含量很高的简单高度重复序列 1 DNA 的一级结构 : 指 4 种脱氧核苷酸的连接及其排列顺序,DNA 序列是这一概念的简称 碱基序列 2) 特征 : 双链反向平行配对而成 脱氧核糖和磷酸交替连接, 构成 DNA 骨架, 碱基排在内侧 内侧碱基通过氢键互补形成碱基对 (A:T,C:G) 2 DNA 的二级结构 : 指两条多核苷酸链反向平行盘绕所产生的双螺旋结构

3 2) 分类 : 右手螺旋 :A-DNA,B-DNA 左手螺旋 :Z-DNA 3 DNA 的高级结构 : 指 DNA 双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构 是一种比双螺旋更高层次的空间构象 2) 主要形式 : 超螺旋结构 ( 正超螺旋和负超螺旋 ) ( 一 )DNA 的半保留复制 (semi-nservative replication) 1 定义: 由亲代 DNA 生成子代 DNA 时, 每个新形成的子代 DNA 中, 一条链来自亲代 DNA, 而另一条链则是新合成的, 这种复制方式称半保留复制 3 DNA 半保留复制的生物学意义 :DNA 的半保留复制表明 DNA 在代谢上的稳定性, 保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代 ( 二 ) 与 DNA 复制有关的物质 1 原料: 四种脱氧核苷三磷酸 (datp dgtp dctp dttp) 2 模板: 以 DNA 的两条链为模板链, 合成子代 DNA 3 引物:DNA 的合成需要一段 RNA 链作为引物 4 引物合成酶( 引发酶 ): 此酶以 DNA 为模板合成一段 RNA, 这段 RNA 作为合成 DNA 的引物 (Primer) 实质是以 DNA 为模板的 RNA 聚合酶 5 DNA 聚合酶 : 以 DNA 为模板的 DNA 合成酶 以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物 反应需要有模板的指导 反应需要有 3 -OH 存在 DNA 链的合成方向为 5 3 性质聚合酶 Ⅰ 聚合酶 Ⅱ 聚合酶 Ⅲ 3' 5 ' 外切活性 ' 3 ' 外切活性 ' 3' 聚合活性 + 中 + 很低 + 很高新生链合成 聚合酶 Ⅰ 主要是对 DNA 损伤的修复 ; 以及在 DNA 复制时切除 RNA 引物并填补其留下的空隙 聚合酶 Ⅱ 修复紫外光引起的 DNA 损伤聚合酶 Ⅲ DNA 复制的主要聚合酶, 还具有 3 5 外切酶的校对功能, 提高 DNA 复制的保真性 6 DNA 连接酶 (1967 年发现 ): 若双链 DNA 中一条链有切口, 一端是 3 -OH, 另一端是 5 - 磷酸基, 连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键, 而使切口连接

4 但是它不能将两条游离的 DNA 单链连接起来 DNA 连接酶在 DNA 复制 损伤修复 重组等过程中起重要作用 7 DNA 拓扑异构酶 (DNA Topisomerase): 拓扑异构酶 І: 使 DNA 一条链发生断裂和再连接, 作用是松解负超螺旋 主要集中在活性转录区, 同转录有关 例 : 大肠杆菌中的 ε 蛋白拓扑异构酶 Ⅱ: 该酶能暂时性地切断和重新连接双链 DNA, 作用是将负超螺旋引入 DNA 分子 同复制有关 例 : 大肠杆菌中的 DNA 旋转酶 8 DNA 解螺旋酶 / 解链酶 (DNA helicase): 通过水解 ATP 获得能量来解开双链 DNA E.coli 中的 rep 蛋白就是解螺旋酶, 还有解螺旋酶 I II III rep 蛋白沿 3 5 移动, 而解螺旋酶 I II III 沿 5 3 移动 9 单链结合蛋白(SSBP-single-strand binding protein): 稳定已被解开的 DNA 单链, 阻止复性和保护单链不被核酸酶降解 ( 三 )DNA 的复制过程 ( 大肠杆菌为例 ) 双链的解开 RNA 引物的合成 DNA 链的延伸 切除 RNA 引物, 填补缺口, 连接相邻的 DNA 片段 1 双链的解开 ftju 制有特定的起始位点, 叫做复制原点 ori( 或 o) 富含 A T 的区段 从复制原点到终点, 组成一个复制单位, 叫复制子复制时, 解链酶等先将 DNA 的一段双链解开, 形成复制点, 这个复制点的形状象一个叉子, 故称为复制叉双链解开 复制起始 P44 大约 20 个 DnaA 蛋白在 ATP 的作用下与 oric 处的 4 个 9bp 保守序列相结合在 HU 蛋白和 ATP 的共同作用下,Dna 复制起始复合物使 3 个 13bp 直接重复序列变性, 形成开链解链酶六体分别与单链 DNA 相结合 ( 需 DnaC 帮助 ), 进一步解开 DNA 双链 2 RNA 引物的合成 DnaB 蛋白活化引物合成酶, 引发 RNA 引物的合成 引物长度约为几个至 10 个核苷酸, 3 DNA 链的延伸 DNA 的半不连续复制 (semi-discontinuous replication):dna 复制

5 时其中一条子链的合成是连续的, 而另一条子链的合成是不连续的, 故称半不连续复制 在 DNA 复制时, 合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为前导链 ; 合成方向与复制叉移动的方向相反, 形成许多不连续的片段, 最后再连成一条完整的 DNA 链为滞后链 在 DNA 复制过程中, 前导链能连续合成, 而滞后链只能是断续的合成 5 3 的多个短片段, 这些不连续的小片段称为冈崎片段 4 切除 RNA 引物, 填补缺口, 连接相邻的 DNA 片段 ( 复制终止 ) 当复制叉遇到约 22 个碱基的重复性终止子序列 (Ter) 时,Ter-Tus 蛋白复合物能使 DnaB 不再将 DNA 解链, 阻挡复制叉继续前移 P47 在 DNA 聚合酶 Ⅰ 催化下切除 RNA 引物 ; 留下的空隙由 DNA 聚合酶 Ⅰ 催化合成一段 DNA 填补上 ; 在 DNA 连接酶作用下, 连接相邻的 DNA 链 ( 四 ) 复制的几种主要方式 P42 1 双链环状 θ 型复制 双向等速 2 滚环型 : (1) 模板链和新合成的链分开 ; (2) 不需 RNA 引物, 在正链 3 -OH 上延伸 (3) 只有一个复制叉 ; 3 D 环复制 --- 单向复制的特殊方式如 : 动物线粒体 DNA ( 五 ) 真核生物中 DNA 的复制特点 1 真核生物每条染色体上有多个复制起点, 多复制子 ( 约 150bp 左右 ); 2 复制叉移动的速度较慢 ( 约 50bp/ 秒 ), 仅为原核生物的 1/10 3 真核生物染色体在全部复制完之前, 各个起始点不再重新开始 DNA 复制 ; 真核生物快速生长时, 往往采用更多的复制起点 4 真核生物有多种 DNA 聚合酶 5 真核生物 DNA 复制过程中的引物及冈崎片段的长度均小于原核生物 ( 真核冈崎片段长约 bp, 原核冈崎片段长约 bp ) ( 六 ) 原核和真核生物 DNA 的复制特点比较 1 复制起点 (ori): 原核一个, 真核多个 ; 2 复制子 : 原核一个, 真核多个 ; 3 复制子长度 : 原核长 ; 真核短 ; 4 复制叉 : 原核多个 ; 真核多个 ; 5 复制移动速度 : 原核较快 ; 真核较慢 ; 6 真核生物染色体在全部完成复制前, 各起始点的 DNA 复制不能再开始 而在快速生长的原核生物中, 复制起点上可以连

6 续开始新的 DNA 复制 7 原核生物染色体的复制与细胞分裂同步, 可以多次复制 ; 真核生物染色体的复制发生在 S 期, 是细胞分类的特定时期, 而且仅此一次 四 DNA 的修复 DNA 修复系统功能错配修复恢复错配碱基切除修复切除突变的碱基核甘酸切除修复修复被破坏的 DNA DNA 直接修复 SOS 系统 修复嘧啶二体或甲基化 DNA DNA 的修复, 导致变异 1 错配修复 (mismatch repair) Dam 甲基化酶使母链位于 5 GATC 序列中腺甘酸甲基化 甲基化紧随在 DNA 复制之后进行 ( 几秒种后至几分钟内 ) 根据复制叉上 DNA 甲基化程度, 切除尚未甲基化的子链上的错配碱基 2 碱基切除修复 excision repair 所有细胞中都带有不同类型 能识别受损核苷酸位点的糖苷水解酶, 它能特意切除受损核苷酸上的 N-β- 糖苷键, 在 DNA 链上形成去嘌呤或去嘧啶位点, 统称为 AP 位点 一些碱基在自发或诱变下会发生脱酰胺, 然后改变配对性质, 造成氨基转换突变 * 腺嘌呤变为次黄嘌呤与胞嘧啶配对 * 鸟嘌呤变为黄嘌呤与胞嘧啶配对 * 胞嘧啶变为尿嘧啶与腺嘌呤配对 3 核苷酸切除修复 1) 通过特异的核酸内切酶识别损伤部位 2) 由酶的复合物在损伤的两边切除几个核苷酸 3) DNA 聚合酶以母链为模板复制合成新子链 4)DNA 连接酶将切口补平 4 DNA 的直接修复在 DNA 光解酶的作用下将环丁烷胸腺嘧啶二体和 6-4 光化物还原成为单体甲基转移酶使 O6- 甲基鸟嘌呤脱甲基生成鸟嘌呤, 防止 G-T 配对 SOS 反应 (SOS response): 是细胞 DNA 受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下, 细胞为求生存而产生的一种应急措施

7 * 包括诱导 DNA 损伤修复 诱变效应 细胞分裂的抑制以及溶原性细菌释放噬菌体等 细胞癌变也与 SOS 反应有关 两个作用 (1) DNA 的修复 ;(2) 产生变异五 DNA 的转座 DNA 的转座或叫移位 (transposition): 由可移位因子 (transposable element) 介导的遗传物质重排现象 转座子 (transposon Tn): 存在于染色体 DNA 上可自主复制和位移的基本单位 已经发现 转座 这一命名并不十分准确, 因为在转座过程中, 可移位因子的一个拷贝常常留在原来位置上, 在新位点上出现的仅仅是它的拷贝 因此, 转座有别于同源重组, 它依赖于 DNA 复制 原核生物转座子的类型 : 1 插入序列 (IS) IS 是最简单的转座子, 不含有任何宿主基因, 它们是细菌染色体或质粒 DNA 的正常组成部分 2 复合转座子 (composite transposon) 复合转座子是一类带有某些抗药性基因 ( 或其他宿主基因 ) 的转座子, 其两翼往往是两个相同或高度同源的 IS 序列 3 TnA 家族 TnA 家族没有 IS 序列 体积庞大 (5000bp 以上 ) 带有 3 个基因, 其中一个编码 β- 内酰胺酶 (AmpR), 另两个则是转座作用所必须的 ( 三 ) 转座作用的机制 转座时发生的插入作用的普遍特征, 是受体分子中有一段很短的 (3~l2bp) 被称为靶序列的 DNA 会被复制, 使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间 对于一个特定的转座子来说, 它所复制的靶序列长度是一样的, 如 IS1 两翼总有 9 个碱基对的靶序列, 而 Tn3 两端总有 5bp 的靶序列 靶序列的复制可能起源于特定内切酶所造成的黏性 DNA 末端 ( 三 ) 转座作用的遗传学效应 p63 (1) 转座引起插入突变 (2) 转座产生新的基因 (3) 转座产生的染色体畸变 (4) 转座引起的生物进化反转录转座子 (retrotransposon): 指通过 RNA 为中介, 反转录成 DNA 后进行转座的可动元件 第三章生物信息的传递 ( 上 ) 从 DNA 到 RNA 转录 (transcription) : 生物体以 DNA 为模板合成 RNA 的过程

8 参与转录的物质 原料 : NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板 :DNA 酶 : RNA 聚合酶 其他蛋白质因子 RNA 合成方向 :5' 到 3' 转录的不对称性 : 在 RNA 的合成中,DNA 的二条链中仅有一条链 可作为转录的模板, 称为转录的不对称性 与 mrna 序列相同的那条 DNA 链称为编码链 ; 将另一条根据碱基 互补原则指导 mrna 合成的 DNA 链称为模板链 DNA 分子上转录出 RNA 的区段, 称为结构基因 转录单元 (transcription unit) 一段从启动子开始至终止子结束的 DNA 序列 二 参与转录起始的关键酶与元件 ( 一 ) RNA 聚合酶 原核生物 RNA 聚合酶 ( 大肠杆菌为例 )--- 全酶 = 核心酶 + σ 因子 亚 基因相对分亚基组分 功能 基 子量 数 α rpoa 核心酶核心酶组装, 启动子识别 β rpob 核心酶 β 和 β' 共同形成 β' rpoc 核心酶 RNA 合成的活性中心 ω? 核心酶? ( 需 查 ) rpod σ 因子存在多种 σ 因子, σ 用于识别不同的启 动子 真核细胞的三种 RNA 聚合酶特征比较 转录产相对活对 α- 鹅膏蕈碱酶位置物性的敏感性 RNA 聚核仁 rrna 50-70% 不敏感合酶 Ⅰ RNA 聚核质 hnrna 20-40% 敏感合酶 Ⅱ

9 RNA 聚存在物种特异核质 trna 约 10% 合酶 Ⅲ 性 RNA 聚合酶与 DNA 聚合酶的区别 RNA 聚合酶 DNA 聚合酶大小 (M) 大, dol 小, dol 引物无有产物较短, 游离较长, 与模板以氢键相连作用方式一条链的某一段两条链同时进行外切酶活性无 5 3, 3 5 校对合成能无有力修复能力无有 ( 二 ) 启动子 (promoter) 启动子定义 : 指能被 RNA 聚合酶识别 结合并启动基因转录的一段 DNA 序列 TATA 区 : 酶的紧密结合位点 ( 富含 AT 碱基, 利于双链打开 ) TTGACA 区 : 提供了 RNA 聚合酶全酶识别的信号转录起点 --- 与新生 RNA 链第一个核甘酸相对应 DNA 链上的碱基 真核生物启动子的结构核心启动子 (core promoter) 定义 : 指保证 RNA 聚合酶 Ⅱ 转录正常起始所必需的 最少的 DNA 序列, 包括转录起始位点及转录起始位点上游 TATA 区 作用 : 选择正确的转录起始位点, 保证精确起始 2 上游启动子元件 包括 CAAT 盒 (CCAAT) 和 GC 盒 (GGGCGG) 等 作用 : 控制转录起始频率 ( 三 ) 转录起始复合物 --- 二元闭合复合物 二元开链复合物 三元复合物 ( 原核 ) 三 转录的基本过程 1 起始位点的识别:RNA 聚合酶与启动子 DNA 双链相互作用并与之相结合的过程 RNA 聚合酶全酶 ( 2 ) 与模板结合 2 转录起始 1RNA 聚合酶全酶 ( 2 ) 与模板结合 DNA 双链解开

10 在 RNA 聚合酶作用下发生第一次聚合反应, 形成转录起始复合物 5 -pppg -OH + NTP 5 -pppgpn - OH 3 + ppi 转录起始复合物 : RNApol ( 2 ) - DNA - pppgpn- OH 3 3 RNA 链的延伸 亚基脱落,RNA pol 聚合酶核心酶变构, 与模板结合松弛, 沿着 DNA 模板前移 ; 在核心酶作用下,NTP 不断聚合,RNA 链不断延长 注意 :9 个核苷酸以前还在启动子区, 容易脱落, 一旦形成 9 个以上的核苷酸并离开启动子区, 转录正式进入眼神阶段 4 转录终止终止子 (terminator): 位于基因的末端, 在转录终止点之前有一段回文序列 ( 反向重复序列 ) 约 6-20bp 真核生物终止 : 由一段特定序列 5 -AATAAA-3 和回文序列 ( 反向重复序列 ) 组成 分为两类 : 强终止子 - 内部终止子 : 不依赖 Rho (ρ) 因子的终止 弱终止子 - 需要 ρ 因子 (rho factor), 又称为 ρ 依赖性终止子 ( Rho-dependent terminator) 不依赖 因子的终止当 RNA 链延伸到转录终止位点时,RNA 聚合酶不再形成新的磷酸二酯键,RNA-DNA 杂合物分离, 转录泡瓦解,DNA 恢复成双链状态, 而 RNA 聚合酶和 RNA 链都被从模板上释放出来, 这就是转录的终止 终止位点上游一般存在一个富含 GC 碱基的二重对称区,RNA 形成发夹结构 ; 在终止位点前面有一段由 4-8 个 A 组成的序列,RNA 的 3 端为寡聚 U 发夹式结构和寡聚 U 的共同作用使 RNA 从三元复合物中解离出来 依赖 因子的终止 因子 : 六聚体蛋白 水解各种核甘三磷酸促使新生 RNA 链从三元转录复合物中解离出来, 从而终止转录 ( 二 ) 真核生物的转录过程 1. 转录起始真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化, 转录起始时, RNA-pol 不直接结合模板, 其起始过程比原核生物复杂 (1). 转录起始前的上游区段 顺式作用元件 (cis-acting element): 影响自身基因表达活性的非编码 DNA 序列 例 : 启动子 增强子 弱化子等

11 增强子 : 在启动区存在的能增强或促进转录的起始的 DNA 序列 但不是启动子的一部分 特点 :1. 远距离效应 ;2. 无方向性 ;3. 顺式调节 ;4. 无物种和基因的特异性 ;5. 具有组织特异性 ; 6. 有相位性 ;7. 有的增强子可以对外部信号产生反应 (2). 转录因子 : 能直接 间接辨认和结合转录上游区段 DNA 的蛋白质, 现已发现数百种, 统称为反式作用因子 (trans-acting factors) 反式作用因子中, 直接或间接结合 RNA 聚合酶的, 则称为转录因子 (transcriptional factors, TF) 参与 RNA-polⅡ 转录的 TFⅡ --TFⅡD TFⅡA TFⅡB TFⅡF TFⅡE TFⅡH (3) 转录起始前复合物 (pre-initiation complex, PIC) 真核生物 RNA-pol 不与 DNA 分子直接结合, 而需依靠众多的转录因子 (4) 模板理论 (piecing theory) 一个真核生物基因的转录需要 3 至 5 个转录因子 转录因子之间互相结合, 生成有活性 有专一性的复合物, 再与 RNA 聚合酶搭配而有针对性地结合 转录相应的基因 2. 转录延伸真核生物转录延长过程与原核生物大致相似, 但因有核膜相隔, 没有转录与翻译同步的现象 RNA-pol 前移处处都遇上核小体 转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象 3. 转录终止 和转录后修饰密切相关 四 转录后加工 5 端加帽 3 端加尾 RNA 的剪接 RNA 的编辑 1 在 5 端加帽 5 端的一个核苷酸总是 7- 甲基鸟核苷三磷酸 (m7gppp) mrna5 端的这种结构称为帽子 (cap) 帽子结构功能 : 1 能被核糖体小亚基识别, 促使 mrna 和核糖体的结合 ; 2m7Gppp 结构能有效地封闭 mrna 5 末端, 以保护 mrna 免受 5 核酸外切酶的降解, 增强 mrna 的稳定 2 3 端加尾 -- 多聚腺苷酸尾巴 ---AAUAAA: 准确切割 加 poly(a) 多聚腺苷酸尾巴功能 : 提高了 mrna 在细胞质中的稳定性 3 RNA 的剪接生物体内内含子的主要类型 :

12 U-AG AU-AC Ⅰ 类内含子 Ⅱ 类内含子 Ⅲ 类内含子参与 RNA 剪接的物质 : snrna( 核内小分子 RNA) snrnp( 与 snrna 结合的核蛋白 ) 核内 RNA(U1 U2 U4 U5 U6) 4 RNA 的编辑 * 编辑 (editing) 是指转录后的 RNA 在编码区发生碱基的突变 加入或丢失等现象 五 原核生物与真核生物 mrna 的特征比较 1 原核生物 mrna 的特征 半衰期短 多以多顺反子的形式存在单顺反子 mrna: 只编码一个蛋白质的 mrna 多顺反子 mrna: 编码多个蛋白质的 mrna Z: β- 半乳糖苷酶 Y: 透过酶 A: 乙酰基转移酶 ZYA 为结构基因 5 端无 帽子 结构, 3 端没有或只有较短的 poly(a ) 结构 SD 序列 : 原核生物起始密码子 AUG 上游 7-12 个核苷酸处有一被称为 SD 序列的保守区 mrna 中用于结合原核生物核糖体的序列 P85 2 真核生物 mrna 的特征 基因 的分子生物学定义 : 产生一条多肽链或功能 RNA 所必需的全部核甘酸序列 5 端存在 帽子 结构 多数 mrna 3 端具有 poly(a ) 尾巴 ( 组蛋白除外 ) 以单顺反子的形式存在六 RNA 合成与 DNA 合成异同点相同点 : 1 都以 DNA 链作为模板 2 合成的方向均为 聚合反应均是通过核苷酸之间形成的 3,5 - 磷酸二酯键, 使核苷酸链延长 不同点 : 复制转录模板两条链均复制模板链转录 ( 不对称转录 ) 原料 dntp NTP 酶 DNA 聚合酶 RNA 聚合酶产物子代双链 DNA mrna, trna,

13 ( 半保留复制 ) rrna 配对 A-T;G-C A-U;T-A;G-C 引物 RNA 引物 无 第四章生物信息的传递 ( 下 ) 从 mrna 到蛋白质翻译 : 指将 mrna 链上的核甘酸从一个特定的起始位点开始, 按每三个核甘酸代表一个氨基酸的原则, 依次合成一条多肽链的过程 蛋白质合成的场所是核糖体 蛋白质合成的模板是 mrna 模板与氨基酸之间的接合体是 trna 蛋白质合成的原料是 20 种氨基酸一 遗传密码 ª ª 三联子 ( 一 ) 三联子密码 :mrna 链上每三个核甘酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸, 这三个核甘酸就称为密码子或三联子密码 (triplet coden) 至 1966 年,20 种氨基酸对应的 61 个密码子和三个终止密码子全部被查清 ( 三 ) 遗传密码的性质 1 连续性编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读, 密码间既无间断也无交叉 基因损伤引起 mrna 阅读框架内的碱基发生插入或缺失, 可能导致框移突变 (frameshift mutation) 从 mrna 5 端起始密码子 AUG 到 3 端终止密码子之间的核苷酸序列, 各个三联体密码连续排列编码一个蛋白质多肽链, 称为开放阅读框架 (open reading frame, ORF) 2 简并性由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并 ( degeneracy ), 对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子 (synonymous codon) 3 通用性与特殊性蛋白质生物合成的整套密码, 从原核生物到人类都通用 已发现少数例外, 如动物细胞的线粒体 植物细胞的叶绿体 4 摆动性转运氨基酸的 trna 上的反密码子需要通过碱基互补与 mrna 上的遗传密码子反向配对结合, 在密码子与反密码子的配对中, 前两对严格遵守碱基配对原则, 第三对碱基有一定的自由度, 可以 摆动,

14 这种现象称为密码子的摆动性 二 trna 的结构 功能与种类 ( 一 ) trna 的结构 1 二级结构 : 三叶草形 2 三级结构 : L 形 ( 二 ) trna 的功能 1 解读 mrna 的遗传信息 2 运输的工具, 运载氨基酸 trna 有两个关键部位 : 3 端 CCA: 接受氨基酸, 形成氨酰 -trna 与 mrna 结合部位 反密码子部位 trna 凭借自身的反密码子与 mrna 链上的密码子相识别, 把所带氨基酸放到肽链的一定位置 1 起始 trna 和延伸 trna 能特异地识别 mrna 模板上起始密码子的 trna 称起始 trna, 其他 trna 统称为延伸 trna 真核生物 : 起始密码子 AUG 所编码的氨基酸是 Met, 起始 AA-tRNA 为 Met-tRNAMet 原核生物 : 起始密码子 AUG 所编码的氨基酸并不是甲硫氨酸本身, 而是甲酰甲硫氨酸, 起始 AA-tRNA 为 fmet-trnafmet 2 同工 trna 代表同一种氨基酸的 trna 称为同工 trna 同工 trna 既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码, 又要有某种结构上的共同性, 能被相同的氨基酰 -trna 合成酶识别 (P119) 3 校正 trna 无义突变校正 trna: 可以通过改变反密码子区校正无义突变错义突变校正 trna: 通过反密码子区的改变把正确的氨基酸加到肽链上, 合成正常的蛋白质 无义突变 : 在蛋白质的结构基因中, 一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子 (UAG UGA UAA), 使蛋白质合成提前终止, 合成无功能的或无意义的多肽, 这种突变就称为无义突变 错义突变 : 由于结构基因中某个核甘酸的变化使一种氨基酸的密码子变为另一种氨基酸的密码子, 这种基因突变叫错义突变 GGA( 甘氨酸 ) AGA( 精氨酸 ) 四 氨酰 -trna 合成酶 AA- trna 合成酶是一类催化氨基酸与 trna 结合的特异性酶, 它既能识别 trna, 又能识别氨基酸, 对两者都具有高度的专

15 一性 三 核糖体的结构与功能核糖体是由 rrna(ribosomal ribonucleic acid) 和多种蛋白质结合而成的一种大的核糖核蛋白颗粒, 蛋白质肽键的合成就是在这种核糖体上进行的 细菌是 70s{50s\30s} 哺乳动物是 80s{60s\\40s} ( 二 ) 核糖体的功能 : 合成蛋白质在单个核糖体上, 可化分多个功能活性中心, 在蛋白质合成过程中各有专一的识别作用和功能 mrna 结合部位 小亚基 结合或接受 AA-tRNA 部位 (A 位 ) 大亚基 结合或接受肽基 trna 的部位 大亚基 肽基转移部位 (P 位 ) 大亚基 形成肽键的部位 ( 转肽酶中心 ) 大亚基 四 蛋白质合成的过程 ( 生物学机制 ) 氨基酸的活化 翻译的起始 肽链的延伸 肽链的终止 蛋白质前体的加工 ( 一 ) 氨基酸的活化原核生物中, 起始氨基酸是 : 甲酰甲硫氨酸起始 AA-tRNA 是 :fmet-trnafmet 真核生物中, 起始氨基酸是 : 甲硫氨酸起始 AA-tRNA 是 :Met-tRNAMet ( 二 ) 翻译的起始原核生物 ( 细菌 ) 为例 : 所需成分 :30S 小亚基 50S 大亚基 模板 mrna fmet-trnafmet GTP Mg2+ 翻译起始因子 :IF-1 IF-2 IF-3

16 翻译起始 ( 翻译起始复合物形成 ) 又可被分成 3 步 : (P129) 1. 核蛋白体大小亚基分离 2 30S 小亚基通过 SD 序列与 mrna 模板相结合 3. 在 IF-2 和 GTP 的帮助下, fmet-trnafmet 进入小亚基的 P 位, trna 上的反密码子与 mrna 上的起始密码子配对 4 带有 trna mrna 和 3 个翻译起始因子的小亚基复合物与 50S 大亚基结合,GTP 水解, 释放翻译起始因子 真核生物翻译起始的特点 核糖体较大, 为 80S; 起始因子比较多 ; mrna 5 端具有 m7gppp 帽子结构 Met-tRNAMet mrna 的 5 端帽子结构和 3 端 polya 都参与形成翻译起始复合物 ; 真核生物翻译起始复合物形成 ( 区别原核生物 ) 原核生物中 30S 小亚基首先与 mrna 模板相结合, 再与 fmet-trnafmet 结合, 最后与 50S 大亚基结合 而在真核生物中, 40S 小亚基首先与 Met-tRNAMet 相结合, 再与模板 mrna 结合, 最后与 60S 大亚基结合生成 80S mrna Met-tRNAMet 起始复合物 (P131) ( 三 ) 肽链的延伸肽链延伸由许多循环组成, 每加一个氨基酸就是一个循环, 每个循环包括 :AA-tRNA 与核糖体结合 肽键的生成和移位 延伸因子 (elongation factor, EF) : 原核生物 :EF-T (EF-Tu, EF-Ts) EF-G 真核生物 :EF-1 EF-2 1 AA-tRNA 与核糖体 A 位点的结合需要消耗 GTP, 并需 EF-Tu EF-Ts 两种延伸因子 2 肽键形成 : 是由转肽酶 / 肽基转移酶催化 3 移位 : 核糖体向 mrna3 端方向移动一个密码子 需要消耗 GTP, 并需 EF-G 延伸因子 A 位点是新到来的氨酰 -trna 的结合位点 P 位点是肽酰 - trna 的结合位点 E 位点是延伸过程中释放 trna 的位点, 即, 去氨酰 -trna 通过 E 位点脱出, 释放到核糖体外的胞质中 ( 四 ) 肽链的终止 RF1: 识别终止密码子 UAA 和 UAG 终止因子 RF2: 识别终止密码子 UAA 和 UGA

17 RF3: 具 GTP 酶活性, 刺激 RF1 和 RF2 活性, 协助肽链的释放真核生物只有一个终止因子 (erf) ( 五 ) 蛋白质前体的加工 1 N 端 fmet 或 Met 的切除 2 二硫键的形成 3 特定氨基酸的修饰磷酸化 糖基化 甲基化 乙基化 羟基化和羧基化 4 切除新生肽链中非功能片段 ( 六 ) 蛋白质折叠由核糖体合成的所有新生肽链必须通过正确的折叠才能形成动力学和热力学稳定的三位构象, 从而表现出生物学活性或功能 新生多肽 一级结构 二级结构 三级结构已经具有活性 ( 对于寡聚蛋白需要组装称为四级结构才有活性 ( 七 ) 蛋白质合成抑制剂 青霉素 四环素和红霉素只与原核细胞核糖体发生作用, 从而阻遏原核生物蛋白质的合成, 抑制细菌生长 被广泛用于人类医学 氯霉素和嘌呤霉素既能与原核细胞核糖体结合, 又能与真核生物核糖体结合, 妨碍细胞内蛋白质合成, 影响细胞生长 氯霉素有时也用于治病, 但剂量和周期受到较严控制 五 蛋白质的运转机制 1 翻译- 运转同步机制 2 翻译后运转机制 (1) 线粒体蛋白质跨膜运转 (2) 叶绿体蛋白质的跨膜运转 3 核定位蛋白的运转机制 4 蛋白质的降解 * 蛋白质的合成位点与功能位点常常被细胞内的膜所隔开, 蛋白质需要运转 * 核糖体是真核生物细胞内合成蛋白质的场所, 任何时候都有许多蛋白质被输送到细胞质 细胞核 线粒体和内质网等各个部分, 补充和更新细胞功能 * 细胞各部分都有特定的蛋白质组分, 蛋白质必须准确无误地定向运送才能保证生命活动的正常进行 * 细胞中蛋白质的合成 : 绝大多数在细胞质中合成 ; 一小部分在细胞器 ( 叶绿体和线粒体 ) 中合成

18 * 定位于细胞器内的大部分蛋白质在细胞质中合成, 细胞器内合成的留在细胞器内 * 蛋白质插入或穿过生物膜的过程称为蛋白质运转 ( protein translocation) 蛋白质运转的两种方式翻译 - 运转同步 (co-translational translocation) 是即将进入内质网的蛋白质的易位方式 ; 蛋白质正合成的时候就可与运转装置结合 ; 蛋白质合成时, 核糖体定位于内质网表面, 称膜结合核糖体 (membrane-bound ribosome) 分泌蛋白质大多是以同步机制运输的翻译后运转 (post-translational translocation) 蛋白质翻译完成后从核糖体上释放, 然合扩散至合适的靶膜并与运转装置结合 蛋白质合成时, 其核糖体不与任何细胞器相连, 称游离核糖体 (free ribosome) 在细胞器发育过程中, 由细胞质进入细胞器的蛋白质大多是以翻译后运转机制运输的 参与生物膜形成的蛋白质, 依赖于上述两种不同的运转机制镶入膜内 蛋白性运转机制主要类型质蛋白质在结合核免疫球蛋白 卵蛋分泌糖体上合成, 并以白 翻译 - 运转同步机水解酶 激素等制运输蛋白质在游离核核 叶绿体 线粒体 细胞器糖体上合成, 以翻乙醛酸循环体 过氧发育译后运转机制运化物酶输体等细胞器中的蛋白质 膜的形两种机制兼有成 质膜 内质网 类囊体中的蛋白质 1 翻译 - 运转同步机制信号肽假说 信号肽 : 能启动蛋白质运转的任何一段多肽 ( 常指新合成多肽链

19 中用于指导蛋白质跨膜转移的 N- 末端氨基酸序列 ( 有时不一定在 N 端 )) 绝大部分被运入内质网内腔的蛋白质都带有一个信号肽 信号序列特点 : (1) 一般带有 个疏水氨基酸 ; (2) 在靠近该序列 N- 端常常有 1 个或数个带正电荷的氨基酸 ; (3) 在其 C- 末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸, 离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链 ( 丙氨酸或甘氨酸 ) 信号肽假说内容 : (1) 蛋白质合成起始首先合成信号肽 (2)SRP( 信号识别蛋白 ) 与信号肽结合, 翻译暂停 (3)SRP 与 SRP 受体结合, 核糖体与膜结合, 翻译重新开始 (4) 信号肽进入膜结构 (5) 蛋白质过膜, 信号肽被切除, 翻译继续进行 (6) 蛋白质完全过膜, 核糖体解离信号肽与蛋白质转运的关系 P144 (1) 完整信号肽是保证蛋白质转运的必要条件 ; (2) 仅有信号肽不足以保证蛋白质转运发生 ; (3) 信号序列切除并不是转运所必需 ; (4) 并非所有运转蛋白质都有可降解的信号肽 蛋白质翻译运转同步运输的基本过程可分两个阶段 : 首先 : 带有新生肽链的核糖体与膜结合 ; 然后 : 新生肽链进入膜通道并易位 核糖体与膜结合需要信号识别颗粒 (signal recognition particle, SRP) SRP 有两种能力 : 结合新合成的分泌型蛋白的信号序列 ; 结合位于膜上的 SRP 受体 2 翻译后运转机制前导肽及其特性 : ظ 翻译后跨膜易位的蛋白质, 前体一般含前导肽 (leader peptide), 前导肽在跨膜运转中起重要作用 ظ 过膜后, 前导肽水解, 蛋白质变为有功能的蛋白质 前导肽的一般特性 : (1) 带正电荷碱性氨基酸 (Arg) 较丰富, 分散于不带电荷的氨基酸序列之间 ;

20 (2) 缺少带负电荷的酸性氨基酸 ; (3) 羟基氨基酸 (Ser) 含量较高 ; (4) 有形成两亲 ( 亲水和疏水 )α- 螺旋能力 线粒体蛋白质跨膜运转 Hsp70 为分子伴侣 分子伴侣 : 结合在一些不完全装配或不恰当折叠蛋白上, 帮助它们折叠或防止它们聚集的蛋白质 分子伴侣的生物学功能 (1) 帮助新生蛋白质正确折叠 (2) 纠正错误折叠或介导其降解 泛素活化酶 (ubiquitin - activating enzyme,e1) 泛素结合酶 (ubiquitin - conjugating enzyme,e2) 泛素蛋白连接酶 (ubiquitin -proteinligating enzyme, E3) E1,E2,E3 的作用 : E1 激活泛素分子, E2 就负责把泛素分子绑在被降解蛋白质上 E3 能识别被降解的蛋白质 第五章分子生物学研究法*重组 DNA 技术 - 基因工程*分子杂交及相关技术*聚合酶链式反应的原理和应用* DNA 多态性及其检测 基因操作 : 主要包括 DNA 分子的切割与连接 核酸分子杂交 凝胶电泳 细胞转化 核酸序列分析以及基因的人工合成 定点突变和 PCR 扩增等 基因工程 : 指在体外将核酸分子插入病毒 质粒或其他载体分子, 构成遗传物质的新组合, 使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增值能力和表达 基因工程技术实际上是核酸操作技术的一部分 1 理论上的三大发现 遗传物质主要是 DNA DNA 的双螺旋结构和半保留复制机制 遗传密码子的破译 2 技术上的三大发明 限制酶和连接酶体外切割和连接 DNA 片断 质粒改造成载体以携带 DNA 片断克隆

21 逆转录酶的使用 1 常用的工具酶限制性核酸内切酶切割 DNA DNA 连接酶生成 3-5 磷酸二酯键 DNA 聚合酶 Ⅰ 探针标记 补平 3 末端反转录酶 cdna 合成多聚核苷酸激酶 5 磷酸化 探针标记末端转移酶 3 末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基 2 载体 vector 自我复制 克隆载体 表达载体原核载体 : 质粒 (pbr322,puc ) 噬菌体 (λ,m13) 真核载体 : 动物病毒载体 plxsn 载体的条件 分子小 ( 10 Kb) 有限制酶酶切位点 可自主复制 有足够的 copy 数 带筛选的标志 1982 年 -- 转基因小鼠 1997 年克隆绵羊 多利 1998 年 -- 克隆鼠 2001 年 2 月 -- 人类基因组重组 DNA 技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一 即是基因工程 (Gene Engineering) 的核心技术 重组 DNA 技术 (Recombinant DNA Technique) 是人类根据需要选择目的基因 (DNA 片段 ) 在体外与基因运载体重组, 转移至另一细胞或生物体内, 以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的 这一技术的发展和应用, 关键在于限制酶的发现和应用 基因操作 : 主要包括 DNA 分子的切割与连接 核酸分子杂交 凝胶电泳 细胞转化 核酸序列分析以及基因的人工合成 定点突变和 PCR 扩增等 基因工程 : 指在体外将核酸分子插入病毒 质粒或其他载体分子, 构成遗传物质的新组合, 使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增值能力和表达

22 基因工程技术实际上是核酸操作技术的一部分 或者说基因操作技术服务于基因工程 一 限制酶限制性内切核酸酶 (restrictive endonucleases), 又称限制酶 是特异性地切断 DNA 链中磷酸二酯键的核酸酶 ( 分子手术刀 ) 发现于原核生物体内, 现已分离出 100 多种, 几乎所有的原核生物都含有这种酶 是重组 DNA 技术和基因诊断中重要的一类工具酶 1 限制酶的命名命名原则 : 限制酶由三部分构成, 即菌种名 菌系编号 分离顺序 如 : 属名菌株名 E co R I 种名编号 EcoRI 来源于大肠杆菌 E.coli 的 RY13 菌株,I 指在该菌株中分离的第一个限制酶 2 限制酶的特点: (1). 限制性内切酶一般识别完全的回文结构, 它具有两个基本特点 : 1 能够在中间划一个对称轴, 两侧的序列两两对称互补配对 ; 2 两条互补链的 5 3 的序列组成相同, 即将一条链旋转 180 度, 则两条链重叠 (2). 识别 4-8 个相连的核苷酸组成的特定核甘酸序列 (3) 切割方式有两种 1 错位切割, 产生互补性的粘性末端 错位切割所产生的 DNA 末端, 两条链不平齐, 一条链凸出, 一条链凹进, 这种末端称为黏性末端 带有相同黏性末端的 DNA 分子很容易在末端互补配对, 连接成新的重组分子 2 沿对称轴切割, 产生平齐末端切割后,DNA 末端的一条链多出一至几个核苷酸, 成为突出末端, 又称粘性末端包括 3 突出 5 突出 切割两条链时产生两端平整的 DNA 分子, 称为平末端 (4) 具有同裂酶来源不同的限制性内切酶识别同样的核甘酸靶序列 如 :BamH I 和 Bst I 具有相同的识别序列 GGATCC (5) 具有同尾酶来源各异, 识别的靶序列也不同, 但却产生相同的黏性末端, 故同尾酶产生的黏性末端可以连接起来, 但一般不能再被原来的任何

23 一种酶所切割 如 :Taq I Cla I 和 Acc I 为一组同尾酶, 其中任何一种酶切割 DNA 分子都产生 5 端 CG 凸出的粘性末端 二 目的基因及载体 ( 一 ) 目的基因 ( 一 ) 目的基因的获得 1) 化学合成法 : 较短的基因 (60-80bp) 用途 :PCR 引物 测序引物 定点突变 核酸杂交探针 1)DNA 的化学合成单链 DNA 短片段的合成已成为分子生物学和生物技术实验室的常规技术 化学合成 DNA 分子是把新的脱氧核糖核苷酸加到 DNA 双链的 5 端, 而在细胞中 DNA 分子合成的方向恰恰相反 整个 DNA 的化学合成过程可以在一个反应柱上连续进行, 并且可以对合成过程进行计算机控制 目前常用的化学合成 DNA 的方法是磷酰胺法 2) 基因组文库和 cdna 文库基因库, 也叫基因组文库, DNA 文库 ( DNA library) 是指用克隆的方法将一种生物的全部基因组长期以重组体方式保持在适当的宿主中 将生物细胞基因组 DNA 通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组 DNA 片段随机地同相应的载体重组 克隆, 所产生的克隆群体代表了基因组 DNA 的所有序列 这样保存的基因组是多拷贝 多片段, 当需要某一片段时, 可以在这样的 图书馆 中查找 ( 没有目录 ) cdna 文库首先获得 mrna, 反转录得 cdna, 经克隆后形成文库 cdan 文库和基因组文库的不同之处在于,cDNA 文库除却了 mrna 拼接过程中除去的内含子等成分, 便于 DNA 重组的使用 其复杂性比基因文库低得多 主要用于研究蛋白质的氨基酸顺序, 可根据克隆的 cdna 分子的核酸序列直接推倒出来 组建一个 cdna 文库的步骤 : 1) 分离表达目的基因的组织或细胞 2) 从组织或细胞中制备总体 RNA 和 mrna 3) 第一条 cdna 链的合成, 需要 RNA 模板,cDNA 合成引物, 逆转录酶,4 种脱氧核苷三磷酸以及相应的缓冲液 (Mg2+) 等 4) 第二条 cdna 链的合成 5) cdna 的甲基化和接头的加入

24 6) 双链 cdna 与载体的连接 ( 二 ) 载体载体 (Vector): 将外源目的 DNA 导入受体细胞, 并能自我复制和增殖的工具 载体具以下特征 : 1) 分子量小, 便于携带较大的 DNA 片段, 能进入宿主细胞并在其中增殖 ;( 质粒大于 15kb 时, 其将外源 DNA 转入大肠杆菌的效率将大大降低 ) 2) 有多种限制酶切点, 每种限制酶最好只有单一切点 ; 3) 被切割后的载体, 插入外源 DNA 后, 不影响其复制能力, 并有可选择的标记基因 ( 如, 抗药基因 ) 4) 可以在载体细胞中独立复制, 即本身是一个复制子 基因工程载体的分类根据载体的分子生物学特性划分 (1). 质粒型载体 环状 dsdna 分子, 自主复制 ( 质粒 DNA 载体 ) 如 : 质粒载体 (2). 病毒型载体 环状 线状 ss- 和 ds-dna 分子, 形成病毒颗粒 如 : 噬菌体载体 (3). 混合型载体 具质粒和病毒特性, 特性的转换依赖于宿主细胞生物学特性 如 : 柯斯质粒载体用于原核生物宿主的载体目前已构建应用的基因工程载体主要有 : 质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 ( 一 ). 质粒 (plasmid ): 质粒是细胞染色体或核区 DNA 外能够自主复制的很质粒载体特点 1 至少有一个复制起点, 因而至少可在一种生物体中自主复制 2 至少应有一个克隆位点, 以供外源 DNA 插入 3 至少应有一个遗传标记基因, 以指示载体或重组 DNA 分子是否进入宿主细胞 4 具有较小的分子量和较高的拷贝数 注 : 前三个特点必不可少 1 标记基因的作用 1) 指示外源 DNA 分子 ( 载体或重组分子 ) 是否进入宿主细胞 2) 指示外源 DNA 分子是否插入载体分子形成了重组子 2 标记基因的种类 1) 抗性标记基因 ( 可直接用于选择转化子 ) 主要是抗生素抗性基因 : Ampr,Tetr,Cmlr,Kanr 2) 生化标记基因

25 其表达产物可催化某些易检测的生化反应, 如 lacz 3 常用的遗传标记基因及其作用机制 1) 四环素抗性基因 ( Tetr,Tcr) 2) 氨苄青霉素抗性基因 ( Ampr,Apr) 3) 氯霉素抗性基因 ( Cmlr,Cmr) 4) 卡那霉素 (Kanr), 新霉素 (Neor) 和 G418 抗性 (G418r) 基因 5)β 半乳糖苷酶基因 (lacz 和 laczα) 三 DNA 重组基本程序 1. 分 载体和目的基因的分离 2. 切 限制性内切酶的应用 3. 接 载体与目的基因连接成重组体 4. 转 基因序列转入细胞 5. 筛 目的基因序列克隆的筛选和鉴定 6. 表 - 目的基因在宿主细胞的表达目的基因的获取方法 : 从基因组中提取 CDNA 法 化学合成法 PCR 法 鉴定得到的目的基因的鉴定方法 : 抗性选择 提取质粒电泳鉴定大小 快速提取酶切鉴定 菌落杂交法 DNA 序列分析 第二节分子杂交及相关技术分子杂交 : 是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上, 然后用标记的探针与被固定的分子杂交, 经显影后显示出目的分子所处的位置的过程. 分子杂交包括 :DNA-DNA 杂交 ( 原位杂交 点杂交 Southern 杂交 ),DNA-RNA 杂交 (Northern 杂交 ) 及蛋白杂交 (Western 杂交 ) 等 一 杂交探针 (Probe) 的获得 Probe: 探针, 是由放射性同位素 生物素或荧光染料等进行标记后, 能与目的基因片段特异性杂交的已知序列的核酸片段 根据探针的来源及核酸性质不同又可分为 DNA 探针,RNA 探针,cDNA 探针, 及寡核苷酸探针等几类 DNA 探针 : DNA 探针是最常用的核酸探针, 指长度在几百碱基对以上的双链 DNA 或单链 DNA 这类探针多为某一基因的全部或部分序列, 或某一非编码序列 可从已建立的基因组文库中筛选分离并克隆制备 cdna 探针 (complementary DNA) : cdna 是指互补于 mrna 的 DNA 分子, 是由逆转录酶催化而

26 产生的 该酶以 RNA 为模板, 根据碱基配对原则, 按照 RNA 的核苷酸顺序合成 DNA( 其中 U 与 A 配对 ) 可以从已构建的 cdna 文库中筛查和分离目的基因探针 RNA 探针 : RNA 探针是一类很有前途的核酸探针, 由于 RNA 是单链分子, 所以它与靶序列的杂交反应效率极高 早期采用的 RNA 探针是细胞 mrna 探针和病毒 RNA 探针, 这些 RNA 是在细胞基因转录或病毒复制过程中得到标记的, 标记效率往往不高, 且受到多种因素的制约 这类 RNA 探针主要用于研究目的, 而不是用于检测 寡核苷酸探针 : 根据已知基因序列, 人工合成一段互补的 DNA 片段 一般长约 15~50 个 bp RNA 探针和 crna 探针具有 DNA 探针所不能比拟的高杂交效率, 但 RNA 探针也存在易于降解和标记方法复杂等缺点 前三种探针均是可克隆的, 一般情况下, 只要有克隆的探针, 就不用寡核苷酸探针 三 DNA 杂交常用的方法用途 : 用于快捷地检查出菌落中是否有某个基因, 但不能检出基因的大小或重复的程度 ( 二 ). Southern DNA 印迹杂交 将重组体 DNA 用限制酶切割, 分离出目的 DNA 后进行电泳分离, 再将其原位转至薄膜上, 固定后用探针杂交的方法叫 Southern 杂交 用途 : 用来检查 DNA 样品中是否存在有某个特定的基因, 而且还可知道其大小及酶切位点的分布 Southern DNA 印迹杂交主要步骤 : 1. DNA 提取, 限制性内切酶切割成 DNA 片段 2. DNA 电泳 3. 印迹, 将进行 DNA 电泳的凝胶置于印迹设备中, 缓冲液内含有碱, 在印迹过程中 DNA 变性, 变成单链 DNA 凝胶上的 DNA 分子通过毛细管作用或电导作用被原封不动地 吸印 到滤膜上 烘烤 1-2 小时,DNA 片段牢固结合到膜上 5. 带有 DNA 的滤膜与杂交探针一起温育, 探针与 DNA 结合 洗去没有结合的游离探针 6. 用 X 光底片曝光后所得的放射性自显影图片, 同溴化乙锭染色的凝胶谱带进行对照比较, 便可鉴定出那一条限制片段是与探针核苷酸同源的

27 ( 三 ). 菌落印迹原位杂交 (in situ hybridization) 让含重组体的菌落或噬菌斑由平板转移到膜上并释放出 DNA, 变性并固定在膜上, 再同 DNA 探针杂交的方法叫原位杂交 用途 : 用于在转化菌落中筛选带有目的基因的重组克隆四 RNA 杂交常用方法 Northern RNA 印迹杂交 : 将 RNA 分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维滤膜或其它化学修饰的活性滤纸上, 进行核酸杂交的一种实验方法, 被检对象为 RNA, 探针为 DNA 或 RNA. 用途 : 用来检查基因组中某个特定的基因是否得到转录 原理及步骤 : 提取总 RNA 提纯分离 mrna 琼脂糖凝胶电泳分离 RNA 转移至硝酸纤维素膜 杂交检测关于印迹技术的概念印迹是将 DNA RNA 或蛋白质固定在固体支持物的过程 印迹的目的是减少待测物质的流动性, 防止丢失 扩散, 保持原有的位置, 便于反复使用, 容易进行斑点和序列分析, 简化分离手续 Southern 杂交 Northern 杂交和 Western 印迹 Eastern 印迹实际上都是印迹技术 但印记转移的目标物质不同, 鉴别方法也不同 五 蛋白质印迹法 (Western bloting) Western blotting 分析 (p189) 是蛋白质分析的技术在基因表达研究中, 应用非常广泛, 因为蛋白质是基因的产物, 研究蛋白质的变化来分析判断基因转录的高与低 步骤 : 细胞 提取总蛋白质 聚丙烯酰胺凝胶电泳 转膜 (Western blotting, 常用醋酸纤维膜 ) 固定 用化学发光试剂标记 ( 抗体抗原反应 ) 分析相对量以判断表达量的多少 第三节聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction,pcr) PCR 是模拟体内 DNA 复制条件, 应用 DNA 聚合酶反应, 特异性扩增某一 DNA 片段的技术 体外程序化的 DNA 合成技术 1. 增效 PCR(booster PCR)2. 巢式 PCR(nest PCR)3 多重 PCR4 逆转录 PCR (retro-transcription PCR, 简称 RT PCR) 5. 不对称 PCR6. 反向 PCR7 锚定 PCR(Anchored PCR, A-PCR) 先合成 cdna, 并用末端脱氧核苷酸转移酶在其 3 - 可变区末端加上一个 PolyG 尾巴, 所用引物是具 5 -polyc 尾巴, 可以与 PolyG 尾巴结合, 是一个固定点, 无论其余部分序列如何, 只识别片段末端, 由此进行 PCR 扩增, 叫锚定 PCR 锚定 PCR 主要用于分析具有可变末端的 DNA 序列.

28 PCR 技术的应用 1. 遗传性疾病的基因诊断 2. 传染病的诊断 ( 肝炎病毒 )3. 癌基因检测 4. 法医学 ( 亲子鉴定 ) 上的应用 5.DNA 测序 6. 基因克隆 7. 引入基因点突变, 基因融合等第四节 DNA 多态性 (DNA Polymorphism ) 群体中每个个体 ( 体细胞 ) 的两套单倍体 DNA 是不完全相同的, 一般每 100~500bp 就有一个是不相同的, 它们多位于内含子序列中, 表型并没有改变, 这种表现称为 DNA 多态 常用做遗传分析中的标记 除一卵双生子外, 没有两个个体的基因组 DNA 是完全相同的 DNA 多态性有两类 : 1. 位点多态性 : 是由于等位基因之间在特定的位点上 DNA 序列存在差异, 也就是基因组中散在的碱基的不同, 包括点突变 ( 转换和颠换 ), 单个碱基的置换 缺失和插入 突变是基因多态性的一种特殊形式, 单个碱基的置换又称为单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism, SNP) 2. 序列长度多态性 : 又称可变数目变异串联重复序列 (variable number of tandem repeats, VNTRS), 重复序列以各自的核心序列 ( 重复单元 ) 首尾相连多次重复, 散在地分布于染色体上, 以插入 / 缺失方式形成多态 VNTR 两侧的酶切位点固定, 但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同, 酶切后产生不同长度的片段 PCR-SSCP(Single-Stranded Conformation Polymorphroism) SSCP : 单链构象多态性是指单链 DNA 由于碱基序列不同而引起构象差异, 这种差异将造成相同或相近长度的单链 DNA 电泳迁移率不同 据此, 可用于 DNA 中单个碱基的替代 微小的缺失或插入的检测 通常与 PCR 技术联合应用, 称为 PCR-SSCP 技术 基因芯片, 又称生物芯片,DNA 芯片,DNA 探针微阵列 (Micro array) 它集成了大量的密集排列的基因探针, 这些探针位于芯片的特定位点上, 可与被荧光标记的若干靶核酸序列互补匹配, 利用基因芯片杂交图象, 可以确定杂交探针的位置, 便可根据碱基互补匹配的原理确定靶基因的序列, 实现核酸序列的分子识别 基因芯片能在同一时间内分析大量的基因, 实现生物基因信息的大规模检测 1. 基因组扫描 2. 寻找基因功能

29 3. 基因型及单碱基多态 (SNP) 4. 突变检测 5. 基因表达 6. 基因测序 7. 药物筛选几乎所有的生物学研究领域 作为一种高通量的基因检测方法, 具有巨大的应用潜力 第六章原核生物基因表达调控一 基因表达 (gene expression): 在一定调节机制控制下, 基因通过转录和翻译而产生其蛋白质产物, 或转录后直接产生其 RNA 产物, 如 trna rrna 等的过程 大多数基因的表达产物是蛋白质, 部分基因如 trna 和 rrna 基因表达产物是 RNA 二 基因表达调控 围绕基因表达过程中发生的各种各样的调节方式都通称为基因表达调控. 转录水平的调控 转录后的调控 翻译水平的调控 DNA 水平包括基因丢失 基因重排 染色质的结构状态 RNA 水平包括转录水平调控 RNA 的转录后加工 mrna 从核内向胞浆转动 mrna 稳定性 蛋白质水平包括翻译过程 ; 翻译后加工的蛋白质的稳定性 三 基因表达的特性 : 1) 时间特异性或阶段特异性 2) 空间特异性或组织细胞特异性 1 时间特异性按功能需要, 某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生, 称之为基因表达的时间特异性 (temporal pecificity) 多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶段特异性 (stage specificity) 2 空间特异性 (spatial specificity): 在个体生长全过程, 某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现, 称之为基因表达的空间特异性 (spatial specificity) 基因表达伴随时间顺序所表现出的这种分布差异, 实际上是由细胞在器官的分布决定的, 所以空间特异性又称细胞或组织特异性 (cell or tissue specificity) 四 基因表达的方式 组成性基因表达

30 适应性表达 ( 诱导和阻遏表达 ) 1 组成性基因表达 指不大受环境变动而变化的一类基因的表达 如 :DNA 聚合酶 RNA 聚合酶等代谢过程中十分必须的蛋白质或酶的表达 某些基因在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达, 通常被称为管家基因 (house-keeping gene) 如 : 微管蛋白基因 糖酵解酶系基因 核糖体蛋白基因等 2 适应性表达( 诱导和阻遏表达 ) 指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达 诱导表达 (induction) 指在特定环境因素刺激下, 基因被激活, 从而使基因的表达产物增加 这类基因称为可诱导基因 阻遏表达 (repression) 指在特定环境因素刺激下, 基因被抑制, 从而使基因的表达产物减少 这类基因称为可阻遏基因 在一定机制控制下, 功能上相关的一组基因, 无论其为何种表达方式, 均需协调一致 共同表达, 即为协调表达 (coordinate expression), 这种调节称为协调调节 (coordinate regulation) 五 基因表达调控的基本原理 : 1. 基因表达调控的多层次和复杂性四个基本调控点 (1) 基因结构的活化 (2) 转录起始 : 最有效的调节环节 (3) 转录后加工及转运 (4) 翻译及翻译后加工 2. 基因转录激活调节基本要素基因表达的调节与基因的结构 性质, 生物个体或细胞所处的内 外环境, 以及细胞内所存在的转录调节蛋白有关 三个基本要素 : 1) 特异的 DNA 调节序列 2) 调节蛋白 3)RNA 聚合酶基因转录激活调节基本要素 1 特异 DNA 序列原核生物的操纵子真核生物的顺式作用元件 2 调节蛋白真核生物的顺式作用元件 : 是指可影响自身基因表达活性的特异 DNA 序列 通常是非编码序列 包括启动子 增强子及沉默子等

31 2 调节蛋白是调节基因转录的蛋白因子, 如原核生物的阻遏蛋白和 CAP 蛋白 ( 降解物基因活化蛋白 ) 真核生物的基本转录因子和特异转录因子等 3 RNA 聚合酶原核启动序列或真核启动子是由转录起始点 RNA 聚合酶结合位点及控制转录的调节组件组成 启动序列影响其与 RNA 聚合酶的亲和力, 而亲和力大小则直接影响转录起动的频率 六 基因表达调控的生物学意义 1 适应环境 维持生长和增殖 2 维持个体发育与分化基因表达调控 转录水平上的调控 转录后水平上的调控 原核生物主要是在转录水平上调控基因的表达 当需要某种基因产物时, 就大量合成这种 mrna, 当不需要这种基因产物时就抑制这种 mrna 的转录, 就是让相应的基因不表达 通常所说的基因不表达, 并不是说这个基因就完全不转录为 mrna, 而是转录的水平很低, 维持在一个基础水平 ( 本底水平 ) 基因表达完全关闭的情况使极为少见的 1 负调控 negative regulation 在没有调节蛋白质存在时基因是表达的, 加入某种调节蛋白质后基因活性就被关闭, 这样的控制系统就叫做负控系统 其调节蛋白质叫做阻遏蛋白 两种类型 : 负控诱导和负控阻遏 2 正调控 positive regulation 在没有调节蛋白质存在时基因是关闭的, 加入某种调节蛋白质后基因活性就被开启, 这样的控制系统就叫做正控系统 其调节蛋白质叫做无辅基诱导蛋白 ( 激活蛋白 ) 两种类型 : 正控诱导和正控阻遏系统 ( 二 ) 特殊代谢物调节基因表达的类型 1 可诱导调节 一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下, 由原来关闭的状态转变为工作状态, 即在某些物质的诱导下使基因活化 调节分解代谢的操纵子, 同时受 camp-cap 的活性调节

32 2 可阻遏调节 一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下, 由原来开启的状态转变为关闭状态, 基因的表达被阻遏. 调节合成代谢的操纵子 ( 三 ) 原核生物基因表达调控的特点 调节的主要环节在转录水平上进行 σ 因子决定 RNA 聚合酶识别特异性 主要通过操纵子模式进行调节 阻遏蛋白对转录的抑制作用 ( 阻遏机制 ) 是普遍存在的负调控作用原核生物中基因的组织形式 几个作用相关的基因在染色体上串连排列在一起, 由同一个调控系统来控制 这样的一个整体称为一个操纵元 (operon) 二 弱化子对基因活性的影响 1 弱化子在操纵区与结构基因之间的一段可以终止转录作用的核苷酸序列, 当操纵子被阻遏时,RNA 合成被终止, 这段核苷酸起终止转录信号作用. 2 弱化子作用机制 RNA 分子在分子内采用不同的碱基配对方式, 形成不同的二级结构而参与调控 当不同的结构对是否允许终止存在差异时, 改变二级结构可对转录终止进行调控三 降解物对基因活性的调节 1 葡萄糖效应 ( 降解物抑制作用 ) 是指当葡萄糖和其它糖类一起作为细菌的碳源时葡萄糖总是优先被利用, 葡萄糖的存在阻止了其它糖类的利用的现象 2 降解物对基因活性的调节葡萄糖通过降低 camp 的含量而抑制基因表达四 细菌的应急反应 1 细菌的应急反应指细菌在恶劣生长环境中关闭 trna 和核糖体形成的能力 2 细菌的应急反应的机制 应急信号 : 鸟苷四磷酸 (ppgpp) 鸟苷五磷酸 (pppgpp) 诱导物 : 空载 trna 乳糖操纵子模型

33 1 Z Y A 基因的产物为一条多顺反子 mrna lacz: 编码 β- 半乳糖苷酶, 它可以将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖 ; lacy: 编码半乳糖苷透性酶, 它能将乳糖运送透过细菌的细胞壁 ; laca: 编码硫代半乳糖苷乙酰转移酶, 进行乳糖代谢 camp-cap 代谢激活蛋白 (Catabolite activating protein, CAP ) 是 camp 的受体蛋白 (cyclic Amp receptor protein, CRP) camp-cap 复合物, 是 lac 操纵元的正调控因子 4 葡萄糖对 lac 操纵子的影响 葡萄糖腺苷酸环化酶活性降低 ATP 无法转变成 camp 不能形成 CAP-cAMP 复合蛋白 RNA 酶无法结合在 DNA 上结构基因不表达 代谢物阻遏效应 研究认为葡萄糖的某些降解产物抑制 lac mrna 的合成, 这种效应称之为代谢物阻遏效应. 特殊代谢物调节基因活性的类型 可诱导调节 : 调节分解代谢的操纵子, 同时受 camp-cap 的活性调节 可阻遏调节 : 调节合成代谢的操纵子 ( 三 ) trp 操纵子的阻遏调控机制 色氨酸操纵子主要参与调控一系列用于色氨酸合成代谢的酶蛋白的转录合成 当细胞内缺乏色氨酸时, 此操纵子开放, 而当细胞内合成的色氨酸过多时, 此操纵子被关闭 色氨酸操纵子的调控机制与乳糖操纵子类似, 但通常情况下, 操纵子处于开放状态, 其辅阻遏蛋白不能与操纵基因结合而阻遏转录 而当色氨酸合成过多时, 色氨酸作为辅阻遏物与辅阻遏蛋白结合而形成阻遏蛋白, 后者与操纵基因结合而使基因转录关闭 ( 一 ) 弱化子在操纵区与结构基因之间的一段可以终止转录作用的核苷酸序列, 当操纵子被阻遏时,RNA 合成被终止, 这段核苷酸起终止转录信号作用. ( 四 ) 转录的弱化作用 mrna 转录的终止是通过前导肽基因的翻译来调节的 在前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子, 故这个前导肽的

34 翻译必定对 trnatrp 的浓度敏感 ( 五 ) 衰减子的生物学意义 活性阻遏物和非活性阻遏物的转变可能较慢, 而 trna 负载与否可能更为灵敏 ; 氨基酸的主要用途是合成蛋白质, 因而以 trna 负载情况为标准来进行控制可能更为恰当. 当细胞内氨基酸高于某一水平时, 可以实现完全的阻遏 ; 而只有低于这一水平时, 才需用衰减子这个调节系统来进行调节, 阻遏蛋白和衰减子调节机制都是为了避免浪费, 提高效率 第七章真核生物基因表达调控基因表达 (gene expression)-- 基因转录及翻译的过程 rrna trna 的合成属于基因表达真核生物基因表达的调控的水平 DNA 水平的调控转录水平的调控转录后水平的调控翻译水平的调控翻译后水平的调控真核基因组的结构特点 1 在真核细胞中, 一条成熟的 mrna 链只能翻译出一条多肽链, 不存在原核生物中常见的多基因操纵子形式 2 真核细胞 DNA 都与组蛋白和大量非组蛋白相结合, 只有一小部分 DNA 是裸露的 3 高等真核细胞 DNA 中很大部分是不转录的, 大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子 4 真核生物能有序地根据生长发育阶段的需要进行 DNA 片段重排, 还能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数 5 在真核生物中, 基因转录的调节区相对较大, 一般通过改变整个所控制基因 5 上游区 DNA 构型来影响它与 RNA 聚合酶的结合能力 在原核生物中, 转录的调节区都很小, 大都位于启动子上游不远处, 调控蛋白结合到调节位点上可直接促进或抑 RNA 聚合酶与它的结合 6 真核生物的 RNA 在细胞核中合成, 只有经转运穿过核膜, 到达细胞质后, 才能被翻译成蛋白质, 原核生物中不存在这样严格的空间间隔 7 许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程才能顺利地翻译成蛋白质 一 基因家族 : 真核基因组中来源相同, 结构相似, 功能相关的一组基因. 可能由某一共同祖先基因经重复和突变产生

35 特点 : 家族成员可以分布于不同染色体上 可集中于一条染色体上, 串联排列在一起, 形成基因簇 (gene cluster) 有些成员不产生有功能的基因产物, 这种基因称为假基因 (Pseudogene).Ψa1: 与 a1 相似的假基因 基因家族的种类 1 简单的多基因家族 以串联方式前后相连 rrna 2 复杂的多基因家族 一般由几个相关基因家族构成, 基因家族之间由间隔序列隔开, 并作为独立的转录单位. 组蛋白基因家族 3 发育调控的复杂多基因家族珠蛋白肽链有 7 种 :α β γ (Gγ Aγ ) δ ε ζ α 链 141AA 合成 α ζ β 链 146AA 合成 β γ (Gγ Aγ ) δ ε ( 三 ) 外显子与内含子的可变调控 1 组成型剪接概念 : 切除内含子后, 将外显子规范地拼接成成熟的 mrna, 称为组成型拼接 这样一个基因只产生一种成熟的 mrna, 也只产生一种蛋白质产物 2 选择性剪接概念 : 可调控的选择性拼接, 因而产生不同的成熟 mrna, 翻择产生不同的蛋白质 三 真核生物 DNA 水平上的基因表达调控 开放 型活性染色质结构对转录的影响基因扩增基因重排与转换基因丢失 ( 二 ) 基因扩增 1 概念 : 基因扩增是指某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象, 它使得细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需要, 是基因活性调节的一种方式.

36 作用 : 满足特定阶段生命活动的需要 2 实例 : 非洲爪蟾卵母细胞中的 rrna 基因 果蝇的发育中, 卵壳蛋白基因 ( 三 ) 基因重排与变换 1 基因重排概念 : 一个基因可以从远离其启动子的地方移到距它很近的位点而被启动转录, 即在 DNA 水平上由无功能的基因片断组合重排成为有功能的基因单位的过程, 叫做基因重排 2 基因转换 酵母的交配型 (mating-type) 不同交配型 (mating-type) 的菌株相互接合才能产生二倍体的合子 相同的交配型之间是不能接合的 细胞的交配型是由 MAT(mating) 座的遗传信息决定的 在此座位上带有 MATa 等位基因的细胞就叫做 a 型细胞 ; 同样带有 MATα 等位基因的细胞就称为 α 型细胞 ( 四 ) 基因丢失 有的生物个体发育早期在体细胞中要丢失部分染色体, 而在生殖细胞中保持全部的基因组四 DNA 甲基化与基因活性的调控 ( 一 ) DNA 的甲基化 DNA 甲基化能关闭某些基因的活性, 去甲基化则诱导了基因的重新活化与表达 DNA 的甲基化能提高该位点的突变频率, 因而可作为诱变剂或致癌因子调节基因表达 1 甲基化的类型 5- 甲基胞嘧啶 N6- 甲基腺嘌呤 7- 甲基鸟嘌呤 2 甲基化的酶 一种被称为日常型 (maintenance) 甲基转移酶, 主要在甲基化母链 ( 模板链 ) 指导下使处于半甲基化的 DNA 双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的鸟嘌呤甲基化 另一种是从头合成 (denovo synthesis) 甲基转移酶, 主要催化 CpG 的甲基化, 不需要母链的指导, 速度慢 真核生物转录水平的调控 RNA 聚合酶 顺式作用元件 反式作用因子 转录起始的调控一 顺式作用元件

37 影响自身基因表达活性的 DNA 序列 非编码序列 分启动子 增强子 沉默子和绝缘子 ( 一 ) 启动子 promoter 真核基因启动子由核心启动子和上游启动子元件 (UPE) 两个部分组成. 在基因转录起始位点 (+1) 及其 5 上游大约 100~200bp 以内的一组具有独立功能的 DNA 序列. 决定 RNA 聚合酶 Ⅱ 转录起始点和转录频率的关键元件. 核心启动子 (core promoter) 保证 RNA 聚合酶 Ⅱ 转录正常起始所必需的 最少的 DNA 序列 包括转录起始位点及转录起始位点上游 -25~-30bp 处的 TATA 盒 核心启动子单独起作用时, 只能确定转录起始位点并产生基础水平的转录 上游启动子元件 (upstream promoter element,upe) 包括通常位于 -7Obp 附近的 CAAT 盒 (CCAAT) 和 GC 盒 (GGGCGG) 等 能通过形成转录前复合物调节转录起始的频率, 提高转录效率 ( 二 ) 增强子 enhancer 1 概念 : 能使与它连锁的基因转录频率明显增加的 DNA 序列. 一般与转录激活因子结合, 通过作用于转录起始复合物增强 RNA 聚合酶的活性, 从而促进转录 增强子和启动子常交错覆盖或连续. 2 增强子的特性 增强效应十分明显 10~200 增强效应与其位置和取向无关 大多为重复序列 有严密的组织和细胞特异性 没有基因专一性 同时受外部信号的调控 ( 三 ) 沉默子 Silencer: 某些基因含有负性调节元件 沉默子, 当其结合特异蛋白因子时, 对基因转录起阻遏作用. ( 四 ) 绝缘子 insulator: 通常位于启动子与正调控元件 ( 增强子 ) 或负调控因子 ( 为异染色质 ) 之间的一种调控序列 其明显特征是能够绝缘或保护启动子免受上游增强子的影响 绝缘子本身对基因的表达既没有正效应, 也没有负效应, 其作

38 用只是不让其他调控元件对基因的活化效应或失活效应发生作用 绝缘子的作用具有方向性 2 RNA 聚合酶的结构组成 3 种聚合酶都由 2 个大亚基,12 个以上的小亚基组成 ; 在 3 种聚合酶之间, 最大的有 2 个亚基, 同时至少 5 个小亚基的基因编码区具有同源性 ;4-7 种小亚基为各种 RNA 聚合酶特有 ; 都具有原核 RNA 聚合酶核心 2 同源的亚基 ; 最大亚基与 相似, 次最大亚基与 相似 ; RNA 聚合酶 II 的羧基末端结构域 (CTD) 一 RNA 的加工成熟 1 rrna 和 trna 的加工成熟 2 mrna 的加工成熟 5 端加帽 (cap) 和 3 端多聚腺苷酸化 (polya) 的调控意义 使 mrna 稳定, 在转录过程中不被降解 mrna 的选择剪接 (alternative splicing) 对基因表达的调控 外显子选择 (optional exon) 内含子选择 (optional intron) 剪接位点 mrna 运输的控制 3 真核生物基因转录后加工的多样性 1) 简单转录单位这类基因只编码产生一个多肽, 其原始转录产物有时需要加工, 有时则不需要加工 2) 复杂转录单位 主要是一些编码组织和发育特异性蛋白质的基因, 内部含有数量不等的内含子, 同时其原始转录产物能通过多种不同方式加工成两个或两个以上的 mrna. 利用多个 5 端转录起始位点或剪接位点产生不同的蛋白质 利用多个 poly(a) 位点和不同的剪接方式产生不同的蛋白质 虽无剪接, 但有多个转录起始位点或加 poly A 位点的基因二 翻译水平的调控翻译水平调控的四个方面 : 1 蛋白质合成起始频率的调节 ; 2 mrna 识别 ; 3 mrna 的稳定性 ; 4 可溶性蛋白因子的修饰三 翻译后水平的调控 1 多肽的切割加工 ;

39 2 多肽的有限水解 ; 3 多肽的化学修饰 ; 4 多肽的剪接 ;