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晦樱阙
5 years ago
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1 第三章从 DNA 到 RNA--- 转录 RNA 转录 (RNA transcription)

2 第三章从 DNA 到 RNA--- 转录表达系统三种物质的基本功能 DNA: 贮存传递 RNA: 贮存传递酶 PRO: 贮存传递酶

3 一与 RNA 转录有关的概念 RNA 的转录 :transcription 酶 : 转录是一种酶促的核苷酸聚合过程, 所需的酶叫做依赖 DNA 的 RNA 聚合酶 (DDRP) 编码链 ( 有义链 coding strand ): 与 mrna 序列相同的那条 DNA 链反义链 ( 无意义链, 负链,antisense ): 在 RNA 的转录中, 用作模板的 DNA 链增强子 :Enhencer 启动子 :Promoter 终止子 :Terminator 转录单元 : 转录区 :

4 上游 :Upstream 下游 :Downstream 初级转录本 :Primary transcript

5 二转录的基本过程模板识别 :RNA 聚合酶与启动子 DNA 作用并与之结合在 DNA 上形成转录泡通过启动子 : 转录起始后直到 9 个核苷酸短链的形成转录延长 : RNA 聚合酶离开启动子, 沿 DNA 链移动并产生新 RNA 链伸长终止 : 不再形成磷酸二酯键,RNA-DNA 分离, 转录泡瓦解,DNA 恢复双链

6 1 模板的识别 - 原核酶对启动子的识别是转录的第一步大肠杆菌启动子 : 在转录开始位置的上游 10 个和 35 个核苷酸位置有两段 DNA 的序列比较保守, 分别称为 -10 序列 (-10 sequence) 和 -35 序列 (-35 sequence) 1. Pribnow box (-10 box) 5 TATAA T box 5 GACA 3 T85T83G81A61C69 A52 T89A89T50A65A100

7 原核启动子四大要素转录起始位点 -10 区 -35 区 -10 区与 -35 区之间的间隔原核基因转录起始位点通常是嘌呤, 其序列为 CAT(A 为起始位点 ) T85T83G81A61C69 A52 T89A89T50A65A 区是一个 6 碱基保守序列 ( 常以 -10 为中心 ) -35 区是另一个 6 碱基保守序列 ( 常以 -35 为中心 ) 当 -10 区和 -35 区中心位置相距 16-18bp 时, 该启动子的功能较强 ; 相距较近或较远时, 起始转录的功能都相应减弱

8 Absence of lactose 两个相关概念 : i p o z y a * 操纵元 (operon): 是原核生物基因 Active No lac mrna 表达调控的一个完整单元, 其中包括结构基因 Presence of lactose i p o z y a 调节基因操作子和启动子 Inactive -GalactosidasePermease Transacetylase

10 启动子 (promoter): 是指 DNA 分子上被 RNA 聚合酶识别并结合形成起始转录复合物的区域, 它还包括一些调节蛋白因子的结合位点 ( 频率效率 ) 一原核生物的 RNA polymerase (E. coli) 1 全酶 (Holo Enzyme) 和核心酶 (Core Enzyme) β α α β + σ β α σ α β Core Enzyme Holo Enzyme

11 (1) 全酶 (Holo Enzyme) 用于转录的起始依靠空间结构与 DNA 模板结合 (σ 与核心酶结合后引起的构象变化 ) 专一性地与 DNA 序列 ( 启动子 ) 结合结合常数 :10 14 /mol 半衰期 : 数小时 (10 7 /mol 1 秒以下 ) 转录效率低, 速度缓慢 ( σ 的结合 )

12 (2) 核心酶 (Core Enzyme) 作用于转录的延伸过程 ( 终止 ) 依靠静电引力与 DNA 模板结合 ( 蛋白质中碱性基团与 DNA 的磷酸根之间 ) 非专一性的结合 ( 与 DNA 的序列无关 ) 结合常数 :10 11 /mol 半衰期 :60 秒

13 (3) 全酶的组装过程 2 α + β α 2 β+β α2 ββ +σ α 2 ββ σ 此外, 新发现的一种 ω 亚基的功能尚不清楚 2 各亚基的特点和功能 (1) σ 因子 σ 因子可重复使用修饰 RNApol 构型使 Holo Enzyme 识别启动子的 Sextama Box(-35 区 ), 并通过 σ 与模板链结合

14 不同的 σ 因子识别不同的启动子 E.coli 中有四种 σ 因子 (σ 70 σ 32 σ 54 σ 28 ) 枯草杆菌中有 11 种 σ 因子 (σ 因子的更替对转录起始的调控 ) (2)α 因子核心酶的组建因子 α+α 2α+β α 2 β+β 促使 RNApol 与 DNA 模板链结合前端 α 因子 -- 使模板 DNA 双链解链为单链尾端 α 因子 -- 使解链的单链 DNA 重新聚合为双链

15 (3) β 因子促进 RNApol+NTP RNA elongation 完成 NMP 之间的磷酸酯键的连接 Editing 功能 ( 排斥与模板链不互补的碱基 ) 与 Rho (ρ) 因子竞争 RNA 3 -end

16 构成 Holoenzyme 后,β 因子含有两个位点 I site(initiation site. Rif s ): 该位点专一性地结合 ATP 或者 GTP ( 需要高浓度的 ATP 或 GTP) E site(elongation site Rif R ): 对 NTP 非专一性地结合 ( 催化作用和 Editing 功能 ) (4) β 因子参与 RNA 非模板链 (sense strand) 的结合 ( 充当 SSB)

17 由于各亚基的功能, 使全酶本身含有五个功能位点有义 DNA 链结合位点 ( β 亚基提供 ) DNA/RNA 杂交链结合位点 (β 亚基提供 ) 双链 DNA 解链位点 ( 前端 α 亚基提供 ) 单链 DNA 重旋位点 ( 后端 α 亚基提供 ) σ 因子作用位点

18 E. coli RNA polymerase 155 KD 11 KD 36.5 KD 36.5 KD 151 KD 70 KD 只用于起用于起始和延

19 二启动子 (promoter) 的结构与功能 (Prok.E.coli) 1 启动子由两个部分组成 (1) 上游部分 CAP-cAMP 结合位点 ( 基因表达调控的正控制位点 ) CAP(catabolite gene Activator Protein) 降解物基因活化蛋白, 环腺苷酸 (camp) 的受体蛋白 (2) 下游部分 RNApol 的进入 ( 结合 ) 位点 -35 ~ -10 包括识别位点和结合位点 (R B 位点 )

20 2 RNA 聚合酶的进入位点 (1) Sextama 框 (Sextama Box) -35 序列,RNA 聚合酶的松弛 ( 初始 ) 结合位点, RNA 聚合酶依靠其 σ 亚基识别该位点识别位点 (R 位点 ) 大多数启动子中共有序列为 T 82 T 84 G 78 A 65 C 54 A 45 重要性 : 很大程度上决定了启动子的强度 (RNApol 的 σ 因子 ) 位置在不同启动子中略有变动

21 (2) Pribonow 框 (Pribonow Box) -10 序列,RNA 聚合酶的牢固结合位点结合位点 (B 位点 ) 一致序列 :T 80 A 95 T 45 A 60 A 50 T 96 (TATP U AT) 因此又称 TATA Box 保守 T 位置范围 -4 到 -13

23 (3) 起始位点 (initiation site):+1 位点 RNA 聚合酶的转录起始位点起始 NTP 多为 ATP 或 GTP

24 起始过程 : a. 全酶与启动子结合的封闭型启动子复合物的形成 ( R 位点被 σ 因子发现并结合 )

25 b 开放型启动子复合物的形成 RNApol 的一个适合位点到达 -10 序列区域, 诱导富含 A T 的 Pribnow 框的熔解, 形成 12-17bp 的泡状物, 同时酶分子向 -10 序列转移并与之牢固结合开放型启动子复合物使 RNApol 聚合酶定向两种复合物均为二元复合物 ( 全酶和 DNA )

26 c. 在开放型的启动子复合物中,RNApol 的 I 位点和 E 位点的核苷酸前体间形成第一个磷酸二酯键 ( β 亚基 ) 三元复合物形成 +1 位多为 CAT 模式, 位于离开保守 T 6~9 个核苷酸处 TTGACA bp TATAAT bp sequence -10 sequence G C T A +1 (4) σ 因子解离核心酶与 DNA 的亲和力下降起始过程结束核心酶移动进入延伸过程

27 转录的起始过程 σ 核心酶 12~17bp

28 (β 亚基 )

29 3 CAP-cAMP 结合位点 ( 也称 CAP 位点 ) 转录调控中,I 阻遏蛋白负调控 lac 操纵子模型

30 I

31 许多基因的表达还存在正调控机制例如 : E.coli 培养基中乳糖和葡萄糖共存时只有葡萄糖被利用原因 :CAP 位点的正调控葡萄糖缺少时, 腺苷酸环化酶将 ATP camp, camp 与 CAP 位点结合, 此时启动子的进入位点才能与 RNApol 结合葡萄糖存在时,cAMP 不能形成, 没有 CAP-cAMP 与 CAP 位点结合, 启动子的 RNApol 进入位点不能结合 RNApol

32 因此, 一个操纵元中有两道控制开关, 只有同时打开, 结构基因才能进行转录 ( 对 lac 操纵元而言, 只有没有葡萄糖, 有乳糖时才能进行录 ) (1)CAP 位点的组成 (-70 ~-40) 位点 Ⅰ:-70 ~ -50 包括一个 IR 序列强结合位点位点 Ⅱ:-50 ~ -40 弱结合位点位点 Ⅰ 对位点 Ⅱ 具有协同效应 (cooperativity)

34 (2) 位点 Ⅱ 结合 CAP-cAMP 复合物后, 促使 RNApol 进入 Sextama Box, 最终与 -10 序列结合起始转录原因 :CAP-cAMP 复合物与位点 Ⅱ 结合 Sextama Box 富含 G C 区域 (G C 岛区 ) 稳定性降低 Pribnow Box 的溶解温度降低促进开放型启动子复合物的形成促进转录

36 第三节真核生物 RNA 转录的启动 RNA Transcription promotion in Eukaryots

37 一真核生物的 RNApol 1 三种 RNApol: 根据对 α - 鹅膏蕈碱的敏感性不同而分类 RNApolⅠ 最不敏感 ( 动植昆 ) RNApol Ⅱ RNApol Ⅲ 最敏感不同种类的敏感性不同 2 位置和转录产物 RNApolⅠ 核仁活性所占比例最大转录 rrna(5.8s 18S 28S)

38 RNApolⅡ 核质主要负责 hnrna snrna 的转录 hnrna(mrna 前体, 核不均一 RNA heterogeneous nuclear RNA) snrna( 核内小分子 RNA small nulear RNA) RNApol Ⅲ 核质负责 trna 5S rrna Alu 序列和部分 snrna 目前在线粒体和叶绿体内发现少数 RNApol( 活性较低 )

39 3 亚基组成: 分子量 500KDa, 含两个大亚基和 7~12 个小亚基 RNApolⅡ: 大亚基中有 C 末端结构域 (carboxy terminal domain CTD) CTD 中含一保守氨基酸序列的多个重复 Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser C 端重复七肽不同生物中重复数目不一样 ( 酶活性 )

40 CTD 中的 Ser 和 Thr 可被高度磷酸化磷酸化的 RNApol Ⅱ 被称为 Ⅱ A 非磷酸化的 RNApol Ⅱ 称为 Ⅱ B CTD 参与转录 Ⅱ B Ⅱ A 使 RNApol 易于离开启动子进入延伸过程 (10 倍 ) 二真核生物的启动子三种 RNApol 三种转录方式三种启动子三类基因,Ⅰ 类 Ⅱ 类 Ⅲ 类

41 1 RNApolⅡ 的启动子结构最复杂位于转录起始点的上游, 有多个短序列元件组成通用型启动子 ( 无组织特异性 ) (1) 帽子位点 (cap site): 转录起始位点与 Prok. 的 CAT 模式相似 (2) TATA 框 (Hogness 框或 Goldberg-Hogness 框 ) 位于 -30 处一致序列为 T 82 A 97 T 93 A 85 A 63 (T 37 )A 83 A 50 (T 37 )

42 定位转录起始点的功能 ( 类似原核的 Pribnow 框 ) TATA 是绝大多数真核基因的正确表达所必需的 (3) CAAT 框 (CAAT box) 位于 -75bp 处一致序列为 GGC/TCAATCT 前两个 G 的作用十分重要 ( 转录效率 ) 增强启动子的效率频率, 不影响启动子的特异性 ( 距转录起始点的距离, 正反方向 ) 以上三个保守序列在绝大多数启动子中都存在

43 (4) 增强子 (enhancer) ( 又称远上游序列 far upstream sequence) 在 -100 以上 SV40 的两个正向重复研究得最清楚 (DR) -107~ ~ -250 各 72bp 该增强子的特点如下 : 对依赖于 TATA 框的转录的增强效应高于不依赖的情况

44 距离效应 : 离 72bp 越近的容易起始转录转录方向离开 72bp 的起始序列优先转录细胞类型的选择 : 不同类型中作用有差异表明其作用具有细胞或组织特异性 ( 调节蛋白 ) (5) GC 框 (GC box) 位于 -90 附近, 较常见的成分核心序列为 GGGCGG 可有多个拷贝, 也可以正反两方向排列

45 (6) 其他元件八聚核苷酸元件 (octamer element OCT 元件 ) 一致序列为 ATTTGCAT K B 元件一致序列为 GGGACTTTCC ATF 元件一致序列为 GTGACGT 还有一些位于起始点下游的相关元件 (7) 不同元件的组合情况不同元件的数目位置和排列方向均有差异例如 :SV40 的早期启动子中有 6 个 GC 框

46 三真核生物转录的起始三种 RNApol 均没有对启动子特异序列的识别能力转录起始过程需要很多的辅助因子 ( 转录因子 ) 参与, 并且按一定顺序与 DNA 形成复合物, 协助 RNApol 定位于转录起始点

47 第四节转录延伸 Transcription Elongation

48 一起始到延伸的转变始于第一个磷酸二酯键的形成伴随着 DNA 分子和酶分子构象的变化 1 Prok. 起始时, σ 因子有利于 β 和 β 亚基具有与 DNA 专一性结合所要求的构象起始后, σ 因子解离, β 和 β 亚基构象发生变化 2 Euk. 多种辅助因子的共同作用来保证这一转变

49 二延伸过程 (Prok) 酶与产物 RNA 不解离底物 NTP 不断加到 RNA 链的 3 -OH 端形成一个磷酸二酯键后, 核心酶向前滑动延伸位点不断地接受新的 NTP,RNA 链不断延伸始终保持三元复合物的结构

51 1 转录泡 RNApol 结合和转录的 DNA 模板区域, 有 17bp 左右 DNA 形成解链区转录泡处杂交双链很短胰脏 RNAase 其长度 10bp( 不准确 ) 推测也就两个核苷酸左右

52 2 拓扑学问题 Φ RNA 合成过程中, 转录泡两端要发生拓扑转变 RNApol 的前沿.. 解螺旋作用 RNApol 后端..DNA 的螺旋化 ( 保持 ) Φ Φ 超缠问题的解决靠 DNA 旋转酶 RNA-DNA 杂交链也要求作旋转运动

53 旋转酶

54 3 转录过程中的延宕 (1) RNA 的合成速度大约 30 ~ 50 个核苷酸 / 秒, 与蛋白质的合成速度相近 (15 个 AA/sec) (2) 模板 DNA 中 G/C 的存在延宕 (G/C 后的 8~10 个核苷酸 ) 延宕作用在 RNA 链的终止和释放中起重要作用思考 : 延宕发生的原因?

55 第五节转录的终止 Transcription termination

56 终止过程 : 酶停止添加底物释放 RNA 链酶解离终止反应杂合双链的氢键断裂, 重新形成双螺旋, 酶的解离终止子 (terminator): 在转录的过程中, 提供转录终止信号的 RNA 序列真正起终止作用的是 RNA 序列 --- 与启动子不同 Prok. 和 Euk. 都具有 ---- 一种基因表达调控的手段

57 一原核生物的终止子 1 终止子的种类 (1) 内在终止子 ( 不依赖 ρ 因子的终止子 ) 体外实验中, 只有核心酶和终止子就足以使转录终止 (2) 依赖 ρ 因子的终止子蛋白质辅助因子 --ρ 因子存在时, 核心酶终止转录两者有共同的结构特征 ( 序列差异 )

58 2 不依赖 ρ 因子的终止子结构特征 : 一是形成一个发夹结构茎. 7~20 bp 的 IR 序列形成 ( 富含 G/C) 环. 中间不重复序列形成发夹结构的突变可阻止转录的终止二是 6 ~ 8 个连续的 U 串 ( 发夹结构末端 )

59 IR IR 茎部富含 GC 不依赖 ρ 终止子结

60 3 依赖 ρ 因子的终止子 (1) 结构 IR 序列中的 G/C 对含量较少发夹结构末端没有固定特征 (2) 靠与 ρ 的共同作用而实现终止

61 G/C 含量较少无连续 U 串

62 二原核生物转录的终止 1 不依赖 ρ 因子的终止子终止转录 (1) 新生 RNA 链发夹结构形成与 RNApol 发生作用阻止 RNA 链的释放造成高度延宕 ( 典型的有 60 秒左右 ) (2) RNApol 暂停为终止提供了机会,6 ~ 8 个连续的 U 串可能为 RNApol 与模板的解离提供了信号 RNA-DNA 之间的 ru-da 结合力较弱

63 于是 : RNA-DNA 解离三元复合体解体 RNApol 解离转录终止 (3) 真正的终止点不固定, 在 U 串中的任何一处 (4) IR 序列和 U 串同等重要 IR 中的 G/C 对含量的减少 U 串的缩短或缺失 (5) DNA 上与 U 串对应的为富含 A/T 的区域说明 :AT 富含区在转录的终止和起始中均起重要的作用

64 2 依赖 ρ 因子的终止子终止转录 (1) 通读 (read through): 在依赖 ρ 因子的转录终止过程中, RNApol 转录了 IR 序列之后, 虽发生一定时间的延宕, 但如果没有 ρ 因子存在, 则 RNApol 会继续转录 (2) ρ 因子 a 活性形式为六聚体促进转录终止的活性,NTPase 活性

65 b RNA 长度大于 50nt 时, 依赖 RNA 的 NTPase 活性最大说明 :ρ 因子识别和结合的是 RNA (3) ρ 因子对终止子的作用 a ρ 因子与 RNA 结合 ( 终止子上游的某一处,RNA 的 5 端 ) b ρ 因子沿 RNA 从 5 3' 移动 (NTP 水解供能 ) ( 终止子处的较长时间的延宕给 ρ 因子追赶的机会 ) c ρ 因子与 RNApol 相互作用而造成转录的终止

66 ρ 结合上来追赶 RNApol ρ 追赶上来 ( 暂停 ) 终止子 ρ 与 RNApol 相互作用使杂交链解链

67 (4) 终止反应还需要 RNA 与 DNA 的相互作用即 : 需要一定的 RNA 序列因为 : 其与模板的结合力必须弱到一定数值, 才能配合 ρ 因子与 RNApol 的作用 ( 发夹结构下游的 AU 序列 ) 序列不同的终止子不同的终止程度基因表达调控的途径之一

68 (5) Prok. 依赖 ρ 因子的终止子为基因表达调控提供了一种方式因为 : Prok. 中转录与翻译偶联?? 为什么同一个转录元里近基因的一个无义突变能阻止远基因的表达这一极性现象

69 RNApol 核糖体无义突位点 ρ 因子

70 三终止与抗终止及抗终止因子各种生物采用不同的手段控制不同发育阶段的基因表达 * 枯草杆菌更替 σ 因子 * T7 噬菌体更换 RNApol * λ 噬菌体采用依赖于 ρ 因子的终止以及通过抗终止因子的抗终止作用

71 四真核生物的终止子及转录终止了解很少 (3 末端 ) 1 RNApolⅡ 的终止子类似 Prok. 不依赖 ρ 因子终止子, 终止可能靠 RNApolⅡ 本身完成 SV40 的终止子 : 发夹结构 U 串 2 RNApolⅢ 的终止子类似原核生物 ( 发夹结构 U 串 ) U 串位于发夹结构的顶端且保守性很强 ( 酵母人 ) 环和柄对转录的终止同等重要

74 第六节原核生物转录产物的后加工 Pre-RNA processing in Prokaryotes

75 Φ Prok. 的 mrna 半衰期只有几分钟 ( 基因表达调控的一种手段 ) Φ rrna trna 比较稳定半衰期几小时成熟分子和转录产物的差别 : 5 单磷酸 / 三磷酸分子大小异常碱基

76 三 RNA 中的甲基化及常见的修饰核苷酸 m 5 C HNH H 3 C HNH m 6 A HNH O O HN CH 3 Prok. 中主要是碱基的修饰 Euk.-- 核糖碱基

77 第七节 Euk 转录产物的后加工 Pre-RNA processing in Eukaryotes

78 一 mrna 的转录后修饰帽子 1 帽子的种类帽子 0(Cap-0) m 7 GpppXpYp ( 共有 ) m 7 G N 7 甲基鸟苷帽子 1 (Cap-1) m 7 GpppXmpYp 第一个核苷酸的 2 -O 位上产生甲基化 (A N 6 位甲基化 ) 帽子 2(Cap-2) m7gpppxmpymp 第二个核苷酸的 2 -O 位上产生甲基化 (A G C U)

79 HN CH 3 m 7 G 帽子 0

81 其中 : 单细胞真核生物只有 Cap 0 Cap 1 是其余真核生物的主要帽子形式 Cap 2 存在于某些真核生物中 2 帽子结构的生成甲基供体都为 S 腺苷甲硫氨酸 (SAM) RNA 鸟苷酸转移酶戴帽酶 (capping enzyme)

82 3 帽子结构的功能 (1) 对翻译起识别作用为核糖体识别 RNA 提供信号 Cap 0 的全部都是识别的重要信号 Cap 1,2 的甲基化能增进识别 (2) 增加 mrna 的稳定性, 使 5 端免遭外切核酸酶的攻击 (3) 与某些 RNA 病毒的正链合成有关 (Cap 1 Cap 2 ) 除帽子结构外的 Euk.mRNA 内部甲基化 ---m 6 A 形式

83 二 mrna 的转录后修饰二多聚 (A) 尾巴 1 3 端约长 200bp ( 大多数 Euk. 的 mrna) (poly(a) + poly(a) - ) 最近研究发现, 原核生物的 RNA 转录后也有 3 添加 poly(a) 的现象 E.coli 的 poly(a)+ 聚合酶早在 1962 年就已发现 2 poly(a) 的生成 a RNA 末端腺苷酸转移酶 (poly(a) 聚合酶 ) 催化前体 --ATP

84 反应如下 : 多聚核糖核酸 + natp Mg ++ 或 Mn ++ 多聚核糖核酸 (A)n + nppi b 添加位点内切酶 (360KDa) 切除一段序列由 poly(a) 聚合酶催化添加 poly(a) 内切酶的识别位点 ( 有其它因子参与 ) 切点上游 13-20bp 处的 AAUAAA 切点下游的 GUGUGUG ( 单细胞 Euk. 除外 )

85 3 poly(a) 的功能 (1) 可能与核质转运有关 ) (2) 与 mrna 的寿命有关 (3) 与翻译有关 a 缺失可抑制体外翻译的起始 b 胚胎发育中,poly(A) 对其 mrna 的翻译有影响 ( 非 poly(a) 化的为储藏形式 ) c 对含 poly(a) 的 mrna 失去 poly(a) 可减弱其翻译

86 (4) poly(a) 在分子生物学实验中有很大应用价值 a 也可将 oligo (dt) 与载体相连, 从总体 RNA 中分离纯化 mrna b 用寡聚 dt(oligo (dt)) 为引物, 反转录合成 cdna

88 第八节 Euk. 转录产物中内元的去除 Intron removing in Eukaryote

89 一概述 1 概念割裂基因 (split gene): 指编码某一 RNA 的基因中有些序列并不出现在成熟的 RNA 序列中, 成熟 RNA 的序列在基因中被其他的序列隔开内元 (intron): 原初转录物中通过 RNA 拼接反应而被去除的 RNA 序列或基因中与这些 RNA 序列相应的 DNA 序列外元 (excon):

91 RNA 拼接 (RNA splicing): 一个基因的外元和内元共同转录在一条转录产物中, 将内元去除而把外元连接起来形成成熟 RNA 分子的过程拼接点 : 5 拼接点或左拼接点 ( 内元上游 ) 3 拼接点或右拼接点 ( 下游 )

92 2 内元的分类 1982 Davies 等人中部核心结构 (central core structure): 在有些内元中, 含有 4 个重复的保守序列, 长度为 10 ~ 20bp,4 个保守序列构成一种二级结构, 在拼接中起重要作用由于并非所有的内元都有中部核心结构, 所以有了内元的分类

93 Ⅰ 类内元 (group Ⅰ): 含有中部核心结构的细胞器基因核基因 Ⅱ 类内元 (group Ⅱ): 不含有中部核心结构细胞器线粒体基因内核基因 Ⅲ 类内元 (group Ⅲ): 具有 GU-AG 特征的边界序列核基因 mrna 前体 trna 基因的内元均位于 trna 的反密码环上

94 3 拼接方式方式一 : 由拼接装置完成 ( 核 mrna 内元 ) 可供识别的特异序列拼接装置由多种蛋白质和核蛋白组成方式二 : 自我拼接 ( 两类内元 Ⅰ Ⅱ) 形成特定的二级结构 RNA 具有催化拼接的能力方式三 : 需要蛋白质酶参与的拼接 ( 酵母 trna) 前两种拼接都属于转酯反应

95 三第 Ⅰ 类内元的拼接特点 : ø 拼接属于自我拼接 ø 形成明显的二级结构 1 结构特点 : (1) 5 拼接点和 3 拼接点 U G 5 exon U intron G exon 3

96 (2) 有由保守序列形成的二级结构 a 保守序列为 5 -P-Q-R-S-3 距拼接点很远, 各 10~12bp P 与 Q 互补 R 与 S 互补而形成中部核心结构

98 b 二级结构中还包括内元与外元的某一序列互补所形成的二级结构内部引导序列 (interal guide sequence IGS): 内元中能与两个拼接点边界序列配对的一段序列 # 第一类内元的拼接依赖于以上二级结构 -- 为自我拼接的进行提供活性位点

99 2 拼接机制 ( 以四膜虫的大 rrna 前体的拼接为例 ) (1) 两种 rrna 转录在一条 35S 的产物中, 26SrRNA 有内元 5 U G 3 小 rrna 大 rrna(26s 有内元 ) (2) 35SRNA 体外有自我拼接的能力反应需要 : 一价和二价离子鸟苷酸辅助因子 (GTP GDP GMP 和鸟嘌呤核苷 ) 不需能量的供给 3) 拼接反应后,G 与内元 (414base) 5 端以磷酸二酯键相连 ( 放射性标记试验 )

100 (4) 具体的拼接过程第一步 : 游离 G 发动的转酯反应 G 的 3 -OH 攻击内元的 5 拼接点 G- 内元左外元 ( 有游离 3 OH)

101 第二步 : 游离外元 ( 左 ) 发动的转酯反应左外元的 3 -OH 攻击 3 拼接点, 同时释放线状的内元, 形成成熟 RNA 分子

102 两次转酯反应是紧密偶联的释放出的内元可继续进行转酯反应而形成环状

103 (5) 自我拼接过程主要由转酯反应构成, 且完全由内元自身完成自我拼接的最大特点转酯反应是. 内元自身能形成特定的二级结构, 产生适于拼接反应的构象和活性位点, 在 G 的参与下完成拼接反应 ( 内部引导序列 ) 这一机制如下图所示 :

104 科罗拉多大学 Cech 等人完成 ( 美 ) 活性位点

105 四第二类内元的拼接 1 拼接点序列 exon----- GUGCG B.S----Py AU ----exon---3 供点受点 ----Py Pu Py Py U A Py % 7 核苷酸的保守序列 (Branch Site ) 3 拼接点上游 6bp ~ 12bp 处

106 在 Branch Site 的两侧存在一些短的序列, 与其上游 10-50Nt 处互成 IR, 形成茎环结构 ( 但 A 不包含在 IR 序列内, 从而被排除成芽状突起 ) 5 --GUGCG PyPuPyPyUAPy-----PyAU 3 Intron IR IR A 5 G AU 3

107 2 拼接机制 (Splicing mechanism) Int ron IR IR A 转酯攻击位点 5 G AU 3 G OH 2 A 3 AU intron intron Exon 1 Exon2 G A PyAU Matural RNA Lariat intron 套索状内元

108 五核基因 mrna 内元的拼接内元拼接与其他加工同时进行 1 相关概念 Euk. 的细胞中, 有许多碱基数在 100 ~ 300 之间的小分子 RNA, 每个细胞有 10 5 ~10 6 个 snrna: scrna: 细胞核中的细胞质中的 (snrnp) (scrnp) 2 核 mrna 内元拼接的结构特点

109 拼接点序 Breathnach-Chambon rule (GU-AG 规 5 ---exon--- GU intron AG exon----3 供点 100% 94% 受点 py X py U pu A py 7Nt branch site 3 拼接点的上游

110 3 拼接机制(Splicing mehanism ) SnRNA (or ScRNA) 与拼接点序列间存在互补区域并参与剪接, 形成拼接体 ( spliceosome) Spliceosome 逐级组装, SnRNA(U 1 U 2 U 5 和 U 4 /U 6 ) 分步替代 U1 通过与 5 拼接点互补而结合 U2 识别并结合分支点 A U1 和 U2 作用使内元的 5 端和 3 端带到一起 (U1 与 3 拼接点配对 ) U1 U2 mrna 与 U4-U5-U6 复合物形成一个完整的拼接体

111 第一次转酯 -- 左外元内元剪切套索第二次转酯 --exons 连接套索状内元释放拼接体 (spliceosome) 解体与 lariat 降解同步 lariat

112

113

114 第九节不连续转录和反式拼接 Discontinuous transcription and Trans-splicing

115 顺式拼接 : 通过拼接将一个 RNA 分子的内元拼接掉, 使外元连接在一起 (cis-splicing) 反式拼接 : 发生在两个 RNA 分子之间的拼接 (trans-spling) 一不连续转录的发现 1982 Vander Ploeg 等人研究锥虫的可变表面糖蛋白基因时发现在其 mrna 的 5 端有 35 个 bases 是其基因中所没有的锥虫的全部 mrna 都含有这个 35bases 序列称其为前导序列 (leader sequence)

116 1 前导序列由位于基因组其它区域的连续重复序列转录而来 200 copies 左右每个重复单位的 3 端还有 100base 的一段序列 ( 内元 ) 因此一种完整 mrna 的前导序列及特异基因编码的 mrna 序列部分的转录是不连续的

117 每个重复单位的前导序列后面存在一个真核生物典型的 5 拼接点 GU 而完整 mrna 的特异基因编码的 mrna 序列的前面都有一个保守的 3 拼接点 AG, 以及分支点 A

118 二反式拼接前导序列与特异基因编码的 mrna 序列部分形成成熟的 mrna 的拼接方式属反式拼接 1986 W. J. Marphy 和 R. E. Sutton 1 前导序列的 3 区和 mrna 的 5 区各相当于一个内元的一半 2 拼接过程形成 Y 型结构线虫的肌动蛋白基因植物叶绿体基因

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121 RNA 的编辑 (RNA editing) 概念 :RNA 编辑是指某些 RNA, 特别是 mrna 前体的一种加工方式, 导致 DNA 所编码的遗传信息发生改变方式 : 核苷酸残基的插入删除或取代意义 : 校正 : 拯救突变位点, 校正基因表达调控 : 构建或去除起始密码子和终止密码子扩充 : 使基因产物获得新的结构和功能, 有利于生物的进化

122 RNA 的再编码 (RNA recoding) RNA 的再编码 :RNA 编码和读码的方式的改变 mrna 在某些情况下不是以固定的方式翻译, 而可以改变原来的编码信息, 以不同的方式进行编码??RNA 在生物进化中的地位!!!

123 名词解释转录启动子 RNA 拼接不连续转录转录终止子简答题 1 说明 RNApol 全酶各个亚基的主要功能 2 以 E.coli 为例, 说出 Prok. 启动子结构及各部分功能 3 以 Prok. 为例简述转录起始过程 4 终止子和终止密码子有何区别? 5 试述 Prok. 中转录终止子的类型及终止机制 6 解释 E.coli 的 λ 噬菌体调控不同发育阶段基因表达的抗终止机制

124 7 简述内元的种类及拼接方式 8 说明 trna 内元拼接的简单步骤和特点 9 trna 基因的类型及各类型的前体在加工过程中所要解决的问题 10 说明 poly(a) 在分子生物学实验中的应用价值 11 为什么在细菌(Prok.) 中很少涉及到 ρ 因子? 12 Euk.mRNA 帽子的种类 13 以四膜虫的大 rrna 前体的拼接为例, 说明第 Ⅰ 类内元拼接的简单过程及特点

125 14 真核生物 mrna 的 3 poly(a) 的编码情况及其准确生成的机制为何? 15 综合比较四种内元拼接方式的异同 16 解释套索结构, 及内元中的套索结构中的磷酸二酯键有何特殊之处

第八章 RNA的转录合成 Chapter RNA Processing

第八章 RNA的转录合成 Chapter RNA Processing 第八章 Chapter 8 RNA 的转录合成 RNA Processing 一 RNA 转录概述转录 : 在 DNA 指导下的 RNA 的合成 DNA 碱基配对 RNA 与 DNA 互补 RNA 聚合酶催化加工修饰 DNA RNA 前体成熟 RNA 编码链模板链 5 G C A G T A C A T G T C 3 3 CG T C A T G T A C A G 5 } DNA 5 G