畜 牧 兽 医 学 报 " 卷 #$ $& & 4&$ %# / *$%9). %1# # #0% 1% 1 %%% 1% % 2# // *4&$ % 9). % 1# #0 % % / ( / *4&4& $ % 9). %&2 %0% & / *4&) 4&&& &#% 2 2 #1# #0

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1 畜牧兽医学报 0 0 鼠伤寒沙门菌 "*-% 和 $"' 双基因缺失菌株的构建及其对抗菌药物敏感性分析 黄 慧 刘保光 孙亚伟 马彩珲 陈丽鹏 苑 丽 潘玉善 胡功政 河南农业大学牧医工程学院 郑州 河南科技学院动物科技学院 新乡 摘 要 为了探索 4& 基因对鼠伤寒沙门菌多重耐药性的调控机制 同时避免外排泵 * 的存在掩盖 4& 对其他外排泵或外膜蛋白的调控作用 利用基于 8 同源重组系统的一步法失活染色体基因 用含有同源臂的线性打靶 3,! 片段替换目的基因 构建鼠伤寒沙门菌 / 株的 * 基因缺失株 / * 然后利用噬菌体转导技术 以前期构建的 4& 缺失株 /4& 为供体菌 本研究新构建的 / * 为受体菌 在 ; 噬菌体的作用下构建双基因缺失菌株 / *4& 同时制备 4& 基因回补菌株 / *4&4& 最后用微量稀释法测定 种临床常用代表性抗菌药物对 / 和各缺失株的最小抑菌浓度 9). 结果表明 成功构建鼠伤寒沙门菌的双基因缺失菌株 / *4& 以及其 4& 基因互补菌株 / *4&4&9). 结果显示 * 基因缺失后 多西环素 庆大霉素 阿米卡星 环丙沙星 恩诺沙星 氟苯尼考 头孢曲松和头孢噻呋的 9). 值分别降低 和 倍 双基因缺失后 多西环素 庆大霉素 阿米卡星和头孢噻呋的 9). 值进一步降低 和 倍 而将 4& 基因回补之后 这 种抗菌药物的 9). 值会升高 和 倍 结果表明 4& 能调控鼠伤寒沙门菌对多西环素 庆大霉素 阿米卡星和头孢噻呋的敏感性 关键词 鼠伤寒沙门菌 4&* 双基因缺失 9). 中图分类号 文献标志码! 文章编号 + ' / '&+!"*-% + $"' $/ * 3 + $ * '&+7'&+!$ 0$0 #0 "$ 74&%/ &/% ++ *&! ' 7/'& &*&' ' +'& '& *+' *+!,7 * )+( +, - $ 9!..*', -+!, ;!, - *+ 74 2) $(!-( $ $'(3 ) 2) $(!#$ $ (- '! $ (/4( ) ' ' %#$1% 4& % $# $2 #1&#* 0 % % 4& %1 &! * / * $ &# %2 %& % 8 & #! &/ *4& $ &# ; $ /4& 2 #/ * 9 $ 4& / *4& 4& $ 1 (!3. 18&! &# 9). %0% #2& % /&2 收稿日期 基金项目 国家自然科学基金 " 作者简介 黄 慧 女 河南罗山人 博士生 主要从事抗感染药物药理及细菌耐药性研究 '$ 通信作者 胡功政 教授 ' #&

2 畜 牧 兽 医 学 报 " 卷 #$ $& & 4&$ %# / *$%9). %1# # #0% 1% 1 %%% 1% % 2# // *4&$ % 9). % 1# #0 % % / ( / *4&4& $ % 9). %&2 %0% & / *4&) 4&&& &#% 2 2 #1# #0 % % 22 #4&* && #9).. 1!8 系统是革兰阴性菌中普遍存在的与耐药性和致病性相关的一种双组分信号转导系统 $#. 其应答调控子. 18 含有多个可与不同的 3,! 序列 特异性结合的位点 可有选择地上调或下调基因的转录从而调控细菌的生命活动 有研究显示. 18 可调控大肠杆菌对新生霉素 卡那霉素以 及部分 内酰胺类抗生素 苯唑西林 头孢美唑等 六种药物 的耐药性 * 等将鼠伤寒沙门菌头孢曲松耐药菌株 8 的 4!8 敲除后 发现菌株对头孢菌素 头孢羟唑的耐药性明显降低 对四环素 链霉素 氯霉素 庆大霉素等药物的耐药性也 有不同幅度的降低 69# 等的研究显示. 18 磷酸化后能降低氨基糖苷类药物和羟基脲的敏感性 这些初步表明. 1!8 对细菌多重耐药性 938 有重要调控作用 主动外排系统是 938 形成的一个重要机制 阴性菌中有多个外排系统与 938 有关 其中!!(. 是 938 形成最重要的外排系统 现有的研究表明 * 的表达不受任何双组份调控子 的调控 不同的双组分信号转导系统对 938 的调控是通过调控 * 以外的其他外排泵来实 现 但 * 的存在和表达可能会掩盖其他外 排系统的作用 **0 $ 等的研究发现在 * 缺失大肠杆菌中 4& 可上调外排泵 0 的 表达量 * 等的研究发现 4& 的缺失可影响外排泵 0 和 " 的表达量 而, 等的研究发现 (8!3 和 9!(. 对耐药性的调控作用只能在 ( 缺失菌中被观察到 目前未见有鼠伤寒沙门菌 ( 缺失时 研究 4& 对细菌抗菌药物敏感性影响的报道 作者前期已将鼠伤寒沙门菌 4& 基因敲除并进行了回补试验 初步证实了 4& 可影响鼠伤寒沙门菌对 内酰胺类的头孢曲松和头孢噻呋以及氨基糖苷类的阿米卡星和庆大霉素的敏感性 本研究为避免 * 的存在掩盖 4& 对其他外排泵或外膜蛋白的调控作用 构建 4& 和 * 双基因缺失株 并分析该缺失株对抗菌药物敏感性的变化 为阐明 4& 调控鼠伤寒沙门菌 938 作用的分子机制奠定基础 材料与方法 ( 菌株和质粒鼠伤寒沙门菌标准菌种.:.. 以下命名为 / 本实验室保存 源自中国兽医药品监察所 质控菌 大肠埃希菌!.. 购自中国普通微生物菌种保存中心 3 质粒 3 质粒.; 质粒 本实验室保存 沙门菌噬菌体 ;* 河南科技学院馈赠 ( 主要试剂和药品 ( 肉汤 ( 琼脂 9* 肉汤等培养基购自北京陆桥技术有限责任公司 质粒小量提取试剂盒购自美国 9'7! 公司 (9 3,! 90 购自北京 ( 公司 ;!8 9 1; 1G 购自 8 公司 7'9 '# : 购自 ; 公司 3,! 胶回收试剂盒购自上海生工生物有限公司 ;.8 引物由上海生工公司合成 氨苄青霉素 卡那霉素购于上海生工生物工程有限公司 多西环素 土霉素 庆大霉素 阿米卡星 喹乙醇 环丙沙星 恩诺沙星 氟苯尼考 头孢曲松 头孢噻呋均为

3 期 黄 慧等 鼠伤寒沙门菌 4& 和 * 双基因缺失菌株的构建及其对抗菌药物敏感性分析 " 国产原料药 符合中国药典或中国兽药典质量标准 使用前置 F 冰箱保存 使用时均在有效期之内 ($"' 基因缺失株的构建 引物设计 根据 7(0 数据库公布的鼠伤寒沙门菌 * 基因全序列 *7 利用 ; 软件设计 对特异性引物 其中 (6 (8 为 * 基因敲除引物 其 H 末端的部分序列与 * 两侧序列同源 靠近 H 末端的部分序列与质粒 3 上 两侧序列互补 用于同源重组 (6(8 为 * 敲除鉴定引物 用于检测 * 缺失突变株 为 4& 基因失活鉴定引物 与 (6(8 同时用来鉴定 4& 和 * 双基因缺失突变株 引物序列见表 一步法失活 * 基因 以 3 质粒为模板 用 (6 (8 引物扩增两侧带有 68 位点的 及 * 两侧同源臂的线性融合 ;.8 产物 线性打靶 3,! 片段 将编码 8 重组系统的 3 质粒电击转化到 / 感受态细胞 经! 的 阿拉伯糖诱导后 将线性融合 ;.8 产物电击转化入 /3 感受态细胞中 在! 的 ( 平板上筛选重组突变体 将阳性重组突变体置 F 培养 再在 ( 琼脂平板上 " F 培养过夜 筛选出仅在 的 ( 中生长的突变体 即为带有 基因的 * 缺失突变体 / * 此时质粒 3 被消除 将.; 质粒电击转化导入 / * F 振荡培养 后 筛选无 # 和 的突变体 此突变体 基因被消除 只剩下一个 68 位点 即 / * 最后以其基因组 3,! 为模板 用 / 做对照 用 (6(8 引物进行 ;.8 鉴定 同时 ;.8 产物测序验证 表 鼠伤寒沙门菌 "*-% 基因同源重组引物 *%*/% &+ '&+&%!"*-% + &+10 #0 "$74&%/ &/% 引物 ; 用途 + 序列 H H 长度 & ; % % 4&00!77777!!!!!.!!.7!!!7. 7.!!.!.!77!..7.!!7.!. / * /4& / *4&!!.. 7..!7...!77.!!.!!!.! (6 (8 *00 77!7..7!!7!.7 7!77. 77! ! 7.!!.7. 7! " !!.!! 7!!!....!7 (6 (8. % %* 00!..77.!..7!.7. 77!!!77. 77!7!!7.7!. /4& "/ * / *4& 带下划横线的碱基为同源臂 & ("*-% 和 $"' 双基因缺失株的构建 利用噬菌体转导技术 以本实验室已构建好的 替代 4& 基因后的菌株 /4& 为供体菌 / * 为受体菌 制备双基因缺失菌株 图 噬菌体增殖 挑取 / 单个菌落接种于 ( 肉汤培养基中 " F 振荡培养 使其浓度达到.6+! 取噬菌体原液 加入到 细菌培养液中 " F 静置 使噬菌体吸附细菌 后置 " F 振荡培养 可见细菌被裂解 加入 氯仿 振荡混匀 离心取上清液用 滤膜过滤 即得较纯的噬菌体 F 保存 将噬菌体增殖液与 ( 琼脂制成双层琼脂培养板 观察噬菌斑的形成并进行噬菌斑计数 含有 4& 片段的噬菌粒的制备 挑取供体菌 /4& 单个菌落接种于 ( 肉汤培养基中 " F 振荡培养过夜 后加入适量的噬菌体增殖液 " F 静置 后振荡培养 制备出含有 4& 片段的噬菌粒 噬菌体转导 挑取受体菌 / * 单菌落接种于 ( 肉汤培养基中 " F 振荡培养过夜 取 含有 4& 片段的噬菌粒与

4 畜 牧 兽 医 学 报 " 卷 过夜培养的受体菌 / * 菌液混合 室温静置 后加入 ( 肉汤培养基 " F 振荡培养 离心收集细菌沉淀 用 ( 肉汤培养基悬浮 后涂布于的! ( 琼脂平板上 筛选阳性转导子 转导子的鉴定 挑取筛选平板上的单克隆接种于! 的 ( 肉汤培养基中过夜培养 提取细菌 3,! 进行 ;.8 鉴定 鉴定引物见表 同时将 ;.8 产物送华大基因公司测序以验证 ** 同源臂 (6 (8 扩增线性打靶 3,! 片段的引物 鉴定 4& 缺失的引物 (6(8 鉴定 * 缺失的引物 ***(6 (8; %%%3,!% ; %% % 4& (6(8; %% %* 图 双基因缺失过程及引物使用策略 )& (''!' + * '&+ + ' / &+!&% (0"*-% 基因回补菌株的构建 将事先构建好的 (!3. 18 表达质粒电转化导入双基因缺失菌株中 获得回补菌株 命名为 / *4&4& (; 值的测定 用微量肉汤稀释法测定 种抗菌药物多西环素 土霉素 庆大霉素 阿米卡星 喹乙醇 环丙沙星 恩诺沙星 氟苯尼考 头孢曲松 头孢噻呋对 / / */ *4& 和 / *4& 4& 的最小抑菌浓度 9). 质控菌为大肠杆菌!.. 试验重复 次 结果取平均值 结 果 ($"' 基因缺失株的鉴定 用引物 (6(8 对 * 基因敲除前后的菌株 / 和 / * 进行 ;.8 扩增 分别扩增出大小为 & 左右和 & 左右的片段 如图 同时测序结果也证明 * 被成功敲除 只剩 & 的残留 68 位点 ("*-% 和 $"' 双基因缺失株的鉴定 噬菌斑的形成 噬菌体增殖后 在双层琼脂培养板上形成明显的噬菌斑 如图 转导子的筛选与鉴定 含有 4& 片段的噬菌粒与受体菌 / * 混合培养后 在! ( 琼脂平板上长出 的转导子 如图! 所示 说明噬菌粒已将 4& 片段传导给受体菌 / * 挑取转导子的单克隆 用 4& 缺失 鉴定引物 和 * 缺失鉴定引物 (6(8 分别进行 ;.8 扩增 5 琼脂糖电泳均出现预期大小的条带 如图 ( 同时测

5 期 黄 慧等 鼠伤寒沙门菌 4& 和 * 双基因缺失菌株的构建及其对抗菌药物敏感性分析 9(9 3,! 相对分子质量标准 用 (6(8 引物扩增 / 的 * 基因 用 (6(8 引物扩增 / * 的 * 基因缺失后的片段 9(9 3,! 0*% %/ &# (6(8 % % % / *&#(6(8 图 $"' 基因缺失株的 鉴定 )& ( +'&!&'&+!$"' + * '&+ 序结果也证实筛选的转导子为 4& 和 * 双基因缺失株 ( 药敏试验 药敏试验中 质控菌大肠杆菌!.. 对所有抗菌药物均敏感 每种抗菌药物的 9). 值均在. ) 允许的范围内 喹乙醇暂无质控菌的标 图 噬菌体 0&+' 侵染鼠伤寒沙门菌后形成的噬菌斑 )& (* 8/!'' &+!'&+!$ 0$ &%/ &/% 0&+' 准数据 * 缺失后 与亲本菌 / 相比 对多种抗菌药物的敏感性均明显升高 多西环素 庆大霉素 阿米卡星 环丙沙星 恩诺沙星 氟苯尼考 头孢曲松和头孢噻呋的 9). 值分别降低了 和 倍 双基因缺失后 其中 种抗菌药物 多西环素 庆大霉素 阿米卡星和头孢噻呋 的 9). 值分别又降低了 和 倍 而将 4& 基因回补到双基因缺失菌株 / *4& 中后 这 种抗菌药物的 9). 值分别升高了 和 倍 且头孢曲松的 9). 也升高了 倍 表! 平板上白色菌落即为阳性转导子所形成的菌落 (;.8 鉴定 9(9 3,! 相对分子质量标准 引物 扩增菌株 /4& 所得产物 引物 (6(8 扩增菌株 /4& 所得片段 引物 扩增菌株 / * 所得产物 引物 (6(8 扩增菌株 / * 所得片段 用引物 扩增菌株 / *4& 所得片段 引物 (6(8 扩增 / *4& 所得片段!;2 $0# (;.89(9 3,! 0 % % %/4&&# % % %/4&&#(6 (8% % % / * &# % % % / * &# (6(8 % % %/ *4&&#. 6. 8% % %/ *4&&#(6(8 图 转导子的筛选与 鉴定 )& (7+&+ ++!& % '&+!' '+/ ' +'

6 畜 牧 兽 医 学 报 " 卷 表 双基因缺失株对 种临床常用代表药物的敏感性检测 ; * /'& &*&'&!' + * '&+%/' +'' +' '&4+'& '& *+'! 抗菌药物!& / / * / * 4& 9). / *4&4& 5!.. 多西环素 31# # 土霉素 1## 庆大霉素 7 " " 阿米卡星! 0 喹乙醇 1 环丙沙星.% 1 恩诺沙星 '% 1 氟苯尼考 6% 头孢曲松. % 1 头孢噻呋. % % 不加诱导剂和 5 的 阿拉伯糖诱导 $ &#5 & 讨 论 随着分子遗传学的发展 噬菌体转导已成为基因精细结构分析的常用方法 它是以噬菌体为媒介将一个细胞的遗传物质转移给另一个细胞的过程 作者首先利用基于 噬菌体短同源序列重组功能的 8 同源重组系统分别构建鼠伤寒沙门菌 4& 缺失株和 * 缺失株 然后利用噬菌体转导方法 在 ; 噬菌体的作用下将 4& 失活片段转移给 * 缺失株 成功构建鼠伤寒沙门菌 4& 和 * 双基因缺失菌株 该方法不需要限制性内切核酸酶和连接酶 不需要复杂的体外重组操作 高效 简单 可操作性强 本研究中 鼠伤寒沙门菌 * 缺失后 其对多西环素 庆大霉素 阿米卡星 环丙沙星 恩诺沙星 氟苯尼考 头孢噻呋的敏感性均明显增强 尤其是对多西环素 环丙沙星 恩诺沙星和头孢噻呋 9). 值降低 倍 多重耐药泵 * 具有广泛的底物 包括氟喹诺酮类 内酰胺类 四环素类 氯霉素 类和大环内酯类等 ( 等的研究发现 * 在鼠伤寒沙门菌的氟喹诺酮类药物抗性中发挥重要作用 * 的失活可使恩诺沙星耐药性降低 " 倍 孟春萍在鸭源大肠杆菌中缺失 * 时 发现庆大霉素 头孢噻呋 氟苯尼考 恩诺沙星 多西环素的 9). 值分别降低 倍 本研究在鼠伤寒沙门菌中敲除 * 后 9). 变化与以往的报道基本一致 说明 * 作为最主要的外排泵对鼠伤寒沙门菌 938 形成尤其是氟喹诺酮类和 内酰胺类药物耐药性形成中发挥重要作用 在 * 基因缺失中同时缺失 4& 基因时 菌株对多西环素 庆大霉素 阿米卡星和头孢噻呋这四种药物的敏感性进一步升高 倍 土霉素和头孢曲松分别与多西环素和头孢噻呋属同一类药物 而它们的敏感性却未发生变化 可能是因为 4& 对 938 的调控是通过调控外排泵和外膜蛋白来实现的 而相关的外排泵或外膜蛋白对同一类的不同药物的外排能力和渗透能力可能不同 在 * 和 4& 双基因缺失株中将 4& 回补后 菌株对多西环素 庆大霉素 阿米卡星 头孢曲松和头孢噻呋的敏感性却有不同程度的降低 倍 这一结果说明 4& 可调控鼠伤寒沙门菌对多西环素 庆大霉素 阿米卡星和头孢噻呋的敏感性 前期通过构建 4& 基因缺失株进行药物敏感性分析 发现 4& 可影响鼠伤寒沙门菌对庆大霉素 阿米卡星 头孢曲松和头孢噻呋的敏感性 本研究通过构建 * 和 4& 双基因缺失株后进行药物敏感性分析 发现 4& 还可

7 期 黄 慧等 鼠伤寒沙门菌 4& 和 * 双基因缺失菌株的构建及其对抗菌药物敏感性分析 影响鼠伤寒沙门菌对多西环素的敏感性, 等发现细菌. 中的应答调控子可通过调控一些药物转运基因的表达而调控细菌的 938 例如 大肠杆菌双组分调控子 '2! 可上调 " 药物外排基因 # 的表达 (8 可 上调控外排泵 0 和 # *) 的表达 沙门菌的 个功能性药物外排泵中 * 是 938 形成最重要的外排泵 0 被证实是调控大肠杆菌对氨 基糖苷类敏感性的重要外排泵 也有研究证实大肠杆菌对 内酰胺类敏感性主要受依赖. 的种 8,3 家族外排系统 *01"# *)# 1" 的协调调控 * 等发现 4& 可影响外排泵 0" 以及部分外膜蛋白的表达量 本试验中 4& 缺失后 菌株对多西环素 庆大霉素 阿米卡星 头孢曲松和头孢噻呋的 9). 值降低 可能与其调控外排泵 0 及外膜蛋白的表达量有关 然而 4& 具体是调控哪些外排泵或外膜蛋白基因以及其调控机制还需进一步研究 结 论构建鼠伤寒沙门菌 / 株的 4& 和 * 双基因缺失株 并分析其对抗菌药物敏感性的变化 发现 4& 能调控鼠伤寒沙门菌对多西环素 庆大霉素 阿米卡星和头孢噻呋的敏感性 参考文献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

8 畜 牧 兽 医 学 报 " 卷 +!:) 9.* +' '!8..8!9'8.!& &#% %1' $ 0%1/ # (') # (!+.*'8, )9('8'.* *.*! + 3!,.! ' * # 2% $# $ 2 # #3/ 0 ( &'' " 孟春萍 鸭大肠杆菌 * 基因的缺失突变株构建及其相关功能研究 3 郑州 河南农业大学 9',7. ;.% * % 21' $ & % 3 <4*! + 2#. 刘建华 苑 丽 潘玉善 等 氨基糖苷类耐药鸭大肠杆菌 0 基因 8,! 表达水平 / 中国兽医学报 )+/*-+!, ;!, - 1 % 0 % # 12 $ %0/ ) ' $!. 编辑 白永平

臧晓南 张学成 王高歌 刘金姐 张晓辉 刘 滨 对两种丝状蓝藻 钝顶节旋藻和盐泽螺旋藻 在基因工程中常用作选择试剂的 种抗生素 氯霉素 氨苄青霉素 红霉素 链霉素 卡那霉素 庆大霉素和新霉素 的敏感性作比较实验 结果表明 两种蓝藻对抗生素的敏感性既有共同的特点 也有 明显的差异 它们对红霉素 氯霉素和链霉素最敏感 致死浓度分别为 和 两种蓝藻对氨苄青霉素比较敏感 的氨苄青霉素即可抑制 和 的生长 但

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