前言促蛋白合成雄性激素类固醇 (AAS) 的非医学使用在美国是违法的, 同时也被大多数体育组织所禁止然而, 无论对于业余还是职业体育运动来说,AAS 兴奋剂问题由来已久, 并且在高中和高校竞赛中日益显现 1988 奥运会上, 由于尿样中被检出司坦唑醇, 短跑运动员本约翰逊被取消参赛资格, 已

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宽悲邹
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1 尿液中促蛋白合成类固醇代谢物的长期检测应用摘要兴奋剂取证 / 检测技术作者 Stephan Baumann Agilent Technologies, Inc Stevens Creek Blvd Santa Clara, CA USA 摘要利用安捷伦 6890N 气相色谱串联 5975B 质谱和安捷伦 7000 系列三重四极杆 GC/MS 建立了对尿液中促蛋白合成类固醇代谢物长期检测的方法利用 GC/MS 的 SIM 模式监测代谢物的硫酸盐结合物, 而不是常规的葡萄糖醛酸结合物, 使美替诺龙 ( 甲基雄烯醇酮 ) 用药后能够被检测到的时间延长了两倍使用三重四极杆 GC/MS 的 SRM 模式还可以进一步延长检测期限, 几乎是常规检测葡萄糖醛酸结合物方法检测期限的三倍

2 前言促蛋白合成雄性激素类固醇 (AAS) 的非医学使用在美国是违法的, 同时也被大多数体育组织所禁止然而, 无论对于业余还是职业体育运动来说,AAS 兴奋剂问题由来已久, 并且在高中和高校竞赛中日益显现 1988 奥运会上, 由于尿样中被检出司坦唑醇, 短跑运动员本约翰逊被取消参赛资格, 已经取得的金牌和两项世界纪录也被取消弗洛伊德兰迪斯由于在筛查试验中被检测到睾丸酮 / 表睾丸酮比偏高, 因此被取消了 2006 年环法总冠军头衔, 并被处以两年禁赛的处罚熟悉反兴奋剂法规的违规者知道, 如果在常规药检之前停药时间足够长, 就可以在训练时安全使用而不被检出因此违规者精心调整最后一次使用 AAS 的时间和兴奋剂检测尿样采集时间的间隔以确保检测结果呈阴性因此,AAS 的可追溯检测是成功反兴奋剂必不可少的现在全世界的兴奋剂检测实验室都在寻找能够在停止使用后更长的时期内检测到 AAS 的方法典型的尿液中促蛋白合成类固醇及其相关物质的兴奋剂检测方法是通过气相色谱 / 质谱联用 (GC/MS) 进行筛查然而, 传统的分析方法只能在用药后五天左右的时间之内检测到 AAS 通过使用能够检测到超低浓度 AAS 的仪器寻找和监测尿液中的长期代谢物以, 就可以在用药后更长时期内检测到促蛋白合成类固醇 [1-3] 本文介绍了使用安捷伦 6890N 气相色谱串联 5975B 质谱和安捷伦 7000 系列三重四极杆 GC/MS 建立可以延长 AAS 检测期限的方法对 AAS 的代谢物硫酸盐结合物的检测使本方法的建立成为可能, 因为 AAS 的硫酸盐结合物比常规检测的 AAS 代谢物在人体内可以存在更长时间 [4, 5] 利用 6890N 气相色谱串联 5975B 质谱, 可以将 AAS 代谢物的检出期限延长至常规 GC/MS 方法的两倍而应用安捷伦 7000 系三重四极杆 GC/MS 可以将 AAS 代谢物的检出期限延长至常规 GC/MS 方法的三倍, 并且干扰少, 灵敏度高实验部分标样及试剂实验所用标样及试剂见表 1 仪器使用的 GC/MS 是配有分流 / 不分流毛细管进样口的 6890N 气相色谱和安捷伦 5795B GC/MSD 使用的 GC/MS/MS 是配有分流 / 不分流毛细管进样口的安捷伦 7890A 气相色谱和安捷伦 7000 系三重四极杆 GC/MS 仪器条件见表 2 和表 3 表 1. 标样及试剂内标 4- 氯 - 睾酮 Fluka 试剂 N- 甲基 -N-( 三甲基硅烷 ) 三氟乙酰胺 Campbell Science Cat. number DR100 (MSFTA) 甲醇 Burdick & Jackson GC230-4 乙腈 Burdick & Jackson 碘化铵 Fluka 巯基乙醇 Sigma

3 表 2. 配安捷伦 5975B 系列 GC/MSD 的安捷伦 6890N 联机 GC 的色谱和质谱条件 GC 运行条件分析柱 Custom HP-1ms 10 m 0.15 mm, 膜厚度 0.12 µm 进样量 1 µl 载气氢气, 恒流,1.0 ml/min ral-turinabol 升温程序 150 C (0.4 min), 以 60 C/min 升至 192 C; 以 5.4 C/min 升至 217 C; 以 47 C 升至 310 C (0.29 min) 美替诺龙升温程序 180 C (0.4 min), 以 62 C/min 升至 235 C; 以 42 C/min 升至 290 C; 以 40 C 升至 310 C (1.9 min) 传输管线温度 280 C MS 条件调谐自动调谐 EMV 补偿 +400 离子采集参数 EI; 选择离子监测溶剂延迟 1.5 min MS 温度离子源 230 C; 四极杆 150 C 表 3. 安捷伦 7000 系三重四极杆 GC/MS 气相色谱和质谱条件 GC 运行条件分析柱 Custom HP-1ms 10 m 0.15 mm, 0.12 µm film 美替诺龙进样量 1 µl ral-turinabol 进样量 0.2 µl 载气氢气, 恒流,1.0 ml/min 分析柱升温程序 180 C (0.4 min), 以 62 C/min 升至 235 C, 以 42 C/min 升至 290 C, 以 40 C 升至 310 C (1.9 min) 传输管线温度 280 C MS 条件调谐自动调谐 EMV 补偿 20 离子采集参数 EI, 选择反应监测碰撞气体流量 N 2 碰撞气体 :1.5 ml/min 溶剂延迟 1.5 min MS 温度离子源 230 C; 四极杆 150 C 样品制备经固相萃取柱初步净化 ( 去除尿基质 ) 后, 用 β- 葡萄糖醛酸酶处理提取物以有效裂开葡萄糖醛酸结合物, 产生游离类固醇混合物过 C-18 固相萃取柱, 用乙腈淋洗以去除未裂开的类固醇硫酸盐结合物和其他污染物然后用甲醇洗脱酶解得到的游离类固醇, 衍生化后用于 GC/MS 分析吹干含有类固醇硫酸盐的乙腈淋洗液, 用 β- 葡萄糖醛酸酶 / 芳基硫酸酯酶水解其中含有的硫酸盐结合物再将水解提取物过 C-18 固相萃取柱, 用乙腈淋洗去除残存的污染物用甲醇洗脱游离类固醇, 吹干, 衍生化后用于 GC/MS 分析样品吹干, 然后溶解在 100 µl N- 甲基 -N-( 三甲基硅烷 ) 三氟乙酰胺 (MSFTA)- NH4I- 乙硫醇 (100:2:3, v/w/v) 中, 并在 65 C 下衍生 15 min [3] 3

4 分析参数不同 AAS 代谢物的 GC/MS 分析参数见表 4, 三重四极杆 GC/MS 参数见表 5 结果类固醇代谢物的长期检测促蛋白合成类固醇及其代谢物以葡糖醛酸或硫酸盐结合物的形式随尿液排出体外, 在分析之前首先要将类固醇解离目前来源于大肠杆菌的 β- 葡萄糖醛酸酶, 经常被用在兴奋剂检测的常规类固醇分析中然而, 该酶不能裂开类固醇的硫酸盐结合物, 因此在常规检查中以硫酸盐结合物形式存在的类固醇是不可见的由于尿液中硫酸盐结合物比葡萄糖醛酸结合物存在时间长, 所以如果某种方法能够使硫酸盐结合物可视化就能够实现类固醇的长期检测盐结合物完全分离的色谱图 ( 图 1) 图 1 中下方的葡萄糖醛酸部分的色谱图显示了 3α- 羟基代谢物及其母体结合物 (17β- 羟基 ) 的存在这两个化合物在兴奋剂检测中通常是常规筛查和步骤确证的目标物图 1 中上方显示了硫酸盐提取物的色谱图, 其中用红色标出的代谢物与 16- 羟基 3,17- 二酮结构相匹配在这种情况下,18% 的羟孕酮代谢物是与葡萄糖醛酸相结合的 ( 下方色谱图中 6.9 分钟时的红色峰 ) 而占 82% 的大部分的羟孕酮代谢物以硫酸盐结合物的形式被排出体外 ( 上方色谱图 ) 通常, 尿液中美替诺龙代谢物的葡萄糖醛酸目标物只能在口服药物后五天以内检测到而美替诺龙的羟孕酮硫酸盐结合物可以用常规的 GC/MS 在口服后至少 9 天内检测到硫酸盐结合的 16- 羟基 -3,17- 二酮代谢物是 A 环中含有甲基的促蛋白合成类固醇中普遍存在的主要代谢物, 包括司腾勃龙羟甲雄酮和甲二氢睾酮 ( 数据未列出 ) 使用 β- 葡萄糖醛酸酶 / 芳基硫酸酯酶和选择性提取步骤可以将促蛋白合成类固醇及其代谢物从硫酸盐结合物中释放出来从尿样提取液的色谱图结果中可以看出, 使用常规的 GC/MS 选择离子监测 (SIM) 模式进行测定, 可得到美替诺龙代谢物的葡萄糖醛酸和硫酸表 4a. 配安捷伦 5975B 系列 GC/MSD 检测器的安捷伦联机 6890N GC 检测美替诺龙的参数化合物保留时间 (min) 选择离子停留时间 (ms) 美替诺龙代谢物 (16- 羟基 -1α- 甲基 -5α- 雄甾 -1- 烯 -3,17- 二酮 ) 氯睾酮 (ISTD) 表 4b. 配安捷伦 5975B 系列 GC/MSD 检测器的安捷伦联机 6890N GC 检测 ral-turinabol 的参数化合物保留时间 (min) 选择离子停留时间 (ms) ral-turinabol( 脱氢氯甲基睾酮 ) 代谢物氯睾酮 (ISTD) 表 5. 安捷伦 7000 系列三重四极杆 GC/MS 分析参数化合物保留时间 (min) SRM 停留时间 (ms) 碰撞能量 (EV) 美替诺龙代谢物 (16β- 羟基 -1α- 甲基 -5α- 雄甾 -1- 烯 -3,17- 二酮 ) ral-turinabol 代谢物 ( 脱氢氯甲基睾酮代谢物 ) 氯睾酮 (ISTD)

5 H H H H CH 2 5 H H 图 1. 从注射美替诺龙对象的尿液中提取得到的美替诺龙葡萄糖醛酸和硫酸盐部分的 GC/MS SIM 色谱图. 下方葡萄糖醛酸部分的色谱图显示 3α- 羟基代谢物及母体结合物 (17β- 羟基 ) 的存在上方显示了硫酸盐提取物的色谱图, 其中用红色标出的代谢物与 16- 羟基 3,17- 二酮 ( 羟孕酮 ) 结构相匹配, 其中 82% 以硫酸盐形式排出美替诺龙代谢物的葡萄糖醛酸部分只能在服药后 5 天之内检测到, 而其硫酸盐结合的代谢物可以在至少 9 天内检测到蓝色迹线指示 3α 羟基代谢物的 431 m/z 离子, 红色迹线指示羟孕酮代谢物的 517 m/z 离子 5

应用三重四极杆 GC/MS 延长检测期限使用三重四极 GC/MS 联用仪的选择反应监测 (SRM) 分析能够进一步延长促蛋白合成类固醇的检测期限这是因为该模式与传统的 GC/MS SIM 模式相比基质干扰少, 灵敏度高应用 SRM 模式可以在服用类固醇 14 天后检测到美替诺龙, 而对应的 GC/MS SIM 模式仅为 9 天 ( 图 2) 服药 12 天后,GC/MS SIM

6 应用三重四极杆 GC/MS 延长检测期限使用三重四极 GC/MS 联用仪的选择反应监测 (SRM) 分析能够进一步延长促蛋白合成类固醇的检测期限这是因为该模式与传统的 GC/MS SIM 模式相比基质干扰少, 灵敏度高应用 SRM 模式可以在服用类固醇 14 天后检测到美替诺龙, 而对应的 GC/MS SIM 模式仅为 9 天 ( 图 2) 服药 12 天后,GC/MS SIM 方法便不能从背景中分辨出美替诺龙代谢物的峰了使用 GC/MS SIM 分析检测尿液中的 oral turinabol 是有问题的, 因为甚至在服药前就会有干扰物的峰, 可能被误认为是其代谢物的峰为此, 必须将检测阈值提高到一个化学噪音不再干扰目标物信号的水平在三重四极杆 GC/MS 上使用 SRM 模式对相同尿样进行分析, 因其基线平稳并且在用药前没有代谢物的干扰峰, 所以能够达到很好的选择性并且可以在服药 9 天后还能检测到类固醇代谢物 ( 图 3) 应用 GC/MS SIM 模式在第 9 天和第 12 天时检测美替诺龙代谢物应用 7000A 三重四极杆 GC/MS SRM 模式在第 9 天和第 14 天检测美替诺龙代谢物图 2. 尿液提取物中美替诺龙代谢物硫酸盐部分 GC/MS SIM 模式和三重四极杆 GC/MS SRM 模式的分析方法对比 GC/MS SIM 使用 532,518 和 517 离子作为检测离子,12 天后美替诺龙代谢物的峰不能从背景中分辨出来相反, 三重四极杆 SRM 使用 Transition, 在 9,10,11,12,13 和 14 天时都能检测到代谢物的峰 6

应用 GC/MS SIM 模式检测 ral turinabol 代谢物应用安捷伦 7000 三重四极杆 GC/MS SRM 模式检测 ral turinabol 代谢物 0 H 6.80 6.85 6.90 6.95 7.00 7.05 7.10 7.15 0- 天 H Cl H H -T 3 丰度 6.80 6.85 6.90 6.95 7.00 7.05 7.10 7.15 不同天数的重叠图 3 天 9 7 天丰度 9 天 6.

7 应用 GC/MS SIM 模式检测 ral turinabol 代谢物应用安捷伦 7000 三重四极杆 GC/MS SRM 模式检测 ral turinabol 代谢物 0 H 天 H Cl H H -T 3 丰度不同天数的重叠图 3 天 9 7 天丰度 9 天图 3. 使用 GC/MS SIM 模式和三重四极杆 GC/MS SRM 模式对尿液提取物中 oral-turinabol 代谢物硫酸盐部分的分析方法对比应用 GC/MS SIM 分析检测尿液中的 oral turinabol 是有问题的, 因为甚至在服药前干扰物的峰就可能被误认为是其代谢物的峰 (0 小时 ) 在三重四极杆 GC/MS 上使用 SRM 模式对相同尿样进行分析, 因其基线平稳并且在用药前没有代谢物的干扰峰, 所以能够达到很好的选择性并且可以在服药 9 天后还能检测到类固醇代谢物 GC/MS SIM 分析使用 658 和 656 m/z 作为分析离子, 三重四极杆 SRM 应用 m/z 转换进行分析红色迹线为 3 天后, 绿色和蓝色基线分别为 7 天和 9 天后结论通过监测硫酸盐结合代谢物, 而不是其葡萄糖醛酸结合代谢物, 可以显著延长促蛋白合成类固醇的检测期限使用独特的选择性提取步骤和 β- 葡萄糖醛酸酶 / 芳基硫酸酯酶可以将促蛋白合成类固醇代谢物从其硫酸盐结合物中释放出来, 备衍生化和 GC/MS 分析使用该步骤使用 GC/MS SIM 模式分析可以使某些促蛋白合成类固醇的检测期限由 5 天延长到 9 天, 几乎是原来的两倍在三重四极杆 GC/MS 联用仪上使用 SRM 模式, 取出了基质干扰, 可以将美替诺龙的检测期限由 9 天延长到 14 天该系统还可以分析一些不易用传统 GC/MS SIM 模式进行分析的类固醇因此, 对于促蛋白合成类固醇的长期检测, 三重四极杆 GC/MS 是传统 GC/MS SIM 模式的一种较好的替代方法 7

8 参考文献 1. W. Schänzer, S. Horning, G. pfermann, M. Donike Gas Chromatography Mass Spectrometry Identification of Long-term Excreted Metabolites of the Anabolic Steroid 4-Chloro-1,2-dehydro-17α-methyltestosterone in Humans, J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 57, (1996). 2. W. Schänzer, H. Geyer, G. Fußhöller, N. Halatcheva, M. Kohler, M-K Parr, S. Guddat, A. Thomas, M. Thevis Mass Spectrometric Identification and Characterization of a New Long-term Metabolite of Methandienone in Human Urine, Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, (2006). 3. W. Schänzer, P. Delahaut, H. Geyer, M. Machnik, S. Horning Long-Term Detection and Identification of Metandienone and Stanozolol Abuse in Athletes by Gas Chromatography-High-Resolution Mass Spectrometry, J Chromatogr B Biomed Appl. 687, (1996). 4. A. T. Cawley., R. Kazlauskas, G. J. Trout, A. V. George, Determination of Urinary Steroid Sulfate Metabolites using Ion Paired Extraction, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 825, 1-10 (2005). 5. V. Ferchaud, P. Courcoux, B. Le Bizec, F. Monteau, F. André, Enzymatic Hydrolysis of Conjugated Steroid Metabolites: Search for ptimum Conditions using Response Surface Methodology, Analyst. 125, (2000). 更多信息更多有关产品和服务信息, 请点击我们的网址安捷伦科技公司对本资料中出现的错误, 以及由于提供使用本资料所造成的意外或间接损害不承担责任本资料中涉及的信息说明和指标, 如有变更, 恕不另行通知安捷伦科技公司,2010 中国印制 2010 年 5 月 6 日 CHCN

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CHCN_ CHCN.qxd 一种使用 Agilent 系列三重四极杆 GC/MS 系统测定人尿中蛋白同化制剂的高灵敏度可靠方法应用简报法医 / 兴奋剂作者 Lorena Garrostas, Óscar J. Pozo, Rosa Ventura, Jordi Segura, Josep Marcos 生物分析研究组 IMIM, Hospital del Mar 巴塞罗那西班牙 Miguel A. Delgadillo,