/ 湖南师范大学自然科学学报第卷 # 4$ # $.;# 74 & # "$ # # $" & 7 $" & # # 干扰 # $ $ $ "$ # 是由小干扰 & # $ $ $ "$ # 引起的细胞内序列特异性基因沉默这给恶性肿瘤等疾病的治疗带来了新的希望然而 # 的低血清稳定性易脱靶

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辣阳管
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1 年月湖南师范大学自然科学学报第卷第期!"#$ "$ % & ' # $ #!$ ()* +,- #./!"#$% 0 0 湖南师范大学生命科学学院动物多肽药物创制国家地方联合工程实验室中国长沙 1 湖南中医药大学医学院中国长沙 1 &' 跨界基因沉默是一种利用大肠杆菌在哺乳动物细胞中传递小干扰并引起基因沉默的新颖技术具有实用稳定和低成本等优点该技术通过构建一种能转录出短发夹的大肠杆菌而这种大肠杆菌产生的能靶向哺乳动物细胞中的特定基因从而引发干扰 # 本文用 $" 同源重组的方法将跨界基因沉默质粒的工作元件快速地整合到大肠杆菌的染色体 ( 上构建了跨界基因沉默菌株通过吖啶橙染色实验证明了跨界基因沉默菌株能够入侵哺乳动物细胞最后 $ $ 结果表明跨界基因沉默菌株可以对靶标基因产生干扰作用该技术的完善将进一步促进工程菌的研发和利用 # 传递跨界基因沉默菌株干扰 $" 同源重组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国家自然科学基金面上项目 /+ 湖南省教育厅科学研究项目 91 湖南省生物发育工程及新产品研发协同创新中心 / & # $#" $4 "

2 / 湖南师范大学自然科学学报第卷 # 4$ # $.;# 74 & # "$ # # $" & 7 $" & # # 干扰 # $ $ $ "$ # 是由小干扰 & # $ $ $ "$ # 引起的细胞内序列特异性基因沉默这给恶性肿瘤等疾病的治疗带来了新的希望然而 # 的低血清稳定性易脱靶性和易引起免疫反应等缺点也给临床应用带来了很大的挑战此外鉴于 # 自身的结构导致其不能直接穿过细胞膜因此找到一种稳定安全和有效的 # 传递方式十分重要 / 跨界基因沉默技术利用工程菌携带短发夹 # # 将传递至哺乳动物细胞引发哺乳动物细胞特定基因的沉默这种新型 # 传递技术的出现在某种程度上弥补了干扰药物的传递困境具有成为临床药物载体的潜力.+ 跨界基因沉默技术由向双林等提出其基本流程为首先构建跨界干扰质粒 3.;# 74 & # &#4 3 *8 3. #. #% 该质粒上的基因其表达产物为 * # 蛋白能与表皮细胞膜上表达的. 整合蛋白.# $7 # 结合促使细胞内陷并吞噬附着于该区域的细菌基因其表达产物为分泌蛋白 55) 使细菌能够从细胞内体中逃离 1. 将 3 *8 转化到大肠杆菌 <5(6/ 以下简称为 <5(6/ 内最后将转化 3 *8 的 <5(6/ 侵染哺乳动物细胞即可在哺乳动物细胞中发挥 # 作用然而质粒转入 <5 (6/ 后游离于细菌的胞质中在无抗性的条件下质粒容易因环境压力而丢失不利于质粒稳定存在并表达若能使跨界基因沉默技术更加稳定方便将有利于拓展跨界基因沉默技术的使用范围本研究对跨界基因沉默技术进行改进将 3 *8 的工作元件整合到 <5(6/ 的基因组中改进后的整合型菌株克服了质粒易丢失的缺点且菌株的保存与使用比质粒更方便在原核生物中由 $" 介导的同源重组技术已经很成熟. $" 蛋白在细菌中广泛存在且高度保守在细菌的同源重组途径中起着重要的作用 $" 同源重组系统可介导长同源序列的同源重组利用大肠杆菌依赖的 $" 蛋白重组系统可以对大肠杆菌基因组进行修饰和基因替换等改造.+ 本研究以 <5(6/ 基因组中的 % 为模板克隆出一段长的序列将其作为 % 的同源序列插入到 3 *8 中构建出环状整合型跨界基因沉默质粒 9 " #"* $7 $4 3.;# 74 & # &#4 9*.3 *8 9*.3 *8 无须线性化即可快速将 3 *8 上的工作元件整合入 <5 (6/ 基因组中实现对 <5 (6/ 基因组的改造随后利用 9*.3 *8 构建了跨界基因沉默菌株并检测该菌株侵染哺乳动物细胞! 1 的能力以及对! 1 细胞中特定基因的干扰能力 :; :; & %<5(6/& %=< # 菌质粒 3 *8 质粒 +; 及质粒 9 $ 等为本实验室保存人结直肠癌细胞株! 1 为本实验室保存的细胞株质粒小量提取试剂盒胶回收试剂盒购于东盛生物公司限制性核酸内切酶 ( 限制性核酸内切酶 $ : 限制性核酸内切酶 ) % 限制性核酸内切酶 " % 和 3 ( 连接酶购自 6< #.55) # 4 #.= 8(% # 4 和 #.." $ # # 4 购于武汉博士德公司 % 8 标记的羊抗鼠二抗购于! 9 公司氯霉素氨苄青霉素钠 > 多聚甲醛 ( 分子量标准氯化钠硼酸琼脂糖酵母提取物等购于生工生物工程上海股份有限公司吖啶橙购于!#7& 公司 695 化学发光试剂购于 :$ "; :# # $ 公司培养细胞所用的 (:6: 培养基和胎牛血清购自美国 =# " 公司!"#$%&' 以质粒 +; 为模板用引物 +; 和 +; 扩增出 # +;."&"& 代表氯霉素抗性基因片段在氯霉素抗性基因两侧设计同方向的 5 8 位点以 <5 (6/ 基因组为模板用引物 % 和.% 扩增出 % 的重组片段两者的 89 产物分别用胶回收试剂盒纯化保存备用将 # +;."& 片段和 % 重组片段等量混合以此混合物为模

3 第期胡琳敏等跨界基因沉默菌株的快速构建及对靶标基因干扰能力的检测 / 板以 +;.% 为引物扩增出 # +;."&.% 基因片段引物序列如表所示 ()*+,-. 3 $ &$ 4 $ $ "$ #&$ 引物名称引物序列 +; =33 99=339=3 3 = = 9==3 9999= =9 ===33 3=9 +; =39 == = 3=3== 33==3 99=339=3 3 3=3 3=93 3 9= 9==3 = ==9===93===33 % 999 =999=993 3= =93 99=339=3 3 = = 9== =3= = =993= 9.% 333=99==9=9= =3= 993 " 9=39= =99 3=3= " = ==99 99= =9 "& 9 93= 9= "& =99= 9 3== =9 将 3 *8 中的基因片段 #% 用 ( 和 $ : 双酶切回收 #% 基因片段再用相同的酶剪切 # +;."&.% 然后将这两部分连接将连接产物用热转化法转入 =< # 菌用含氯霉素抗性终浓度为 &7,5 的固体培养基筛选置于培养箱中培养第二天挑单克隆扩增用菌落 89 初筛之后提取阳性菌落中的质粒双酶切验证最后将验证为阳性的质粒送上海生工测序将测序正确的质粒命名为 9*.3 *8 即带有 #% 基因的环状整合型跨界基因沉默质粒 9*.3 *8 /"#$%&'01$% 取 9*.3 *8 加到 <5(6/ 中用热转化法处理置于细菌培养箱过夜培养第二天从固体培养基中挑取单克隆重组子接种于 &5 离心管中离心管先用无菌针头在管盖上戳一个小孔并加 &5 带氯霉素抗性的 5< 液体培养基最后将离心管放在恒温摇床上培养 A+ 将重组子菌液做模板用 89 初筛的引物如表所示将阳性重组子菌液复壮第二次 89 筛检用相同的引物以细菌基因组 ( 为模板 89 预变性变性 / 退火延伸 &# 循环 / 后延伸 &# 将阳性菌落的菌液加入甘油管中保种 / 0$% $% 2 构建 9*.3 *8 时笔者已在氯霉素抗性基因两侧设计了同方向的 5 8 位点因此可用 9 $.5 8 重组酶系统来删除抗性基因取 &5 细菌复壮后加 5 9 $ 质粒到管中混匀后转移到 && 电击杯中电压为 ; & 电击一次电击转化后复苏将菌液沉淀浓缩至 5 涂到氯霉素, 氨苄青霉素双固体培养基上过夜培养长出单克隆后挑取接种到含氨苄青霉素液体培养基中培养继续培养将菌液分别接种到无抗性的 5< 固体培养基和氯霉素固体培养基进行双固体培养基对照检测选取无抗性的菌落以 ", " 为引物做菌落 89 以菌落 89 为阳性结果的细菌基因组 ( 做模板用引物 ", " 和 "&,"& 引物序列如表所示进行第二次 89 验证 ", " 扩增为阳性而 "&,"& 扩增为阴性的菌落即为抗性敲除成功的跨界基因沉默菌株将此菌液复壮当 *+ + 达到 A + 时按 5, 保种待用 $ $ 34"#&'01 55)56 78 从固体培养基上挑单克隆接种到 5< 培养液中过夜培养将菌液离心后收集上清到新管中用 39. 丙酮沉淀法提取 55) 分泌蛋白根据沉淀量加入!(! 保存备用用 $ $ 检测 55) 的表达情况取 7 蛋白质进行!(!. 聚丙烯酰胺凝胶电泳胶浓度为 > 电压为转 8 ( 膜恒电流 & 时间为 1 &# 用 > 脱脂奶粉封闭孵育 55) 蛋白质的一抗 B 洗去一抗孵育 % 8 标记的羊抗鼠二抗 B 最后用 695 化学发光试剂显影并用 3. 全自动数码凝胶图像分析系统上海天能科技有限公司记录实验结果 9:; 34 0! 1 在 + 孔板中放入玻璃盖玻片将细胞以每孔 C 个接种于孔板内用于细胞爬片之后置于 > 相对湿度的细胞培养箱中培养从固体培养基上复苏细菌进行侵染实验经 *83= 诱导后当细菌培养到 *+ + D 时终止培养取出菌株用于侵染! 1 细胞用无血清无抗生素的细胞培养基洗涤细菌次最后用细胞培养基重悬细菌完全混匀根据实验中需要的 :)* 值细胞与细菌的比值 B,B,B 稀释细菌准备进行细菌侵染试验前

/ 湖南师范大学自然科学学报第卷先将细胞的培养基更换成无血清无抗生素的培养基后加入含有细菌的培养液轻摇培养板使细菌均匀分布 A 后去除含细菌的培养基加入含庆大霉素的培养基用以杀死细胞外的细菌将细胞用 > 多聚甲醛固定液固定处理 8<! 洗涤后在摇床上轻摇用通透液, 丙酮 B, 甲醇 DB 处理 / 再用 8<!

4 / 湖南师范大学自然科学学报第卷先将细胞的培养基更换成无血清无抗生素的培养基后加入含有细菌的培养液轻摇培养板使细菌均匀分布 A 后去除含细菌的培养基加入含庆大霉素的培养基用以杀死细胞外的细菌将细胞用 > 多聚甲醛固定液固定处理 8<! 洗涤后在摇床上轻摇用通透液, 丙酮 B, 甲醇 DB 处理 / 再用 8<! 洗涤用 > 吖啶橙工作液以 &5, 孔加入孔板中染色立即用 8<! 冲洗用滤纸吸去多余的水然后用封闭胶水将玻璃片封闭固定最后用激光扫描共聚焦显微镜德国 E$# 5!: 观察拍照保存实验结果 +"#$%&'01 <5(6/.3 *8.93< 利用的质粒 9*.3 *8 快速构建跨界基因沉默菌株 <5 (6/.3 *8.93< 目标基因 93< 的发夹结构干扰序列为 $ $ 9 99== 3. =3== =39= 933=== == # $ $ == 3=3== =333. 9= 933=== == &# /@ 退火将 9*.3 *8 质粒用 ) % 和 " % 双酶切最后将干扰序列与 9*.3 *8 质粒连接经测序连接正确的质粒就是 <5(6/. 3 *8.93< 取 59*.3 *8.93< 加入 <5(6/ 感受态中获得重组菌重组菌的鉴定方法同 / 用 $ $ 检测跨界基因沉默菌株 <5(6/.3 *8.93< 的干扰能力 *& 7$ 软件分析目的条带的光密度值采用. 检验判断实验组和对照组之间均值的差异显著性显著水平定为 ( <= >?@AB CDE 首先扩增出同源臂片段如图所示以质粒 +; 为模板用引物扩增出 # +;."& 片段其长度为 1 图以 <5(6/ 基因组为模板用引物扩增出 % 的重组片段其长度为图 < 将两者的 89 产物分别用胶回收试剂盒回收然后将两种产物等量混合以此混合物为模板 89 扩增出 # +;."&.% 基因片段其长度为 / / 图 9 再将 9*.3 *8 和 # +;."&.% 基因片段分别用 ( 和 $ : 双酶切将两者的连接产物转入 =< # 菌然后提取阳性菌落中的质粒并进行双酶切验证图 ( 实验结果表明环形跨界基因沉默整合质粒被成功构建并被命名为 9*.3 *8 注 & ##" # # +;."& 89 3 $ $ 7 $89 4 " 1 < & ##" # % 3 $ $ 7 $89 4 " 9 & ##" # # +;."&.% 3 $ $ 7 $89 4 " / / ( #4 # $ # +;."&. % $" & # &#4 4 $4#7$ # <=>?@ 89 +<=>?@A BCDE!"# 89 & 7 & 4 #4 # $ $" & # &#4 4 $4#7$ # F $%&'% 将 9*.3 *8 转进 <5(6/ 用引物 ", " 进行菌落 89 初筛如图中的 /1 /+/ 号菌液扩增出 +/ 的鉴定条带因为是跨界基因沉默质粒元件中的一段序列对于改造后的 <5(6/ 而言这是一个外源的基因能用菌落 89 扩增出的目的条带说明这些菌经 9*.3 *8 已将其他元件也整合到其染色体上了为了确认这些菌是否确实为阳性笔者将上述部分阳性菌液作为候选菌株继续培养并提取基因组 ( 然后用相同引物进行第二轮 89 如图 < 所示个泳道都有目的条带且条带的大小和位置正确通过两轮 89 验证跨界基因沉默菌株已构建成功

第期胡琳敏等跨界基因沉默菌株的快速构建及对靶标基因干扰能力的检测 // 注 3 $# 4 $ $"# " 89 # 7 ", " #&$ # 3 $ $ 7 $89 4 " +/ < 3 $ $". 4 4 $ $"# 7$ &#"89 0 89 $% 89 "#$%&'01!"#!$ $"# 3;.

工作元件将只在无抗性的 5< 固体培养基上生长的菌落进行菌落 89 如图 / 中泳道所示工作元件已丢失而泳道 /+1 为删除抗性基因后工作元件仍然存在为阳性菌取部分阳性菌进一步做 89 验证提取细菌的基因组 ( 并用引物 ", " 和 "&,"& 进行 89 检测若在这一轮 89 筛选中引物 ", " 扩增产物为阳性而 "&,"& 扩增产物为阴性

# 5 $ / + 1 $ ## $ "$ # < 3 $ $" 4 4 $ $"#

5 第期胡琳敏等跨界基因沉默菌株的快速构建及对靶标基因干扰能力的检测 // 注 3 $# 4 $ $"# " 89 # 7 ", " #&$ # 3 $ $ 7 $89 4 " +/ < 3 $ $". 4 4 $ $"# 7$ &#" $% 89 "#$%&'01!"#!$ $"# 3;. # "$ # " $ &#"89 $GHIJKLM N 虽然跨界基因沉默菌株已经构建成功但是菌株的基因组上还含有质粒上的抗性基因因此要删除整合到染色体上的抗性基因使其成为安全的 # 传递载体通过 9 $.5 8 重组酶系统删除抗性基因后跨界基因沉默菌株有可能同时丢失已整合的. 工作元件将只在无抗性的 5< 固体培养基上生长的菌落进行菌落 89 如图 / 中泳道所示工作元件已丢失而泳道 /+1 为删除抗性基因后工作元件仍然存在为阳性菌取部分阳性菌进一步做 89 验证提取细菌的基因组 ( 并用引物 ", " 和 "&,"& 进行 89 检测若在这一轮 89 筛选中引物 ", " 扩增产物为阳性而 "&,"& 扩增产物为阴性则说明跨界基因沉默作用元件已稳定整合到该菌株的基因组染色体上而抗性基因 "& 被成功删除如图 /< 所示泳道 / 都有目的条带说明工作元件未丢失如图 /9 所示泳道 / 都无目的条带说明抗性基因删除成功泳道为阳性对照图 /< 和 /9 中编号相同的泳道其模板来源相同实验结果表明抗性基因 "& 已经成功被删除注 3 $# 4 $ $"# " 89 # 7 ", " #&$ # 5 $ / + 1 $ ## $ "$ # < 3 $ $" 4 4 $ $"# 7$ &#"89 # 7 ", " #&$ # 4 $ $ 7 $89 4 " +/ 9 3 $ $". 4 4 $ $"# 7$ &#"89 # 7"&,"& #&$ # 4 $ $ 7 $89 4 " / 0 89 $% 89 2FGH $% I 01!"#!$ $"# ## $ "$ # # " & $ #" $ # "$7$ $ " $ &#"89 $% O 跨界基因沉默菌株的基因组 ( 整合了 3 *8 中的 #% 和基因为了检测上述整合进细菌基因组的跨界干扰元件能否正常工作笔者通过 $ $ 和侵染实验来进行验证 $ $ 34 55)56 78!"# 3 $$ $ # 55)4$$"$4 $ $ 首先通过 $ $ 检测跨界基因沉默菌株是否能够稳定表达 #% 基因的编码产物 55) 蛋白如图所示 <5(6/ 为空载对照 3 *8 为含 3 *8 质粒的 <5 (6/<.9*.3 *8 为已将跨界基因沉默质粒整合到基因组且删除抗性基因的 <5 (6/ 结果表明跨界基因沉默菌株能正常表达 55) 蛋白

/ 湖南师范大学自然科学学报第卷 "# 其次用侵染实验来检验跨界基因沉默菌株是否能稳定表达基因从而有入侵细胞的能力吖啶橙能透过细胞膜并与细胞核中的核酸结合在蓝光的激发下发出绿色荧光如图彩图见封三所示! 1 细胞内最大的绿色荧光团为细胞核细胞质处有许多绿色小亮斑即为入侵的细菌用空载细菌检测侵染细胞的能力可见!

"# 用 + 中的方法构建干扰 93< 基因的跨界基因沉默菌株将其命名为 <5 (6/.3 *8.93. < 将构建好的跨界基因沉默菌株侵染! 1 细胞然后用 $ $ 来检测此跨界基因沉默菌株对细胞中靶基因的干扰能力结果如图 + 所示跨界基因沉默菌株 <5(6/.3 *8.93< 能在 1 和显著下调! 1 细胞中." $ # 蛋白的表达将.

6 / 湖南师范大学自然科学学报第卷 "# 其次用侵染实验来检验跨界基因沉默菌株是否能稳定表达基因从而有入侵细胞的能力吖啶橙能透过细胞膜并与细胞核中的核酸结合在蓝光的激发下发出绿色荧光如图彩图见封三所示! 1 细胞内最大的绿色荧光团为细胞核细胞质处有许多绿色小亮斑即为入侵的细菌用空载细菌检测侵染细胞的能力可见! 1 细胞质中没有入侵的细菌由此可知空载菌不能侵染哺乳动物细胞图在相同处理条件下用携带了跨界基因沉默整合元件的菌株去侵染细 "#$%&'01 9:; J 胞! 1 细胞质中有入侵的细菌图 < 以上!"# " #4# $ 7$ # # 7 $4 $3;. # "$ # # 4$4 结果表明笔者构建的跨界基因沉默菌株具有入 # & && # "$ 侵哺乳动物细胞的能力 (!"# 用 + 中的方法构建干扰 93< 基因的跨界基因沉默菌株将其命名为 <5 (6/.3 *8.93. < 将构建好的跨界基因沉默菌株侵染! 1 细胞然后用 $ $ 来检测此跨界基因沉默菌株对细胞中靶基因的干扰能力结果如图 + 所示跨界基因沉默菌株 <5(6/.3 *8.93< 能在 1 和显著下调! 1 细胞中." $ # 蛋白的表达将." $ # 的表达量分别降至 9 组不用细菌处理细胞的 + />( 和 + />( 这表明跨界基因沉默菌株可携带并能抑制哺乳细胞中目的基因的表达注 ( $7 #." $ #.;# 74 & # "$ # 3 $97 $! 1 "$ $ $4 # "$ # 4 $& "; 7 $! 1 "$ $ $4 # "$ # " # $ $ $ # $ 7$7$ $ <.93< 7 $! 1 "$ $ $4 # $ <5 (6/.3 *8.93< < # # $ # $$ $ #." $ # $# ( $ $ $ $4 $&$!( D/ ( ( " & $4 $" $ 4# 797 PQ ( $ $ 34"#$%&'01KLM$% NO!"#( 3 $$ $ # 7$7$ $ # $ $ $4.;# 74 & # "$ # 4$$"$4 $ $ # 是一种由双链引起的基因沉默现象能抑制靶基因的表达具有特异性和高效等优点对哺乳动物细胞来说要使外源的 # 起基因沉默作用 # 的传递成为限制 # 技术发展的瓶颈之一更限制了特异性干扰作用应用于临床药物开发向双林等在 + 年提出了跨界基因沉默技术利用基因工程改造后的工程细菌携带侵染细胞并在细胞内释放的特点使 # 的运用不再因传递的问题而被限制但是 3 *8 转入大肠杆菌后容易因环境压力而丢失从而丧失跨界基因沉默的功能如果能使质粒整合到跨界基因沉默菌株的基因组内那么跨界基因沉默系统会变得更加稳定方便这也将有利于拓展跨界基因沉默技术的使用范围将来可以把益生菌改造成跨界基因沉默菌株当人们饮用这种益生菌到肠道后它不仅对身体有益还能发挥 # 作用这种一举两得的方式将使得临床治疗变得更为便捷基于以上考虑笔者对跨界基因沉默技术进行完善首先运用传统分子克隆的方法构建环形跨界基因沉默整合质粒 9*.3 *8 然后通过 $" 介导的同源重组将 9*.3 *8 上的跨界基因沉默元件成功地整合到大

7 第期胡琳敏等跨界基因沉默菌株的快速构建及对靶标基因干扰能力的检测 / 肠杆菌 <5.(6/ 的基因组中并通过 9 $.5 8 重组酶系统删除跨界基因沉默菌株基因组中的抗性基因随后利用 $ $ 和细菌侵染实验来检测跨界基因沉默菌株中基因组的跨界干扰元件是否能正常工作结果表明抗性删除的基因沉默菌株不仅能稳定表达 55) 蛋白而且具有细胞侵染的能力为了验证构建出的基因沉默菌株是否能在细胞中发挥其基因沉默作用笔者对跨界基因沉默菌株进行了功能检测以 93< 基因做为靶标用环形跨界基因沉默整合质粒构建了 <5(6/.3 *8.93< 跨界基因沉默菌株此菌株带有能引起 93< 基因沉默的序列将干扰菌株侵染细胞后用 $ $ 来检测菌株对靶标基因的干扰作用结果表明跨界基因沉默菌株可通过传递抑制细胞中目的基因的表达在本研究中改良后的跨界基因沉默整合菌株解决了载体细菌中质粒容易丢失的缺点提高了跨界沉默菌株的稳定性同时表现出无抗性的特点而且还能有效地沉默细胞中靶基因这使跨界基因沉默技术的使用变得更方便在今后的研究中笔者还将对跨界基因沉默技术进一步改造使该菌株真正成为既能治疗疾病又对人体无害的工程菌 RS*+ 5 6! : )!!* )'65563(5 # 4 & # $ $ # 7 # & 4# $ $ $ $ #" #" # 3 $ 4 <# $" 1. *:! % 5 " 4 $&#"4$ # $ 6= # # 7 $ $" $" & $ &#"$ $ $$"# $ $ &$ " "$ 9 $ 1.+ / %)=9 :! "# " $ $$"# $4$ # $ & # $ $ # 7 $ $ #" 3 $ #"./ *=6 3 ;# 74 & # $ $ $ "$ ; # $ 4$ # $ $ $ #" 6 $ ) # <# 3 $ //. =' 63 '6% ' % 3 ;# 74 & # $ $ $ "$ ; # $ &$ 4 # 4 "$ $ $ #"7$ $ # $. "# 7 :$ 4 : <#./ + = *55)399 "# 7$ $ $ &# "$ "$ # & && # "$ <# $" * =! 5 '6% ' 5*9! # #.$ $ # 7 "$ # $ #"# # $ $ $ "$# & && <#. $" : 3%6 6 9 #"4$ # $ # $ $ #7 " $ #4$ # $ # # )." # # 7 # &$ =$ $3 $ / /. %6'9 8 :$" # & &$& $# $ # & #&$ #" $. $ $# $ # 7 # )" $ $ $ # 7. 4$ $4 4 " $4 " & # " 7$ : 9$ +//. * =! ! 9 '6% ' - % * # 4 # # 7$ $ # $ "# 7 3 ;# 74 & # ; # :$ 4 : <# =6% '% < "$ # 4$ # $ #$$" ;# 74 & # # 6 $ ()* /, ( 3 $ "# # # ( 4! # $".&$4# $4 7$ $#" $" & # # <# 9 $& / 9%6E =% 8 563*9% 8 :$" # & & 7 $" & # # & $ $". (,4 ( " $ $ 1/1. 5*E ) #7# 4 $ # $ $", ( 7$ $ &# 6 #4$ "$ "#$ 7$ $4 #" # 4 $ 4 & # #"7$ $ $ 8 " " 4!"#'! +//1./// 戴倩田云卢向阳同源重组介导的克隆策略研究进展农产品加工学刊 +./ + 杨献伟杨瑞馥崔玉军细菌基因组同源重组量化与鉴定遗传 +/./

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽

/ 湖南师范大学自然科学学报 第 卷 # 4$ # $.;# 74 & # "$ # # $" & 7 $" & # # 干扰 # $ $ $ "$ # 是由小干扰 & # $ $ $ "$ # 引起的细胞内序列特异性基因沉默 这给恶性肿瘤等疾病的治疗带来了新的希望 然而 # 的低血清稳定性 易脱靶

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