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冷侑江
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1 第 29 卷第 6 期 2014 年 12 月天津科技大学学报 Journal of Tianjin University of Science & Technology Vol. 29 No. 6 Dec DOI: /j.issn pgpa 和 tdcg 基因的敲除对大肠杆菌磷脂酰丝氨酸合成的影响刘逸寒, 乔婧, 李玉, 佟新伟, 刘晓光, 路福平 ( 工业发酵微生物教育部重点实验室, 工业酶国家工程实验室, 天津市工业微生物重点实验室, 天津科技大学生物工程学院, 天津 ) 摘要 : 磷脂酰丝氨酸具有改善大脑的认知和记忆的功能, 是医药和食品行业重要的原料. 为进一步提高大肠杆菌 (Escherichia coli) 中磷脂酰丝氨酸含量, 利用 Red 重组系统, 以可积累磷脂酰丝氨酸的 E. coli K12( sdaa sdab pgpb) 为出发菌株, 敲除 pgpa 和 tdcg 基因, 切断与磷脂酰丝氨酸合成相关的 L- 丝氨酸和磷脂酰甘油磷酸的分解代谢途径. 摇瓶发酵后的检测结果表明, 重组菌株 E. coli K12( sdaa sdab pgpa pgpb tdcg) 中磷脂酰丝氨酸占菌体总磷脂的比例为 2.5%, 较出发菌株 (1%) 提高了 1.5 倍. 关键词 : 磷脂酰丝氨酸 ; 大肠杆菌 ; 基因敲除 ; 代谢中图分类号 :Q784 文献标志码 :A 文章编号 : (2014) Effect of Gene pgpa and tdcg Knock-off on the Phosphatidylserine Biosynthesis in Escherichia coli LIU Yihan,QIAO Jing,LI Yu,TONG Xinwei,LIU Xiaoguang,LU Fuping (Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education,National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes,Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology,College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology,Tianjin ,China) Abstract:Phosphatidylserine(PS)is an important active ingredient for medicine and food industry which could improve the cognitive ability and memory. In order to improve the content of PS in Escherichia coli, the Red recombinant system was used for deleting the gene pgpa and tdcg in E. coli K12( sdaa sdab pgpb)which can accumulate PS to block the L- serine degradation and cutting off the phosphatidylglycerophosphate catabolic pathway. After fermentation,the results showed that the total PS phospholipids synthesized by the mutant strain E. coli K12( pgpa pgpb sdaa sdab tdcg)was 2.5% which was 1.5 times higher than that in the starting strain(1%). Key words:phosphatidylserine;escherichia coli;gene knock-off;metabolic 磷脂酰丝氨酸 (phosphatidylserine,ps) 是存在于细菌酵母植物哺乳动物细胞中的一种重要的膜磷脂, 是大脑中主要的酸性磷脂.PS 有显著的保健功效, 能改善老年阿尔茨海默病提高认知力抗抑郁抗压抑辅助激活酶等 [1]. 目前,PS 产品主要是由大豆中提取制备, 也可由磷脂酶催化磷脂酰胆碱和丝氨酸合成, 但此催化反应尚处于实验室研究阶段, 且该酶的生产成本较高, 催化过程较为复杂.PS 作为磷脂成分之一存在于微生物体内, 因此, 可以利用代谢工程手段对微生物体内 PS 相关代谢途径进行改造, 以提高 PS 合成量, 通过微生物发酵法为 PS 的制备提供新思路. 目前, 国内外对大肠杆菌磷脂相关代谢进行了大量的研究. 在大肠杆菌中,PS 由 L 丝氨酸和 CDP 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( ); 国家高技术研究发展计划 863 计划资助项目 (2012AA022108) 作者简介 : 刘逸寒 (1982 ), 男, 天津人, 副教授 ; 通信作者 : 路福平, 教授,lfp@tust.edu.cn.

2 2 天津科技大学学报第 29 卷第 6 期二酰基甘油经 PS 合成酶 (phosphatidylserine synthetase,pss) 催化合成 ( 图 1).Rilfors 等发现 PSS [2] 是一种膜结合酶, 当它处于游离状态时没有活性, 只有和膜上的磷脂酰甘油磷酸 (phosphatidylglycerophosphate,pgp) 结合后才具有活性, 可见 PSS 的活性受到 PGP 调节.Icho [3] [4] 和 Funk 等研究表明,pgpA pgpb pgpc 此 3 个基因分别编码 3 种磷脂酰甘油磷酸酶同工酶 PGPA PGPB PGPC, 该酶催化 PGP 转 [5] 化为磷脂酰甘油 (phosphatidyl glycerol,pg).lu 等分别敲除 pgpa pgpb pgpc 后, 研究 PGP 在大肠杆菌的积累, 发现此 3 个同工酶基因同时被敲除后会阻断 PG 的生物合成途径, 菌体生长受到限制. 另外, [6 7] Su 等发现,PS 的合成底物之一 L 丝氨酸经 L 丝氨酸脱氨酶催化后可转化为丙酮酸,sdaA sdab tdcg 分别编码 L 丝氨酸脱氨酶 3 种同工酶. Voelker [8] 研究表明,PS 在磷脂酰丝氨酸脱羧酶 (phosphatidylserine decarboxylase,psd) 作用下可以合成磷脂酰乙醇胺 (phosphatidyl ethanolamine,pe). [9] Ishinaga 等发现, 大肠杆菌 PSS 活力提高有利于 PE [10] 的合成.Vance 等分析了 PS 在大肠杆菌酵母植物和哺乳动物中的功能和分布, 并简述了 PSS 酶的调节机制. 可见, 目前有关 PS 的研究主要是将其作为 PE 合成的前体分析, 而以提高 PS 合成量为目的的研究尚未见报道. 图 1 大肠杆菌磷脂代谢途径 Fig. 1 The metabolic pathways of the PS in E. coli 本课题组在前期研究中, 结合基因工程与代谢工程技术, 通过敲除 E.,coli K12 中 2 个 L 丝氨酸脱氨酶基因 sdaa sdab 和 1 个磷脂酰甘油酸酶基因 pgpb, 已成功构建并获得 1 株 PS 合成量提高的大肠杆菌重组菌株 E.,coli K12( sdaa sdab pgpb), 其 PS 占菌体总磷脂含量的 1%, 而原始菌株 E.,coli K12 中 PS 占菌体总磷脂含量 <0.5%. 本文在 E.,coli K12( sdaa sdab pgpb) 基础上, 进一步敲除磷脂酰甘油磷酸酶 pgpa 基因和 L 丝氨酸脱氨酶 tdcg 基因, 通过积累 PGP 以提高 PSS 活性和阻断 L 丝氨酸分解代谢两个方面进行改造, 使 PS 在大肠杆菌内得到进一步积累, 构建 PS 合成量提高的大肠杆菌重组菌株, 为 PS 的生物合成奠定基础. 1 材料与方法 1.1 材料菌株与质粒大肠杆菌 E.,coli K12 大肠杆菌 E.,coli K12 ( sdaa sdab pgpb) 及所用质粒 pkd3 pkd46 pcp20 均为本实验室保存. 以 pkd3 为模板可 PCR 扩增出两侧含有 FRT 位点的抗性基因, 可作为筛选标记.pKD46 温敏型低拷贝质粒,42, 不复制, 经 L 阿拉伯糖诱导后表达 Gam Beta 和 Exo 这 3 种 λ 噬菌体重组蛋白.pCP20 用于 FRT 间抗性基因片段的切除培养基和培养条件 LB 液体培养基 (g/l): 蛋白胨 10, 酵母提取物 5, 氯化钠 10,pH 7.0. 用于大肠杆菌培养,37, 200,r/min 摇床振荡培养. LB 固体培养基 (g/l): 蛋白胨 10, 酵母提取物 5, 氯化钠 10, 琼脂 20,pH 7.0. 用于大肠杆菌培养, 37, 恒温培养箱静置培养. 液体和固体培养基在需要时添加氨苄青霉素 ( 终质量浓度 100,µg/mL) 和氯霉素 ( 终质量浓度为 25,µg/mL) 引物研究所需引物包括用于扩增同时带有同源臂和氯霉素抗性基因的引物和鉴定目的基因是否被成功敲除的引物, 见表 1, 下划线部分为 50,bp 左右同源臂.

3 2014 年 12 月刘逸寒, 等 :pgpa 和 tdcg 基因的敲除对大肠杆菌磷脂酰丝氨酸合成的影响 3 表 1 引物序列 Tab. 1 Primer sequences 引物名称引物序列引物用途 pgpa-h1 5 -CTTTGTTTTATTCGTGACGGCGAACCTGTTACATTAGACTGGAAAGGATGT 带有目的基因同源臂氯霉素抗性基因上 GTAGGCTGGAGCTGCTTC-3 pgpa-h2 5 -TCCAGGCCTGATGAGACGTGACAAGCGTCACATCAGGCATCGGTGCACA 带有目的基因同源臂氯霉素抗性基因下 AATGGGAATTAGCCATGGTCC-3 pgpa-out1 5 -GGCGGTGAAGATTACGAGTTG-3 鉴定 pgpa 缺失菌株 pgpa-out2 5 - ACTGGTGTCTGATGAGGTGGG-3 鉴定 pgpa 缺失菌株 tdcg-h1 5 -GTAAGGTCGTTCCGCTCCACTTCACTGAACGGCAATCCGAGGGTGTGGAT 带有目的基因同源臂氯霉素抗性基因上 ATGGGAATTAGCCATGGTCC-3 tdcg-h2 5 -AAAAAAAAGGTGCACATTTGTGCACCCAAGGATGAAAGCTGACAGCAAT 带有目的基因同源臂氯霉素抗性基因下 GGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3 tdcg-out1 5 -TTTGCCACCATCAACGAAG-3 鉴定 tdcg 缺失菌株 tdcg-out2 5 -TCAAGGCGATATGCGGTC-3 鉴定 tdcg 缺失菌株 1.2 方法基因敲除 ( 以敲除基因 pgpa 为例 ) 利用 Red 重组系统对大肠杆菌进行基因敲除 ( 图 2). 该系统的质粒包括模板质粒 pkd3 Red 酶表达质粒 pkd46 和 FLP 表达质粒 pcp20. (a) 扩增有同源臂的抗性基因 (b) 同源重组的发生 (c) 获得重组基因 (d) 切除抗性基因图 2 基因敲除示意图 Fig. 2 Procedure of gene knock-off 以大肠杆菌 E.,coli K12( sdaa sdab pgpb) 为出发菌株, 敲除基因 pgpa 的步骤为 :(1) 以 pkd3 为模板, 用 pgpa-h1 和 pgpa-h2 引物扩增出带有同源臂的氯霉素抗性基因, 两端带有 FRT 位点, 如图 2(a) 所示 ;(2) 利用 L 阿拉伯糖诱导菌体内的质粒 pkd46, 使其表达 Gam Beta Exo 三种重组蛋白, 并制备成感受态细胞, 将上步得到的同源线性片段电转化入此感受态细胞中, 碱性片段上的同源臂与基因组上的同源区域互相识别, 如图 2(b) 所示 ;(3) 线性片段上的同源臂与基因组上的同源区域同源重组, 如图 2(c) 所示, 用引物 pgpa-out1 和 pgpa-out2 鉴定发生同源重组的菌株 ;(4) 将质粒 pcp20 电转化入发生同源重组的菌体后,42, 诱导其表达 FLP 重组酶, 此酶将 FRT 位点间的序列及 1 个 FRT 位点切除, 如图 2(d), 用 pgpa-out1 和 pgpa-out2 鉴定基因组上抗性基因切除的菌株磷脂的提取取稳定期的菌液离心, 用生理盐水洗涤 3 次, 置于冷冻干燥机,-70, 干燥 12,h, 获得干菌体. 按 m( 干菌体 ) V( 提取液 )=1,g 1,mL 的比例加入提取液 (V( 己烷 ) V( 异丙醇 )=3 2), 振荡或搅拌 48,h 后, 离心, 取上清液加入旋蒸仪, 通氮气旋转干燥, 干燥后, 加入 1,mL 氯仿溶解提取出的总磷脂, 取出再用氮气吹干即得总磷脂待测样品高效液相色谱法测定磷脂酰丝氨酸含量高效液相色谱分析采用 Venusil XBP C18 色谱柱 (250,mm 4.6,mm,5,μm), 柱温为 31,, 流量为 1.0,mL/min, 检测器为蒸发光散射检测器, 检测波长为 205,nm; 流动相中 V(85% 磷酸 ) V( 甲醇 ) V( 乙腈 )= 将磷脂酰丝氨酸标准品溶于氯仿中配制成质量浓度分别为 0.020, , , , ,4,mg/mL 的标准溶液, 然后进行液相色谱分析. 磷脂酰丝氨酸的出峰时间在 3,min 左右, 如图 3 所示. 以峰面积的对数 (lg,a) 对相应质量浓度的对数 (lg,c) 进行线性回归, 可得线性回归方程 lg,a = 3.005,2,lg,C+7.592,2,R 2 =0.999,1.

4 天津科技大学学报第 29 卷第 6 期 sdab tdcg) 的生长曲线, 每隔 20,min 测定 2 株菌在 λ=600,nm 处的吸光度 (A 600 ), 绘制所得突变菌株的生长曲线. 2 结果与分析图 3 磷脂酰丝氨酸的高效液相色谱图 Fig. 3 HPLC of phosphatidylserine 1.2.4 生长曲线的测定用 Bioscreen 全自动生长曲线分析仪测定原始菌株 E.

coli K12( sdaa sdab pgpb) 的基础上, 敲除基因 pgpa, 首先要获得带同源臂的氯霉素抗性片段, 两端带有 FRT 位点, 以 pkd3 为模板, 引物为 pgpa-h1 和 pgpa-h2, 所得 PCR 产物大小约为 1,133,bp, 如图 4(a) 所示. (a) 扩增同源片段 (b) 同源重组验证 (c) 切除抗性验证 M. DNA marker;1.

经氯霉素抗性平板筛选抗性菌株, 并用引物 pgpa-out1 和 pgpa-out2 对筛选得到的菌株进行菌落 PCR 鉴定,pgpA 基因全长 519,bp, 由于验证引物的位置处于同源臂的外围, 因此, 出发菌株验证引物间的大小应为 1,035,bp, 而发生同源重组后的菌株, 其验证引物间的大小应为 1,549,bp. 如图 4(b) 所示, 条带与预期相符, 说明同源重组获得成功. 2.

4 4 天津科技大学学报第 29 卷第 6 期 sdab tdcg) 的生长曲线, 每隔 20,min 测定 2 株菌在 λ=600,nm 处的吸光度 (A 600 ), 绘制所得突变菌株的生长曲线. 2 结果与分析图 3 磷脂酰丝氨酸的高效液相色谱图 Fig. 3 HPLC of phosphatidylserine 生长曲线的测定用 Bioscreen 全自动生长曲线分析仪测定原始菌株 E.,coli K12 出发菌株 E.,coli K12( sdaa sdab pgpb) 和重组菌株 E.,coli K12( pgpa pgpb sdaa 2.1 E.,coli,K12( pgpa, pgpb, sdaa, sdab) 的构建 (pgpa 基因的敲除 ) 带有 FRT 位点的同源线性片段扩增在 E. coli K12( sdaa sdab pgpb) 的基础上, 敲除基因 pgpa, 首先要获得带同源臂的氯霉素抗性片段, 两端带有 FRT 位点, 以 pkd3 为模板, 引物为 pgpa-h1 和 pgpa-h2, 所得 PCR 产物大小约为 1,133,bp, 如图 4(a) 所示. (a) 扩增同源片段 (b) 同源重组验证 (c) 切除抗性验证 M. DNA marker;1. 抗性基因线性片段 ;2. 菌株 E. coli K12( pgpa pgpb sdaa sdab);3 5. 出发菌株 E. coli K12( sdaa sdab pgpb); 4. 切除抗性的重组菌株图 4 pgpa 基因敲除及鉴定过程 Fig. 4 Verification of the pgpa deletion 同源重组后转化子的筛选将得到的抗性基因线性片段电转化入上述经诱导含有重组酶的感受态细胞内. 经氯霉素抗性平板筛选抗性菌株, 并用引物 pgpa-out1 和 pgpa-out2 对筛选得到的菌株进行菌落 PCR 鉴定,pgpA 基因全长 519,bp, 由于验证引物的位置处于同源臂的外围, 因此, 出发菌株验证引物间的大小应为 1,035,bp, 而发生同源重组后的菌株, 其验证引物间的大小应为 1,549,bp. 如图 4(b) 所示, 条带与预期相符, 说明同源重组获得成功切除氯霉素抗性基因的验证鉴定成功的阳性菌株经 42, 培养, 使温敏质粒 pkd46 丢失. 然后, 将另一温敏质粒 pcp20 转入此重组菌株中, 在 30, 下用氯霉素和氨苄青霉素的双抗性平板筛选.42, 诱导 FLP 重组酶表达, 挑取普通 LA 平板上长出的菌落, 用引物 pgpa-out1 和 pgpa-out2 对丢失质粒 pcp20 的单菌落进行菌落 PCR 验证, 出发菌株验证引物间的大小应为 1,035,bp, 而抗性基因切除后的菌株, 其验证引物间的大小应为 611,bp. 结果如图 4(c) 所示, 待鉴定菌株有 1 条大于 500,bp 的条带 ( 泳道 4), 对照菌株 1,000,bp 附近有 1 条带 ( 泳道 5), 与预期相符, 说明抗性基因切除成功, 得到菌株 E.,coli K12( pgpa pgpb sdaa sdab). 2.2 E.,coli,K12( pgpa, pgpb, sdaa, sdab, tdcg) 的构建 (tdcg 基因的敲除 ) 按照与类似步骤验证 tdcg 基因的敲除, 用含有 50,bp 同源臂的引物 tdcg-h1 和 tdcg-h2 扩增两端带有 FRT 位点的氯霉素抗性基因, 所得 PCR 产物大小为 1,133,bp, 如图 5(a) 所示 ( 泳道 1).

2014 年 12 月刘逸寒, 等 :pgpa 和 tdcg 基因的敲除对大肠杆菌磷脂酰丝氨酸合成的影响 5 (a) 扩增同源片段 (b) 同源重组验证 (c) 切除抗性验证 M. DNA marker;1. 抗性基因线性片段 ;2. 菌株 E. coli K12( pgpa pgpb sdaa sdab tdcg);3 4. 菌株 E. coli K12 ( pgpa pgpb sdaa sdab);5.

出发菌株验证引物间的大小应为 1,801,bp, 而发生同源重组后的菌株, 其验证引物间的大小应为 1,585,bp. 从泳道 2 3 可以看出, 待鉴定菌株有 1 条略大于 1,500,bp 的条带, 对照菌株有 1 条处于 1,500,bp 和 2,000,bp 的条带, 与预期相符, 说明同源重组获得成功.

图 5(c) 中对照菌株有 1 条位于 1,500,bp 和 2,000,bp 的条带 ( 泳道 4), 待鉴定菌株有 1 条处于 500,bp 和 750,bp 的条带 ( 泳道 5), 与预期相符, 说明抗性基因切除成功, 获得菌株 E.,coli K12( pgpa pgpb sdaa sdab tdcg). 2.3 磷脂酰丝氨酸含量分析原始菌株出发菌株和重组菌株中磷脂酰丝氨酸的含量见表 2.

5 2014 年 12 月刘逸寒, 等 :pgpa 和 tdcg 基因的敲除对大肠杆菌磷脂酰丝氨酸合成的影响 5 (a) 扩增同源片段 (b) 同源重组验证 (c) 切除抗性验证 M. DNA marker;1. 抗性基因线性片段 ;2. 菌株 E. coli K12( pgpa pgpb sdaa sdab tdcg);3 4. 菌株 E. coli K12 ( pgpa pgpb sdaa sdab);5. 切除抗性的菌株图 5 tdcg 基因敲除及鉴定过程 Fig. 5 The process of the tdcg deletion 线性片段与基因组发生同源重组后, 用引物 tdcg-out1 和 tdcg-out2 对筛选得到的氯霉素抗性菌株进行菌落 PCR 鉴定, 如图 5(b) 所示. 出发菌株验证引物间的大小应为 1,801,bp, 而发生同源重组后的菌株, 其验证引物间的大小应为 1,585,bp. 从泳道 2 3 可以看出, 待鉴定菌株有 1 条略大于 1,500,bp 的条带, 对照菌株有 1 条处于 1,500,bp 和 2,000,bp 的条带, 与预期相符, 说明同源重组获得成功. 抗性基因切除后, 用引物 tdcg-out1 和 tdcg-out2 进行菌落 PCR 验证, 结果如图 5(c) 所示. 出发菌株验证引物间的大小应为 1,801,bp, 而抗性基因切除后的菌株, 其验证引物间的大小应为 647,bp. 图 5(c) 中对照菌株有 1 条位于 1,500,bp 和 2,000,bp 的条带 ( 泳道 4), 待鉴定菌株有 1 条处于 500,bp 和 750,bp 的条带 ( 泳道 5), 与预期相符, 说明抗性基因切除成功, 获得菌株 E.,coli K12( pgpa pgpb sdaa sdab tdcg). 2.3 磷脂酰丝氨酸含量分析原始菌株出发菌株和重组菌株中磷脂酰丝氨酸的含量见表 2. 由表 2 可以看出 : 出发菌株比原始菌株中 PS 的积累量提高了约 1 倍, 为 1%, 继续敲除磷脂酰甘油磷酸酶基因 pgpa 时, 菌株的 PS 积累量提高为 1.5%; 继而敲除 L 丝氨酸脱氨酶 tdcg 时,PS 的产量可获得进一步提高, 最高能达到 2.5% 左右. 表 2 原始菌株出发菌株及重组菌株中 PS 在总磷脂中的含量 Tab. 2 The content of PS in total phospholipids in the original strain,strarting strain and recombinant strains 菌株 PS 含量 /% E. coli K12 <0.5 E. coli K12( sdaa sdab pgpb) 1.0±0.2 E. coli K12( pgpa pgpb sdaa sdab) 1.5±0.1 E. coli K12( pgpa pgpb sdaa sdab tdcg) 2.5± 磷脂酰丝氨酸的积累对生长情况的影响在 400,μL 的 LB 培养基中, 培养原始菌 E.,coli K12 出发菌 E.,coli K12( sdaa sdab pgpb) 和重组菌 E.,coli K12( pgpa pgpb sdaa sdab tdcg) 并绘制出各个菌株的生长曲线, 如图 6 所示. 由图 6 可以看出 : 在稳定期, 菌株 E.,coli K12( sdaa sdab pgpb) 和 E.,coli K12( pgpa pgpb sdaa sdab tdcg) 的菌液吸光度均明显低于原始菌株 E.,coli K12, 且 E.,coli K12( sdaa sdab pgpb) 和 E.,coli K12(( pgpa pgpb sdaa sdab tdcg) 不再有二次生长现象. 分析其原因是 :sdaa sdab tdcg 基因的敲除阻断了 L- 丝氨酸脱氨为丙酮酸的途径, 导致菌体内丙酮酸合成速率受到一定影响 ; 同时,pgpA pgpb 基因的敲除影响心磷脂的合成, 从而主要减弱线粒体膜的合成, 使菌体生长受到抑制. 3 结论图 6 菌株的生长曲线 Fig. 6 The growth curve of the strains 本文利用 Red 重组系统对大肠杆菌磷脂相关代谢途径进行改造, 获得重组菌株 E.,coli K12( pgpa

6 6 天津科技大学学报第 29 卷第 6 期 pgpb sdaa sdab tdcg), 成功阻断 L 丝氨酸的分解代谢和磷脂酰甘油磷酸的部分代谢. 将原始菌株 E.,coli K12 出发菌株 E.,coli K12( sdaa sdab pgpb) 和重组菌株 E.,coli K12( pgpa pgpb sdaa sdab tdcg) 进行摇瓶发酵, 发酵 20,h 后利用高效液相色谱分析菌体 PS 的含量, 重组菌株 PS 在总磷脂的含量是出发菌株的 2.5 倍 ; 但经途径改造后, 菌株生长变缓, 不再有二次生长现象, 说明途径改造使 PS 积累的同时, 导致菌体生长速度受到限制. 实验表明, 通过改造代谢途径可以提高 PS 在大肠杆菌中的含量, 为大肠杆菌发酵制备 PS 奠定了基础. 参考文献 : [1] 周芳, 李洪军. 磷脂酰丝氨酸研究进展 [J]. 食品工业科技,2008(5): [2] Rilfors L,Niemi A,Haraldsson S,et al. Reconstituted phosphatidylserine synthase from Escherichia coli is activated by anionic phospholipids and micelle-forming amphiphiles[j]. Biochimica et Biophysica Acta(BBA)- Molecular and Cell Biology of Lipids,1999,1438(2): [3] Icho T. Membrane-bound phosphatases in Escherichia coli:sequence of the pgpb gene and dual subcellular localization of the pgpb product[j]. Journal of Bacteriology,1988,170(11): [4] Funk C R,Zimniak L,Dowhan W. The pgpa and pgpb genes of Escherichia coli are not essential:evidence for a third phosphatidylglycerophosphate phosphatase[j]. Journal of Bacteriology,1992,174(1): [5] Lu Y H,Guan Z,Zhao J,et al. Three phosphatidylglycerol-phosphate phosphatases in the inner membrane of Escherichia coli[j]. Journal of Biological Chemistry, 2011,286(7): [6] Su H S,Moniakis J,Newman E B. Use of gene fusions of the structural gene sdaa to purify L-serine deaminase 1,from Escherichia coli K-12[J]. European Journal of Biochemistry,1993,211(3): [7] Su H S,Lang B F,Newman E B. L-serine degradation in Escherichia coli K-12:Cloning and sequencing of the sdaa gene[j]. Journal of Bacteriology,1989,171(9): [8] Voelker D R. Phosphatidylserine decarboxylase [J]. Biochimica et Biophysica Acta,1997,1348(1/2): [9] Ishinaga M,Kito M. Participation of soluble phophatidylserine synthetase in phosphatidylethanolamine biosynthesis in Escherichia coli membrane[j]. European Journal of Biochemistry,1974,42(2): [10] Vance J E,Steenbergen R. Metabolism and functions of phosphatidylserine[j]. Progress in Lipid Research, 2005,44(4): 责任编辑 : 常涛

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材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌