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同毋
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1 第 40 卷分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究第期 2012 年月 Chinese Journal of Analytical Chemistry ~ DOI: /SP.J 以局部结构类似物为类模板的分子印迹整体柱在线检测三甲氧苄啶张红武郭建文李康王伟声吴玉萍卢绮雯翟海云 * ( 广东药学院药科学院, 广州 ) 摘要以三聚氰胺 (MAM) 为类模板分子, 甲基丙烯酸 (MAA) 为功能单体, 二甲基丙烯酸乙二醇酯 (EDMA) 为交联剂, 聚乙二醇 (PEG400) 为致孔剂, 原位聚合法制备了对三甲氧苄啶 (TMP) 有较强选择性吸附作用的分子印迹 (MIP) 整体柱以该 MIP 整体柱为高效液相色谱柱, 考察了其在不同色谱流动相组成条件下对 TMP 的识别性能结果显示,MIP 整体柱在甲醇乙腈水等条件下能够吸附 TMP 而不出峰可以利用 MIP 整体柱在甲醇 - 水 (80 20,V/V) 中在线选择性吸附 ( 或富集 )TMP, 然后将流动相转换为甲醇进一步除去疏水性杂质, 最后用强洗脱剂洗脱 TMP 出峰 MIP 整体柱线检测人血清中 TMP 的工作曲线为 A= 42.8c -3.03(r= ); 线性范围为 8.32~93.8 mg/l; 检出限 mg/l 关键词三甲氧苄啶 ; 分子印迹整体柱 ; 类模板 ; 三聚氰胺 ; 高效液相色谱 ; 在线检测 1 引言在分子印迹聚合物 (MIP) 的研究中, 可以利用目标分子的结构 ( 或局部结构 ) 类似物分子为类模板制备 MIP, 以实现对目标分子或某一类目标分子的选择性识别 [1~ 7] 这样不仅可以有效避免 MIP 中残余模板分子的泄漏对测定准确性的影响 [1], 还可解决某些成本昂贵或在聚合溶液体系中难溶解目标分子的 MIP 的制备问题 [8] MIP 整体柱融合了 MIP 的选择性和整体柱的高流通性高柱效制备简单等特性, 而且印迹柱内的印迹位点完整, 对目标分子显示出良好的选择性识别能力 [9], 已成为分析领域的研究热点之一 MIP 整体柱也已被用于多种药物或中药有效成分的选择性分离与分析 [10~ 15] 三甲氧苄啶 (Trimethoprim,TMP), 是一种广谱抗菌药, 常与多种抗菌素合用, 起到协同增效作用已有研究表明,TMP 对许多新的感染性疾病有临床疗效发展新的高选择性和高灵敏的分析方法, 对于准确测定复杂基质中的 TMP 有重要意义以 TMP 为模板, 采用本体聚合悬浮聚合等方法制备的 MIP [16,17] [18] 已被应用于 TMP 的固相萃取和电化学测定研究中 Liu 等制备了以 TMP 为模板的 MIP 整体柱, 并研究了该印迹柱对 TMP 的识别性能为了避免 MIP 中模板分子泄漏影响 TMP 测定的准确性, 本研究采用三聚氰胺 (MAM) 为类模板, 制备 MIP 整体柱, 测定 TMP 聚乙二醇 (PEG400) 作为致孔剂, 在整体柱内形成大的贯穿孔, 使 MIP 整体柱具有良好的通透性 ; 此外, 其还通过形成氢键, 促使三聚氰胺溶解, 最终使形成的印迹位点靠近柱内贯穿孔道表面, 为 TMP 分子进入印迹空穴提供便利 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 1200 高效液相色谱仪 ( 美国安捷伦公司 ), 采用 20 ml 定量环 ;JSM-6330F 扫描电子显微镜 ( 日本电子公司 ); 超纯水仪 ( 广州科桥实验技术设备有限公司 ), 高速离心机 (Thermo 220/240) 三聚氰胺 (MAM, 含量 99.9%, 广州齐云生物科技有限公司 ); 三甲氧苄啶 (TMP) 磺胺甲 (SMZ) 甲氨蝶呤 (MTX) 对照品购自中国生物制品药品检验所 ; 叶酸 (FOL, 含量 97%,HPLC 级, 上海晶纯试剂公司 ); 甲基丙烯酸 (MAA) 偶氮二异丁腈 (AIBN) 聚乙二醇 (PEG400) 均为分析纯 ( 天津市科密欧公司 ); 二甲基丙烯酸乙二醇酯 (EDMA, 含量 98%,ACROS); 甲醇和乙腈 ( 色谱纯, 默克公司 ); 乙酸收稿 ; 接受本文系国家自然青年科学基金 (No ) 资助项目 * zhaihaiyun@ 126.com 唑

2 分析化学第 40 卷 ( 分析纯, 广州化学试剂厂 ); 氨水 ( 分析纯, 含氨 25% 的水溶液, 广东光华化学厂有限公司 ) 水为超纯水,EDMA 使用前经中性氧化铝层析柱过滤提纯,AIBN 经乙重结晶提纯其它试剂均为分析纯空白人血清由广东药学院门诊部提供 2.2 MIP 整体柱的制备将模板分子三聚氰胺 (0.125 mmol) 甲基丙烯酸 (1.5 mmol) 二甲基丙烯酸乙二醇酯 (13.5 mmol) 溶于由甲醇和 PEG 400 组成的混合溶剂中, 加入引发剂偶氮异丁腈 (42.1 mg), 冰浴通氮气 10 min, 灌入不锈钢色谱柱管 (100 mm 4.6 mm,i.d) 内, 两端密封, 在 50 水浴中反应 40 h 更换柱头后将其接入高效液相色谱 (HPLC) 系统中, 分别用甲醇 - 乙酸混合液 (4 1,V/V) 甲醇甲醇 - 氨水混合液 (9 1,V/V) 冲洗, 除去模板分子致孔剂及未反应的单体最后分别用水甲醇冲洗至基线平稳空白整体柱 (NIP) 的制备除不加模板分子外, 其它步骤均与印迹柱相同 2.3 色谱性能研究分别以印迹整体柱 (MIP 柱 ) 和空白整体柱 (NIP 柱 ) 为色谱柱, 考察不同流动相条件下整体柱的容量因子 (k) 或印迹因子 (IF) 值 k=(tr -t0)/t0,if=kmip /knip 其中,tR 为保留时间 ;t0 为死时间, 此处为丙酮的保留时间流速为 0.5 或 1.0 ml/min, 检测波长 λ=247 nm 2.4 人血清样品测定先用甲醇将 2.25 g/l 的 TMP 标准储备液稀释到不同浓度分取不同浓度的 TMP 标准溶液 400 ml, 分别加入 400 ml 乙腈 400 ml 空白血清, 得到浓度为 8.32,18.7,28.1,37.5,56.2,75.0,84.4 和 93.7 mg/l 的血清标液振荡混匀, 以 r/min 离心 5 min, 取上清液进行测定按同样方法配制 4.16,35.6 和 48.8 mg/l 人血清样品 3 结果与讨论 3.1 MIP 整体柱的制备 TMP 分子中的二氨基嘧啶环结构与 MAM 的分子结构极为类似 ( 图 1), 可采用 MAM 为类模板, 制备对 TMP 有识别能力的 MIP 整体柱 MAM 呈碱性,MAA 的 COOH 基团作为氢键的供体和受体 [1] 能同时与 MAM 母体环上的 N 原子和取代基仲胺 ( NH ) 形成双氢键而构成多个多元环状结构多元氢键作用力和印迹位点空间几何形状的协同作用, 构成了 MIP 整体柱对 MAM 模板分子极强的选 [19] 择性识别能力图 2 为对 MIP 整体柱和 NIP 整体柱截面的扫描电镜对比图从图 2 可见, 由于 PEG400 通过占位相分离洗脱在整体柱床中形成大量贯穿孔, 因而整体柱截面呈现网状多孔的骨架结构, 具有良好的通透性本实验所制备的整体柱以甲醇为流动相, 流速 1.0 ml/min 时压力为 1.1~1.2 MPa PEG400 能通过醚链上的氧原子与 MAM 分子产生氢键作用而促使 MAM 很快溶解, 两者在溶液中有可能以复合物形式存在这种极性较强的大分子复合物可使聚合过程中相分离较早发生, 且程度增大, 引起聚合物堆积粒子成长程度增大, 造成 MIP 柱内聚合物堆积粒子尺寸较大 ( 图 2) NIP 柱的聚合液中不存在这种复合物, 因此聚合过程中的相分离程度小于 MIP 柱, 聚合完成后产生的堆积粒子尺寸明显小于 MIP 柱 PEG400 分子链上的氧原子与 MAM 分子上的部分 NH 2 基团产生氢键作用, 造成功能单体 MAA 只能与 MAM 分子中的其它基团发生较强的分子间相互作用, 实现有效的自组装 ( 图 3) 当聚合反应完成洗除 PEG400 和 MAM 后, 便形成了靠近贯穿孔道表面的印迹空穴大的流通空间和靠近孔道表面的印迹位点为 MIP 柱识别体积较大的 TMP 分子提供了便利 3.2 流动相组成对识别性能的影响 TMP 在甲醇乙腈纯水等流动相中能完全被 MIP 整体柱保留 ( 考察到 t=30 min), 在乙腈纯水流动相中也能被 NIP 柱保留, 而在甲醇流动相中则缓慢从 NIP 柱上洗脱从表 1 可见, 在不同比例的甲醇 - 水流动相中,TMP 在 MIP 柱上被完全保留含水量低于 50% (V/V) 时,TMP 不在 NIP 柱上保留 ; 当含水量高于 50% (V/V) 时, 疏水作用力的影响占主导,TMP 则又完全保留在 NIP 柱上在乙腈 - 水 (V/V) 分别为

第期张红武等 : 以局部结构类似物为类模板的分子印迹整体柱在线检测三甲氧苄啶图 1 Fig.1 本实验中有关化合物分子结构 Molecular structures of the tested compounds 图 2 MIP 和 NIP 柱截面扫描电镜图 ( 放大 2500 倍 ) Fig.

3 第期张红武等 : 以局部结构类似物为类模板的分子印迹整体柱在线检测三甲氧苄啶图 1 Fig.1 本实验中有关化合物分子结构 Molecular structures of the tested compounds 图 2 MIP 和 NIP 柱截面扫描电镜图 ( 放大 2500 倍 ) Fig.2 SEM images of MIP and NIP column (magnification of 2500 times) 80 20,60 40,40 60 时,MIP 和 NIP 柱上均检测到 TMP 的出峰, 但 tr 明显不同, 色谱峰型均展宽严重在甲醇中分别添加 0.2%,1.0% 和 5.0% (V/V) 的乙酸时,TMP 的保留时间 ( 流速 0.5 ml/min) 分别为 26.6,23.4 和 39.1 min 可能是由于生成的甲氧苄啶乙酸盐在甲醇中溶解度有限,TMP 峰型均严重展宽乙酸添加量较大时, 保留时间反而延长在甲醇中固定添加 2.5% (V/V) 的水并同时分别添加 0.1%,0.2% 和 1.0% (V/V) 乙酸时, 保留时间值为 5.16,4.58 和 2.14 min 加入的水增大了甲氧苄啶乙酸盐的溶解性, 使 TMP 出峰时间明显缩短, 峰型变窄当甲醇中添加 0.5% (V/V) 氨水时,TMP 的保留时间为 3.76 min, 接近丙酮的出峰时间 (3.19 min) 3.3 最佳色谱流动相的选择为实现人血清中 TMP 的选择性富集与测定, 综合考虑上述流动相的实验结果后, 选择甲醇 - 水 (80 20,V/V) 为进样流动相此时,TMP 在 MIP 整体柱上被选择性富集, 而在 NIP 柱上不被保留然后, 流动相转换为甲醇, 进一步除去疏水性杂质最后, 再用强洗脱剂将 TMP 洗脱出峰氨水 - 甲醇 ( ,V/V) 在 λ = 247nm 处的背景吸收与甲醇接近, 故选其为洗脱剂 3.4 MIP 整体柱的交叉选择性选择了与 TMP 同属二氢叶酸还原酶抑制剂的叶酸 (FOL), 甲氨蝶呤 (MTX) 以及经常与 TMP 共同

4 分析化学第 40 卷图 3 Fig.3 使用的磺胺甲印迹过程示意 Simple illustrations of imprinting process 唑 (SMZ) 为考察对象, 检验 MIP 整体柱的结合选择性在甲醇水 (80 20,V/V) 流动相中, 这 3 种相关药物均不被保留, 它们的保留时间分别为 2.28 (FOL), (MTX) 和 min (SMZ) 从图 4 可见,MIP 整体柱内的印迹空穴对 TMP 的嘧啶环有很高的选择性识别能力 FOL,MTX 和 SMZ 混合物在 MIP 整体柱上不被保留, 而 TMP 被保留在柱上, 直到被洗脱出峰本实验中未出现明显的 MAM 泄漏现象, 而且 MAM 在 λ= 247 nm 时的吸收强度很弱, 对 TMP 的准确测定不产生影响 3.5 人血清中 TMP 的测定表 1 流动相条件对 MIP 整体柱分离效果的影响 Table 1 Effect of the composition of mobile phase on separation performance of MIP monolithic column 流动相 Mobile phase composition (V/V) 甲醇 - 水 Methanoḻ water kmip knip IF 乙腈 - 水 Acetonitrile-water kmip knip IF * # # # : 未出峰或未计算 IF (No obvious chromatographic peak, or no calculation of IF); # : 未检测 (Not detecting); * : 缓慢洗脱出峰 (Eluting slowly);kmip: MIP 柱容量因子 (Capacity factor for MIP monolithic column); knip: NIP 柱容量因子 (Capacity factor for N-MIP monolithic column); IF (kmip/knip): 印迹因子 (Imprinting factor);λ=247 nm,v=0.5ml/min 从图 5 可见, 甲醇 - 水 (80 20,V/V) 和甲醇可有效除去样品中绝大多数背景杂质, 而 TMP 则选择性地被富集在 MIP 柱内 NIP 柱经洗脱后, 未见 TMP 洗脱峰, 仅显示很小的溶剂峰 ; 而在 MIP 柱上则可见明显的 TMP 洗脱峰 ; 空白血清样在 MIP 柱上也没有 TMP 洗脱峰以 TMP 血清标准溶液浓度值 (c) 为横坐标, 相应的 TMP 色谱峰面积 (A) 为纵坐标, 进行线性回归 : A=42.8c-3.03(r=0.9994), 线性范围为 8.32~93.8 mg/l, 检出限按 3 倍的信噪比计算为 mg/l 对 35.6 和 48.8 mg/l 两个血清样平行测定 3 次, 回收率分别为 93.5% (RSD=1.0% ) 和 94.1% (RSD=2.5% ) 浓度为 4.16 mg/l( 低于线性范围最低值 8.32 mg/l) 的血清样品, 在甲醇 - 水流动相条件下连续进样 (20 m L)3 次, 洗脱峰面积测定值 A=471.2, 计算值为 mg/l, 平均每针为 3.70 mg/l, 回收率为 88.9% 本研究以三聚氰胺为类模板甲基丙烯酸为功能单体二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂 PEG400 为致孔剂制备 MIP 整体柱 PEG400 不仅起到了致孔剂的作用, 还促使 MAM 溶解, 使印迹位点靠近孔道

5 第期张红武等 : 以局部结构类似物为类模板的分子印迹整体柱在线检测三甲氧苄啶表面, 为 TMP 的识别提供便利利用该 MIP 整体可在线选择性富集检测人血清中的 TMP 图 4 MIP 柱的识别选择性 Fig.4 Cross selectivity of MIP column A. SMZ (25.0 mg/l) +FOL (22.6 mg/l)+mtx (23.8 mg/l)+tmp (22.5 mg/l); B. SMZ (25.0 mg/l)+fol (22.6 mg/l)+mtx (23.8 mg/l) 流动相 Mobile phase: 0~15 min 甲醇 - 水 (Methanoḻ water, 80 20,V/V),v = 0.50 ml/min;15 ~ 21 min 甲醇 (Methanol),v= 1.0 ml/min;21 ~ 31 min 氨水 - 甲醇 (Ammonia wateṟ methanol, ,V/V ),v= 1.0 ml/min;λ=247 nm 图 5 MIP 柱与 NIP 柱测定人血清样中的 TMP( 加标 35.6 mg/l) Fig.5 Chromatograms of TMP in human serum (35.6 mg/l) on MIP and NIP columns A.NIP 柱测定人血清中 TMP (NIP column);b. MIP 柱测定空白血清 (blank human serum on MIP column);c. MIP 柱测定人血清中 TMP (MIP column); 流动相 Mobile phase:0~8 min 甲醇 - 水 (Methanoḻ water, 80 20,V/V),v= 0.50 ml/min; 甲醇 (Methanol),v= 1.0 ml/min;18~25 min 氨水 - 甲醇 (Ammonia wateṟ methanol, , V/V),v=1.0 ml/min;λ=247 nm References 1 MatsuiJ,FujiwaraK,TakeuchiT.Anal.Chem.,2000,72(8):1810~ QuagliaM,ChenonK,HalAJ,LorenziED,SelergrenB.J.Am.Chem.Soc.,2001,123(10):2146~ HalAJ,QuagliaM,ManesiotisP,LorenziED,SelergrenB.Anal.Chem.,2006,78(24):8362~ WangJC,GuoRB,ChenJP,ZhangQ,LiangX M.Anal.Chim.Acta,2005,540(2):307~315 5 QiPP,WangJC,JinJ,SuF,ChenJP.Talanta,2010,81(4-5):1630~635 6 SheYX,CaoW Q,ShiX M,LvXL,LiuJJ,WangRY,JinF,WangJ,XiaoH.J.Chromatogr.B,2010,878 (23):2047~ WANGJiang-Tao,SONG Xing-Liang.ChineseJ.Anal.Chem.,2010,38(8):1121~1126 王江涛, 宋兴良. 分析化学,2010,38(8):1121~ LiuXJ,LiuJZ,HuangY Y,ZhaoR,LiuG Q,ChenY.J.Chromatogr.A,2009,1216(44):7533~ Kim H,GuiochonG.Anal.Chem.,2005,77(1):93~ YinJF,YangGL,ChenY.J.Chromatogr.A,2005,1090(1-2):68~75 11 LiZY,LiuZS,ZhangQ W,DuH Q.ChineseChemicalLeters,2007,18(3):322~ HuangXD,ZouHf,ChenX M,LuoQZ,KongL.J.Chromatogr.A,2003,984(2):273~ ZHANGJing,HELang-Chong,FU Qiang.ChineseJ.Anal.Chem.,2005,33(8):1121~1126 张静, 贺浪冲, 傅强. 分析化学,2005,33(8):1121~ YANG Qing-Qing,LIJuan,,DIBin,SU MengXiang,YANFang.ChinJ.PharmAnal.,2011,31(1):1~5 杨清清, 李娟, 狄斌, 苏梦翔, 严方. 药物分析杂志,2011,31(1):1~5 15 LIUZhao-Sheng,SUJing,ZHENGChao,HAOLaṉFang,GAO Ru-Yu.Chin.J.PharmAnal.,2006,26(11): 1684~1688 刘照胜, 苏敬, 郑超, 郝兰芳, 高如瑜. 药物分析杂志,2006,26(11):1684~ HuSG,LiL,HeX W.Anal.Chim.Acta,2005,537(1-2):215~ RebeloT,AlmeidaSA,GuerreiroJRL,Montenegro M CBS M,SalesM GF.MicrochemicalJournal,2011, 98(1):21~28

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