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阚军云
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1 第 50 卷第 1 期 2014 年 2 月兰州大学学报 ( 自然科学版 ) Journal of Lanzhou University (Natural Sciences) Vol. 50 No. 1 Feb 文章编号 : (2014) 复合功能单体法合成氧氟沙星分子印迹材料汤万进 1, 赵彤 1, 周春红 2, 张海霞 1 1. 兰州大学化学化工学院, 兰州甘肃省食品质量监督检验研究中心, 兰州摘要 : 以氧氟沙星为模板分子, 甲基丙烯酸和 2- 乙烯基吡啶为复合功能单体, 二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂合成了复合功能单体的印迹聚合物材料. 通过静态吸附实验和 Scatchard 模型分析研究印迹材料对模板分子的吸附容量特异性和选择性. 结果表明 : 与单一功能单体制备的 MIP 材料相比, 复合单体 MIP 材料对模板分子及其类似物都存在着较高的吸附容量和更好的选择性. 而 Scatchard 模型证明在 MIP 复合印迹材料表面存在两种结合方式 : 一种是呈高选择性亲和力, 另一种为弱选择性亲和力. 其相应的最大吸附容量分别为 48, 240 µmol/g, 在含有 20 µg/ml 氧氟沙星溶液时, 复合单体的印迹材料与对应的非印迹材料相比, 印迹因子可达到随后将该材料作为特异性吸附剂结合高效液相色谱对牛奶中痕量的氟喹诺酮进行吸附和检测, 取得了理想的重现性 (RSD 5.0%) 和加标回收率 (93.72% %). 关键词 : 分子印迹 ; 复合功能单体 ; 高效液相色谱 ; 氟喹诺酮 ; 氧氟沙星中图分类号 : O 文献标识码 : A Preparation of a molecularly imprinted polymer of ofloxacin with combined functional monomers TANG Wan-jin 1, ZHAO Tong 1, ZHOU Chun-hong 2, ZHANG Hai-xia 1 1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Lanzhou University, Lanzhou , China 2. Gansu Food Quality Supervision and Inspection Center, Lanzhou , China Abstract: Molecularly imprinted polymers (MIP) were prepared using ofloxacin as the template molecule, both methacrylic acid and 2-vinylpyridine as combined monomers and ethylene glycol dimethacrylate as a cross-linking agent. The equilibrium binding experiment and Scatchard model analysis were used to evaluate the molecular binding characteristics, and for recognition and selectivity of MIP materials. The MIP with double monomers was found to own larger adsorption amount for ofloxacin and a higher imprint factor (3.20 in 20 µg/ml ofloxacin solution) than the MIP prepared with a single monomer. The MIP with double monomers has two kinds of binding sites: high and low selective affinities. The affinity curves shows that the maximum adsorption capacities were 48 and 240 µmol/g, respectively for high and selective affinity sites. Finally, the MIP with double monomers was chosen as an adsorbent to concentrate and detect trace fluoroquinolones in milk samples combined with the HPLC analytical method and an ideal repeatability (RSD 5.0%) and satisfied recovery (93.72% %) were obtained. Key words: molecularly imprinted polymers; combined functional monomers; high performance liquid chromatography; fluoroquinolone; ofloxacin 近年来, 各类药物被广泛滥用, 不可避免地导致微量药物进入生态环境, 虽然本身浓度很低, 但通过食物链累积而对人类健康造成了巨大威胁, 因此对痕量药物残留的分析成为迫切需要解决的问题 [1]. 氟喹诺酮 (Fluoroquinolones, FQs) 类药物是一类重要的人造抗生素, 广泛应用于家畜家禽收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 甘肃省科技支撑计划项目 (1204FKCA127); 甘肃省科技重大专项计划项目 (1102FKDA011) 作者简介 : 张海霞 (1970 ), 女, 河北邢台人, 教授, 博士研究生导师, 博士, zhanghx@lzu.edu.cn, 研究方向为功能材料与分析化学, 通信联系人.

甘肃省食品质量监督检验研究中心, 兰州 730000 摘要 : 以氧氟沙星为模板分子, 甲基丙烯酸和 2- 乙烯基吡啶为复合功能单体, 二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂合成了复合功能单体的印迹聚合物材料.

2 第 1 期汤万进, 等 : 复合功能单体法合成氧氟沙星分子印迹材料 137 和水产动物的细菌感染性疾病防治 [2]. 测定痕量的 FQ s 药物前必须经过样品预处理从而达到富集与除杂的目的, 然而常见吸附剂选择性较差, 在复杂环境或生物样品基质中难以有效地对单一 FQ s 进行选择性吸附 [3 4], 因此开发具有高吸附容量和良好选择效果的吸附剂显得非常有意义. 分子印迹聚合物 (Molecular imprinted polymer, MIP) 是具有特殊键合位点并对目标分子具有特异选择性的材料 [5], 可以作为选择性吸附剂对低浓度或复杂样品中某些组分进行富集分离. FQs 的 MIP 材料在环境生物食品等方面应用十分广泛. 比如, [6] Benito 等合成恩诺沙星 MIP 材料并用作固相萃取 [7] 小柱, 对河水中的 FQ s 进行痕量检测 ; Yan 等将合成的环丙沙星 MIP 材料直接作为液相色谱固定 [8] 相, 分离富集人体尿液中的目标分析物 ; 而 Yan 等合成的 FQ s 类 MIP 材料作为固相萃取小柱来检测与分离牛奶中的痕量环丙沙星和恩诺沙星 ; Turiel [9] 等以环丙沙星的印迹材料来选择性的吸附土壤中的微量氟喹诺酮等. 这些分子印迹材料都以单一功能单体法合成. 目前利用复合功能单体法形成的印迹材料报道不多, 不同功能单体可通过与模板形成多种结合位 [10] 点而增强对模板的特异性识别性能. Mosbach 等采用甲基丙烯酸和 4- 乙烯基吡啶复合功能单体法 [11] 制备了抗癫痫类药物的分子印迹, 周良模等以丙烯酰胺和 2- 乙烯基吡啶为复合功能单体合成液相色谱手性固定相. 结果表明复合功能单体法制备的 MIP 材料比单一功能单体材料在特异性和吸附容量上都有很大的提高. 本文以甲基丙烯酸和 2- 乙烯基吡啶作为复合功能单体, 制备了氧氟沙星的分子印迹材料. 通过静态平衡结合法和 Scatchard 模型分析其结合容量和特异性吸附性能, 最后将该材料作为吸附剂结合 HPLC-UV 建立了测定牛奶样品中 FQ s 的方法. 1 实验部分 1.1 化学试剂 2- 乙烯基吡啶 (2-VP) α- 甲基丙烯酸 (MAA) 二甲基丙烯酸乙二醇酯 (EGDMA) 购自 Alfa Aesar 天津化学有限公司, 减压蒸馏后使用 ; 偶氮二异丁腈 (AIBN) 购于天津市越丰化学品有限公司, 甲醇重结晶后使用 ; 氧氟沙星 (OFL) 恩诺沙星 (ENR) 诺氟沙星 (NOR) 和磺胺甲基嘧啶 (SMZ) 购于上海源叶生物科技有限公司 ; 乙醇乙腈甲苯二氯甲烷 (DCM) 和乙酸购于天津光复试剂公司, 所有的化学试剂均为分析纯. 1.2 实验仪器与色谱条件色谱分析在高效液相色谱仪 (Varian, 美国 ) 上完成. 色谱柱为反相, C18 柱 (Dikma Technologies), 内径柱长 = 4.6 mm 250 mm, 柱温 40 C, 流动相流速为 1.0 ml/min, 进样量 10.0 µl, 紫外检测器的检测波长为梯度检测 : min, 267 nm; min, 293 nm; min, 277 nm. 流动相组成为甲醇 (HPLC 级, 迪马科技, 美国 ) 和磷酸盐缓冲液 (10.0 mmol H 3 PO 4, 10.0 mmol NaH 2 PO 4 溶于 1 L 超纯水中, 三乙胺调节至 ph=2.80) 的混合物, 体积混合比例为 25:75, 流动相使用前用 0.45µm 的滤膜过滤. 紫外可见分光光度计 ( 普析通用仪器公司 ) Nicolet 670 傅里叶红外光谱仪 ( 美国 ) 和 JEM- 1230EX 透射电子显微镜 ( 日本, 100 kv) 用于材料的表征等. 1.3 分子印迹的制备分别用两种单独功能单体以及复合功能单体制备氧氟沙星分子 (OFL) 印迹聚合物, 过程见图 1. 图 1 复合功能单体法合成氧氟沙星分子印迹聚合物制备过程 Figure 1 Preparation of ofloxacin molecularly imprinted polymer with combined functional monomers 分子印迹聚合物的制备称取 0.1 mmol (36.2 mg)ofl 作为模板分子, 量取 0.4 mmol 2-VP( 或者 MAA) 和 2.0 mmol (375 µl) EGDMA 分别作为功能单体和交联剂, 置于 25.0 ml 圆底烧瓶中, 加至 10.0 ml 的甲苯与氯仿混合溶剂中 ( 体积比 1:1), 超声溶解. 待完全溶解后, 冰水浴下搅拌 30 min, 通 N min, 隔绝氧气且获得均匀的预聚体系. 之后加入 20.0 mg AIBN, 溶液置于 60 C 油浴中反应 24 h, 得到的材料标记为 MIPⅠ (2-VP 为功能单体 ) 和 MIPⅡ (MAA 为功能单体 ).

剂显得非常有意义. 分子印迹聚合物 (Molecular imprinted polymer, MIP) 是具有特殊键合位点并对目标分子具有特异选择性的材料 [5], 可以作为选择性吸附剂对低浓度或复杂样品中某些组分进行富集分离.

3 138 兰州大学学报 ( 自然科学版 ) 第 50 卷复合功能单体法合成印迹聚合物 (MIPⅢ) 将 0.4 mmol 的 2-VP 替换为 0.2 mmol 的 MAA 和 0.2 mmol 的 2-VP 的混合物进行如上合成, 得到 MIPⅢ. 以上 3 种印迹材料用乙醇离心洗涤 3 次以上, 真空干燥至恒重. 将聚合物用甲醇乙酸溶液 ( 体积比 4:1) 索氏提取 48 h, 至提取液中 OFL 在 λ= 300 nm 吸收峰高度不变为止, 再用甲醇 24 h 冲洗以除尽乙酸, 真空干燥至恒重. 相应不加模板分子的非印迹材料, 其合成处理步骤与上相同, 分别对应标记为 NIPⅠ,Ⅱ,Ⅲ. 1.4 印迹材料吸附实验吸附溶剂与吸附材料的选择将 3 种印迹聚合物 MIP 各取 20.0 mg, 依次加入到 µg/ml 的 OFL 乙腈溶液或乙醇溶液中, 室温震荡吸附 24 h. 通过对比吸附数据, 选择吸附容量较高的溶剂. 将 3 种印迹聚合物 MIP 及其相应的 NIP 材料各取 20.0 mg 加入到 100, 500, µg/mL OFL 乙腈溶液中, 室温震荡吸附 24 h, 静置后取上清液, 过滤, 用紫外可见分光光度计测定 OFL 质量浓度, 计算吸附容量, 得到最优吸附材料静态吸附试验对复合单体印迹材料进行静态吸附实验并对数据进行 Scatchard 模型分析. 在 10.0 ml 浓度范围为 µg/mL 的 OFL 乙腈溶液中加入 20.0 mg 的印迹材料, 震荡吸附 24 h, r/min 离心取上清液, 过滤, 测定 OFL 质量浓度, 计算各自吸附容量, 并重复 3 次, 取平均 [12] 值, 用 Scatchard 公式进一步分析来评估 MIP 材料上的键合常数. Q/C free = (Q max Q)/K D. (1) 在 Scatchard 公式中, K D 为离解平衡常数, Q max 为饱和吸附量. 以 Q/C free 对 Q 作图, 之后根据曲线的斜率和截距分别得到 K D 及 Q max, 这里吸附量 Q 是指每克材料吸附分析物的质量静态吸附动力学研究称取 MIPⅢ 和 NIPⅢ 各 20.0 mg, 加至 10.0 ml 浓度分别为 20, 200, µg/mL 的 OFL 乙腈溶液中, 室温震荡 24 h, 分别在 10, 20, 30 min 及 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 24 h 取上清液, 稀释并在紫外可见分光光度计测定其浓度. 每一个浓度重复实验 3 次, 取平均值静态选择性吸附实验取 20.0 g MIPⅢ 材料加入到 10.0 ml 含 OFL, NOR, ENR 和 SMZ 各 1.0 mg 的混合溶液中, 室温震荡 12 h 使之充分吸附, 取上清液, 过滤, HPLC- UV 分析测定并重复 3 次. 1.5 实际样品中氟喹诺酮的检测经过杀菌和乳液均一的新鲜纯牛奶购买于超市并保存于 4 C 环境中. 从牛奶中萃取氟喹诺酮分子步骤如下 : 取 10.0 ml 牛奶, 加入 1.0 ml 乙腈, 加入等质量的 OFL, NOR 和 ENR 溶于其中, 再加入体积 5.0 mol/l HCl 水溶液, 涡旋震荡 3.0 min, 然后以转速 r/m 离心 10.0 min. 收集上清液, 滴加若干乙腈, 若有浑浊出现, 则继续上述操作至无浑浊出现为止. 取 20.0 mg MIPⅢ 加入到上清液中, 涡旋震荡 15.0 min 使其吸附完全, 静置, 离心, 弃上清液 ; 用洗脱液对上述沉淀进行解吸附作用 : 加入一定体积的洗脱液, 涡旋, 离心, 取上清液. 为使样品进一步的富集, 将洗脱溶液 N 2 挥干, 用 0.5 ml 流动相重新溶解, 用 0.45 µm 尼龙膜过滤后进行 HPLC- UV 分析. 2 结果与讨论 2.1 分子印迹的制备合成分子印迹聚合物的方法很多, 本论文采用沉淀聚合法, 以 OFL, AIBN 和 EGDMA 分别作为模板分子引发剂和聚合物交联剂 ; 对于致孔剂, 由于 OFL 的结构较为复杂, 有 3 个相互共轭的芳香环, 同时存在着羧基叔胺基. 溶解实验后结果表明, OFL 较易溶于乙腈氯仿酸性水溶液和碱性水溶液, 微溶于甲醇乙醇和纯水. 考虑到乙腈毒性较大, 对环境污染比较严重, 而若在水溶液或者醇溶液中, 分子间氢键作用等非共价作用易被破坏殆尽, 因此最终选择氯仿作为溶剂兼致孔剂, 同时考虑到氯仿属于中等极性致孔剂, 一般认为致孔剂的沸点和极性严重影响到形成的聚合物形貌及比表面积 [13]. 加入一定量的甲苯不但可以很好地降低致孔剂极性, 还可以更好地促进反应物溶解性与聚合物的分散性. 综合考虑, 选用氯仿与甲苯混合液 ( 体积比 50:50) 作为致孔剂. 选择合适功能单体种类至关重要 : 根据模板分子的结构, 基本可以确定合适的功能单体. 一般来说, 碱性模板分子选择酸性功能单体 ( 如 MAA 等 ), 酸性模板分子选择碱性功能单体 ( 如 2-VP 等 ), 而本文中所用的模板分子既有羧基又有叔胺基, 因此作为两性

相应不加模板分子的非印迹材料, 其合成处理步骤与上相同, 分别对应标记为 NIPⅠ,Ⅱ,Ⅲ. 1.4 印迹材料吸附实验 1.4.1 吸附溶剂与吸附材料的选择将 3 种印迹聚合物 MIP 各取 20.0 mg, 依次加入到 100.

4 第 1 期汤万进, 等 : 复合功能单体法合成氧氟沙星分子印迹材料 139 性质的分子, 分别使用了 2-VP, MAA 以及 2-VP 和 MAA 按摩尔比 1:1 作为复合功能单体来形成聚合物, 分别对各个聚合物的吸附性能进行研究, 以得到最佳性能印迹材料. 对合成的各种 MIP 及 NIP 材料进行了 FRIT 光谱分析 ( 图 2, 图 3). 发现 4 个图谱比较类似, 这可能是由于功能单体在聚合物中所占比例太小, 难以辨别. 从图 2 中可以看出 cm 1 处的宽峰对应于聚合物结构水的反伸缩振动峰, cm 1 和 cm 1 是亚甲基的 C-H 伸缩振动特征峰, 在 cm 1 处出现的特征吸收峰对应于交联剂中存在的酯羰基键, cm 1 出现的是 C-C 骨架弯曲振动峰. 由图 3 可见, MIPⅠ: cm 1 处的 3 个吸收峰对应于芳杂环骨架伸缩振动特征峰 ; MIPⅡ: cm 1 为末端烯烃氢吸收峰, cm 1 对应于 CH 3 不对称弯曲振动特征峰 ; MIPⅢ, NIPⅢ a MIPⅠ; b MIPⅡ; c MIPⅢ; d NIP-Ⅲ 图 2 4 种材料的傅里叶红外光谱图 Figure 2 Fourier transform infrared spectra of four polymers 峰型较为一致, 出现了图 2, 图 3 中特有的 a 和 b 吸收峰, 充分说明了两种功能单体都出现在聚合物孔穴中. 2.2 吸附溶剂和吸附材料的选择将 3 种 MIP 分别在 µg/ml 的 OFL 乙醇溶液和乙腈溶液中进行静态吸附实验, 发现以 MAA 为功能单体的聚合物在乙醇中基本上没有吸附作用, 而其余两种聚合物的吸附值也很低. 出现这种情况, 可能是由于在吸附过程中, 氢键和静电作用力是主要结合力, 在乙醇中会破坏这些非共价结合力, 另外合成的 MIP 是在低极性的氯仿甲苯混合溶剂中进行的, 因此溶剂的记忆效应也导致了吸附容量的降低, 而在同样浓度的 OFL 乙腈溶剂中, 3 种聚合物材料吸附容量则相对要高. 相对而言, 与氯仿同属于中等极性溶剂的乙腈可以诱导模板分子进入聚合物孔穴且不破坏分子间作用力, 得到了较为理想的吸附数据, 因此选择乙腈作为吸附溶剂. 分别配制不同浓度的 OFL 乙腈溶液, 通过紫外可见分光光度计上扫描, 发现其最大吸收波长在 300 nm 处, 在该波长处做 OFL 乙腈溶液的标准曲线, 线性良好 : A 300 = C (C 的单位为 µg/ml),r 2 = , 线性范围为 µg/mL, 以此作为定量实验的标准. 在后续实验中, OFL 浓度不在此区间时, 稀释到该线性范围进行计算. 分别将 3 种 MIP 材料加入到不同浓度的 OFL 乙腈溶液中进行充分吸附. 用印迹因子 α 来评价 MIP 的特异性能力, 印迹因子计算见 (2) 式 [14]. 各种材料的吸附结果见表 1, 通过吸附实验数据来选择效果最好和吸附容量较合适的印迹聚合物. α = Q MIP /Q NIP, (2) a MIPⅠ; b MIPⅡ; c MIPⅢ; d NIP-Ⅲ 图 3 4 种材料在 1680 cm cm 1 的局部区域放大图 Figure 3 Enlarged view of the local area for four polymers in 1680 cm cm 1 其中 Q 是 MIP 或 NIP 材料的吸附容量. 吸附容量和印迹因子是评价 MIP 的主要指标. 如表 1 所示, 在不同浓度下, 各 MIP 材料的印迹因子 α>1, 说明相应的 MIP 对 OFL 的识别能力比 NIP 高 ; 之后对比在相同浓度下不同材料的吸附容量, 发现 MIPⅠ 吸附容量最低, MIPⅡ 印迹因子最小, MIPⅢ 不但有较高的吸附容量而且印迹因子也可以与 MIPⅠ 几乎可以持平. 究其原因, MIPⅡ 主要以氢键和静电作用力为主要结合力, 在材料表面同时存在一些质子化基团, 所以导致了非特异性结合位点所占比重很大, 因此虽然吸附容量很高而印迹因子很低 ; 而对于 MIPⅠ, 虽然模板分子与功能单体之间有着很强的 π-π 作用力,

从图 2 中可以看出 3 440 cm 1 处的宽峰对应于聚合物结构水的反伸缩振动峰, 2 896 cm 1 和 2 953 cm 1 是亚甲基的 C-H 伸缩振动特征峰, 在 1 732 cm 1 处出现的特征吸收峰对应于交联剂中存在的酯羰基键, 1 150 cm 1 出现的是

5 140 兰州大学学报 ( 自然科学版 ) 第 50 卷但是由于功能单体空间位阻相对较大, 很难使每一个带有芳香环的分子对彼此近距离接触, 这也就导致了该材料具有较强的印迹效应和较低的模板负载量 ; 对于 MIPⅢ, 2-VP 和 MAA 同时存在, 使得最终形成的孔穴中兼具了较高的吸附容量和较强的印迹效应, 因此选择 MIPⅢ 进行后续研究. 表 1 3 类材料在不同浓度的溶液中对氧氟沙星的吸附效果 Table 1 Adsorption effect of three types materials for ofloxacin in different concentrations 功能单体 µg/ml µg/ml µg/ml Q MIP Q NIP α Q MIP Q NIP α Q MIP Q NIP α 2-VP MAA VP/MAA 每个实验平行 3 次, 取平均值, RSD 5.0%, Q MIP 和 Q NIP 的单位为 mg/g. 2.3 复合单体材料对模板的结合性能为了研究复合单体材料的结合性能, 本文做了静态吸附实验和 Scatchard 分析. 图 4 是 MIPⅢ 和 NIPⅢ 在不同浓度 OFL 乙腈溶液的吸附等温线. 浓度范围在 µg/mL 时, 可看出 MIPⅢ 和 NIPⅢ 对 OFL 的吸附容量会随着 OFL 浓度的增加而增大, 并且 MIPⅢ 有很高的吸附容量, 随着浓度的增加, 两种材料的吸附趋势不同, MIPⅢ 对 OFL 的吸附量随着浓度的增加持续增大, 而 NIPⅢ 则达到吸附饱和量. 通过结合率 ( 即材料上已经结合分析物量与原溶液中分析物总量比值 ) 对浓度的曲线可以看出两种材料在 100.0µg/mL 时达到最大结合率, 之后吸附容量虽增大, 但是被吸附药物占药物总量的百分比例逐渐降低. 可以看出, MIPⅢ 对 OFL 的结合率要比 NIPⅢ 大, 尤其在低浓度时更为明显, 这也说明 MIPⅢ 可以更好地富集样品中痕量 OFL. 通过计算结合率比值得知在浓度为 20.0 µg/ml 时达到值 3.20, 特异性效果明显, 随着浓度增大, α 有所降低最终到达一个近似平台 (2.0±0.5). 这可能归结于在低浓度时, MIPⅢ 的非特异性吸附量很少, 另外 MIPⅢ 存在着不同类的价键结合位点, 使其结合力更强. 图 5 是 MIP 吸附不同浓度 OFL 的 Scatchard 分析模型. 通过 Scatchard 模型分析可以看出, 两个线性关系暗示着在 MIP 复合印迹材料表面存在两种结合方式 : 一种是呈高选择性或高键合能的亲和力, 另一种是有低键能的弱亲和力. 高键合能的 a 材料的吸附容量对氧氟沙星浓度的吸附曲线图 5 MIPⅢ 吸附氧氟沙星的 Scatchard 分析模型 Figure 5 Scatchard analysis model of MIPⅢfor OFL 亲和力 K d1 = mmol/l, Q max1 = mmol/g b 材料的结合率对氧氟沙星浓度的吸附曲线图 4 MIPⅢ 和 NIPⅢ 对氧氟沙星的吸附等温曲线 Figure 4 Adsorption isotherm of MIP Ⅲ and NIP Ⅲ for ofloxacin (17.33 mg/g), 类似地对应于低键能的弱亲和力 K d2 = mmol/l, Q max2 = mmol/g (86.68 mg/g). 2.4 吸附动力学研究吸附动力学实验是考察复合单体材料对模板

表 1 3 类材料在不同浓度的溶液中对氧氟沙星的吸附效果 Table 1 Adsorption effect of three types materials for ofloxacin in different concentrations 功能单体 100.0 µg/ml 500.0 µg/ml 1 000.

6 第 1 期汤万进, 等 : 复合功能单体法合成氧氟沙星分子印迹材料 141 分子的吸附容量随时间变化的情况. 图 6 显示 OFL 在 MIPⅢ 的吸附动力学性质, 很明显, 吸附平衡时间取决于溶液浓度. 在 µg/mL 浓溶液中, MIP 对 OFL 的吸附平衡需要 12 h 左右, 在 µg/ml 溶液中平衡需要 5 h, 而在 20.0 µg/ml 的较稀溶液中, 平衡约需 1 h. 浓度越小, 吸附平衡时间越短. 同子的色谱图. 从图 8(mAu 为色谱峰高的单位, 无量纲量 ) 中可以看出, 4 种物质分离度很大, 因此建立的分析方法可同时检测 4 种物质. 图 7 几种分析物结构示意图 Figure 7 Schematic diagram of several analytes a 20.0 µg/ml b µg/ml a 磺胺甲基嘧啶 ; b 氧氟沙星 ; c 诺氟沙星 ; d 恩诺沙星图 8 4 种药物分子的高效液相色谱图 Figure 8 HPLC spectra of four analytes 图 8 的实验条件为 : ODS C18 柱, 内径柱长 = 4.6 mm mm, 流速 1.0 ml/min, 柱温 40 C, 进样量 10.0 µl, 紫外检测波长 min, 267 nm; min, 293 nm; min, 277 nm. 流动相为甲醇和磷酸盐缓冲液, 体积比为 25:75. c µg/ml 图 6 MIPⅢ 和 NIPⅢ 在不同浓度氧氟沙星乙腈溶液中吸附动力学曲线 Figure 6 Adsorption kinetics of MIP Ⅲ and NIP Ⅲ for OFL solution in different concertrations 时可以看到, NIP 相对于 MIP 平衡时间更短, 可能是由于在制备 MIP 时形成了特异性的识别位点在聚合物孔道深处, 导致 OFL 的扩散缓慢. 2.5 MIPⅢ 材料的选择性配制 OFL, NOR, ENR 和 SMZ 4 种药物分子的混合物 ( 结构见图 7), 利用高效液相色谱进行分离分析. 操作条件见实验部分. 图 8 是 4 种药物分另外, 以浓度为横坐标, 色谱峰面积为纵坐标, 得到了每个药物分子的标准曲线 ( 线性范围为 µg/mL), 见表 2. 从表 2 中可以发现, 标准曲线线性良好, 可信度高. 另外, 在后续高浓度吸附实验中, 将溶液稀释至该线性区间进行检测. 根据标准曲线计算材料对混合物的吸附容量, 在 µg/ml 的混合溶液中, 经计算得到结果 ( 图 9). 从图 9 中可以发现, MIP 对氧氟沙星吸附容量为 2.65 mg/g, 对诺氟沙星吸附量为 2.34 mg/g, 对恩诺沙星的吸附容量为 1.39 mg/g, 而相应的对磺胺甲基嘧啶吸附量仅有 0.27 mg/g. 本文认为在选择性吸附过程中, MIPⅢ 的特异性结合位点导致了几种沙星类药物的吸附, 而对于结构不相似

从图 8(mAu 为色谱峰高的单位, 无量纲量 ) 中可以看出, 4 种物质分离度很大, 因此建立的分析方法可同时检测 4 种物质. 图 7 几种分析物结构示意图 Figure 7 Schematic diagram of several analytes a 20.0 µg/ml b 200.

7 142 兰州大学学报 ( 自然科学版 ) 第 50 卷表 2 4 种分析物的线性方程相关系数检测限定量限 (LOQ) Table 2 Linear equations, correlation coefficient, LOD and LOQ of the four analytes 药物名称线性方程相关系数检测限 (µg/ml) 定量限 (µg/ml) 磺胺甲基嘧啶 Y =417433X R 2 = 氧氟沙星 Y =501345X R 2 = 诺氟沙星 Y =629797X R 2 = 恩诺沙星 Y =664510X R 2 = 再用洗脱液对吸附在材料上的分析物进行解吸附作用, 将洗脱溶液挥干, 用 0.5 ml 流动相稀释后做 HPLC-UV 分析 ph 优化图 9 复合单体材料对 4 种药物的选择性吸附性能研究 Figure 9 Selective adsorption of polymer with combined functional monomers for the four analytes 的磺胺类药物, 则无特异性吸附. 以上结果说明了以 OFL 为模板的 MIP 印迹材料同时吸附 OFL, ENR 和 NOR 的可行性. 由静态吸附实验数据可得 : µg/ml OFL 乙腈溶液中, MIPⅢ 的吸附容量为 5.32 mg/g. 这与 MIP 在混合分析物溶液对 OFL 的吸附容量不一致, 而相应的 OFL, NOR 和 ENR 的吸附容量总和为 6.38 mg/g, 同时 NIP 对这 3 种分析物的吸附总量达到 4.07 mg/g, 这两个数据略高于材料对单一 OFL 吸附数据 ( 由于对 SMZ 吸附量较少, 暂不考虑 ). 因此可以认为复合单体材料对每一种物质的吸附容量是相互关联的, 即复合单体材料将一定量的结合位点非均等地分摊到每一个物质. 另外, 从 OFL 与 NOR 结构上来看, 发现这两种分析物的空间位阻大小极其相似, 相应地 ENR 的空间位阻则小一些, 而 SMZ 的结构与前三者不具有可比性. 这也可以合理地解释复合单体材料对 OFL 和 NOR 的吸附容量较为类似, 而小位阻的 ENR 在空腔内不易被捕获, 因而吸附容量略低. 由于分子大小不一, 可以很好地解释三者的吸附总容量高于单一分子吸附容量. 2.6 吸附与解吸附条件的优化选择性吸附结果说明了以 OFL 为模板的 MIP Ⅲ 同时吸附和富集生物样品中微量的氟喹诺酮类药物的可行性. 于是将 MIPⅢ 加入到牛奶简单处理后的上清液中, 利用涡旋使药物完全吸附, 适当的 ph 值不仅可以使 MIP 吸附容量增大, 而且还有利于提高印迹材料的选择性. 在处理牛奶时, 分别在 ph 值为 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 和 6.0 时测定其回收率, 发现随着 ph 的增大, 回收率略有增加. 当 ph 为 6.0 时为最佳, OFL, NOR 和 ENR 的回收率可达 96.78%. ph 值的增大有利于回收率的提高, 因此, 选 ph 为 6.0 来进行下一步研究. 不同 ph 值下 MIPⅢ 对分析物的吸附量不同可能与分析物的存在形式和 MIP 的表面电荷有关. 在具有两性性质的氟喹诺酮类药物中, OFL, NOR 和 ENR 的等电点 (PI) 都在 6.70 左右 [15]. 当溶液 ph 值低于两性分子的 PI 值时, 带正电荷. 因此在该实验条件下, 几个分析物实际上基本不带电荷. MIPⅢ 材料, 由于同时存在酸性丙烯酸基团和碱性吡啶基团, 因此也有类似的两性性质. 较低 ph 对于有两性性质的吸附剂和分析物分子, 均易导致其氨基质子化, 均显示正电荷, 因此吸附效果不太理想 ; 而在接近 PI 值时, 目标分子和材料显示中性, 展现出了更强的吸附特性, 进而有较高的回收率解吸溶液的优化确定牛奶溶液 ph=6.0, 用 5.0 ml 乙腈, 甲醇和乙酸混合溶液 ( 体积比为 90:10) 对已吸附的材料洗涤 3 次, 发现甲醇和乙酸混合液可以很好地洗涤, 不仅不保留干扰物, 而且洗涤 2 次就可以把所有吸附分析物解吸. 而纯乙腈溶剂洗涤 3 次后吸附材料上仍有残余, 并且为待分析物带来众多干扰. 所以将甲醇和乙酸溶液作为洗涤溶液, 而后用 ml 的解析溶液对材料进行洗脱. 发现当解吸溶液为 2.0 ml 时就可以将保留在材料上的分析物完全洗脱下来. 为使样品进一步的富集, 将洗脱溶液 N 2 挥干, 用一定体积流动相稀释后进行 HPLC-UV 分析.

80 恩诺沙星 Y =664510X 262667 R 2 =0.9995 0.30 1.00 再用洗脱液对吸附在材料上的分析物进行解吸附作用, 将洗脱溶液挥干, 用 0.5 ml 流动相稀释后做 HPLC-UV 分析. 2.6.1 ph 优化图 9 复合单体材料对 4 种药物的选择性吸附性能研究 Figure 9 Selective adsorption of polymer with combined functional monomers for the four analytes 的磺胺类药物, 则无特异性吸附.

8 第 1 期汤万进, 等 : 复合功能单体法合成氧氟沙星分子印迹材料同时检测牛奶中的 3 种氟喹诺酮牛奶的处理过程在实验部分已有描述, 牛奶中未检测出分析物. 随后进行了回收率实验 : 分别在牛奶样品中加入 3 种分析物各 1.0, 5.0, 10.0 µg, 之后对其进行吸附解吸, 分别用 1.0, 1.0, 2.0 ml 流动相稀释后, HPLC-UV 分析. 3 种氟喹诺酮类药物的加标回收率见表 3. 由表 3 可见样品中 OFL 的回收率比较理想. 每一个样品同一天内平行进样 3 次, 并且隔日重复, 其相对标准偏差见表 4. 发现 RSD 5.0%, 说明 MIPⅢ 从牛奶样品中吸附氟喹诺酮类抗生素是可行的, 且牛奶样品中的基质成分并没有影响到印迹聚合物对的富集和分离效率. 表 3 3 种分析物在牛奶中的平均加标回收率 Table 3 Average recoveries of three analytes in milk 加入量 /µg OFL/% NOR/% ENR/% 表 4 3 种分析物在牛奶中相对标准偏差 (n = 3) Table 4 Relative standard deviation of three analytes in milk (n = 3) 加入量 /µg 日内 RSD/% 日间 RSD/% OFL NOR ENR OFL NOR ENR 图 10 为加入 3 种喹诺酮药物 (50 ng/g) 的牛奶样品经过材料 MIPⅢ 处理前后的色谱图. 从图 10 中可以看到, 富集效果比较理想, 可以将该 MIP 材料对氟喹诺酮这一类分子进行初步的选择性吸附富集. 3 结论本文以酸性功能单体 ( 甲基丙烯酸 ) 和碱性功能单体 (2- 乙烯基吡啶 ) 为复合功能单体, 通过沉淀聚合方法制备的氧氟沙星分子印迹材料, 其印迹因子和吸附量都优越于单功能单体制备的材料, 该 MIP 可以用作固相萃取材料进行牛奶样品的前处理, 建立的方法具有可信的重现性和回收率. 参考文献 [1] Rodríguez E, Navarro V F, Benito P E, et al. Multiresidue determination of ultratrace levels of fluoroquinolone antimicrobials in drinking and aquaculture water samples by automated online molecularly imprinted solid phase extraction and liquid chromatography[j]. Analytical Chemistry, 2011, 83(6): [2] Carabineiro S A C, Thavorn A T, Pereira M F R, et al. Adsorption of ciprofloxacin on surfacemodified carbon materials[j]. Water Research, 2011, 45(15): [3] Tamayo F G, Turiel E, Martín E A. Molecularly imprinted polymers for solid-phase extraction and solid-phase microextraction: recent developments and future trends[j]. Journal of Chromatography A, 2007, 1152(1): [4] Turiel E, Martín E A, Tadeo J L. Molecular imprinting-based separation methods for selective analysis of fluoroquinolones in soils[j]. Journal of Chromatography A, 2007, 1172(2): [5] Wei Xiao-lin, Samadi A, Husson S M. Synthesis and characterization of molecularly imprinted polymers for chromatographic separations[j]. Separation Science and Technology, 2005, 40(1/3): [6] Benito P E, Urraca J L, Sellergren B, et al. Solid-phase extraction of fluoroquinolones from aqueous samples using a water-compatible stochiometrically imprinted polymer[j]. Journal of Chromatography A, 2008, 1208(1): a, b, c 峰依次为 OFL, NOR 和 ENR 图 10 加标牛奶溶液 ( 加标浓度均为 50.0 ng/g) 经过 MIP Ⅲ 处理前后的色谱图 Figure 10 Chromatograms of spiked milk solution before and after treatment of MIP Ⅲ (spiked concentration was 50.0 ng/g) [7] Yan Hong-yuan, Row K H, Yang Geng-liang. Water-compatible molecularly imprinted polymers for selective extraction of ciprofloxacin from human urine water-compatible molecularly imprinted polymers for selective extraction of ciprofloxacin from human urine[j]. Talanta, 2008, 75(1): [8] Yan Hong-yuan, Tian Ming-lei, Row K H. Determination of enrofloxacin and ciprofloxacin in milk using molecularly imprinted solid-phase

由表 3 可见样品中 OFL 的回收率比较理想. 每一个样品同一天内平行进样 3 次, 并且隔日重复, 其相对标准偏差见表 4. 发现 RSD 5.

9 144 兰州大学学报 ( 自然科学版 ) 第 50 卷 extraction[j]. Journal of Separation Science, 2008, 31(16/17): [9] Turiel E, Martín E A, Tadeo J L. Molecular imprinting-based separation methods for selective analysis of fluoroquinolones in soils[j]. Journal of Chromatography A, 2007, 1172(2): [10] Mosbach K, Horiyama S, Matsunaga H, et al. Molecularly imprinted polymers for simultaneous determination of antiepileptics in river water samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[j]. Journal of Chromatography A, 2009, 1216(25): [11] 周良模, 王进防, 孟子晖, 等. 复合碱性功能单体分子烙印手性固定相 [J]. 化学学报, 1999, 57(10): [12] Yan Hong-yuan, Qiao Feng-xia, Row K H. Molecularly imprinted-matrix solid-phase dispersion for selective extraction of five fluoroquinolones in eggs and tissue[j]. Analytical Chemistry, 2007, 79(21): [13] Chen Ling-xin, Xu Shou-fang, Li Jin-hua. Recent advances in molecular imprinting technology: current status, challenges and highlighted applications [J]. Chemical Society Reviews, 2011, 40(5): [14] Yang Kai-guang, Liu Zong-bin, Mao Mao, et al. Molecularly imprinted polyethersulfone microspheres for the binding and recognition of bisphenol A[J]. Analytica Chimica Acta, 2005, 546(1): [15] 刘世旺. 亲合毛细管电泳法测定八种氟喹诺酮药物的等电点 [J]. 黄冈师范学院学报, 2006, 26(2): ( 责任编辑 : 张勇 )

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