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1 第 50 卷 第 1 期 2014 年 2 月 兰 州 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 ) Journal of Lanzhou University (Natural Sciences) Vol. 50 No. 1 Feb 文 章 编 号 : (2014) 复 合 功 能 单 体 法 合 成 氧 氟 沙 星 分 子 印 迹 材 料 汤 万 进 1, 赵 彤 1, 周 春 红 2, 张 海 霞 1 1. 兰 州 大 学 化 学 化 工 学 院, 兰 州 甘 肃 省 食 品 质 量 监 督 检 验 研 究 中 心, 兰 州 摘 要 : 以 氧 氟 沙 星 为 模 板 分 子, 甲 基 丙 烯 酸 和 2- 乙 烯 基 吡 啶 为 复 合 功 能 单 体, 二 甲 基 丙 烯 酸 乙 二 醇 酯 为 交 联 剂 合 成 了 复 合 功 能 单 体 的 印 迹 聚 合 物 材 料. 通 过 静 态 吸 附 实 验 和 Scatchard 模 型 分 析 研 究 印 迹 材 料 对 模 板 分 子 的 吸 附 容 量 特 异 性 和 选 择 性. 结 果 表 明 : 与 单 一 功 能 单 体 制 备 的 MIP 材 料 相 比, 复 合 单 体 MIP 材 料 对 模 板 分 子 及 其 类 似 物 都 存 在 着 较 高 的 吸 附 容 量 和 更 好 的 选 择 性. 而 Scatchard 模 型 证 明 在 MIP 复 合 印 迹 材 料 表 面 存 在 两 种 结 合 方 式 : 一 种 是 呈 高 选 择 性 亲 和 力, 另 一 种 为 弱 选 择 性 亲 和 力. 其 相 应 的 最 大 吸 附 容 量 分 别 为 48, 240 µmol/g, 在 含 有 20 µg/ml 氧 氟 沙 星 溶 液 时, 复 合 单 体 的 印 迹 材 料 与 对 应 的 非 印 迹 材 料 相 比, 印 迹 因 子 可 达 到 随 后 将 该 材 料 作 为 特 异 性 吸 附 剂 结 合 高 效 液 相 色 谱 对 牛 奶 中 痕 量 的 氟 喹 诺 酮 进 行 吸 附 和 检 测, 取 得 了 理 想 的 重 现 性 (RSD 5.0%) 和 加 标 回 收 率 (93.72% %). 关 键 词 : 分 子 印 迹 ; 复 合 功 能 单 体 ; 高 效 液 相 色 谱 ; 氟 喹 诺 酮 ; 氧 氟 沙 星 中 图 分 类 号 : O 文 献 标 识 码 : A Preparation of a molecularly imprinted polymer of ofloxacin with combined functional monomers TANG Wan-jin 1, ZHAO Tong 1, ZHOU Chun-hong 2, ZHANG Hai-xia 1 1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Lanzhou University, Lanzhou , China 2. Gansu Food Quality Supervision and Inspection Center, Lanzhou , China Abstract: Molecularly imprinted polymers (MIP) were prepared using ofloxacin as the template molecule, both methacrylic acid and 2-vinylpyridine as combined monomers and ethylene glycol dimethacrylate as a cross-linking agent. The equilibrium binding experiment and Scatchard model analysis were used to evaluate the molecular binding characteristics, and for recognition and selectivity of MIP materials. The MIP with double monomers was found to own larger adsorption amount for ofloxacin and a higher imprint factor (3.20 in 20 µg/ml ofloxacin solution) than the MIP prepared with a single monomer. The MIP with double monomers has two kinds of binding sites: high and low selective affinities. The affinity curves shows that the maximum adsorption capacities were 48 and 240 µmol/g, respectively for high and selective affinity sites. Finally, the MIP with double monomers was chosen as an adsorbent to concentrate and detect trace fluoroquinolones in milk samples combined with the HPLC analytical method and an ideal repeatability (RSD 5.0%) and satisfied recovery (93.72% %) were obtained. Key words: molecularly imprinted polymers; combined functional monomers; high performance liquid chromatography; fluoroquinolone; ofloxacin 近 年 来, 各 类 药 物 被 广 泛 滥 用, 不 可 避 免 地 导 致 微 量 药 物 进 入 生 态 环 境, 虽 然 本 身 浓 度 很 低, 但 通 过 食 物 链 累 积 而 对 人 类 健 康 造 成 了 巨 大 威 胁, 因 此 对 痕 量 药 物 残 留 的 分 析 成 为 迫 切 需 要 解 决 的 问 题 [1]. 氟 喹 诺 酮 (Fluoroquinolones, FQs) 类 药 物 是 一 类 重 要 的 人 造 抗 生 素, 广 泛 应 用 于 家 畜 家 禽 收 稿 日 期 : ; 修 回 日 期 : 基 金 项 目 : 甘 肃 省 科 技 支 撑 计 划 项 目 (1204FKCA127); 甘 肃 省 科 技 重 大 专 项 计 划 项 目 (1102FKDA011) 作 者 简 介 : 张 海 霞 (1970 ), 女, 河 北 邢 台 人, 教 授, 博 士 研 究 生 导 师, 博 士, [email protected], 研 究 方 向 为 功 能 材 料 与 分 析 化 学, 通 信 联 系 人.

2 第 1 期 汤 万 进, 等 : 复 合 功 能 单 体 法 合 成 氧 氟 沙 星 分 子 印 迹 材 料 137 和 水 产 动 物 的 细 菌 感 染 性 疾 病 防 治 [2]. 测 定 痕 量 的 FQ s 药 物 前 必 须 经 过 样 品 预 处 理 从 而 达 到 富 集 与 除 杂 的 目 的, 然 而 常 见 吸 附 剂 选 择 性 较 差, 在 复 杂 环 境 或 生 物 样 品 基 质 中 难 以 有 效 地 对 单 一 FQ s 进 行 选 择 性 吸 附 [3 4], 因 此 开 发 具 有 高 吸 附 容 量 和 良 好 选 择 效 果 的 吸 附 剂 显 得 非 常 有 意 义. 分 子 印 迹 聚 合 物 (Molecular imprinted polymer, MIP) 是 具 有 特 殊 键 合 位 点 并 对 目 标 分 子 具 有 特 异 选 择 性 的 材 料 [5], 可 以 作 为 选 择 性 吸 附 剂 对 低 浓 度 或 复 杂 样 品 中 某 些 组 分 进 行 富 集 分 离. FQs 的 MIP 材 料 在 环 境 生 物 食 品 等 方 面 应 用 十 分 广 泛. 比 如, [6] Benito 等 合 成 恩 诺 沙 星 MIP 材 料 并 用 作 固 相 萃 取 [7] 小 柱, 对 河 水 中 的 FQ s 进 行 痕 量 检 测 ; Yan 等 将 合 成 的 环 丙 沙 星 MIP 材 料 直 接 作 为 液 相 色 谱 固 定 [8] 相, 分 离 富 集 人 体 尿 液 中 的 目 标 分 析 物 ; 而 Yan 等 合 成 的 FQ s 类 MIP 材 料 作 为 固 相 萃 取 小 柱 来 检 测 与 分 离 牛 奶 中 的 痕 量 环 丙 沙 星 和 恩 诺 沙 星 ; Turiel [9] 等 以 环 丙 沙 星 的 印 迹 材 料 来 选 择 性 的 吸 附 土 壤 中 的 微 量 氟 喹 诺 酮 等. 这 些 分 子 印 迹 材 料 都 以 单 一 功 能 单 体 法 合 成. 目 前 利 用 复 合 功 能 单 体 法 形 成 的 印 迹 材 料 报 道 不 多, 不 同 功 能 单 体 可 通 过 与 模 板 形 成 多 种 结 合 位 [10] 点 而 增 强 对 模 板 的 特 异 性 识 别 性 能. Mosbach 等 采 用 甲 基 丙 烯 酸 和 4- 乙 烯 基 吡 啶 复 合 功 能 单 体 法 [11] 制 备 了 抗 癫 痫 类 药 物 的 分 子 印 迹, 周 良 模 等 以 丙 烯 酰 胺 和 2- 乙 烯 基 吡 啶 为 复 合 功 能 单 体 合 成 液 相 色 谱 手 性 固 定 相. 结 果 表 明 复 合 功 能 单 体 法 制 备 的 MIP 材 料 比 单 一 功 能 单 体 材 料 在 特 异 性 和 吸 附 容 量 上 都 有 很 大 的 提 高. 本 文 以 甲 基 丙 烯 酸 和 2- 乙 烯 基 吡 啶 作 为 复 合 功 能 单 体, 制 备 了 氧 氟 沙 星 的 分 子 印 迹 材 料. 通 过 静 态 平 衡 结 合 法 和 Scatchard 模 型 分 析 其 结 合 容 量 和 特 异 性 吸 附 性 能, 最 后 将 该 材 料 作 为 吸 附 剂 结 合 HPLC-UV 建 立 了 测 定 牛 奶 样 品 中 FQ s 的 方 法. 1 实 验 部 分 1.1 化 学 试 剂 2- 乙 烯 基 吡 啶 (2-VP) α- 甲 基 丙 烯 酸 (MAA) 二 甲 基 丙 烯 酸 乙 二 醇 酯 (EGDMA) 购 自 Alfa Aesar 天 津 化 学 有 限 公 司, 减 压 蒸 馏 后 使 用 ; 偶 氮 二 异 丁 腈 (AIBN) 购 于 天 津 市 越 丰 化 学 品 有 限 公 司, 甲 醇 重 结 晶 后 使 用 ; 氧 氟 沙 星 (OFL) 恩 诺 沙 星 (ENR) 诺 氟 沙 星 (NOR) 和 磺 胺 甲 基 嘧 啶 (SMZ) 购 于 上 海 源 叶 生 物 科 技 有 限 公 司 ; 乙 醇 乙 腈 甲 苯 二 氯 甲 烷 (DCM) 和 乙 酸 购 于 天 津 光 复 试 剂 公 司, 所 有 的 化 学 试 剂 均 为 分 析 纯. 1.2 实 验 仪 器 与 色 谱 条 件 色 谱 分 析 在 高 效 液 相 色 谱 仪 (Varian, 美 国 ) 上 完 成. 色 谱 柱 为 反 相, C18 柱 (Dikma Technologies), 内 径 柱 长 = 4.6 mm 250 mm, 柱 温 40 C, 流 动 相 流 速 为 1.0 ml/min, 进 样 量 10.0 µl, 紫 外 检 测 器 的 检 测 波 长 为 梯 度 检 测 : min, 267 nm; min, 293 nm; min, 277 nm. 流 动 相 组 成 为 甲 醇 (HPLC 级, 迪 马 科 技, 美 国 ) 和 磷 酸 盐 缓 冲 液 (10.0 mmol H 3 PO 4, 10.0 mmol NaH 2 PO 4 溶 于 1 L 超 纯 水 中, 三 乙 胺 调 节 至 ph=2.80) 的 混 合 物, 体 积 混 合 比 例 为 25:75, 流 动 相 使 用 前 用 0.45µm 的 滤 膜 过 滤. 紫 外 可 见 分 光 光 度 计 ( 普 析 通 用 仪 器 公 司 ) Nicolet 670 傅 里 叶 红 外 光 谱 仪 ( 美 国 ) 和 JEM- 1230EX 透 射 电 子 显 微 镜 ( 日 本, 100 kv) 用 于 材 料 的 表 征 等. 1.3 分 子 印 迹 的 制 备 分 别 用 两 种 单 独 功 能 单 体 以 及 复 合 功 能 单 体 制 备 氧 氟 沙 星 分 子 (OFL) 印 迹 聚 合 物, 过 程 见 图 1. 图 1 复 合 功 能 单 体 法 合 成 氧 氟 沙 星 分 子 印 迹 聚 合 物 制 备 过 程 Figure 1 Preparation of ofloxacin molecularly imprinted polymer with combined functional monomers 分 子 印 迹 聚 合 物 的 制 备 称 取 0.1 mmol (36.2 mg)ofl 作 为 模 板 分 子, 量 取 0.4 mmol 2-VP( 或 者 MAA) 和 2.0 mmol (375 µl) EGDMA 分 别 作 为 功 能 单 体 和 交 联 剂, 置 于 25.0 ml 圆 底 烧 瓶 中, 加 至 10.0 ml 的 甲 苯 与 氯 仿 混 合 溶 剂 中 ( 体 积 比 1:1), 超 声 溶 解. 待 完 全 溶 解 后, 冰 水 浴 下 搅 拌 30 min, 通 N min, 隔 绝 氧 气 且 获 得 均 匀 的 预 聚 体 系. 之 后 加 入 20.0 mg AIBN, 溶 液 置 于 60 C 油 浴 中 反 应 24 h, 得 到 的 材 料 标 记 为 MIPⅠ (2-VP 为 功 能 单 体 ) 和 MIPⅡ (MAA 为 功 能 单 体 ).

3 138 兰 州 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 ) 第 50 卷 复 合 功 能 单 体 法 合 成 印 迹 聚 合 物 (MIPⅢ) 将 0.4 mmol 的 2-VP 替 换 为 0.2 mmol 的 MAA 和 0.2 mmol 的 2-VP 的 混 合 物 进 行 如 上 合 成, 得 到 MIPⅢ. 以 上 3 种 印 迹 材 料 用 乙 醇 离 心 洗 涤 3 次 以 上, 真 空 干 燥 至 恒 重. 将 聚 合 物 用 甲 醇 乙 酸 溶 液 ( 体 积 比 4:1) 索 氏 提 取 48 h, 至 提 取 液 中 OFL 在 λ= 300 nm 吸 收 峰 高 度 不 变 为 止, 再 用 甲 醇 24 h 冲 洗 以 除 尽 乙 酸, 真 空 干 燥 至 恒 重. 相 应 不 加 模 板 分 子 的 非 印 迹 材 料, 其 合 成 处 理 步 骤 与 上 相 同, 分 别 对 应 标 记 为 NIPⅠ,Ⅱ,Ⅲ. 1.4 印 迹 材 料 吸 附 实 验 吸 附 溶 剂 与 吸 附 材 料 的 选 择 将 3 种 印 迹 聚 合 物 MIP 各 取 20.0 mg, 依 次 加 入 到 µg/ml 的 OFL 乙 腈 溶 液 或 乙 醇 溶 液 中, 室 温 震 荡 吸 附 24 h. 通 过 对 比 吸 附 数 据, 选 择 吸 附 容 量 较 高 的 溶 剂. 将 3 种 印 迹 聚 合 物 MIP 及 其 相 应 的 NIP 材 料 各 取 20.0 mg 加 入 到 100, 500, µg/mL OFL 乙 腈 溶 液 中, 室 温 震 荡 吸 附 24 h, 静 置 后 取 上 清 液, 过 滤, 用 紫 外 可 见 分 光 光 度 计 测 定 OFL 质 量 浓 度, 计 算 吸 附 容 量, 得 到 最 优 吸 附 材 料 静 态 吸 附 试 验 对 复 合 单 体 印 迹 材 料 进 行 静 态 吸 附 实 验 并 对 数 据 进 行 Scatchard 模 型 分 析. 在 10.0 ml 浓 度 范 围 为 µg/mL 的 OFL 乙 腈 溶 液 中 加 入 20.0 mg 的 印 迹 材 料, 震 荡 吸 附 24 h, r/min 离 心 取 上 清 液, 过 滤, 测 定 OFL 质 量 浓 度, 计 算 各 自 吸 附 容 量, 并 重 复 3 次, 取 平 均 [12] 值, 用 Scatchard 公 式 进 一 步 分 析 来 评 估 MIP 材 料 上 的 键 合 常 数. Q/C free = (Q max Q)/K D. (1) 在 Scatchard 公 式 中, K D 为 离 解 平 衡 常 数, Q max 为 饱 和 吸 附 量. 以 Q/C free 对 Q 作 图, 之 后 根 据 曲 线 的 斜 率 和 截 距 分 别 得 到 K D 及 Q max, 这 里 吸 附 量 Q 是 指 每 克 材 料 吸 附 分 析 物 的 质 量 静 态 吸 附 动 力 学 研 究 称 取 MIPⅢ 和 NIPⅢ 各 20.0 mg, 加 至 10.0 ml 浓 度 分 别 为 20, 200, µg/mL 的 OFL 乙 腈 溶 液 中, 室 温 震 荡 24 h, 分 别 在 10, 20, 30 min 及 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 24 h 取 上 清 液, 稀 释 并 在 紫 外 可 见 分 光 光 度 计 测 定 其 浓 度. 每 一 个 浓 度 重 复 实 验 3 次, 取 平 均 值 静 态 选 择 性 吸 附 实 验 取 20.0 g MIPⅢ 材 料 加 入 到 10.0 ml 含 OFL, NOR, ENR 和 SMZ 各 1.0 mg 的 混 合 溶 液 中, 室 温 震 荡 12 h 使 之 充 分 吸 附, 取 上 清 液, 过 滤, HPLC- UV 分 析 测 定 并 重 复 3 次. 1.5 实 际 样 品 中 氟 喹 诺 酮 的 检 测 经 过 杀 菌 和 乳 液 均 一 的 新 鲜 纯 牛 奶 购 买 于 超 市 并 保 存 于 4 C 环 境 中. 从 牛 奶 中 萃 取 氟 喹 诺 酮 分 子 步 骤 如 下 : 取 10.0 ml 牛 奶, 加 入 1.0 ml 乙 腈, 加 入 等 质 量 的 OFL, NOR 和 ENR 溶 于 其 中, 再 加 入 体 积 5.0 mol/l HCl 水 溶 液, 涡 旋 震 荡 3.0 min, 然 后 以 转 速 r/m 离 心 10.0 min. 收 集 上 清 液, 滴 加 若 干 乙 腈, 若 有 浑 浊 出 现, 则 继 续 上 述 操 作 至 无 浑 浊 出 现 为 止. 取 20.0 mg MIPⅢ 加 入 到 上 清 液 中, 涡 旋 震 荡 15.0 min 使 其 吸 附 完 全, 静 置, 离 心, 弃 上 清 液 ; 用 洗 脱 液 对 上 述 沉 淀 进 行 解 吸 附 作 用 : 加 入 一 定 体 积 的 洗 脱 液, 涡 旋, 离 心, 取 上 清 液. 为 使 样 品 进 一 步 的 富 集, 将 洗 脱 溶 液 N 2 挥 干, 用 0.5 ml 流 动 相 重 新 溶 解, 用 0.45 µm 尼 龙 膜 过 滤 后 进 行 HPLC- UV 分 析. 2 结 果 与 讨 论 2.1 分 子 印 迹 的 制 备 合 成 分 子 印 迹 聚 合 物 的 方 法 很 多, 本 论 文 采 用 沉 淀 聚 合 法, 以 OFL, AIBN 和 EGDMA 分 别 作 为 模 板 分 子 引 发 剂 和 聚 合 物 交 联 剂 ; 对 于 致 孔 剂, 由 于 OFL 的 结 构 较 为 复 杂, 有 3 个 相 互 共 轭 的 芳 香 环, 同 时 存 在 着 羧 基 叔 胺 基. 溶 解 实 验 后 结 果 表 明, OFL 较 易 溶 于 乙 腈 氯 仿 酸 性 水 溶 液 和 碱 性 水 溶 液, 微 溶 于 甲 醇 乙 醇 和 纯 水. 考 虑 到 乙 腈 毒 性 较 大, 对 环 境 污 染 比 较 严 重, 而 若 在 水 溶 液 或 者 醇 溶 液 中, 分 子 间 氢 键 作 用 等 非 共 价 作 用 易 被 破 坏 殆 尽, 因 此 最 终 选 择 氯 仿 作 为 溶 剂 兼 致 孔 剂, 同 时 考 虑 到 氯 仿 属 于 中 等 极 性 致 孔 剂, 一 般 认 为 致 孔 剂 的 沸 点 和 极 性 严 重 影 响 到 形 成 的 聚 合 物 形 貌 及 比 表 面 积 [13]. 加 入 一 定 量 的 甲 苯 不 但 可 以 很 好 地 降 低 致 孔 剂 极 性, 还 可 以 更 好 地 促 进 反 应 物 溶 解 性 与 聚 合 物 的 分 散 性. 综 合 考 虑, 选 用 氯 仿 与 甲 苯 混 合 液 ( 体 积 比 50:50) 作 为 致 孔 剂. 选 择 合 适 功 能 单 体 种 类 至 关 重 要 : 根 据 模 板 分 子 的 结 构, 基 本 可 以 确 定 合 适 的 功 能 单 体. 一 般 来 说, 碱 性 模 板 分 子 选 择 酸 性 功 能 单 体 ( 如 MAA 等 ), 酸 性 模 板 分 子 选 择 碱 性 功 能 单 体 ( 如 2-VP 等 ), 而 本 文 中 所 用 的 模 板 分 子 既 有 羧 基 又 有 叔 胺 基, 因 此 作 为 两 性

4 第 1 期 汤 万 进, 等 : 复 合 功 能 单 体 法 合 成 氧 氟 沙 星 分 子 印 迹 材 料 139 性 质 的 分 子, 分 别 使 用 了 2-VP, MAA 以 及 2-VP 和 MAA 按 摩 尔 比 1:1 作 为 复 合 功 能 单 体 来 形 成 聚 合 物, 分 别 对 各 个 聚 合 物 的 吸 附 性 能 进 行 研 究, 以 得 到 最 佳 性 能 印 迹 材 料. 对 合 成 的 各 种 MIP 及 NIP 材 料 进 行 了 FRIT 光 谱 分 析 ( 图 2, 图 3). 发 现 4 个 图 谱 比 较 类 似, 这 可 能 是 由 于 功 能 单 体 在 聚 合 物 中 所 占 比 例 太 小, 难 以 辨 别. 从 图 2 中 可 以 看 出 cm 1 处 的 宽 峰 对 应 于 聚 合 物 结 构 水 的 反 伸 缩 振 动 峰, cm 1 和 cm 1 是 亚 甲 基 的 C-H 伸 缩 振 动 特 征 峰, 在 cm 1 处 出 现 的 特 征 吸 收 峰 对 应 于 交 联 剂 中 存 在 的 酯 羰 基 键, cm 1 出 现 的 是 C-C 骨 架 弯 曲 振 动 峰. 由 图 3 可 见, MIPⅠ: cm 1 处 的 3 个 吸 收 峰 对 应 于 芳 杂 环 骨 架 伸 缩 振 动 特 征 峰 ; MIPⅡ: cm 1 为 末 端 烯 烃 氢 吸 收 峰, cm 1 对 应 于 CH 3 不 对 称 弯 曲 振 动 特 征 峰 ; MIPⅢ, NIPⅢ a MIPⅠ; b MIPⅡ; c MIPⅢ; d NIP-Ⅲ 图 2 4 种 材 料 的 傅 里 叶 红 外 光 谱 图 Figure 2 Fourier transform infrared spectra of four polymers 峰 型 较 为 一 致, 出 现 了 图 2, 图 3 中 特 有 的 a 和 b 吸 收 峰, 充 分 说 明 了 两 种 功 能 单 体 都 出 现 在 聚 合 物 孔 穴 中. 2.2 吸 附 溶 剂 和 吸 附 材 料 的 选 择 将 3 种 MIP 分 别 在 µg/ml 的 OFL 乙 醇 溶 液 和 乙 腈 溶 液 中 进 行 静 态 吸 附 实 验, 发 现 以 MAA 为 功 能 单 体 的 聚 合 物 在 乙 醇 中 基 本 上 没 有 吸 附 作 用, 而 其 余 两 种 聚 合 物 的 吸 附 值 也 很 低. 出 现 这 种 情 况, 可 能 是 由 于 在 吸 附 过 程 中, 氢 键 和 静 电 作 用 力 是 主 要 结 合 力, 在 乙 醇 中 会 破 坏 这 些 非 共 价 结 合 力, 另 外 合 成 的 MIP 是 在 低 极 性 的 氯 仿 甲 苯 混 合 溶 剂 中 进 行 的, 因 此 溶 剂 的 记 忆 效 应 也 导 致 了 吸 附 容 量 的 降 低, 而 在 同 样 浓 度 的 OFL 乙 腈 溶 剂 中, 3 种 聚 合 物 材 料 吸 附 容 量 则 相 对 要 高. 相 对 而 言, 与 氯 仿 同 属 于 中 等 极 性 溶 剂 的 乙 腈 可 以 诱 导 模 板 分 子 进 入 聚 合 物 孔 穴 且 不 破 坏 分 子 间 作 用 力, 得 到 了 较 为 理 想 的 吸 附 数 据, 因 此 选 择 乙 腈 作 为 吸 附 溶 剂. 分 别 配 制 不 同 浓 度 的 OFL 乙 腈 溶 液, 通 过 紫 外 可 见 分 光 光 度 计 上 扫 描, 发 现 其 最 大 吸 收 波 长 在 300 nm 处, 在 该 波 长 处 做 OFL 乙 腈 溶 液 的 标 准 曲 线, 线 性 良 好 : A 300 = C (C 的 单 位 为 µg/ml),r 2 = , 线 性 范 围 为 µg/mL, 以 此 作 为 定 量 实 验 的 标 准. 在 后 续 实 验 中, OFL 浓 度 不 在 此 区 间 时, 稀 释 到 该 线 性 范 围 进 行 计 算. 分 别 将 3 种 MIP 材 料 加 入 到 不 同 浓 度 的 OFL 乙 腈 溶 液 中 进 行 充 分 吸 附. 用 印 迹 因 子 α 来 评 价 MIP 的 特 异 性 能 力, 印 迹 因 子 计 算 见 (2) 式 [14]. 各 种 材 料 的 吸 附 结 果 见 表 1, 通 过 吸 附 实 验 数 据 来 选 择 效 果 最 好 和 吸 附 容 量 较 合 适 的 印 迹 聚 合 物. α = Q MIP /Q NIP, (2) a MIPⅠ; b MIPⅡ; c MIPⅢ; d NIP-Ⅲ 图 3 4 种 材 料 在 1680 cm cm 1 的 局 部 区 域 放 大 图 Figure 3 Enlarged view of the local area for four polymers in 1680 cm cm 1 其 中 Q 是 MIP 或 NIP 材 料 的 吸 附 容 量. 吸 附 容 量 和 印 迹 因 子 是 评 价 MIP 的 主 要 指 标. 如 表 1 所 示, 在 不 同 浓 度 下, 各 MIP 材 料 的 印 迹 因 子 α>1, 说 明 相 应 的 MIP 对 OFL 的 识 别 能 力 比 NIP 高 ; 之 后 对 比 在 相 同 浓 度 下 不 同 材 料 的 吸 附 容 量, 发 现 MIPⅠ 吸 附 容 量 最 低, MIPⅡ 印 迹 因 子 最 小, MIPⅢ 不 但 有 较 高 的 吸 附 容 量 而 且 印 迹 因 子 也 可 以 与 MIPⅠ 几 乎 可 以 持 平. 究 其 原 因, MIPⅡ 主 要 以 氢 键 和 静 电 作 用 力 为 主 要 结 合 力, 在 材 料 表 面 同 时 存 在 一 些 质 子 化 基 团, 所 以 导 致 了 非 特 异 性 结 合 位 点 所 占 比 重 很 大, 因 此 虽 然 吸 附 容 量 很 高 而 印 迹 因 子 很 低 ; 而 对 于 MIPⅠ, 虽 然 模 板 分 子 与 功 能 单 体 之 间 有 着 很 强 的 π-π 作 用 力,

5 140 兰 州 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 ) 第 50 卷 但 是 由 于 功 能 单 体 空 间 位 阻 相 对 较 大, 很 难 使 每 一 个 带 有 芳 香 环 的 分 子 对 彼 此 近 距 离 接 触, 这 也 就 导 致 了 该 材 料 具 有 较 强 的 印 迹 效 应 和 较 低 的 模 板 负 载 量 ; 对 于 MIPⅢ, 2-VP 和 MAA 同 时 存 在, 使 得 最 终 形 成 的 孔 穴 中 兼 具 了 较 高 的 吸 附 容 量 和 较 强 的 印 迹 效 应, 因 此 选 择 MIPⅢ 进 行 后 续 研 究. 表 1 3 类 材 料 在 不 同 浓 度 的 溶 液 中 对 氧 氟 沙 星 的 吸 附 效 果 Table 1 Adsorption effect of three types materials for ofloxacin in different concentrations 功 能 单 体 µg/ml µg/ml µg/ml Q MIP Q NIP α Q MIP Q NIP α Q MIP Q NIP α 2-VP MAA VP/MAA 每 个 实 验 平 行 3 次, 取 平 均 值, RSD 5.0%, Q MIP 和 Q NIP 的 单 位 为 mg/g. 2.3 复 合 单 体 材 料 对 模 板 的 结 合 性 能 为 了 研 究 复 合 单 体 材 料 的 结 合 性 能, 本 文 做 了 静 态 吸 附 实 验 和 Scatchard 分 析. 图 4 是 MIPⅢ 和 NIPⅢ 在 不 同 浓 度 OFL 乙 腈 溶 液 的 吸 附 等 温 线. 浓 度 范 围 在 µg/mL 时, 可 看 出 MIPⅢ 和 NIPⅢ 对 OFL 的 吸 附 容 量 会 随 着 OFL 浓 度 的 增 加 而 增 大, 并 且 MIPⅢ 有 很 高 的 吸 附 容 量, 随 着 浓 度 的 增 加, 两 种 材 料 的 吸 附 趋 势 不 同, MIPⅢ 对 OFL 的 吸 附 量 随 着 浓 度 的 增 加 持 续 增 大, 而 NIPⅢ 则 达 到 吸 附 饱 和 量. 通 过 结 合 率 ( 即 材 料 上 已 经 结 合 分 析 物 量 与 原 溶 液 中 分 析 物 总 量 比 值 ) 对 浓 度 的 曲 线 可 以 看 出 两 种 材 料 在 100.0µg/mL 时 达 到 最 大 结 合 率, 之 后 吸 附 容 量 虽 增 大, 但 是 被 吸 附 药 物 占 药 物 总 量 的 百 分 比 例 逐 渐 降 低. 可 以 看 出, MIPⅢ 对 OFL 的 结 合 率 要 比 NIPⅢ 大, 尤 其 在 低 浓 度 时 更 为 明 显, 这 也 说 明 MIPⅢ 可 以 更 好 地 富 集 样 品 中 痕 量 OFL. 通 过 计 算 结 合 率 比 值 得 知 在 浓 度 为 20.0 µg/ml 时 达 到 值 3.20, 特 异 性 效 果 明 显, 随 着 浓 度 增 大, α 有 所 降 低 最 终 到 达 一 个 近 似 平 台 (2.0±0.5). 这 可 能 归 结 于 在 低 浓 度 时, MIPⅢ 的 非 特 异 性 吸 附 量 很 少, 另 外 MIPⅢ 存 在 着 不 同 类 的 价 键 结 合 位 点, 使 其 结 合 力 更 强. 图 5 是 MIP 吸 附 不 同 浓 度 OFL 的 Scatchard 分 析 模 型. 通 过 Scatchard 模 型 分 析 可 以 看 出, 两 个 线 性 关 系 暗 示 着 在 MIP 复 合 印 迹 材 料 表 面 存 在 两 种 结 合 方 式 : 一 种 是 呈 高 选 择 性 或 高 键 合 能 的 亲 和 力, 另 一 种 是 有 低 键 能 的 弱 亲 和 力. 高 键 合 能 的 a 材 料 的 吸 附 容 量 对 氧 氟 沙 星 浓 度 的 吸 附 曲 线 图 5 MIPⅢ 吸 附 氧 氟 沙 星 的 Scatchard 分 析 模 型 Figure 5 Scatchard analysis model of MIPⅢfor OFL 亲 和 力 K d1 = mmol/l, Q max1 = mmol/g b 材 料 的 结 合 率 对 氧 氟 沙 星 浓 度 的 吸 附 曲 线 图 4 MIPⅢ 和 NIPⅢ 对 氧 氟 沙 星 的 吸 附 等 温 曲 线 Figure 4 Adsorption isotherm of MIP Ⅲ and NIP Ⅲ for ofloxacin (17.33 mg/g), 类 似 地 对 应 于 低 键 能 的 弱 亲 和 力 K d2 = mmol/l, Q max2 = mmol/g (86.68 mg/g). 2.4 吸 附 动 力 学 研 究 吸 附 动 力 学 实 验 是 考 察 复 合 单 体 材 料 对 模 板

6 第 1 期 汤 万 进, 等 : 复 合 功 能 单 体 法 合 成 氧 氟 沙 星 分 子 印 迹 材 料 141 分 子 的 吸 附 容 量 随 时 间 变 化 的 情 况. 图 6 显 示 OFL 在 MIPⅢ 的 吸 附 动 力 学 性 质, 很 明 显, 吸 附 平 衡 时 间 取 决 于 溶 液 浓 度. 在 µg/mL 浓 溶 液 中, MIP 对 OFL 的 吸 附 平 衡 需 要 12 h 左 右, 在 µg/ml 溶 液 中 平 衡 需 要 5 h, 而 在 20.0 µg/ml 的 较 稀 溶 液 中, 平 衡 约 需 1 h. 浓 度 越 小, 吸 附 平 衡 时 间 越 短. 同 子 的 色 谱 图. 从 图 8(mAu 为 色 谱 峰 高 的 单 位, 无 量 纲 量 ) 中 可 以 看 出, 4 种 物 质 分 离 度 很 大, 因 此 建 立 的 分 析 方 法 可 同 时 检 测 4 种 物 质. 图 7 几 种 分 析 物 结 构 示 意 图 Figure 7 Schematic diagram of several analytes a 20.0 µg/ml b µg/ml a 磺 胺 甲 基 嘧 啶 ; b 氧 氟 沙 星 ; c 诺 氟 沙 星 ; d 恩 诺 沙 星 图 8 4 种 药 物 分 子 的 高 效 液 相 色 谱 图 Figure 8 HPLC spectra of four analytes 图 8 的 实 验 条 件 为 : ODS C18 柱, 内 径 柱 长 = 4.6 mm mm, 流 速 1.0 ml/min, 柱 温 40 C, 进 样 量 10.0 µl, 紫 外 检 测 波 长 min, 267 nm; min, 293 nm; min, 277 nm. 流 动 相 为 甲 醇 和 磷 酸 盐 缓 冲 液, 体 积 比 为 25:75. c µg/ml 图 6 MIPⅢ 和 NIPⅢ 在 不 同 浓 度 氧 氟 沙 星 乙 腈 溶 液 中 吸 附 动 力 学 曲 线 Figure 6 Adsorption kinetics of MIP Ⅲ and NIP Ⅲ for OFL solution in different concertrations 时 可 以 看 到, NIP 相 对 于 MIP 平 衡 时 间 更 短, 可 能 是 由 于 在 制 备 MIP 时 形 成 了 特 异 性 的 识 别 位 点 在 聚 合 物 孔 道 深 处, 导 致 OFL 的 扩 散 缓 慢. 2.5 MIPⅢ 材 料 的 选 择 性 配 制 OFL, NOR, ENR 和 SMZ 4 种 药 物 分 子 的 混 合 物 ( 结 构 见 图 7), 利 用 高 效 液 相 色 谱 进 行 分 离 分 析. 操 作 条 件 见 实 验 部 分. 图 8 是 4 种 药 物 分 另 外, 以 浓 度 为 横 坐 标, 色 谱 峰 面 积 为 纵 坐 标, 得 到 了 每 个 药 物 分 子 的 标 准 曲 线 ( 线 性 范 围 为 µg/mL), 见 表 2. 从 表 2 中 可 以 发 现, 标 准 曲 线 线 性 良 好, 可 信 度 高. 另 外, 在 后 续 高 浓 度 吸 附 实 验 中, 将 溶 液 稀 释 至 该 线 性 区 间 进 行 检 测. 根 据 标 准 曲 线 计 算 材 料 对 混 合 物 的 吸 附 容 量, 在 µg/ml 的 混 合 溶 液 中, 经 计 算 得 到 结 果 ( 图 9). 从 图 9 中 可 以 发 现, MIP 对 氧 氟 沙 星 吸 附 容 量 为 2.65 mg/g, 对 诺 氟 沙 星 吸 附 量 为 2.34 mg/g, 对 恩 诺 沙 星 的 吸 附 容 量 为 1.39 mg/g, 而 相 应 的 对 磺 胺 甲 基 嘧 啶 吸 附 量 仅 有 0.27 mg/g. 本 文 认 为 在 选 择 性 吸 附 过 程 中, MIPⅢ 的 特 异 性 结 合 位 点 导 致 了 几 种 沙 星 类 药 物 的 吸 附, 而 对 于 结 构 不 相 似

7 142 兰 州 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 ) 第 50 卷 表 2 4 种 分 析 物 的 线 性 方 程 相 关 系 数 检 测 限 定 量 限 (LOQ) Table 2 Linear equations, correlation coefficient, LOD and LOQ of the four analytes 药 物 名 称 线 性 方 程 相 关 系 数 检 测 限 (µg/ml) 定 量 限 (µg/ml) 磺 胺 甲 基 嘧 啶 Y =417433X R 2 = 氧 氟 沙 星 Y =501345X R 2 = 诺 氟 沙 星 Y =629797X R 2 = 恩 诺 沙 星 Y =664510X R 2 = 再 用 洗 脱 液 对 吸 附 在 材 料 上 的 分 析 物 进 行 解 吸 附 作 用, 将 洗 脱 溶 液 挥 干, 用 0.5 ml 流 动 相 稀 释 后 做 HPLC-UV 分 析 ph 优 化 图 9 复 合 单 体 材 料 对 4 种 药 物 的 选 择 性 吸 附 性 能 研 究 Figure 9 Selective adsorption of polymer with combined functional monomers for the four analytes 的 磺 胺 类 药 物, 则 无 特 异 性 吸 附. 以 上 结 果 说 明 了 以 OFL 为 模 板 的 MIP 印 迹 材 料 同 时 吸 附 OFL, ENR 和 NOR 的 可 行 性. 由 静 态 吸 附 实 验 数 据 可 得 : µg/ml OFL 乙 腈 溶 液 中, MIPⅢ 的 吸 附 容 量 为 5.32 mg/g. 这 与 MIP 在 混 合 分 析 物 溶 液 对 OFL 的 吸 附 容 量 不 一 致, 而 相 应 的 OFL, NOR 和 ENR 的 吸 附 容 量 总 和 为 6.38 mg/g, 同 时 NIP 对 这 3 种 分 析 物 的 吸 附 总 量 达 到 4.07 mg/g, 这 两 个 数 据 略 高 于 材 料 对 单 一 OFL 吸 附 数 据 ( 由 于 对 SMZ 吸 附 量 较 少, 暂 不 考 虑 ). 因 此 可 以 认 为 复 合 单 体 材 料 对 每 一 种 物 质 的 吸 附 容 量 是 相 互 关 联 的, 即 复 合 单 体 材 料 将 一 定 量 的 结 合 位 点 非 均 等 地 分 摊 到 每 一 个 物 质. 另 外, 从 OFL 与 NOR 结 构 上 来 看, 发 现 这 两 种 分 析 物 的 空 间 位 阻 大 小 极 其 相 似, 相 应 地 ENR 的 空 间 位 阻 则 小 一 些, 而 SMZ 的 结 构 与 前 三 者 不 具 有 可 比 性. 这 也 可 以 合 理 地 解 释 复 合 单 体 材 料 对 OFL 和 NOR 的 吸 附 容 量 较 为 类 似, 而 小 位 阻 的 ENR 在 空 腔 内 不 易 被 捕 获, 因 而 吸 附 容 量 略 低. 由 于 分 子 大 小 不 一, 可 以 很 好 地 解 释 三 者 的 吸 附 总 容 量 高 于 单 一 分 子 吸 附 容 量. 2.6 吸 附 与 解 吸 附 条 件 的 优 化 选 择 性 吸 附 结 果 说 明 了 以 OFL 为 模 板 的 MIP Ⅲ 同 时 吸 附 和 富 集 生 物 样 品 中 微 量 的 氟 喹 诺 酮 类 药 物 的 可 行 性. 于 是 将 MIPⅢ 加 入 到 牛 奶 简 单 处 理 后 的 上 清 液 中, 利 用 涡 旋 使 药 物 完 全 吸 附, 适 当 的 ph 值 不 仅 可 以 使 MIP 吸 附 容 量 增 大, 而 且 还 有 利 于 提 高 印 迹 材 料 的 选 择 性. 在 处 理 牛 奶 时, 分 别 在 ph 值 为 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 和 6.0 时 测 定 其 回 收 率, 发 现 随 着 ph 的 增 大, 回 收 率 略 有 增 加. 当 ph 为 6.0 时 为 最 佳, OFL, NOR 和 ENR 的 回 收 率 可 达 96.78%. ph 值 的 增 大 有 利 于 回 收 率 的 提 高, 因 此, 选 ph 为 6.0 来 进 行 下 一 步 研 究. 不 同 ph 值 下 MIPⅢ 对 分 析 物 的 吸 附 量 不 同 可 能 与 分 析 物 的 存 在 形 式 和 MIP 的 表 面 电 荷 有 关. 在 具 有 两 性 性 质 的 氟 喹 诺 酮 类 药 物 中, OFL, NOR 和 ENR 的 等 电 点 (PI) 都 在 6.70 左 右 [15]. 当 溶 液 ph 值 低 于 两 性 分 子 的 PI 值 时, 带 正 电 荷. 因 此 在 该 实 验 条 件 下, 几 个 分 析 物 实 际 上 基 本 不 带 电 荷. MIPⅢ 材 料, 由 于 同 时 存 在 酸 性 丙 烯 酸 基 团 和 碱 性 吡 啶 基 团, 因 此 也 有 类 似 的 两 性 性 质. 较 低 ph 对 于 有 两 性 性 质 的 吸 附 剂 和 分 析 物 分 子, 均 易 导 致 其 氨 基 质 子 化, 均 显 示 正 电 荷, 因 此 吸 附 效 果 不 太 理 想 ; 而 在 接 近 PI 值 时, 目 标 分 子 和 材 料 显 示 中 性, 展 现 出 了 更 强 的 吸 附 特 性, 进 而 有 较 高 的 回 收 率 解 吸 溶 液 的 优 化 确 定 牛 奶 溶 液 ph=6.0, 用 5.0 ml 乙 腈, 甲 醇 和 乙 酸 混 合 溶 液 ( 体 积 比 为 90:10) 对 已 吸 附 的 材 料 洗 涤 3 次, 发 现 甲 醇 和 乙 酸 混 合 液 可 以 很 好 地 洗 涤, 不 仅 不 保 留 干 扰 物, 而 且 洗 涤 2 次 就 可 以 把 所 有 吸 附 分 析 物 解 吸. 而 纯 乙 腈 溶 剂 洗 涤 3 次 后 吸 附 材 料 上 仍 有 残 余, 并 且 为 待 分 析 物 带 来 众 多 干 扰. 所 以 将 甲 醇 和 乙 酸 溶 液 作 为 洗 涤 溶 液, 而 后 用 ml 的 解 析 溶 液 对 材 料 进 行 洗 脱. 发 现 当 解 吸 溶 液 为 2.0 ml 时 就 可 以 将 保 留 在 材 料 上 的 分 析 物 完 全 洗 脱 下 来. 为 使 样 品 进 一 步 的 富 集, 将 洗 脱 溶 液 N 2 挥 干, 用 一 定 体 积 流 动 相 稀 释 后 进 行 HPLC-UV 分 析.

8 第 1 期 汤 万 进, 等 : 复 合 功 能 单 体 法 合 成 氧 氟 沙 星 分 子 印 迹 材 料 同 时 检 测 牛 奶 中 的 3 种 氟 喹 诺 酮 牛 奶 的 处 理 过 程 在 实 验 部 分 已 有 描 述, 牛 奶 中 未 检 测 出 分 析 物. 随 后 进 行 了 回 收 率 实 验 : 分 别 在 牛 奶 样 品 中 加 入 3 种 分 析 物 各 1.0, 5.0, 10.0 µg, 之 后 对 其 进 行 吸 附 解 吸, 分 别 用 1.0, 1.0, 2.0 ml 流 动 相 稀 释 后, HPLC-UV 分 析. 3 种 氟 喹 诺 酮 类 药 物 的 加 标 回 收 率 见 表 3. 由 表 3 可 见 样 品 中 OFL 的 回 收 率 比 较 理 想. 每 一 个 样 品 同 一 天 内 平 行 进 样 3 次, 并 且 隔 日 重 复, 其 相 对 标 准 偏 差 见 表 4. 发 现 RSD 5.0%, 说 明 MIPⅢ 从 牛 奶 样 品 中 吸 附 氟 喹 诺 酮 类 抗 生 素 是 可 行 的, 且 牛 奶 样 品 中 的 基 质 成 分 并 没 有 影 响 到 印 迹 聚 合 物 对 的 富 集 和 分 离 效 率. 表 3 3 种 分 析 物 在 牛 奶 中 的 平 均 加 标 回 收 率 Table 3 Average recoveries of three analytes in milk 加 入 量 /µg OFL/% NOR/% ENR/% 表 4 3 种 分 析 物 在 牛 奶 中 相 对 标 准 偏 差 (n = 3) Table 4 Relative standard deviation of three analytes in milk (n = 3) 加 入 量 /µg 日 内 RSD/% 日 间 RSD/% OFL NOR ENR OFL NOR ENR 图 10 为 加 入 3 种 喹 诺 酮 药 物 (50 ng/g) 的 牛 奶 样 品 经 过 材 料 MIPⅢ 处 理 前 后 的 色 谱 图. 从 图 10 中 可 以 看 到, 富 集 效 果 比 较 理 想, 可 以 将 该 MIP 材 料 对 氟 喹 诺 酮 这 一 类 分 子 进 行 初 步 的 选 择 性 吸 附 富 集. 3 结 论 本 文 以 酸 性 功 能 单 体 ( 甲 基 丙 烯 酸 ) 和 碱 性 功 能 单 体 (2- 乙 烯 基 吡 啶 ) 为 复 合 功 能 单 体, 通 过 沉 淀 聚 合 方 法 制 备 的 氧 氟 沙 星 分 子 印 迹 材 料, 其 印 迹 因 子 和 吸 附 量 都 优 越 于 单 功 能 单 体 制 备 的 材 料, 该 MIP 可 以 用 作 固 相 萃 取 材 料 进 行 牛 奶 样 品 的 前 处 理, 建 立 的 方 法 具 有 可 信 的 重 现 性 和 回 收 率. 参 考 文 献 [1] Rodríguez E, Navarro V F, Benito P E, et al. Multiresidue determination of ultratrace levels of fluoroquinolone antimicrobials in drinking and aquaculture water samples by automated online molecularly imprinted solid phase extraction and liquid chromatography[j]. Analytical Chemistry, 2011, 83(6): [2] Carabineiro S A C, Thavorn A T, Pereira M F R, et al. Adsorption of ciprofloxacin on surfacemodified carbon materials[j]. Water Research, 2011, 45(15): [3] Tamayo F G, Turiel E, Martín E A. Molecularly imprinted polymers for solid-phase extraction and solid-phase microextraction: recent developments and future trends[j]. Journal of Chromatography A, 2007, 1152(1): [4] Turiel E, Martín E A, Tadeo J L. Molecular imprinting-based separation methods for selective analysis of fluoroquinolones in soils[j]. Journal of Chromatography A, 2007, 1172(2): [5] Wei Xiao-lin, Samadi A, Husson S M. Synthesis and characterization of molecularly imprinted polymers for chromatographic separations[j]. Separation Science and Technology, 2005, 40(1/3): [6] Benito P E, Urraca J L, Sellergren B, et al. Solid-phase extraction of fluoroquinolones from aqueous samples using a water-compatible stochiometrically imprinted polymer[j]. Journal of Chromatography A, 2008, 1208(1): a, b, c 峰 依 次 为 OFL, NOR 和 ENR 图 10 加 标 牛 奶 溶 液 ( 加 标 浓 度 均 为 50.0 ng/g) 经 过 MIP Ⅲ 处 理 前 后 的 色 谱 图 Figure 10 Chromatograms of spiked milk solution before and after treatment of MIP Ⅲ (spiked concentration was 50.0 ng/g) [7] Yan Hong-yuan, Row K H, Yang Geng-liang. Water-compatible molecularly imprinted polymers for selective extraction of ciprofloxacin from human urine water-compatible molecularly imprinted polymers for selective extraction of ciprofloxacin from human urine[j]. Talanta, 2008, 75(1): [8] Yan Hong-yuan, Tian Ming-lei, Row K H. Determination of enrofloxacin and ciprofloxacin in milk using molecularly imprinted solid-phase

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