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世冀
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1 左乙拉西坦缓释片的制备及其 Beagle 犬体内药动学研究徐兵勇 1,2, 潘迎锋 1, 平丽安全评价研究中心, 杭州 ) 3 (1. 浙江省药品化妆品审评中心, 杭州 ;2. 正大青春宝药业有限公司, 杭州 ;3. 浙江大学药物摘要 : 目的制备左乙拉西坦缓释片, 进行体外释放特性以及 Beagle 犬体内药动学研究方法按照筛选处方制备左乙拉西坦缓释片, 以市售左乙拉西坦缓释片 (Keppra-XR) 为参比制剂, 采用相似因子 (f 2 ) 法进行体外释放行为相似度评价 ; 并将自制左乙拉西坦缓释片与市售普通片进行 Beagle 犬体内药动学参数比较结果自制左乙拉西坦缓释片与市售左乙拉西坦缓释片体外释放行为相似市售左乙拉西坦普通片和自制左乙拉西坦缓释片的药动学参数 T max 分别为 (1.75±0.50) 和 (5.50±1.00) h,c max 分别为 (30.33±2.00) 和 (17.29±3.56) mg L 1,AUC 0-t 分别为 (186.88±8.83) 和 (202.50±34.20) mg L 1 h 结论自制的左乙拉西坦缓释片具有缓释效果关键词 : 左乙拉西坦 ; 缓释片 ; 药动学中图分类号 :R943;R969.1 文献标志码 :B 文章编号 : (2017) DOI: /j.cnki.issn 引用本文 : 徐兵勇, 潘迎锋, 平丽. 左乙拉西坦缓释片的制备及其 Beagle 犬体内药动学研究 [J]. 中国现代应用药学, 2017, 34(9): Study on Preparation of Levetiracetam Sodium Extended-release Tablet and It s Pharmacokinetics in Beagle Dogs XU Bingyong 1,2, PAN Yingfeng 1, PING Li 3 (1.Zhejiang Center for Drug and Cosmetics Evaluation, Hangzhou , China; 2.Chiatai Qingchunbao Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou , China; 3.Center for Drug Safety Evaluation, Zhejiang University, Hangzhou , China) ABSTRACT: OBJECTIVE To prepare the Levetiracetam extended-release tablet and investigate its pharmacokinetics in Beagle dogs and in vitro release. METHODS Prearation of Levetiracetam extended-release tablet according to optimized prescription, choosed sell products(keppra-xr) as reference products, evaluation of in vitro release behavior similarity by the similar factor(f 2 ). The pharmacokinetic parameters were compared between the self-made extended-release tablet and the sell tablet. RESULTS The self-made extended-release tablet was similar to the reference products in vitro release, T max of reference products and self-made extended-release tablet were (1.75±0.50) and (5.50±1.00) h, C max were (30.33±2.00) and (17.29±3.56) mg L 1, AUC 0-t were (186.88±8.83) and (202.50±34.20) mg L 1 h. CONCLUSION The self-made Levetiracetam extended-release tablet exhibits the sustained release characteristics in vitro. KEY WORDS: Levetiracetam; extended-release tablet; pharmacokinetics 左乙拉西坦 (levetiracetam,lev) 是一种新型的抗癫痫药物, 主要用于治疗继发性局限性全身性癫痫, 具有安全性好治疗指数高等特点, 有广阔的应用前景 [1-3] 1999 年美国 FDA 批准左乙拉西坦片上市 ( 商品名 :Keppra),2007 年批准进口 ( 商品名 : 开浦兰 );2008 年美国 FDA 批准比利时优时比 (UCB) 公司研制的左乙拉西坦缓释片 ( 商品名 :Keppra-XR ) 上市, 规格为每片 500 mg 与 750 mg, 每日仅需服药 1 次, 主要用于治疗 16 岁以上的癫痫病患者, 我国尚未进口目前国内仅有市售普通片上市 [4], 每日给药 2 次, 该药极易溶于水, 生物利用度较高, 口服后释放迅速, 血药浓度迅速升高可引发神经系统的不良反应如嗜睡疲劳行为失常等 [5] 为制备作用持久疗效稳定不良反应小的缓释制剂, 本实验以 UCB 公司的左乙拉西坦缓释片为参比制剂, 制备左乙拉西坦缓释片, 并对其进行体外释放度以及 Beagle 犬体内药动学研究 1 仪器试剂与动物 1.1 仪器与试剂 Agilent 1200 高效液相色谱仪 ( 美国 Agilent 公司 ); 色谱柱为 Agilent HC-C18(4.6 mm 150 mm, 5 µm);zrs-8g 型溶出仪 ( 天津大学无线电厂 ); XS205 型电子天平 ( 瑞士梅特勒公司 ) 作者简介 : 徐兵勇, 男, 硕士, 工程师 Tel: @qq.com 1266 Chin J Mod Appl Pharm, 2017 September, Vol.34 No.9 中国现代应用药学 2017 年 9 月第 34 卷第 9 期

2 左乙拉西坦缓释片 ( 比利时 UCB 公司, 批号 : 57577, 规格 : 每片 500 mg); 左乙拉西坦片 ( 比利时 UCB 公司, 批号 :108698, 规格 : 每片 500 mg); 左乙拉西坦对照品 ( 珠海联邦制药厂有限司中山分厂, 批号 : S, 含量 :99.6%); 吡拉西坦对照品 ( 中国食品药品检定研究院, 批号 : , 含量 :100.0%); 羟丙甲纤维素 (HPMC, 上海昌为医药辅料技术有限公司, 型号 : K4M K15M K100M); 硬脂酸镁微粉硅胶均为药用辅料 ; 乙腈和二氯甲烷为色谱纯 ; 其余试剂均为分析纯 ; 水为纯化水 1.2 动物 Beagle 犬 8 只, 各半, 体质量 8.7~10.6 kg, 由南京安立默科技有限公司提供, 动物生产许可证号 :SCXK( 苏 ) 左乙拉西坦缓释片的制备 2.1 左乙拉西坦缓释片处方筛选缓释材料筛选缓释材料是缓释制剂处方重要组成部分, 参考 FDA 官网公布左乙拉西坦缓释片 ( 商品名 :KEPPRA-XR ) 处方信息, 选择 HPMC 为本品缓释材料, 按照表 1 中处方 1~3 对 HPMC 常用的 3 种规格 K4M K15M K100M 进行筛选, 以释放度 ( 篮法 100 r min 1,pH 值 6.0 磷酸缓冲液 900 ml 为释放介质 ) 为考察指标, 计算自制缓释片与参比制剂释放度的相似因子 (f 2 值 ) [6], 结果表明, 采用 HPMC K4M 缓释材料的自制样品与参比制剂释放度的 f 2 值最大, 体外释放行为最相似, 因此选择 HPMC K4M 为本品缓释材料, 并按照表 1 中处方 3~5 对 HPMC K4M 用量进行筛选, 结果表明 HPMC K4M 用量为 150 mg( 相当于处方总量 23%) 时, 自制样品与参比制剂释放度的 f 2 值最大, 体外释放行为最相似, 因此确定 HPMC K4M 的用量为处方总量的 23% 结果见表 2~3 表 1 不同缓释材料种类与用量处方 Tab. 1 The tablet formulations with different viscosity and dosages of HPMC mg 处方组成处方 1 处方 2 处方 3 处方 4 处方 5 左乙拉西坦 HPMC K4M HPMC K15M 250 HPMC K100M 250 硬脂酸镁微粉硅胶 % 乙醇适量适量适量适量适量润滑剂用量筛选为了改善制剂中间体颗粒的流动性和防止压片过程中黏冲, 往往需要加入适量助流剂或润滑剂, 在已确定缓释材料的基础上, 按照表 4 中处方 5~7 对润滑剂的种类与用量进行筛选, 结果表明, 处方 5 制备颗粒休止角为 32.2, 压片过程没有黏冲, 处方 6 制备颗粒休止角为 33.5, 压片过程中有少许黏冲, 处方 7 休止角为 35.5, 压片过程中无黏冲, 综合分析, 本品采用微粉硅胶为助流剂, 硬脂酸镁为润滑剂表 2 HPMC 种类对药物释放度影响 Tab. 2 The influence of different viscosity of HPMC on drug release degree 释放度 /% 时间 /h K4M K15M K100M 参比制剂 f 表 3 HPMC K4M 的用量对药物释放度影响 Tab. 3 The influence of different dosages of HPMC K4M on drug release degree 释放度 /% 时间 /h 250 mg 200 mg 150 mg 参比制剂 f 表 4 润滑剂与助流剂筛选处方 Tab. 4 The tablet formulations with different flow aid and lubrication prescription mg 处方组成处方 5 处方 6 处方 7 左乙拉西坦 HPMC K15M 硬脂酸镁 5 10 微粉硅胶 % 乙醇适量适量适量中国现代应用药学 2017 年 9 月第 34 卷第 9 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2017 September, Vol.34 No

3 2.1.3 包衣工艺筛选左乙拉西坦具有一定刺激性气味, 故需采用包衣工艺, 以掩盖药物的不良气味, 提高患者的依从性按照已确定处方制备左乙拉西坦缓释片芯, 称重后置包衣锅内, 调节适宜转速, 向锅内喷包衣溶液 ( 欧巴代胃溶型 85G 型, 浓度为 15%) 适量, 进风温度 50~60, 转速 10~15 r min 1, 当片芯分别增重约 0.5%,1.5%, 4.5% 时, 停止包衣比较不同包衣增重样品的释放度, 结果表明包衣增重为 1.5% 时, 自制样品与参比制剂 f 2 值最大, 两者释放行为最相似, 本品选择包衣增重为 1.5% 结果见表 5 表 5 包衣液增重筛选结果 Tab. 5 Results of coating solution weight gain 释放度 /% 时间 /h 0.5% 1.5% 4.5% 参比制剂 f 处方及工艺验证按照处方筛选确定左乙拉西坦缓释片处方制备 3 批左乙拉西坦缓释片称取处方量的左乙拉西坦 HPMC K4M 等量递加法混合均匀加入适量 50% 乙醇制软材, 过 20 目筛制粒,60 干燥, 过 18 目筛整粒加入处方量的硬脂酸镁和微粉硅胶于颗粒中, 混合均匀测定中间体含量, 以 18 9 mm 冲制备左乙拉西坦片片芯将欧巴代胃溶包衣粉溶于水中, 搅拌溶解, 取左乙拉西坦片片芯, 称重后置包衣锅内, 调节适宜转速, 向锅内喷包衣溶液适量, 同时吹热风, 当片剂增重约 1.5% 时, 停止包衣干燥即得 2.3 体外释放度测定参照 FDA 的溶出度方法数据库中公示的左乙拉西坦缓释片释放度检查方法 [7], 采用篮法, 转速为 100 r min 1, 释放介质为 0.05 mol L 1 磷酸缓冲液 900 ml(ph 值 6.0) 采用 HPLC 定量测定, 以十八烷基键合硅胶为填充剂, 乙腈 -ph 5.6 缓冲溶液 ( ) 为流动相, 检测波长为 220 nm 专属性试验按照处方量称取约 160 mg 空白辅料, 用 900 ml 释放介质溶解, 滤过, 作为阴性空白对照溶液, 取 20 µl 注入液相色谱仪, 记录色谱图, 试验结果表明, 空白辅料色谱图在主峰处均无色谱峰出现, 对释放度测定无干扰线性关系考察精密称取左乙拉西坦对照品 50 mg, 置于 10 ml 量瓶中, 用释放介质溶解并释稀至刻度, 摇匀, 作为对照品储备液, 精密量取对照品储备液 0.1,0.5,1.0,1.5,2.0 ml, 分别置于 10 ml 量瓶中, 加溶出介质稀释至刻度, 摇匀, 注入液相色谱仪, 记录色谱图, 以各对照品浓度为横坐标 (C), 峰面积为纵坐标 (A), 得线性回归方程 :A= C (R 2 = ), 结果表明在 0.05~1.00 mg ml 1 范围内线性关系良好回收率试验精密称取左乙拉西坦对照品 11 mg( 相当于处方量 80%) 14 mg( 相当于处方量 100%) 16 mg( 相当于处方量 120%), 分别置于 25 ml 量瓶中, 按处方比例加入空白辅料, 用适量释放介质溶解并稀释至刻度, 摇匀, 用 0.45 µm 滤膜过滤, 取续滤液, 取 20 µl 注入液相色谱仪, 记录色谱图, 计算平均回收率为 99.6%(n=9),RSD 值为 1.2% 仪器精密度试验取项下配制浓度为 0.56 mg ml 1 的供试品溶液, 连续进样 6 次, 记录色谱图, 计算峰面积的 RSD 值为 0.31%, 说明仪器精密度良好稳定性试验取项下配制浓度为 0.56 mg ml 1 的供试品溶液, 室温条件下放置 2, 4,6,8,10,12 h, 用 0.45 µm 滤膜过滤, 取续滤液, 取 20 µl 注入液相色谱仪, 记录色谱图, 主成分峰面积 RSD 为 1.25%, 样品溶液在 12 h 内稳定释放度测定取自制 3 批左乙拉西坦缓释片, 进行释放度测定,3 批自制样品体外释放度均符合要求并将自制样品 ( 平均值 ) 与参比制剂 ( 比利时 UCB 公司 ) 在水 0.1 mol L 1 盐酸 ph 4.5 醋酸盐缓冲液介质 ph 6.0 磷酸盐缓冲液 4 种不同释放介质中释放曲线进行比较, 计算相似因子 f 2 值, 结果表明自制样品与参比制剂在上述 4 种释放介质 f 2 值为 75~83, 均 >50, 体外释放行为相似, 具体释放曲线见图 1~ Chin J Mod Appl Pharm, 2017 September, Vol.34 No.9 中国现代应用药学 2017 年 9 月第 34 卷第 9 期

4 图 mol L 1 盐酸释放介质中释放曲线比较 Fig. 1 The release curve comparison in 0.1 mol L 1 hydrochloric acid solution 图 2 ph 6.0 磷酸盐缓冲液释放介质中释放曲线比较 Fig. 2 The release curve comparison in ph 6.0 phosphate buffer solution 图 3 ph 4.5 醋酸盐缓冲液释放介质中释放曲线比较 Fig. 3 The release curve comparison in ph 4.5 acetate buffer 3 左乙拉西坦缓释片 Beagle 犬体内药动学研究 3.1 色谱条件 Agilent HC-C 18 色谱柱 (4.6 mm 150 mm, 5 μm);inertsil ODS-SP Cartridge Guard Column 保护柱 (10 mm 4.0 mm), 以乙腈 mol L 1 磷酸二氢钠溶液 (4:96) 为流动相, 流速 :0.9 ml min 1 ; 柱温 :25 ; 检测波长 :210 nm; 进样量 :30 μl 3.2 贮备液配制精密称取 50 mg 左乙拉西坦对照品, 用流动相定容至 10 ml 量瓶中, 配制为 5 mg ml 1 左乙拉西坦储备液, 置低温避光保存备用量取左乙拉西坦储备液适量, 分别用乙腈稀释成不同浓度的左乙拉西坦标准系列溶液精密称取 10 mg 内标吡拉西坦对照品, 用流动相定容至 10 ml 量瓶中, 配制 1 mg ml 1 储备液, 用水稀释成浓度为 100 μg ml 1 吡拉西坦对照品溶液, 置低温避光保存备用 3.3 血浆样品预处理使用二氯甲烷液液萃取, 取 0.2 ml 待测血浆图 4 水释放介质中释放曲线比较 Fig. 4 The release curve comparison in water 样品加入 2 ml 离心管中, 加入 20 μl 内标, 涡旋 30 s 后, 加入二氯甲烷 1 ml, 涡旋 2 min, 超声震荡 10 min,4 000 r min 1 离心 10 min, 分离取下层有机层于另一试管,40 氮气吹干 200 μl 流动相复溶, 涡旋 1 min, r min 1 离心 10 min 后取上清, 进样 30 μl 3.4 给药方案及血样采集将 8 只 Beagle 犬分成 2 组, 每组各半, 一组口服左乙拉西坦缓释片, 另一组口服左乙拉西坦片, 各每只 500 mg 分别于给药前及给药后 0.5, 1,2,3,4,6,8,10,12,14,24,36,48 h 时间点四肢静脉交替采血约 2 ml, 置含肝素的抗凝试管,3 000 r min 1 离心 10 min, 分离血浆, 置 20 冰箱保存待测 3.5 专属性按 3.1 项下色谱条件, 血浆中内源性物质不干扰待测物和内标的测定, 且左乙拉西坦和内标峰形对称, 分离度很好左乙拉西坦 (Ⅰ) 和内标中国现代应用药学 2017 年 9 月第 34 卷第 9 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2017 September, Vol.34 No

5 (Ⅱ) 的保留时间分别为和 3.32 min, 色谱图见图线性关系考察及最低定量限测定取空白 Beagle 犬血浆 200 μl, 加入左乙拉西坦系列浓度标准液 20 μl, 浓度为 100 μg ml 1 内标吡拉西坦溶液 20 μl, 配制成为左乙拉西坦血浆终浓度分别为 1,5,10,50,100,200,500 μg ml 1 的血浆样品按 3.3 项下方法操作, 建立标准曲线以待测物浓度为横坐标 (X), 待测物与内标物色谱图的峰面积比值为纵坐标 (Y), 用加权 (W=1/X2) 最小二乘法进行回归运算 [8], 得线性回归方程 Y= X (r= ), 结果表明, 左乙拉西坦在 1~500 μg ml 1 范围内线性关系良好, 定量下限为 1 μg ml 1 图 5 左乙拉西坦和内标 HPLC 色谱图 A 空白色浆 ;B 空白血浆 + 对照 ;C 给药血浆样品 1 吡拉西坦 ;2 左乙拉西坦 Fig. 5 Chromatograms of levetiracetam and internal standard in dog plasma A blank plasma; B blank plasma spiked with levetiracetam and IS; C plasma sample. 1 piracetam; 2 levetiracetam. 3.7 精密度与回收率试验取空白 Beagle 犬血浆 200 μl, 制备左乙拉西坦低中高 3 个质控浓度 (5,50,500 μg ml 1 ) 的质控 (QC) 样品, 按 3.3 项下方法操作, 每个浓度进行 5 样本分析, 连续测定 3 d, 根据当日的标准曲线, 计算 QC 样品的测得浓度, 根据 QC 样品结果考察本法的日内日间精密度及相对回收率另取犬空白血浆 200 μl, 按 3.3 项下方法操作, 吹干前加入相应的对照品溶液及内标溶液, 40 氮气吹干 200 μl 流动相复溶, 涡旋 1 min, r min 1 离心 10 min 后取上清进样以每一浓度 QC 样品获得的峰面积与未经提取直接获得的峰面积之比计算提取回收率, 结果见表稳定性试验按 3.3 项下方法操作, 制备低中高 (5, 50,500 μg ml 1 )3 个质控浓度的 QC 样品, 每个浓度进行 3 样本分析, 分别经 3 次 20 冰冻 - 室温溶解循环, 20 冰冻放置 7 d 及处理后的 QC 样品室温放置 24 h 考察方法的稳定性, 结果见表 7 表 6 左乙拉西坦精密度及回收率试验 (n=5) Tab. 6 Results of precision and recovery test(n=5) 加入浓度 / 测得浓度 / RSD/% 回收率 /% μg ml 1 μg ml 1 日内日间 ± ± ± ± ± ±3.8 表 7 左乙拉西坦稳定性结果 (n=3) Tab. 7 Results of stability test(n=3) 条件 3 次 20 冰冻 - 室温溶解循环 20 冰冻放置 7 d 24 h 室温放置加入质控浓度 / 测得质控浓度 / RSD/% μg ml 1 μg ml ± ± ± ± ± ± ± ± ± 药时曲线及药动学参数计算按 3.3 项下方法操作, 每个分析批制备一条标准曲线, 同时制备低中高 (5, 50, 500 μg ml 1 )3 个质控浓度的 QC 样品,QC 样品数量不少于每个分析批中样品总量的 5% 根据每一分析批的标准曲线计算 QC 样品和血浆样品的浓度,QC 样品的浓度不能超出理论值的 15%, 本实验每个分析批测得的 QC 样品浓度为理论浓度的 89.31%~ % 8 只 Beagle 犬单剂量口服左乙拉西坦缓释片和左乙拉西坦片的平均药时曲线见图 6 采用 DAS 3.0 软件计算 8 只 Beagle 犬单剂量口服左乙拉西坦缓释片和左乙拉西坦片的主要药动学参数, 结果见表 Chin J Mod Appl Pharm, 2017 September, Vol.34 No.9 中国现代应用药学 2017 年 9 月第 34 卷第 9 期

6 表 8 单剂量口服左乙拉西坦缓释片和左乙拉西坦片的主要药动学参数 Tab. 8 Pharmacokinetic parameters of levetiracetam in Beagle dogs after single dose oral administration of levetiracetam sustained release tablets and levetiracetam tablets 药动学参数普通片缓释片 T max /h 1.75± ±1.00 T 1/2 /h 5.28± ±2.64 C max /mg L ± ±3.56 AUC (0-t) /mg L 1 h ± ±34.20 相对简单, 重复性好, 有利于实现样品的大规模生产对制备左乙拉西坦缓释片进行 Beagle 犬体内药动学研究, 建立了 HPLC 测定 Beagle 犬血浆中左乙拉西坦的浓度, 方法学验证结果符合生物样品分析要求考察单次给药后左乙拉西坦普通片和左乙拉西坦缓释片的药动学参数, 结果表明乙拉西坦缓释片达峰时间 (T max ) 明显延长, 达峰浓度 (C max ) 明显降低, 缓释片和 AUC (0-48h) 与普通片无显著性差异, 表明制备左乙拉西坦缓释片体内具有较明显的缓释特征, 没有出现突释现象后续应对左乙拉西坦缓释片体内药动学深入研究, 以获得自制缓释片与市售缓释片生物等效性数据, 为本品临床试验的设计和临床合理用药提供参考 REFERENCES 图 6 单剂量口服左乙拉西坦缓释片和左乙拉西坦片的平均药时曲线图 Fig. 6 Mean plasma concentration time curves of levetiracetam in Beagle dogs after single dose oral administration of levetiracetam sustained release tablets and levetiracetam tablets 4 讨论本品服用剂量较大, 为了达到理想缓释效果, 应尽可能选择种类和用量均较少的辅料, 考虑到左乙拉西坦属于高水溶性药物, 本品选择 HPMC 为骨架材料, 欧巴代胃溶型 85G 型为包衣材料, 通过对 HPMC 型号和用量, 以及包衣增重进行筛选, 确定采用 HPMC K4M 为缓释材料, 用量约为处方量 23%, 包衣增重为 1.5% 采用优化得到处方工艺制备 3 批样品,3 批样品体外释放度符合要求, 与市售缓释片在常用 4 种释放介质 f 2 值均大于 >50, 体外释放行为相似, 本品处方与制备工艺 [1] WANG J L, OUYANG Q, ZHONG C G, et al. Research progress in preparation technique of Levetiracetam [J]. Chin J Biochem Pharm( 中国生化药物杂志 ), 2012, 33(4): [2] HU X Q, MA A X. Levetiracetam versus phenytoin for seizure prophylaxis after brain injury:a mete-analysis [J]. Chin J New Drugs Clin Rem( 中国新药与临床杂志 ), 2015, 34(3): [3] LYSENG W K. Levetiracetam: a review of its use in epilepsy [J]. Drugs, 2011, 71(4): [4] DENG M, MA J Y, MENG L J, et al. Bioequivalence test of domestic levetiracetam tablets in healthy volunteers [J]. Chin J New Drugs( 中国新药杂志 ), 2016, 25(19): [5] YAN Y K, WANG Z. Progress of Levetiracetam basic research [J]. Chin J Mod Appl Pharm( 中国现代应用药学 ), 2013, 30(5): [6] LIU Q F, LUO G A, WANG Y M. Application development of similarity evaluation on release of susteined and controlled release preparation [J]. Chin Pharm J( 中国药学杂志 ), 2006, 41(15): [7] Cfm [8] 钟大放. 以加权最小二乘法建立生物分析标准曲线的若干问题 [J]. 药物分析杂志, 1996, 16(5) : 收稿日期 : ( 本文责编 : 李艳芳 ) 中国现代应用药学 2017 年 9 月第 34 卷第 9 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2017 September, Vol.34 No

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.