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6 866 中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 05, 46(8) 药理与临床 人血浆中苯达莫司汀和活性代谢产物 γ- 羟基苯达莫司汀的 LC-MS/MS 法测定 管登峰,, 马智宇, 钟大放, 吴玉林, 陈笑艳 * (. 中国科学院上海药物研究所, 上海 003;. 中国药科大学药学院, 江苏南京 0009) 摘要 : 建立了液相色谱 - 串联质谱法测定人血浆中的苯达莫司汀 ( ) 和活性代谢产物 γ- 羟基苯达莫司汀 ( ), 并考察 的同分异构体对测定的影响 使用 Synergi Hydro-RP 柱, 以甲醇 5 mmol/l 乙酸铵溶液 ( 含 0.% 甲酸 )(54 46) 为流动相, 流速梯度洗脱 采用电喷雾电离源, 多反应监测模式, 正离子检测 在人血浆中共检测到 4 种羟基代谢物 ( m/z 374.), 其中, 的 3 种同分异构体的峰面积之和不足其 % 人血浆中 和 在 3 ~ ng/ml 和.5 ~ 000 ng/ml 范围内线性关系良好 的日内和日间 RSD 小于 6.0% 和 8.0%, 准确度为 96.%~ 06.0% 和 98.6%~ 03.0% 关键词 : 苯达莫司汀 ;γ- 羟基苯达莫司汀 ; 同分异构体 ; 液相色谱 - 串联质谱 ; 测定中图分类号 :R969;O 文献标志码 :A 文章编号 :00-855(05) DOI:0.65/j.cnki.cjph Determination of Bendamustine and Its Active Metabolite γ-hydroxy Bendamustine in Human Plasma by LC-MS/MS GUAN Dengfeng,, MA Zhiyu, ZHONG Dafang, WU Yulin, CHEN Xiaoyan * (. Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 003;. College of Pharmacy, China Pharmaceutical University, Nanjing 0009) ABSTRACT: An LC-MS/MS method was established for the determination of bendamustine () and its active metabolite γ-hydroxy bendamustine () in human plasma, and the effect of the isomers of on the determination was also investigated. A Synergi Hydro-RP column was used, with the mobile phase of methanol 5 mmol/l ammonium acetate solution (containing 0.% formic acid)(54 46) by gradient flow programming. A multiple reaction monitoring (MRM) mode was applied in the positive mode for mass spectrometric detection. In metabolic profiles of in human plasma, four hydroxylated metabolites (m/z 374.) were observed, in which the total peak area of the three isomers was no more than % of that of. It was linear for and in the ranges of ng/ml and ng/ml, respectively. Their intra- and inter-day RSDs were within 6.0% and 8.0%, and their accuracies were 96.% % and 98.6% %, respectively. Key Words: bendamustine; γ-hydroxy bendamusitne; isomer; LC-MS/MS; determination 收稿日期 : 作者简介 : 管登峰 (989-), 女, 硕士研究生, 专业方向 : 药物代 谢动力学 dfisme@6.com 通信联系人 : 陈笑艳 (97-), 女, 研究员, 博士生导师, 从事药 物代谢动力学研究 Tel: xychen@simm.ac.cn 苯达莫司汀 ( bendamustine,) 是一种双功能烷化剂, 通过干扰 DNA 的功能和合成发挥 [ 抗肿瘤作用 ] 在体内主要经 CYPA 酶代谢, 产生 种活性代谢产物 γ- 羟基苯达莫司汀 (γ-hydroxy bendamustine,) 和 N- 去甲基苯达莫司汀 (N-demethyl bendamustine,3) [], 两者血浆浓度

7 中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 05, 46(8) 867 分别相当于 的 0% 和 % [ 3,4] 其中 的药效活性与 相当,3 的药效活性仅为 的 0%~ 0% 有报道采用高效液相色谱 - 荧光检测法 (HPLC- FLD) 和液相色谱 - 串联质谱法 (LC-MS/MS) 同时测定人血浆中的 和 HPLC-FLD 法测定 的最低定量限 (LLOQ) 大于 8 和 5 ng/ml [5,6] ;LC-MS/ MS 法检测灵敏度较高 [7] 结构中存在多个羟基化位点, 可能存在异构体, 尚未见报道考察这些异构体对 测定的影响 本研究建立了 LC-MS/MS 法同时测定人血浆中的 和, 并考察 的同分异构体对测定的影响 仪器与试药 00 型液相色谱系统 ( 包括 G3A 型二元输液泵, G367D 型自动进样器,G36B 型柱温箱和 G3B 型真空脱气机 ) 6460 型三重四极杆串联质谱仪及 Mass Hunter 数据采集软件 B.0.0 均为美国 Agilent 公司产品 Acquity Ultra 超高效液相色谱系统, 配备有紫外检测器及 Masslynx V4. 控制软件 ( 美国 Waters 公司 );Triple TOF 型质谱仪, 配备有 ESI 源 CDS 自动校正系统 Analyst TF V.6 控制软件和 Peak View V. 数据分析软件 ( 美国 AB SCIEX 公司 ) 盐酸盐对照品 ( 重庆天地药业有限责任公司, 纯度 99.84%, 批号 S000); 盐酸盐对照品 ( 重庆赛诺生物药业股份有限公司, 批号 E, 纯度 95.4% ); d 6 - 盐酸盐 (4, 内标, 加拿大 TRC 公司, 化学纯度 98%, 同位素纯度 99%, 批号 B3); 盐酸盐注射液 ( 海口市制药厂有限公司, 规格 5 mg); 其他试剂均购自国药集团化学试剂有限公司 甲醇 乙腈 甲酸和乙酸铵均为色谱纯 ; 水为去离子水 空白人血浆由南京医科大学第一附属医院提供, 使用时每 0.8 ml 血浆样品须加入 6 mol/l 盐酸 0 µl 酸化处理 方法与结果. 色谱和质谱条件色谱条件 : 色谱柱 Synergi Hydro-RP 柱 (4.6 mm mm,4 µm); 预柱 C 8 保护柱 (4.0 mm 3.0 mm, 5 µm); 流动相甲醇 含 0.% 甲酸的 5 mmol/l 乙酸铵溶液 (54 46); 流速梯度 0.0 min,. ml/min, min,0.6 ml/min; 柱温 5 ; 进样量.0 µl 质谱条件 : 离子源电喷雾离子源 ( ESI 源 ), 正离子检测 ; 干燥气温度 3 ; 干燥气流速 0 L/min; 雾化气压力 0 psi; 鞘气温度 0 ; 鞘气流速 L/min; 毛细管电压 4.0 kv; 喷嘴电压 0 V; 扫描方式多反应离子监测 ( MRM); 监测离子对 m/z 358 m/z 304() m/z 374 m/z 338() 和 m/z 364 m/z 30(4); 扫描时间 80 ms. 溶液配制精密称取 盐酸盐对照品适量, 以甲醇溶解并定容, 制得相当于 浓度为.0 mg/ml 的对照品贮备液 以空白人血浆稀释制备系列浓度血样, 浓度分别为 和 ng/ml, 浓度分别为 和 000 ng/ml 另外同法配制质控贮备液, 以空白人血浆稀释制备 LLOQ( 3 ng/ml,.5 ng/ml) 及低 ( 6 ng/ml, 3 ng/ml) 中 ( 0 ng/ml, ng/ml) 高 ( 6 0 ng/ml, 800 ng/ml) 浓度质控血样, 分装后于 -70 贮存 精密称取 4 对照品适量, 以甲醇溶解并定容, 制备浓度为 88.0 µg/ml 的内标贮备液 ( 以碱基计算 ) 用乙腈稀释, 制备浓度为 00 ng/ml 的内标溶液, 置 4 冰箱保存 取人空白全血 0 µl, 与空白人血浆 980 µl 混合, 加入 6 mol/l 盐酸 5 µl 酸化, 即得溶血的空白人血浆.3 血样预处理避光条件下进行 取空白人血浆 00 µl, 分别加入甲醇 5 µl 内标溶液 00 µl 和乙腈 00 µl, 涡旋混匀, 离心 (8 000 g)5 min, 取上清液进样分析.4 方法学验证.4. 选择性取 6 个不同来源的空白人血浆 份溶血的空白人血浆, 以及以相应空白人血浆配制的 LLOQ 血样 ( 按. 项下方法制备 ), 按.3 项下方法处理, 分别进样, 记录色谱图 ( 图 ) 结果表明, 空白血浆中内源性物质及溶血样品不干扰测定 同位素内标 4 不干扰 的测定.4. 线性试验按. 项下方法制备系列浓度血样, 按.3

8 868 中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 05, 46(8) Counts Counts A Counts 0 Counts B C D 4 Counts E Counts F A: 空白人血浆,B: 空白人血浆 +4(00 ng/ml),c:lloq 血样,D: 患者静注 盐酸盐 ( 剂量 00 mg/m )65 min 后的血样 ( ng/ml; 58 ng/ml),e: 溶血空白人血浆,F: 溶血空白人血浆 +(3 ng/ml)+(.5 ng/ml)+4(00 ng/ml) -;-;4-4 图 典型色谱图 Fig. Typical Chromatograms 4 项下方法操作, 分别进样 以待测物浓度 c 为横坐标, 待测物与内标物的峰面积比值 R 为纵坐标, 用加权 (W=/c ) 最小二乘法进行回归运算, 得回归方程 :R=0.00 3c ,r =0.995 ;:R= c ,r² = 在 3 ~ ng/ml 和.5 ~ 000 ng/ml 范围内线性关系良 好,LLOQ 为 3 和.5 ng/ml.4.3 精密度和准确度试验按. 项下方法分别制备 LLOQ 及低 中 高浓度质控血样, 按.3 项下方法操作, 每一浓度 d 内测定 6 次, 连续测定 3 d 根据当日标准曲线计算 LLOQ 和质控样品浓度 分别计算 的

9 中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 05, 46(8) 869 日内 日间 RSD 及准确度, 结果见表 表 精密度和准确度试验结果 /% Tab. Results of Precision and Accuracy Tests/% 浓度 /ng ml - 准确度 (n=8) RSD 日内 (n=6) 日间 (n=8) 回收率试验 按. 项下方法分别制备低 中 高浓度 质控血样, 各 6 份, 分别按.3 项下方法操作, 进样测定 另取空白人血浆, 除不加内标溶液外, 按.3 项下操作, 向获得的上层有机相中加入低 中 高浓度对照品溶液 ( / 浓度分别为 4/ 600/00 和 5 600/3 00 ng/ml, 下同 ) 和内标溶 液 (00 ng/ml), 涡旋混匀后进样分析, 记录峰面积 (n=3) 以 种处理方法样品的峰面积比值计算提 取回收率 计算得低 中 高浓度 的回收率 分别为 9.7% 90.4% 97.9% 和 96.8% 97.6% 94.7%,RSD 分别小于 4.% 和 9.6%.4.5 基质效应 取 6 个不同来源的空白人血浆和 份溶血的空 白人血浆, 除不加内标溶液外, 均按.3 项下 方法操作 取全部上清液, 加入如上制备的低 高 浓度对照品溶液和内标溶液, 涡旋混匀后进样分 析, 记录峰面积 另取同法处理的酸化水 00 µl 代 替空白人血浆, 按上述方法处理并进样, 获得相应 峰面积 以 种处理方法的峰面积比值计算基质效 应 结果低 高浓度 的基质效应因子为 99.7% 和 00%,RSD 为.0% 和.3%; 的基质效应因子 为 96.0% 和 0%,RSD 为 4.5% 和.5% 在本试 [ 验条件下, 可忽略基质对 测定的影响 8], 且 溶血样品不干扰测定.4.6 稳定性试验 按. 项下方法分别制备低 高浓度质控 血样, 考察避光室温放置 4 h 避光室温放置 6 h 3 次冻融循环及 70 放置 94 d 的稳定性 结果 表明, 在上述考察时间和条件内待测物均保持稳 定, 准确度为 90%~ 0%.5 药动学应用.5. 试验方案 临床试验经南京医科大学第一附属医院伦理委 员会批准, 入选 5 名 B 细胞惰性淋巴瘤 ( 包括慢 性淋巴细胞白血病 ) 患者, 签署知情同意书后, 静 注 盐酸盐注射液, 给药剂量为 00 mg/m, 输注 60 min 分别于给药前及给药后 和 300 min 采集血样 全血采集后 4 离心 ( 60 g)0 min, 分离血浆样品置已加入盐酸的采样管中, 混匀后于 70 冰箱保存待测.5. 试验结果 取上述血样, 按.3 项下方法处理后进样 测定, 绘制药 - 时曲线 结果见图 c/ng.ml ; - 图 肿瘤患者静注 盐酸盐后 和 的药 - 时曲线 (n=5) Fig. Mean Drug Concentration-time Curves of and in Cancer Patients after an Intravenous Administration of Hydrochloride (n=5).6 同分异构体对测定的影响 的丁酸侧链以及苯环上存在多个羟基化代谢 位点, 因此, 活性代谢物 在血样中可能存在多种 同分异构体 另外羟基化代谢物的葡萄糖醛酸结合 物和硫酸结合物经质谱检测时易发生源内裂解, 产 生与 相同质荷比的离子, 因此方法建立时须评价 这些异构体和结合物对 测定的影响 取 5 名患者给药后 h 的血浆样品各 0 µl, 合

10 870 中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 05, 46(8) 并后经乙腈沉淀蛋白, 采用 Q-TOF MS 检测 色 谱柱为 Acquity UPLC HSS T3 柱 (. mm 00 mm,.8 µm), 以甲醇 (A) 5 mmol/l 乙酸铵溶液 ( 含 0.% 甲酸,Β) 为流动相, 梯度洗脱 (0 min,a B=0 90;.0 6 min,a B= ;6.0 7 min,a B= ; min,a B=99 ;8.0 min, A B=0 90) 选择性监测 m/z ( 的 [M+H] + ) m/z 5.00( 的葡萄糖醛酸结合物 ) 和 m/z ( 的硫酸结合物 ), 结果检测到 4 个 m/z 374 的色谱峰 ( 标记为 P ~ P4), 未检测到结 合型代谢物, 如图 3 所示 通过与对照品色谱保 留时间比较, 可确定 P4 为活性代谢产物 对 m/z 374 进行产物离子分析, 它们均生成相同的碎片离 子 m/z 356 和 m/z 338 MRM 检测结果表明 P ~ P3 的峰面积总和小于 峰面积的 % 因此, 尽管 在人体内可代谢生成多个羟基代谢物, 但以 为 主, 可不考虑同分异构体对 测定的影响 I/cps 00% % 0% PP 图 3 患者静脉滴注 盐酸盐 h 后血浆的提取离子色谱图 (m/z ) Fig.3 Extracted Ion Chromatograms of m/z in Patients Plasma after Intravenous Administration of Hydrochloride ( h) 3 讨论 和 的结构中都含有一个氮芥类结构, 在生 理 ph 值条件下不稳定, 易水解, 因此本试验在采 样管中加入盐酸酸化血样 ; 同时以含 0.% 甲酸的 5 mmol/l 乙酸铵溶液为流动相水相, 提高待测物的 稳定性 样品采集时可能会有溶血样品, 因此在方 法建立时考察了溶血样品, 结果表明溶血样品不干 扰待测物的测定 待测物见光易分解, 整个试验操 P3 P4 6 作应在避光条件下进行 本研究建立了 LC-MS/MS 法测定人血浆中的 和 通过优化预处理条件 色谱条件 分析时间 等显著提高了分析方法的效率, 每一样品色谱运行 时间为 4.5 min 本法简单 灵敏 易操作 选择性好, 成功应用于注射用盐酸 盐酸盐在肿瘤患者的药动 学研究 参考文献 : [] Eichbaum M, Bischofs E, Nehls K, et al. Bendamustine hydrochloride--a renaissance of alkylating strategies in anticancer medicine [J]. Drugs Today (Barc), 009, 45(6): [] Korycka-Wolowiec A, Robak T. Pharmacokinetic evalution and therapeutic activity of bendamustine in B-cell lymphoid malignancies [J]. Expert Opin Drug Metab Toxicol, 0, 8(): [3] Teichert J, Baumann F, Chao Q, et al. Characterization of two phase I metabolites of bendamustine in human liver microsomes and in cancer patients treated with bendamustine hydrochloride [J]. Cancer Chemother Pharmacol, 007, 59(6): [4] Teichert J, Sohr R, Baumann F, et al. Synthesis and characterization of some new phase II metabolites of the alkylator bendamustine and their identification in human bile, urine, and plasma from patients with cholangiocarcinoma [J]. Drug Metab Dispos, 005, 33(7): [5] 吴蔚, 刘智, 程航, 等. 高效液相色谱荧光检测法测定 人血浆中苯达莫司汀及 γ- 羟基化苯达莫司汀浓度 [J]. 肿 瘤药学, 0, (): [6] Xie FF, Cheng ZN, Cheng H, et al. Simultaneous determination of bendamustine and its active metabolite, γ-hydroxy-bendamustine in human plasma and urine using HPLC-fluorescence detector: application to a pharmacokinetic study in Chinese cancer patients [J]. J Chromatogr B, 04, 960: [7] Dubbelman AC, Tibben M, Rosing H, et al. Development and validation of LC-MS/MS assays for the quantification of bendamusitng and its metabolites in human plasma and urine [J]. J Chromatogr B, 0, : [8] Bergeron A, Furtado M, Garofolo F. Importance of using highly pure internal standards for successful liquid chromatography/tandem mass spectrometric bioanalytical assays [J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 009, 3(9):

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