乙型鏈球菌 (GBS) 鑑定 與藥物敏感性試驗流程介紹 台灣醫事檢驗學會 2015.07.05 2015.08.23 1
乙型鏈球菌 (Streptococcus agalactiae, Group B streptococcus, GBS) 鏈球菌屬 革蘭氏陽性鏈球菌 (GPC in chain) 菌體直徑 < 2 μm GPC in cluster GPC in chain Gm (+) diplococcus 2
乙型鏈球菌 (GBS) 菌落特徵與生化特性 綿羊血血液培養基上呈灰色半透明菌落 ( 窄型之 Beta 溶血或無溶血 ) 兼性厭氧 需 5 % CO 2 可生長良好,24 hr 培養菌落直徑大小約大於 0.5 mm 革蘭氏陽性鏈球菌 觸酶 (Catalase) 陰性 CAMP test 陽性 Hippurate test 陽性 ( 具有 hippuritase) Lancefield grouping B 3
乙型鏈球菌 (Streptococcus p agalactiae, Group B streptococcus, GBS) α-streptococcus β-streptococcus γ- Streptococcus S. pneumoniae Gr A streptococcus Enterococcus viridans streptococcus Gr.D streptococcus Enterococcus Lactococcus Aerococcus Gemella Leuconstoc Pdi Pediococcus Gr B streptococcus Gr.C streptococcus Gr.G streptococcus Gr.D streptococcus Gr.F streptococcus Et Enterococcus Gr.B streptococcus Gr.D streptococcus 4
溶血特徵比較 5
不同菌株間之 beta 溶血特徵比較 GAS GBS 菌落 0.5mm 窄溶血圏 S. aureus -strepto. non ABD 6
乙型鏈球菌檢驗鑑定流程圖 7
常見鏈球菌之生化特性 菌名 ( 群 ) 溶血 Lancefield group CAMP Hippurate hydrolysis PYR Bileesculine/ 65%NaCl 6.5% Bacitracin S. pyogenes A + / S S. agalactiae S. dysgalactiae Enterococus B + + /v R C / R D + +/+ R 8
Enriched broth (LIM / Carrot broth) Subculture on BAP GBS( ) GBS( ) Carrot broth (-) Enriched broth LIM broth / Carrot broth 9
Enriched broth (LIM / Carrot broth) Subculture on BAP GBS(+) GBS(+) () beta hemolytic GBS ~ 96% Carrot broth (+) Enriched broth LIM broth / Carrot broth 10
觸媒試驗 (Catalase Test,3% H 2 O 2 ) 1. 以木棒或牙籤將菌株挑取菌株, 塗抹於測試卡片或玻片上 2. 滴入一滴配製好的 3% H 2 O 2 3. 觀察是否產生氣泡 4. 陽性反應會產生大量氣泡, 陰性則不會產生氣泡 使用單一菌落避免挑到含血培養基 陽性對照 :S. aureus ATCC 25923 陰性對照 :S. pyogenes ATCC 19615 陽性反應 : 產生大量氣泡 陰性反應 : 無氣泡產生 11
Hippurate Test 目的 : 測試菌株是否具有 Hippuricase 1. 取出三管已分裝好的 Hippurate 試劑 ( 每管 0.4 ml) 2. 分別加入培養 18 24 小時的測試菌株 陽性對照菌株 (S. agalactiae ATCC 12386) 與陰性對照菌株 (S. pyogenes ATCC 19615), 濃度約需達 McF 3 ( 注意勿將培養基挑起, 以免內含之蛋白質影響試驗結果 ) 3. 於 35 37 培養 2 小時 4. 加入 4 滴的 ninhydrin 試劑 5. 於 35 37 培養 30 分鐘 6. 每隔 10 分鐘觀察一次顏色, 陽性反應會於 30 分鐘內出現深藍紫色變化, 陰性則呈現淡淡的紫色或不變色 Hippuricase 35, 4 hours Ninhydrin Glycine ninhydrin 35, 30min ( 深藍紫色產物 ) Hippurate = benzene ring + glycine 12
CAMP test (Christie, Atkins, Munch Peterson test) 1. 以直線劃法將標準菌株 S. aureus ATCC 25923 劃於 BAP 中間的位置 2. 同樣以直線劃法, 將測試菌株垂直步驟 1 之菌線劃於 BAP 上, 切勿碰觸步驟 1 之菌線 3. 將 BAP 於 35 37, 二氧化碳 (5%) 培養箱中培養 18 24 小時 4. 觀察在 S. aureus 與測試菌株之交界處是否產生箭頭狀 (arrowhead) 的加強溶血現象, 有的話則為陽性反應, 確認為乙型鏈球菌 5. 陰性則不會產生箭頭狀 (arrowhead) 的加強溶血現象 BAP QC S. aureus ATCC 25923 GAS 陰性反應 : 無加強溶血現象 GBS 陽性反應 : 箭頭狀加強溶血現象 S. aureus ATCC 25923 ( hemolysin) 13
Lancefield 血清分型 (Lancefield grouping) Group A Streptococcus pyogenes (GAS) Group B Streptococcus agalactiae (GBS) Group C S. equisimilis, S. zooepidemicus, S. equi, S. dysgalactiae Group D Enterococci, S. bovis Group E S. milleri and mutans Group F S. anginosus Group G S. canis and S. dysgalactiae Group H S. sanguis Rebecca Craighill Lancefield Group L S. dysgalactiae (Jan 5, 1895 Mar 3, 1981) Group N Lactococcus lactis 美國微生物學家 Group R&S Streptococcus suis 主要貢獻 : non Lancefield Streptococci other Strep. spp GAS 和風濕熱的關聯性研究 beta 溶血性鏈球菌的血清分型 ( 依細胞壁上之碳水化合物組成不同而分型 ) 14
鏈球菌血清分型乳膠凝集試驗 (Latex serologic test for streptococcal grouping) 依照廠商說明書操作菌株 : Streptococcus 15
鏈球菌血清分型乳膠凝集試驗 (Latex serologic test for streptococcal grouping) Lancefield grouping Beta 溶血性鏈球菌的血清分型 無凝集 ( 陰性 ) 凝集反應 ( 陽性 ) 16
商業化鑑定儀器 / 套組 Phoenix VITEK 2 MALDI-TOF API Strep 20 17
常見窄型溶血細菌之生化特性 菌名 ( 群 ) Gram stain ti S. agalactiae E. faecalis Listeria GPC in short Chain GPC in short Chain, in pair Lancefield group tl Hippurate catalase CAMP PYR 65%NCl 6.5% NaCl hydrolysis B + + v D + + Short GPB + + Smear catalase 18
103 年孕婦乙型鏈球菌檢驗機構調查彙總 ( 回覆家數 :140 家 ) 鑑定 回覆 家數百分比 附註 是否操作觸媒 (3% 是 128 91.4 catalase) tl 試驗? 否 12 86 8.6 是 92 65.7 是否操作 CAMP test? 否 47 33.6 未回覆 1 07 0.7 是 3 2.1 是否操作 Hippurate 否 133 95.0 hydrolysis test 未回覆 4 29 2.9 是 102 72.9 Prolex TM latex Agglutination system(34) Remel streptex(17) PRO LAB DIAGNOSTICS(12) 是否操作乙型鏈球菌血清分型乳膠凝集試驗 否 36 25.7 未回覆 2 1.4 OXOID(8) BIO RAD(6) BioM'erieux SLIDEX Strepto Plus(4) PASTOREXTM Strep(2) Phadebact Strep B test(2) BD Directigen TM Meningitis Combo test(1) SLIDEX streptoplus(1) Thermo(1) 是否使用自動化鑑定儀器或商業化套組 是 61 43.6 Vitek 2(29) Phoenix(23) BBL crystal(4) Bruker 否 76 55.0 MALDI TOF(3) API(2) Microscan(2) MASS(1) 未回覆 2 14 1.4 19
藥物感受性試驗 CLSI 建議的方法 : 紙錠擴散法 CLSI M100 S25 肉湯稀釋法 / 培養基稀釋法 E test Automatic MIC methods 20
藥物感受性試驗 CLSI 建議的方法 : 紙錠擴散法 培養基 :MH-BAP 菌落 :BAP overnight (18-20 小時 ) 菌落 調菌方式 : 直接調菌 (broth / saline) 濃度 :McFarland No. 0.5 培養環境 :5% CO 2 溫箱,35 ± 2 培養時間 :20~24 hrs 21
紙錠法 Mueller Hinton BAP Agar susceptibility tests 判讀標準是使用此培養皿累積而得 approximately 4 mm ph (7.2-7.4) < ph7.2 -- lose potency: macrolides, aminoglycosides, quinolone excessive activity: tetracyclines > ph7.4 -- opposite effects can be expected thymidine or thymine 影響 Thymidine and thymine in the M-H agar can reverse the inhibitory effect of sulfonamides and trimethoprim Mg 2+, Ca 2+ 影響 - for P. aeruginosa 22
藥物感受性試驗 使用無菌棉棒挑取經培養 18 20 小時的菌落 測量抑制環的直徑 ( 量測時為菌落生長處非溶血處 ) 將培養基反轉 ( 培養基蓋朝下 ) 置於 35 ± <15 分鐘 2,5% 二氧化碳培養箱中, 培養 20 24 小時 於 TSB 或無菌生理食鹽水調成 05McF 0.5 濃度之懸浮液 <15 分鐘 <15 分鐘 將無菌粗棉棒浸潤於已調好的菌液中, 沿管壁輕輕將多餘菌液壓除, 塗抹在含 5% 綿羊血的 Mueller Hinton 培養基表面上 ( 以三個不同的方向進行塗抹, 每次轉 60 度, 使接種原平均分布 ) 待菌液吸收後 ( 約 3 5 分鐘, 勿超過 15 分鐘 ), 以無菌鑷子將適當的抗生素紙錠貼於瓊脂表面 紙錠間的距離應超過 24 mm, 與培養基的邊緣應距 15 mm; 但對於操作 D zone test 時應注意將 E 與 CC 的紙錠貼於相隔 12 mm 之距離 23
藥物感受性試驗 準備菌液 -Direct Colony Suspension Method - McFarland No.0.5-1-2*10 8 CFU/mL -15 分鐘內接種 24
藥物感受性試驗 Retro 80 Inoculator - 塗菌方式 - 三向法 - 不可與挑菌共用 同一支棉棒 -15 分鐘內打紙錠 (24mm) Rotate 60 Rotate 60-15 分鐘內放 CO 2 溫箱 25
藥物感受性試驗 ( 結果判讀 ) 反射光 Rfl Reflected dlight 在暗色的背景 Enterobacteriaceae, other gram nagative bacilli, staphylococci, enterococci streptococci ( 拿掉蓋子 ) 透射光 Transmitted light Oxacillin for staphylococci Vancomycin for enterococci 26
藥物感受性試驗 ( 結果判讀 ) 量取生長抑制圈 ( 非溶血圈 ) 不要由背面量 Disk S I R MIC S I R Penicillin 24 - - 0.12 - - Ampicillin 24 - - 0.25 - - Clindamycin 19 16-18 15 0.25 0.5 1 Erythromycin 21 16-20 15 0.25 0.5 1 Vancomycin 17 - - 1 - - CLSI M100-S25,2015 27
Staphylococcus, py, hemolytic y Streptococci* Erythromycin / Clindamycin i Mechanism Determinant Ery Clin Efflux msra, mef R S Ribosome modification erm C R S** Ribosome modification erm B R R constitutive * Groups A, B, C, G **requires induction to show resistance 28
MH BAP or BAP CLSI M100 S25 29
操作 D test ( 偵測誘發型克林達黴素抗藥性 ) 發生在 E(R/I), CC(S) 時 12 mm 菌株具有 erm 基因 E CC 以 D test 試驗偵測 操作藥物感受性試驗時, 將 E 與 CC 紙錠貼距 12 mm 的距離 當 CC 周圍出現盾狀 (D 型 ) 抑制圈時為陽性結果 陽性結果 Dtest(+) 出現時, 表示菌株具有誘發型克林達黴素抗藥性, 須將 CC 結果修正為 R D test t( ( ): 不具有誘發型克林達黴素抗藥性 E CC Dtest (+): 具有誘發型克林達黴素抗藥性 3
D test 陽性結果 ( 誘發型克林達黴素抗藥性 ) Photo courtesy of Dr. Lesley McGee, CDC 當 CC 周圍出現盾狀 (D 型 ) 抑制圈時為陽性結果, 表示菌株具有誘發型克林達黴素抗藥性, 須將 CC 結果修正為 R 31
藥物感受性試驗結果 P VA AM CC CC E P(S), AM(S), CC(S), E(R), VA(S), D test(-) 32
藥物感受性試驗結果 E P CC AM VA CC P(S), AM(S), CC(S), E(R), VA(S), Dtest(+) 修正為 P(S), AM(S), CC(R), E(R), VA(S) 33
Streptococcus Gr.B Organism or group Category I Not reported or only rarely reported to date Confirm ID and susceptibility -streptococcus Ampicillin or penicillin NS Vancomycin - NS CLSI M100 S25 Penicillin X R 22mm >24mm S Ampicillin S Vancomycin S Erythromycin Clindamycin X R S D zone test (+) R 34
103 年孕婦乙型鏈球菌檢驗機構調查彙總 ( 回覆家數 :140 家 ) 藥敏回覆家數百分比附註是 133 95.0 是否操作 D 否 5 3.6 zone test? 未回覆 2 1.4 Mueller 123 87.9 Hinton BAP 操作抗生素敏 BAP 7 5.0 感性試驗使用之培養基 Phoenix Vitek 2 AST 其他 13 9.3ST 01 Card MicroScan 35
2015 年 1~5 月各檢驗機構 Penicillin/Ampicillin/Vancomycin 抗藥 100 機構家數 90 80 70 60 50 VA 40 30 20 10 0 10 5 6 1 2 1 1 1 0 2 2 0 0 1 2 3 抗藥件數 >3 P AM 36
2015 年 1~5 月 Erythromycin/Clindamycin 抗藥 60 機構家數 50 40 30 20 CC E 10 0 3 4 5 抗藥比率 37
檢驗醫事機構資格審查原則 中華民國 102 年 7 月修訂 設有檢驗單位之醫院或聯合診所, 或獨立設置之檢驗所 ( 以下稱檢驗醫事機構 ) 符合下列資格之ㄧ者, 國健署得核予孕婦乙型鏈球菌檢驗醫事機構資格 : ( 一 ) 經財團法人全國認證基金會 (TAF) 細菌培養檢驗與藥物感受性試驗檢驗項目認證 ( 二 ) 經本署認可之機構或團體之認證 ( 三 ) 經本署委託機構或團體辦理孕婦乙型鏈球菌檢驗與藥物感受性試驗能力測試合格 38
檢驗醫事機構資格審查原則 符合前點資格者, 得檢附下列文件一式三份, 向國健署提出申請資格審查 : ( 一 ) 申請表 ( 二 ) 衛生局核發之開業執照影本 ( 三 ) 醫事檢驗人員相關證明文件 ( 四 ) 乙型鏈球菌培養檢驗之儀器資料 ( 五 ) 乙型鏈球菌培養及檢驗標準操作程序書 ( 六 ) 符合前點規定之資格證明文件 39
檢驗醫事機構資格審查原則 資格審查 ( 由國健署或其得聘請專家 / 委託相關學會辦理 ) 取得資格審查後, 始得接受國健署及醫事服務機構委託辦理預防保健服務孕婦產前檢查之孕婦乙型鏈球菌檢驗 40
檢驗醫事機構資格審查原則 通過國健署資格審查後, 應配合辦理下列事項 : ( 一 ) 應於收到檢體後七日內, 通知委託代檢醫療機構其檢查結果 如有陽性檢查結果, 應優先通知送檢機構 ( 二 ) 孕婦乙型鏈球菌檢查結果, 應於檢驗後十四日內, 依國健署規定之格式, 登錄於國健署指定管理系統 ( 三 ) 持續辦理內部品管, 並定期依品管稽核表之項目自我稽核, 且針對缺失提出改善措施, 相關資料應完整保留, 以備國健署抽查 41
檢驗醫事機構資格審查原則 通過國健署資格審查後, 應配合辦理下列事項 ( 續 ): ( 四 ) 定期接受國健署委託機構或團體辦理此類檢驗與藥物感受性試驗之外部能力試驗 ( 五 ) 因執行孕婦乙型鏈球菌檢驗之檢驗醫事機構人員離職, 致無具資格人員執行業務, 或有其他因素致不能執行業務時, 應立即停止辦理孕婦乙型鏈球菌檢驗業務, 經主管機關限期改善, 並改善完竣者, 始得恢復辦理 42
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檢驗醫事機構資格審查原則 通過資格審查後, 有以下情形之一者, 必須接受實地檢查 : ( 一 ) 經檢舉有缺失 ( 二 ) 經資料分析, 檢驗品質差異過大 ( 三 ) 其他基於業務需要, 應進行實地檢查 44
檢驗醫事機構資格審查原則 通過資格審查之檢驗醫事機構, 有以下情形之一者, 應取消其資格 : ( 一 ) 未依規定及期限申報個案檢查資料或申報之資料不完整 不正確, 經通知限期補正, 逾期未補正 ( 二 ) 經查有偽造個案檢查資料情事或其他情節重大之情形 ( 三 ) 經實地檢查, 確有重大缺失 45
檢驗醫事機構資格審查原則 通過資格審查之檢驗醫事機構, 有以下情形之一者, 應取消其資格 ( 續 ): ( 四 ) 使用未經衛生福利部查驗登記領有許可證之檢驗試劑及儀器設備 ( 五 ) 經查有第六點第五款之情形, 經主管機關限期改善而未於期限內改善者 ( 六 ) 喪失第二點所定資格 (TAF/ 認證 / 能力試驗合格 ) 46
檢驗醫事機構資格審查原則 經取消資格者, 自取消之日起, 屆滿三個月後, 始得檢附第二點文件及改善計畫之實施成果報告, 重新提出申請 47
Q & A (15) Q: 使用鏈球菌血清分型乳膠凝集試驗 (Latex serologic test for streptococcal grouping) g) 鑑定 GBS, 是否應操作品管測試? A: 正確, 依試劑操作說明執行陽性品管與陰性品管測試 48
Q & A (17) Q: 使用紙錠擴散法操作 GBS 的抗生素藥物敏感性試驗, 應該採用何種培養基?(102.12( 增修 ) A: 應使用含 5% 綿羊血的 M H agar, 不可以使用一般的 BAP 來取代 49
Q & A (18) Q: 乙型鏈球菌的抗生素敏感性試驗方法有哪些? A: 依據臨床與實驗室標準協會 (Clinical and Laboratory Standards Institute ; CLSI) 建議乙型鏈球菌的敏感性試驗包括紙錠擴散法 微量稀釋法或經查驗登記合格的商品化套組 50
Q & A (19) Q: 乙型鏈球菌的抗生素敏感性測試是否需要包括 inducible clindamycin resistance 的試驗? A: 是的, 因有部分的乙型鏈球菌具有誘導型 clindamycin 抗藥, 因此若有懷疑應操作 D zone test 且應注意將 erythromycin 與 clindamycin 的紙錠相隔 12 mm 51
Q & A (20) Q: 操作乙型鏈球菌的 D zone test 與金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus py aureus) ) 的 D zone test 是否有所不同? A: 是的, 金黃色葡萄球菌的 D zone test 中,erythromycin i 與 clindamycin i 的紙錠距離相隔 15 26 mm, 相對的 GBS 的 D zone test,erythromycin 與 clindamycin 的紙錠距離為 12 mm 52
Q & A (21) Q: 臨床上普遍會以 Cefamezin(cefazolin) 來治療孕婦乙型鏈球菌的感染, 實驗室是否應操作此抗生素的敏感性測試? A: 依據 CLSI 的建議, 若乙型鏈球菌菌株對於 penicillin 有效時, 同時也表示對 ampicillin, amoxicillin, amoxicillinclavulanicacid acid, ampicillin sulbactam, cefazolin, cefepime, cephradine, cephalothin, cefotaxime, ceftriaxone, ceftizoxime, imipenem, ertapenem, and meropenem 等藥物有效, 因此不需再操作上述抗生素的敏感性測試, 直接引用 penicillin 測試結果 53
Q & A (22) Q: 依據 CLSI 的建議, 若 GBS 菌株對於 penicillin 有效時, 同時表示對 ampicillin, cefazolin 等藥物有效, 所以可直接以 penicillin 結果發 ampicillin 報告嗎? (102.1212 增修 ) A: 可以, 不需再操作上述藥物的敏感性試驗, 直接引用 penicillin 測試結果 54
Q & A (23) Q: 自動化鑑定儀器 (Vitek 2, Phoenix, 等 ) 若無 ampicillin 藥物結果, 是否可直接以 penicillin 結果發 ampicillin 報告? (102.12 增修 ) A: 可以, 不需再操作上述藥物的敏感性試驗, 直接引用 penicillin 測試結果 55
Q & A (24) Q: 臨床上會將抗生素敏感性試驗的 intermediate (I) 當作 resistant (R) 嚴謹看待, 但學會之 GBS 測驗結果卻將兩者分開統計, 或是以受測家數較多答案者為主要答案, 而造成受測單位結果異常, 是否可將 I R 統一計算 (103 年增修 ) A: 學會的能力試驗是依達 80 % 的一致性作為評估標準, 且國際上規範如 CAP 也是以此標準作評估 若檢驗單位的答案與 80 % 受測家數的答案不同, 應自行檢討在抗生素敏感性試驗上的流程 56
Q & A (25) Q: 如果紙錠法及商品化藥敏套組所作的 D zone 結果不同, 應如何處理? (103 年增修 ) A: D zone 檢測時, 使用 Disk diffusion method 是標準方法, 商品化產品上市前, 都與標準方法比較, 必須有一定比率以上的一致性結果 當發現有方法間的差異時, 應告知原廠, 請原廠進行測試並找出差異的原因 廠 57
感謝聆聽 58