集結渦漩法在小板顫振分析之應用

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铃祷骆
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1 工程科技與教育學刊第 10 卷第 1 期第 83~88 頁民國 102 年 3 月以兩相流動提高超過濾濃縮醱酵液玻尿酸之回收率蘇芳儀陳樹人 * 國立高雄應用科技大學化學工程與材料工程系通訊作者電子郵件 : biochen@kuas.edu.tw 摘要以 100 kd 超過濾膜從鏈球菌醱酵液 (ph 7.0) 回收分子量為 1,200 kd 玻尿酸時, 回收率僅有 88%; 如果將醱酵液調整到 ph 2.5, 回收率可以提高至 96% 雖然降低酸鹼值有助於增加玻尿酸分子間的作用力, 促使玻尿酸分子纏繞形成分子團, 因而不容易穿越濾膜 ; 但伴隨而來的濃度極化現象, 卻明顯地降低超過濾操作的過濾通量本研究發現利用氣液兩相超過濾系統, 配合模組放置角度的改變, 可產生適當型態的氣泡氣泡上升之浮力能有效地擾動液體, 降低濃度極化現象, 因而提高過濾通量關鍵詞 : 鏈球菌玻尿酸超過濾濃度極化 1. 前言玻尿酸 (hyaluronic acid, HA) 主要存在於動物眼球玻璃體 [1] 臍帶 [2] 關節滑液 [3] 皮膚 [4] 與公雞雞冠 [5] 等組織除了動物之外,1937 年 Kendall 等人 [6] 發現鏈球菌莢膜主要的成分即是玻尿酸 ; 玻尿酸生產菌多隸屬於藍士菲耳特氏 A 群與 C 群鏈球菌, 常見者有 Streptococcus equi S. equisimilis S. dysgalactiae S. pyrogenes; 目前學術界與產業界多以獸疫鏈球菌 S. zooepidemicus 作為玻尿酸生產菌玻尿酸水溶液呈現擬塑性流體的特性, 具有良好的黏彈性 [7], 在關節疾治療生醫材料與保濕化粧品的開發上有廣泛的應用 [8-10] 傳統生產玻尿酸的方法是自公雞雞冠萃取 ; 然而, 以微生物醱酵生產玻尿酸, 不僅可以免除未知動物病毒的污染, 也可以在分離純化程序中避免使用氯彷丙酮等危害性溶劑 [10] 自鏈球菌醱酵液純化玻尿酸通常使用先以離心去除細胞, 再以硫酸銨沈澱出玻尿酸, 沈澱物以鹽水回溶之後, 反覆以酒精沈澱去除殘留的蛋白質, 最後再經過層析得到高純度的產物 [11] 為了簡化純化流程, 以超過濾回收玻尿酸是值得探討的分離程序超過濾可以自醱酵液直接回收產物, 免除硫酸銨沈澱的步驟, 並可移除大部分蛋白質, 卻難以避免濃度極化現象因此, 本研究除了探討超過濾的操作條件與方法之外, 也提出降低濃度極化現象的操作策略 2. 材料與方法本研究使用之玻尿酸生產菌為獸疫鏈球菌 Streptococcus zooepidemicus ATCC 批次醱酵生產是在 2.5-L 醱酵槽 (M-100, Tokyo Rikakikai, Tokyo) 進行, 醱酵條件為溫度 37 C 與 ph 7, 通氣量 1.0 vvm, 攪拌速率 600 rpm 培養基組成為 20 g/l glucose 10 g/l yeast extract 2.5 g/l K 2 HPO 4 2 g/l NaCl 與 1.5 g/l MgSO 4 H 2 O 過濾裝置使用 100 kda MWCO 的過濾膜, 過濾面積為 cm 2, 模組內渠道高度為 0.5 cm 超過濾系統裝置如 Fig. 1 所示, 操作步驟為 : (1) 通入去除菌體的醱酵液, 調整液相流速, 將管內及模組內的空氣趕出 (2) 通入空氣, 調整氣相流速 (3) 緩慢增加透膜壓力, 此時需注意控制調整氣液兩相的流速 Journal of Engineering Technology and Education, ISSN

2 84 蘇芳儀陳樹人在兩相流動超過濾實驗中, 空氣的注入因子定義為 : UG ε = U + U L G (1) 其中,U L 為液相醱酵液在模組內的表面流速,U G 為空氣在模組內的表面流速, 透膜壓力則由濾出端的控制閥調整玻尿酸濃度分析以 carbazole 法 [12] 分析, 先以濃硫酸水解玻尿酸得到葡萄糖醛酸, 加入 carbazole 試劑與葡萄糖醛酸反應產生粉紅色基團, 再以分光光譜儀測定波長 525 nm 之吸收度, 經由檢量線換算即可得知玻尿酸濃度 Back-pressure Valve Gauge Plate Membrane Module Reservoir Pump Flow Meter Filtrate Flow Meter Air 流體流動方向 Pump Fig. 1 超過濾裝置 3. 結果與討論研究用菌株所生產之玻尿酸分子量為 1,100 kda 是吾人採用 100 kda 的超過濾膜, 直接回收於醱酵液中的玻尿酸實驗操作條件控制在壓力為 10 psi 液相流速為 75 ml/min 從 Table 1 可以看出 : 在 ph 6.8 下, 有 12% 的玻尿酸可通過 100 kda 的濾膜,100 kda 的濾膜無法完全回收 1,100 kda 的玻尿酸分子之原因可能在於玻尿酸為一線性高分子, 在超過濾操作下, 容易被拉伸成線性, 因而通過 100 kda 的濾膜為了減少玻尿酸的損失, 本研究將醱酵液 ph 調整為 2.5, 以便增加玻尿酸分子間作用力, 彼此之間較為聚集而形成一較為剛性的高分子超過濾回收的實驗結果發現, 在 ph 2.5 的條件下玻尿酸的損失約只有 4%, 但殘留在濾膜的玻尿酸卻增加了, 亦即濃度極化效應較為明顯雖然在 ph 2.5 下, 玻尿酸的損失明顯減少 ; 但濃度極化效應卻明顯地降低濾速, 濃縮時間比 ph 6.8 的

3 以兩相流動提高超過濾濃縮醱酵液玻尿酸之回收率 85 操作條件多了 200 min 為改善此嚴重的極化現象, 本研究擬進一步探討以氣液兩相流動超過濾, 降低極化現象的可行性 Table 1 ph 值對超過濾回收玻尿酸之影響 ph HA (g) Filtrate Recovered Fouled Loss g 0.21 g 0.16 g 12% g 0.19 g 0.22 g 4% Fig. 2 顯示在不同透膜壓力下, 進行單一路徑流向的濾出液通量可以發現 : 透膜壓力愈大, 濾出液通量也隨之增加, 然而當壓力達到 30 psi 後, 濾出液通量已接近最大值, 因此後續的實驗皆於 30 psi 的壓力下進行由此圖亦可看出 : 隨著時間增加, 濾速逐漸下降, 尤其以前 20 分鐘最為明顯, 之後逐漸緩和, 這是由於玻尿酸會附在膜上而造成薄膜阻塞, 使得過濾阻力上升, 而隨著時間操作, 膜上的玻尿酸濃度增加, 於是造成逆向擴散的情形發生, 隨後溶質再對流於溶液中, 達到一穩定值於是後續的實驗, 均將透膜壓力固定在 30 psi, 操作時間為 100 min J v (m 3 /m 2 h) Fig. 2 不同透膜壓力對濾出液通量的影響兩相流動過濾系統之原理在於藉由注入空氣造成邊界層擾動, 降低極化層的現象研究首先將薄膜與桌面垂直的角度調整為 90 [13], 如 Fig. 3 所示, 箭頭指向為流體流動方向操作條件為 : 透膜壓力 30 psi 液相流速 35 ml/min 氣相流速 30 ml/min 注入因子為 0.46 然而實驗發現導入的空氣易受到管壁的阻礙, 而降低氣體的流速, 且渠道的寬度為 1.2 cm, 高度為 0.5 cm, 但注入空氣與醱酵液的管徑卻只有 0.3 cm, 相形之下, 氣泡更顯微小, 不易壓縮邊界層

4 86 蘇芳儀陳樹人 θ = 180 ο θ = 90 ο Fig. 3 θ = 45 ο 不同角度的模組操作示意圖因此, 吾人欲利用空氣向上的浮力及液體向下之重力, 使得導入模組的氣泡可以壓縮邊界層 ; 於是在將同的操作條件下, 將模組旋轉 45 及 180 結果發現氣泡大小明顯增大, 而模組偏轉 180 度的氣泡幾乎占據整個模組, 如 Fig. 4 所示這是因為當模組偏轉之後, 注入的空氣會受到斜放或平放模組底部的阻力, 使得原本可以快速進入模組的空氣在進口端聚集, 於是得到形狀較大的氣泡 θ = 90 o θ = 45 o θ = 180 o Fig. 4 不同角度模組的氣泡型態比較在不同模組操作方式下的濾出液通量可以看出 (Fig. 5), 模組角度旋轉 180 可顯著提高濾出液通量, 由氣泡的類型判斷 taylor bubble 的形成可能是提高濾速的關鍵條件研究進一步探討導入氣體流率比例對於濾出液通量之影響由 Fig. 6 可發現, 在相同的液體流速 35 ml/min, 導入空氣 10 ml/min( 注入因子為 0.22), 其效果反而比不通氣來的差由實驗觀察, 此時由於氣體流速較慢, 所以容易堆積在模組內, 氣泡流動不易, 且氣泡直徑約 0.5 cm, 均勻分散於渠道中此時氣泡的存在, 反而降低了液體過濾的有效面積而注入因子為 046 的操作則有較明顯的氣泡擾亂邊界層, 濾出液通量也略有提高 J v (m 3 /m 2 h) Fig. 5 不同角度模組, 通透量與時間關係圖模組角度 :( ) 90 ( ) 45 ( ) 180

5 以兩相流動提高超過濾濃縮醱酵液玻尿酸之回收率 J v (m 3 /m 2 h) Fig. 6 注入因子對濾出液通量的影響注入因子 :( ) 0 ( ) 0.22 ( ) 0.36 ( ) 0.46 固定注入因子, 同時增加氣液兩相的流速的實驗結果顯示於 Fig. 7 比較不同氣液流速以及單相流動超過濾, 發現固定注入因子而同時提高氣液兩相流速, 濾速並沒有因此而有顯著的增加觀察此時的氣泡型態, 若液相流速 75 ml/min, 氣相流速 65 ml/min, 此時氣泡大約形成直徑 0.5 cm 的大小, 均勻且分散於整個模組內, 主要是因為氣泡是藉由液相帶入模組, 所以當液相流速增加, 氣泡也會隨之快速進入模組, 所以不容易聚集成較大顆的氣泡型態 ; 而液相流速 35 ml/min, 氣相流速 30 ml/min, 其氣泡則是以更大顆的子彈型均勻分布於模組內由此數據可更進一步證明 : 氣泡形態才是增進濾速的主因, 並以形成子彈型的 Taylor bubble 造成管壁的剪應力影響較大 4. 結論在中性環境裡, 玻尿酸的線性結構較為鬆散, 若直接利用 100 kda 的超濾膜濃縮回收, 則會有 12% 的損失如果將醱酵液調為 ph 2.5, 則玻尿酸分子彼此之間較為聚集, 不易因被拉伸而通過濾膜, 回收率僅有 4% 在超過濾系統中,pH 2.5 的玻尿酸聚集於薄膜表面, 造成極化現象, 使得濾速明顯降低, 即使通入約與液相體積流速相當的空氣流速, 亦無法擾亂邊界層若使用兩相流動超過濾系統中, 藉由調整操作模組的角度, 可利用氣體向上之浮力與液體向下之重力, 通入的空氣可聚集形成 Taylor bubble, 壓縮邊界層, 通透量可提高 13% 由此可知, 以兩相流動超過濾系統濃縮醱酵液玻尿酸時, 有助於形成 Taylor bubble 的操作條件, 可有效地降低濃度極化現象, 提高產物的回收率

6 88 蘇芳儀陳樹人 J v (m 3 /m 2 h) Fig. 7 不同氣體流速對濾出液通量的影響 ( ) 液相流速 35 ml/min, 未通氣 ;( ) 液相流速 75 ml/min, 氣相流速 65 ml/min;( ) 液相流速 35 ml/min, 氣相流速 30 ml/min 參考文獻 [1] K. Meyer and J. W. Palmer, The polysaccharide of the vitreous humor, J. Biol. Chem., 107, (1934). [2] K. Meyer and J. W. Palmer, On glycoproteins: II. The polysaccharides of vitreous humor and of umbilical cord, J. Biol. Chem., 114, (1936). [3] K. Meyer, E. M. Smyth, and M. H. Dawson, The isolation of a mucopolysaccharide from synovial fluid, J. Biol. Chem., 128, (1939). [4] K. Meyer and E. Chaffee, The mucopolysaccharides of skin, J. Biol. Chem., 138, (1941). [5] N. F. Boas, Isolation of hyaluronic acid from the cock's comb, J. Biol. Chem., 186, (1950). [6] Kendall, F. E., M. Heidelberger, and M. H. Dawson, A serologically inactive polysaccharide elaborated by mucoid strains of group A hemolytic streptococcus, J. Biol. Chem., 118, (1937). [7] T. J Liesegang, Viscoelastic substance in ophthalmology, Survey Ophthalmol., 34, (1990). [8] I. F. Radaeva, G. A. Kostina, and A. V. Zmievskii, Hyaluronic acid: biological role, structure, synthesis, isolation, purification, and applications, Appl. Biochem. Microbiol., 33, (1997). [9] L. Lapčik Jr, L. Lapčik,, S. De Smedt, J. Demeester, and P. Chabreček, Hyaluronan: preparation, structure, properties, and applications, Chem. Rev., 8, (1998). [10] B. Fong Chong, L. M. Blank, R. Mclaughlin, and L. K. Nielsen, Microbial hyaluronic acid production, Appl. Microbiol. Biotechnol., 66, (2005). [11] Kakehi, K., M. Kinoshita, and S.-I. Yasueda, Hyaluronic acid: separation and biological implications, J. Chromatogr. B, 797, (2003). [12] T. Bitter and H. M. Muir, A modified Uronic acid carbazole reation, Anal. Biochem. 4, (1962). [13] T.-W. Cheng, H.-M. Yeh, and J.-H. Wu, Effects of gas slugs and inclination angle on the ultrafiltration flux in tubular membrane module, J. Membr. Sci. 158, (1999).

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.......Z-59-P42 心靈被單蠥 2001 參與者玩布工作坊婦女心靈被單不只是被單蠥還烙印著一群玩布婦女的心靈成長紀錄蠥她們不但在縫補中縫合了命的傷口蠥也玩出草根婦女的命向度受女性主義的啟蒙李元貞是繼七年代為女性平權運動作先鋒的台灣第一位女性主義者呂秀蓮之後以喚醒婦女支援婦女建立平等和諧的兩性社會的另一位婦運領導一九八二年她創辦婦女新知雜誌蠥鼓勵婦女訓練獨立自主的能力蠥積極參與社會文