复方丹参滴丸对胰岛素抵抗大鼠糖脂代谢的影响

复方丹参滴丸对胰岛素抵抗大鼠糖脂代谢的影响 陈频, 徐向进, 史道华 ( 南京军区福州总医院内分泌科, 福建福州 350025) 关键词 : 复方丹参滴丸 ; 吡格列酮 ; 葡萄糖转运蛋白 -4; 脂联素 ; 胰岛素抵抗摘要 : 目的 : 探讨复方丹参滴丸对胰岛素抵抗大鼠糖脂代谢的作用及机制 方法 : 以 SD 大鼠为对象, 隔日 1 次肌注地塞米松 1mg/kg 诱导产生胰岛素抵抗模型, 采用胰岛素敏感性指数评价胰岛素抵抗 大鼠随机分为正常 模型对照 吡格列酮 丹参注射针及复方丹参滴丸浸膏 5 个处理组 给药 8 周后采用 EL ISA 法测定脂联素浓度及实时 PCR 法测定大鼠骨骼肌细胞葡萄糖转运蛋白 -4mRNA 表达 胞膜转位 结果 : 造模成功大鼠胰岛素抵抗指数增加, 脂联素分泌减少, 肌细胞葡萄糖转运蛋白 -4mRNA 的表达及转位明显降低 而经上述 3 种药物干预后, 大鼠的胰岛素抵抗指数均有不同程度降低, 脂联素分泌及肌细胞葡萄糖转运蛋白 -4mRNA 表达 胞膜转位增强 (P <0.05,P <0.01), 且吡格列酮及复方丹参滴丸浸膏两组间作用无明显差异 ( 均 P>0.05); 丹参注射针作用较弱 ( 均 P <0.05) 结论: 复方丹参滴丸可能通过丹参素调节糖脂代谢, 发挥改善胰岛素抵抗的作用 Effects of Danshen Dripping Pill on glycolipidmetabolism in insulin resistant rats CHEN Pin, XU Xiang-jin, SH IDao-hua (Department of Endocrinology, PLA Fuzhou General Hospital, Fuzhou 350025, China) 批注 [z1]: KEY WORDS: Danshen Dripping Pill; pioglitazone; Glut-4; adponectin; insulin resistance ABSTRACT: AIM: We investigated the effects of Danshen Dripping Pill (DSP) on the glucose metabolism in rats during the insulin resistant (IR) statue. M ETHODS: HOMA-IR was used to show the degree of insulin resistant and Sprague-Dawley rats were randomly divided into 5 groups, normal control, IR control, Pioglitazone (PID), Danse Injection (DSZ) and DSP groups, and the model rats were given dexamethasone to induce the insulin resistant statue. After being treated for 8 weeks, the serum adiponectin concentration and the relative expression amount of Glut-4 mrna in skeletal muscles were detected by EL ISA and real time PCR, respectively. RESULTS: The insulin resistant model rats induced by dexamethasone had a series of characters with the high level of HOMA-IR, and the serum adiponectin concentration was decreased, the Glut-4 mrna relative expression amount in skeletal muscle cell and its translocation on the plasma membrane were inhibited. The effects of dexamethasone were significantly reversed by PID, DSZ

and DSP, respectively(p <0.05,P <0.01). The difference of effects between PID and DSP had no significance, however the effects of DSZ were weaker than that of PID and DSP (P <0.05). CONCLUSION: It suggests that Danshen Dripping Pill can reverse the insulin resistance in rats induced by dexamethasone, the mechanism may be involved in increasing adponectin, promoting the expression of Glut-4 mrna in skeletal muscle cell and its translocation on the plasma membrane, and then in enhancing the insulin sensitivity. 胰岛素抵抗 (IR) 的发生与脂肪因子分泌异常及胰岛素受体后信号传导缺陷密切相 [1] 关 脂联素(ADPN) 促进骨骼肌细胞葡萄糖转运蛋白 4(Glut-4) 的表达及转位, 是唯一与 [2] IR 程度呈负相关的脂肪细胞因子 现代中药研发提示活血化瘀方剂具有改善胰岛素抵 [3] 抗的潜在作用 复方丹参滴丸(DSP) 由丹参 三七 冰片组成, 可清除自由基抗氧化 改善血管内皮功能 抑制血管平滑肌细胞增殖, 本研究通过观察 DSP 干预对胰岛素抵抗大鼠 HOMA-IR 血清 ADPN 浓度及骨骼肌细胞 Glut-4 mrna 表达 胞膜转位的影响, 从糖脂代谢角度探讨复方丹参滴丸改善 IR 的作用及机制 1 材料与方法 1. 1 胰岛素抵抗大鼠模型的建立和分组 SPF 级 SD 大鼠隔日 1 次肌注地塞米松磷酸钠注射液 1mg/kg 建立胰岛素抵抗模型, 并随机分为正常对照组 (NC) 模型对照组(IR) 吡格列酮组 (PID, 江苏恒瑞医药股份有限公司, 批号 06042951,20mg/kg) 丹参注射针组 (DSZ, 上海第一生化药业有限公司, 批号 060301,12.5mL/kg) 及复方丹参滴丸浸膏组 (DSP, 天津天士力制药集团有限公司,0.5g/kg), 每组 5 只 同时 NC 和 IR 组予同容积生理盐水 给药 8 周后, 心脏采血及剪取骨骼肌组织冻存于 -80.0 冰箱 1. 2 取冻存的骨骼肌 10g 在冰点 Hanks 液中进行匀浆, 匀浆液以 1000r/min 的转速离心 10min, 弃去微粒子物质 上清液 40000r/min,4 离心 1h, 结果得到的超浮游物 ( 上清 ) 代表细胞内的分离成分 ; 片状沉淀物在 0 Hanks 液中超声萃取 1sec, 共 7 次, 再 [4,5] 40000r/min,4 离心 1h 此时得到的上清液即含提取的膜成分 1. 3 血糖和总胆固醇 甘油三酯检测血糖采用己糖激酶法, 总胆固醇 甘油三酯为脂酶法, 自动生化仪测定 1. 4 胰岛素检测放射免疫法, 自动放射免疫仪测定 1. 5 指数的计算 HOMA 模型胰岛素抵抗指数 (HOMA-IR)= 空腹胰岛素 (FINS) 空腹血糖 (FPG)/22.5; 胰岛素敏感指数 (ISI)=1/(FINS FPG) [6] 1. 6 脂联素检测酶联免疫吸附法 (Chemicon 公司, 大鼠试剂盒, 批号 0611045021) 1. 7 实时 PCR 检测 Corbett Research 公司 RotorGene 3000 Real time PCR 仪检测大鼠骨骼肌细胞总 Glut-4 及胞膜 Glut-4mRNA 表达 Glut-4 基因引物 Sense:5 -GGCTGTGAGTGAGTGCTTT-3,Antisense:5 -GGTTTCTGCTCCCTATCGTA-3 每组各设 3

孔, 反应条件 :94, 预变性 5min; 按 94 20sec,60 20sec,72 20sec, 共 35 个循环 ;87.5 收集荧光 10s 根据绘制的梯度稀释 DNA 标准曲线, 每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度即为此样品目的基因校正后的相对含量 1. 8 统计学分析成组数据用均数 ± 标准差 ( x ±s) 表示, 统计学处理使用 SPSS11.0 统计软件, 组间差异比较采用单因素的方差分析, 两样本均数比较采用 Student s t 检验 2 结果 2. 1 各组大鼠 FPG FINS HOMA-IR ISI 水平测定模型对照 FPG FINS HOMA-IR 较正常对照组明显增加 (P<0.05 或 P<0.01),ISI 较正常对照组明显降低 (P<0.05) 吡格列酮干预组 FPG FINS HOMA-IR 较模型对照组明显降低 (P<0.05 或 P<0.01),ISI 较模型对照组明显增加 (P<0.05) 复方丹参滴丸及丹参注射针干预组 FPG HOMA-IR 较模型对照组明显降低 (P<0.05),ISI 较模型对照组明显增加 (P<0.05),FINS 与模型对照组无明显差异 (P>0.05) 且复方丹参滴丸与吡格列酮两干预组的作用比较无明显差异 (P>0.05) 但丹参注射针与吡格列酮相比较作用则较弱 (P<0.05, 表 1) 表 1 各组大鼠 FPG FINS HOMA-IR ISI 的水平 ( x ±s) (n=5) 组别 FPG FINS /mmol/l /mu/l HOMA-IR ISI NC 4.42±0.60 165±19.0 3.47±0.20-6.58±0.20 IR 6.44±0.19 b 305±21.3 c 4.57±0.07 b -7.58±0.07 b IR+PIO 4.81±0.60 e 176±40.1 f 3.41±0.28 e -6.53±0.28 e IR+DSZ 5.80±0.32 eh 290±33.1 h 3.94±0.15 eh -6.98±0.15 eh IR+DSP 5.04±0.40 e 197±46.4 e 3.58±0.19 e -6.76±0.19 e 注 : 与正常对照组比较, b P <0.05, c P <0.01; 与模型对照组比较, e P <0.05, f P <0.01; 与吡格列酮组比较, h P <0.05 2. 2 各组大鼠 BW TC TG ADPN 水平测定模型对照组 TC TG 较正常对照组明显增加 (P <0.05);BW ADPN 较正常对照组明显降低 (P <0.01) 吡格列酮干预组 TC TG 较模型对照组明显降低 (P <0.05);BW ADPN 较模型对照组明显增加 (P <0.05) 复方丹参滴丸组对 BW TC TG 及 ADPN 的影响与吡格列酮组相同, 且两组间无明显差异 (P >0.05) 丹参注射针组 BW ADPN 较模型对照组明显增加 (P <0.05),TC TG 较模型对照组明显降低 (P <0.05) 其中 TC TG 与吡格列酮组无明显差异 (P >0.05),BW ADPN 与吡格列酮组有明显差异 (P <0.05, 表 2) 表 2 各组大鼠 BW TC TG ADPN 的水平 ( x ±s) (n=5) 组别 BW /g TC /mmol/l TG /mmol/l ADPN /ng/ml

NC 568±28.6 1.36±0.11 0.28±0.03 9.18±0.40 IR 308±25.9 c 2.50±0.29 b 0.90±0.16 b 5.06±0.52 c IR+PID 394±41.6 e 1.17±0.29 e 0.42±0.19 e 7.90±0.32 e IR+DSZ 352±43.2 eh 1.42±0.25 e 0.34±0.09 e 6.64±0.50 eh IR+DSP 386±30.5 e 1.30±0.19 e 0.50±0.24 e 7.83±0.42 e 注 : 与正常对照组比较, b P <0.05, c P <0.01; 与模型对照组比较, e P <0.05; 与吡格列酮组比较, h P <0.05 2. 3 各组骨骼肌细胞的总 Glut-4 及胞膜 Glut-4 mrna 表达模型对照组骨骼肌细胞的总 Glut-4 及胞膜 Glut-4 mrna 表达量均较正常对照组明显降低 (P <0.01) 丹参针注射液 复方丹参滴丸及吡格列酮等 3 个干预组细胞总 Glut-4 及胞膜 Glut-4 mrna 表达量均较模型对照组明显增加, (P <0.05 或 P <0.01), 且复方丹参滴丸及吡格列酮两组间无明显差异 (P >0.05) 丹参针注射液及吡格列酮两组间有明显差异 (P >0.05, 图 1 及图 2) 图 1 复方丹参滴丸对大鼠骨骼肌细胞总 Glut-4 mrna 表达的影响 (n=5) 注 : 与正常对照组比较, c P <0.01; 与模型对照组比较, e P <0.05, f P<0.01; 与吡格列酮组比较, h P <0.05 图 2 复方丹参滴丸对大鼠骨骼肌胞膜 Glut-4 mrna 表达的影响 (n=5) 注 : 与正常对照组比较, c P <0.01; 与模型对照组比较, f P <0.01; 与吡格列酮组比较, h P <0.05 3 讨论 糖皮质激素是用于研究 IR 的重要激素 [7-9] 文献报道, 地塞米松 (DEX) 能引起大鼠产生

IR 状态 大鼠 FBG 和 FINS 水平伴随着 DEX 给药时间及剂量而递增,DEX 1mg/kg 隔日肌注 1 周 即出现糖耐量损害和高 FINS 血症的 IR 模型, 因成模容易而被用于筛选胰岛素增敏剂 本研究观察到 DEX 诱导后, 大鼠 TC TG 及 HOMA-IR 指数明显增高, 而 BW ISI 明显降低, 表明 IR 模型复制成功 目前 IR 机制研究中脂联素异常分泌备受关注 脂联素可调节糖脂代谢, 具有改善胰岛素抵抗 抗炎 抗动脉粥样硬化等多种功能 正常人血浆脂联素浓度 1.9~17.0mg/L, [10~13] 胰岛素抵抗状态下脂联素分泌水平明显降低 与肥胖和葡萄糖耐量程度相比, 血浆 [10,14] 低脂联素水平与胰岛素抵抗和高胰岛素血症更相关 更具有统计学意义 在 IR 遗传倾向的恒河猴发展为 2 型糖尿病的动物研究过程中, 观察到血浆脂联素水平的下降程度 [15] 与胰岛素抵抗 糖尿病的进展呈正相关, 胰岛素抵抗越严重, 血浆脂联素水平越低 敲除脂联素基因大鼠的实验表明基因缺陷大鼠可引发 IR, 而经补充外源性脂联素或其球状结构域后能通过抑制肿瘤坏死因子 -α 改善胰岛素受体后信号传导, 促进骨骼肌细胞总 Glut-4 表达及胞膜转位, 抑制肝糖输出 改善肌肉中脂质代谢提高胰岛素敏感性, 降低 [16,17] 血糖和血脂, 证实了脂联素可以作为内源性胰岛素增敏因子, 有效地预测 防治胰岛素抵抗的发生 发展 噻唑烷二酮类药 (TZDs) 是目前有效的 IR 干预药物 TZDs 激活 PPARr 后, 不仅促进脂肪细胞分化, 清除游离脂肪酸, 增强脂肪酸氧化, 调节血脂 ; 且通过抑制肿瘤坏死因子 -α 水 [18] 平及活性以时间和剂量依赖性方式明显增强脂联素表达及分泌, 增强骨骼肌 Glut-4 的 [19,20] 表达和转位促进葡萄糖转运和利用, 实现不影响 β 细胞分泌功能的胰岛素增敏作用 本研究结果亦表明吡格列酮干预后,IR 大鼠胰岛素抵抗指数下降, 血浆脂联素水平明显增加, 骨骼肌中胰岛素诱导的 Glut-4 的表达和转位增加 但 TZDs 存在严重不良反应, 如增加血容量 加重水肿 引发充血性心衰等, 限制了临床应用 已有的药理研究表明, 复方丹参滴丸具有改善胰岛素抵抗的潜在作用 它通过抑制 [21,22] 交感神经活性, 减弱肾素 - 血管紧张素系统作用, 扩张血管 降低血压 ; 影响多种凝血 [23] 因子, 降低血液黏稠度, 抑制血小板活化, 改善纤溶活性及微循环, 抑制钙内流降低脂 [24,25] 氧化酶活性及提高超氧化物歧化酶活性, 影响血脂的转化和清除 冠心病患者经 DSP 干预后, 动脉斑块面积 内膜增生程度明显减轻, 内膜中平滑肌细胞和纤维组织亦减少, [26~28] 血管腔狭窄程度减轻, 动脉舒张功能改善, 血管内皮素分泌减少 损伤的人脐静脉内皮细胞模型研究中提示 DSP 干预可改善损伤后的细胞活性, 双向调节一氧化氮产生而改 [29,30] [31] 善胰岛素抵抗 在长达 6 个月的高脂喂养复制胰岛素抵抗大犬模型实验中, 观察到实验大犬经 DSP 干预后, 通过抑制脂质过氧化产物生成 抑制氧化应激反应, 保护肝细胞从而明显增加胰岛素敏感性 另一试验亦提示采用 DSP 对早期糖尿病肾脏损害的大鼠干 [32] 预治疗 12 周, 观察 DSP 具有减少尿微量白蛋白, 保护肾功能的作用 从我们的研究中观察到 IR 模型大鼠经复方丹参滴丸浸膏干预后, 胰岛素抵抗各项指征有不同程度的改善, 血浆脂联素水平增加, 促进骨骼肌 Glut-4 mrna 表达和转位, 且与吡格列酮组相比较, 两组作用无统计学差异, 表明复方丹参滴丸浸膏具有较强的改善胰岛素抵抗作用

本研究结果还显示,IR 模型大鼠经丹参注射针干预后, 胰岛素抵抗指征亦有改善, 同样可增加血浆脂联素水平及骨骼肌中胰岛素诱导的 Glut-4 的表达和转位, 但其作用强度弱于复方丹参滴丸 因而我们推测复方丹参滴丸可能通过其单体丹参素促进脂联素分泌, 上调 Glut 4-mRNA 表达, 调节糖脂代谢, 发挥改善胰岛素抵抗的作用 ; 辅于三七 冰片的协同效应, 复方浸膏制剂的药理作用明显优于丹参 复方丹参滴丸作为我国第一个通过美国 FDA 临床 [3] 试验许可 (IND) 审查的中药复方制剂, 值得进一步研究其改善胰岛素抵抗的精确机制 参考文献 : [1] Reaven GM. Role of insulin resistance in human disease [J].Diabetes, 1988,37(12):1595-1607. [2] Maeda N, TakahashiM, Funahashi T, et al. PPARgamma ligands increase expression and plasma concentrations of adiponectin, an adipose-derived protein [J]. Diabetes,2001,50(9):2094-2099. [3] 郭治昕. 复方丹参滴丸的中药现代化研究 [J]. 中国中医药信息杂志,2000,7(4):14-15. [4] Huisamen B, van ZylM, KeyserA, et al. The effects of insulin and beta-adrenergic stimulation on glucose transport, glut 4 and PKB activation in the myocardium of lean and obese non-insulin dependent diabetes mellitus rats [J]. Mol Cell Biochem, 2001,223(122):15-25. [5] 陈小琳, 毕会民. 罗格列酮及饮食干预对胰岛素抵抗大鼠骨骼肌 GLUT4 转位的影响 [J]. 中国医师杂志,2004,6(3):337-339. [6] 李光伟. 检测人群胰岛素敏感性的一项新指数 [J]. 中华内科杂志,2000,3(2):10-12. [7] Severino C, Brizzi P, Solinas A, et al. Low-dose dexamethasone in the rat: a model to study insulin resistance [J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2002,283(2):E367-373. [8] Buren J, Liu HX, Jensen J, et al. Dexamethasone impairs insulin signalling and glucose transport by dep letion of insulin receptor substrate-1, phosphatidylinositol 3-kinase and protein kinase B in primary cultured rat adipocytes [J]. Eur J Endocrinol, 2002,146(3):419-429. [9] Tappy L, Randin D, Vollenweider P, et al. Mechanisms of dexamethasone-induced insulin resistance in healthy humans [J].J Clin Endocrinol Metab, 1994, 79(4): 1063-1069. [10] Pellme F, Smith U, Funahashi T, et al. Circulating adiponectin levels are reduced in nonobese but insulin-resistant first-degree relatives of type 2 diabetic patients [J].D iabetes, 2003, 52(5): 1182-1186.

[11] Yokoyama H, EmotoM, Mori K, et al. Plasma adiponectin level is associated with insulin-stimulated nonoxidative glucose disposal [J]. J Clin Endocrinol Metab, 2006,91(1):290-294. [12] WinzellMS, Nogueiras R, Dieguez C, et al. Dual action of adiponectin on insulin secretion in insulin-resistant mice [J].Biochem Biophys Res Comm un, 2004,321(1):154-160. [13] Pannacciulli N, Bunt JC, Ortega E, et al. Lower total fasting plasma adiponectin concentrations are associated with higher metabolic rates [J]. J Clin EndocrinolMetab, 2006,91(4):1600-1603. [14] Weyer C, Funahashi T, Tanaka S, et al. Hypoadiponectinemia in obesity and type 2 diabetes: close association with insulin resistance and hyperinsulinemia [J]. J Clin Endocrinol M etab, 2001,86(5):1930-1935. [15] Hotta K, Funahashi T, Bodkin NL, et al. Circulating concentrations of the adipocyte protein adiponectin are decreased in parallel with reduced insulin sensitivity during the progression to type 2 diabetes in rhesus monkeys [J]. Diabetes, 2001,50(5):1126-1133. [16] Hug C, Lodish HF. The role of the adipocyte hormone adiponectin in cardiovascular disease [J]. Curr Opin Pharmacol, 2005,5(2):129-134. [17] Kobayashi K, Inoguchi T, Sonoda N, et al. Adiponectin inhibits the binding of low-density lipop rotein to biglycan, a vascular proteoglycan [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005,335(1):66-70. [18] Fasshauer M, Klein J, Neumann S, et al. Hormonal regulation of adiponectin gene expression in 3T3-L1 adipocytes [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2002, 290(3):1084-1089. [19] Hallsten K, Virtanen KA, Lonnqvist F, et al. Rosiglitazone but not metform in enhances insulin and exercise-stimulated skeletal muscle glucose up take in patients with newly diagnosed type 2 diabetes [J]. Diabetes, 2002, 51(12): 3479-3485. [20] 李延兵, 廖志红, 黄知敏, 等. 吡格列酮和二甲双胍对 2 型糖尿病胰岛素抵抗的影响 [J]. 中华内分泌代谢杂志,2004,20:30-32. [21] 刘志扬. 复方丹参滴丸对 2 型糖尿病合并微血管病变的临床观察 [J]. 中国血液流变学杂志, 2004,14(2):197-203. [22] 王玉鹏. 复方丹参滴丸治疗冠心病的作用机制研究 [J]. 安徽中医临床杂志, 2001, 13(4):251-252. [23] 周玉珍, 王春芝, 丁勇民. 复方丹参滴丸对脑血流动力学影响的自身对照比较 [J]. 中国临床康复, 2006, 10(23):167-169.

[24] 王山岭, 王丽霞, 孙月和. 复方丹参滴丸对不稳定型心绞痛患者血小板活化及纤溶活性的影响 [J]. 中国心血管杂志,2003,8(5):354-356. [25] 田季雨, 陈建宗, 顾宜, 等. 复方丹参滴丸对家兔血脂水平和颈动脉粥样硬化斑块的影响 [J]. 中国临床康复, 2004,8(9):1708-1709. [26] 马晓静, 张兴华, 马红军, 等. 复方丹参滴丸对球囊损伤血管内膜增生修复的影响 [J]. 临床心血管病杂志,2006,22(7):437-438. [27] 葛玉霞, 段云友, 阮骊韬, 等. 复方丹参滴丸对血管内皮功能的保护作用 [J]. 中国临床康复, 2004,8(6):1096-1097. [28] 刘慧, 胡永寸, 陈俭. 复方丹参滴丸对血浆内皮功能的保护作用 [J]. 天津药学, 2003,15(2):39-40. [29] 王东霞, 王孝铭, 许晶兰. 复方丹参滴丸对人血管内皮细胞功能及形态保护作用的研究 [J]. 中国病理生理杂志, 2006,22(5):933-937. [30] 许晶兰, 王孝铭, 王东霞. 复方丹参滴丸对过氧化氢损伤的人脐静脉血管内皮细胞的保护作用 [J]. 中国病理生理杂志,2006,22(5):929-932. [31] 张雷, 孙智才, 李惠敏, 等. 复方丹参滴丸对胰岛素抵抗犬肝脏保护作用研究 [J]. 国际医药卫生导报, 2005,22(22):9-12. [32] 李佑生, 王文健, 马宇滢, 等. 复方丹参滴丸防治大鼠早期糖尿病肾脏损害的研究 [J]. 中成药,2007,29(1):40-44