标题

第 39 卷第 6 期 Vol. 39 No. 6 摇 摇 摇 摇 中南医学科学杂志 Journal of Medical Science in Central South China 2011 年 11 月 Nov. 2011 沙眼衣原体 T 细胞抗原 CT143 原核表达 纯化及免疫活性鉴定 陆春雪1,吴移谋1,彭摇 波2,刘良专1,蔡恒玲1,李忠玉1 (1. 南华大学 微生物与免疫学教研室,湖南 衡阳 421001;2. 南华大学 肿瘤研究所) 摘摇 要:摇 目的摇 克隆沙眼衣原体( Chlamydia trachomatis,ct) T 细胞抗原 Ct143 基因,表达并纯化该蛋白,检 测其免疫活性 摇 方法摇 采用 PCR 技术从 Ct 基因组中扩增 Ct143 基因,并构建 pgex鄄6p鄄ct143 原核表达质粒,转 化 E. coli XL1鄄Blue,IPTG 诱导重组 GST鄄CT143 融合蛋白表达,经酶切后得到无 GST 标签的纯蛋白免疫 Balb / c 鼠, ELISA 及 Western鄄blot 分析 CT143 蛋白免疫原性及免疫反应性 摇 结果摇 成功构建了 pgex鄄6p鄄ct143 原核表达质 粒,序列测定证实重组质粒插入片段与 GenBank 登陆的 Ct D 型一致,长度为 843 bp;gst鄄ct143 融合蛋白在 E. coli 中获得稳定高效表达;纯蛋白与佐剂混匀后肌肉免疫小鼠,ELISA 检测免疫小鼠的血清效价为 1 颐 12 800,Western blot 结果表明该蛋白与 Ct 泌尿生殖道感染病人混合血清中 IgG 结合,具有免疫反应性 摇 结论摇 成功克隆表达了 Ct T 细胞抗原 CT143,该抗原经纯化后具有良好的免疫原性及免疫反应性 关键词:摇 沙眼衣原体;摇 CT143;摇 克隆表达;摇 纯化;摇 免疫活性 中图分类号:R374郾 1摇 摇 摇 文献标识码:A摇 摇 摇 文章编号:2095-1116(2011)06-0611 - 04 Cloning Expression,Purification and Antigenicity Analysis of Chlamydia Trachomatis T Cell Antigen CT143 LU Chun鄄xue,WU Yi鄄mou,PENG Bo,et al (Department of Microbiology and Immunology,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China) Abstract:摇 Objective摇 To clone,express and purify the Chlamydia trachomatis T cell antigen CT143 and prelimina鄄 rily characterize the antigenicity of purified recombinant protein. 摇 Methods摇 The ORF of Ct143 was cloned and inserted into the expression vector pgex6p鄄2 to construct pgex鄄6p鄄ct143 recombinant plasmid. The recombinant plasmid was trans鄄 formed into E. coli XL1鄄Blue to express GST鄄CT143 fusion protein,then purified with Glutathione Sepharose 4B Beads and digested with PreScission Protease to remove the GST tag. The pure protein was used to immunize Balb / c mice. ELISA and Western bolt were carried out to identify the immunogenicity and immunoreactivity. 摇 Results摇 The pgex6p鄄ct143 expres鄄 sion plasmid was successfully constructed. DNA sequencing showed that the inserted Ct143 was about 843 bp,encoding a protein with 280 amino acids. CT143 was expressed as GST fusion proteins in E. coli and then successfully cleaved by PreS鄄 cission Protease. The ELISA result showed the specific antibody titer against CT143 reached 1颐 12 800 and the affinity be鄄 tween recombinant CT143 and IgG antibodies from pooled Ct infected patient serum was identified by Western blot. 摇 Con鄄 clusion摇 CT143 protein was successfully expressed and purified in prokaryotic system and the specific anti鄄ct143 antibody was induced in BALB / c mice,which lay a foundation for the further study on CT143 protein function and vaccine develop鄄 ment. Key words:摇 Chlamydia trachomatis;摇 CT143;摇 cloning and expression;摇 purification immunoactivity 收稿日期:2011-09 - 28 基金项目:国家自然科学基金(30970165 81102230) 和衡阳市科技局基金(2008KS30) 资助. 通讯作者:李忠玉,电话:0734-8282907,E鄄mail:lzhy1023@ hotmail. com. 611

摇 摇 沙 眼 衣 原 体 (Chlamydia trachomatis,ct) 是 一 类 专 性 细 胞 内 寄 生 具 有 独 特 发 育 周 期 的 原 核 细 胞 型 微 生 物, 包 括 A B C D 等 19 种 血 清 型, 其 中 K ~ D 型 可 引 起 泌 尿 生 殖 道 感 染, 据 2001 年 世 界 卫 生 组 织 统 计,Ct 泌 尿 生 殖 道 感 染 每 年 新 发 病 例 约 为 9 000 万, 已 超 过 淋 病 每 年 新 发 病 例 数 (6 000 万 ) 而 成 为 性 传 播 疾 病 的 主 要 病 原 体 之 一 [1] 流 行 病 学 调 查 结 果 显 示, 衣 原 体 感 染 存 在 大 量 的 无 症 状 或 微 症 状 患 者, 通 常 不 被 发 现 或 不 被 治 疗, 可 持 续 存 在 数 月 至 数 年, 最 终 引 起 严 重 并 发 症, 如 盆 腔 炎 不 孕 异 位 妊 娠 宫 颈 鳞 状 细 胞 癌 等, 构 成 了 衣 原 体 感 染 的 高 发 病 率 和 沉 重 的 社 会 经 济 负 担 [2,3] 20 世 纪 90 年 代, 西 方 发 达 国 家 试 图 通 过 Ct 筛 查 及 早 期 抗 生 素 治 疗 等 措 施 控 制 Ct 感 染, 曾 短 期 降 低 感 染 率 达 50% 以 上, 但 因 抗 生 素 的 干 预 抑 制 了 衣 原 体 自 然 感 染 保 护 性 免 疫 应 答 的 产 生, 致 使 再 次 感 染 病 例 数 显 著 增 加 [4] 因 此 研 制 出 新 型 有 效 的 Ct 疫 苗 是 预 防 控 制 Ct 疾 病 的 关 键 本 研 究 采 用 基 因 重 组 技 术 将 Ct T 细 胞 抗 原 CT143 基 因 定 向 克 隆 到 原 核 表 达 载 体 pgex 鄄 6p, 再 将 重 组 质 粒 转 化 E. coli XL1 鄄 Blue, 实 现 了 CT143 在 E. coli 中 高 效 表 达, 并 对 表 达 的 蛋 白 进 行 纯 化 及 免 疫 活 性 分 析, 为 研 究 Ct T 细 胞 抗 原 的 结 构 与 功 能 研 制 基 因 工 程 疫 苗 奠 定 理 论 和 实 验 基 础 1 摇 材 料 与 方 法 1. 1 摇 材 料 摇 摇 Ct D 标 准 株 D / UW 鄄 3 / CX 基 因 组 DNA 模 板 pgex 鄄 6p 原 核 表 达 载 体 E. coli XL1 鄄 Blue Ct 泌 尿 生 殖 道 感 染 患 者 血 清 和 健 康 无 感 染 者 血 清 样 本 Balb / c 小 鼠 均 由 美 国 德 克 萨 斯 大 学 圣 安 东 尼 奥 健 康 科 学 中 心 钟 光 明 教 授 实 验 室 提 供 Pfx DNA 聚 合 酶 BamH 玉 Not 玉 限 制 性 内 切 酶 等 均 购 自 Invitrogen 公 司,Glutathi 鄄 one Sepharose 4B Beads 为 Invitrogen 公 司 产 品 ;PreS 鄄 cission Protease(GST 融 合 蛋 白 剪 切 酶 ) 为 GE health 鄄 care 公 司 产 品,HRP 标 记 羊 抗 鼠 IgG 羊 抗 人 IgG 均 购 自 Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc 1. 2 摇 CT143 基 因 序 列 分 析 和 特 异 性 引 物 的 设 计 合 成 从 GenBank ( http: 椅 www. ncbi. nlm. nih. gov / Entrez) 获 取 D 标 准 株 CT143 基 因 全 长 序 列 ( GI: 15604862), 应 用 primer5. 0 软 件 设 计 并 合 成 一 对 特 异 性 引 物, 并 在 上 游 下 游 引 物 中 分 别 引 入 BamHI NotI 限 制 性 酶 切 位 点 及 保 护 性 碱 基 引 物 如 下 ( 下 划 线 为 酶 切 位 点 ):5 忆 鄄 CG 鄄 GGATCC 鄄 ATG AAA AAG 612 TTT GCT ACT TTC CT 鄄 3 忆 ; 5 忆 鄄 TTT TCC TTT T 鄄 GC GGCCGC 鄄 TTA 鄄 AAG ATT TGA TTG GAA ATG CG 鄄 3 忆 1. 3 摇 pgex 鄄 6p 鄄 CT143 原 核 表 达 质 粒 的 构 建 及 鉴 定 以 D 标 准 株 D / UW 鄄 3 / CX 基 因 组 DNA 为 模 板, PCR 法 扩 增 CT143 编 码 基 因 ; 扩 增 产 物 经 1. 0% 琼 脂 糖 电 泳 鉴 定 其 结 果 ; 应 用 PCR 快 速 纯 化 试 剂 盒 纯 化 回 收 PCR 产 物 纯 化 产 物 经 BamH 玉 Not 玉 双 酶 切 后 16 益 连 接 到 原 核 表 达 载 体 pgex 鄄 6p 鄄 2 上, 转 化 E. coli XL1 鄄 Blue 氨 苄 抗 性 平 板 筛 选 转 化 成 功 的 菌 株, 挑 取 单 个 菌 落 进 行 PCR 鉴 定 及 序 列 测 定 1. 4 摇 pgex 鄄 6p 鄄 CT143 重 组 质 粒 融 合 蛋 白 的 表 达 和 纯 化 将 鉴 定 后 的 阳 性 克 隆 接 种 于 3 ml 含 100 滋 g / ml 氨 苄 的 LB 培 养 液 中,37 益 摇 床 培 养 过 夜 次 日 以 1 颐 100 的 比 例 扩 大 培 养, 并 加 入 IPTG ( 终 浓 度 为 0. 2 mmol / L)30 益 诱 导 表 达 低 速 离 心 收 集 细 菌, 超 声 破 菌 后 高 速 离 心, 上 清 与 Glutathione Sepharose 4B Beads 室 温 结 合 1 h 后, 用 特 异 性 的 GST 融 合 蛋 白 剪 切 酶 ( 该 酶 特 异 性 结 合 Beads 并 精 确 剪 切 GST 标 签 与 目 的 蛋 白 间 LeuGluValLeuPheGlnGlyPro 基 序 的 Gln 鄄 Gly 残 基 ) 室 温 作 用 Beads 2 h, 离 心 收 集 酶 切 后 的 上 清 液 ( 主 要 含 酶 切 后 的 目 的 蛋 白 ) 及 Beads 洗 脱 液 ( 非 特 异 性 结 合 的 酶 切 后 目 的 蛋 白 ), 最 后 采 用 超 滤 离 心 管 (Millipore,Billerica,MA) 离 心 浓 缩, 获 得 纯 化 的 无 GST 标 签 纯 蛋 白 蛋 白 经 12% SDS 鄄 PAGE 电 泳 分 析, 观 察 其 表 达 情 况 和 纯 化 效 果 1. 5 摇 动 物 免 疫 以 50 滋 L 无 GST 标 签 的 CT143 纯 蛋 白 (40 滋 g) 与 等 体 积 的 弗 氏 不 完 全 佐 剂 (IFA) 超 声 乳 化 后, 行 Balb / c 小 鼠 两 侧 臀 部 肌 肉 注 射, 初 次 免 疫 后 的 第 14 天 和 第 28 天, 再 分 别 用 20 滋 g 纯 化 蛋 白 与 等 体 积 弗 氏 不 完 全 佐 剂 超 声 乳 化 后 进 行 第 2 次 和 第 3 次 免 疫 实 验 过 程 中 同 时 设 定 PBS 免 疫 组 为 对 照 组, 以 相 同 的 方 式 进 行 免 疫 小 鼠 在 每 次 免 疫 前 及 最 后 1 次 免 疫 后 2 周, 尾 静 脉 采 血, 分 离 血 清, - 80 益 保 存 备 用 1. 6 摇 ELISA 测 定 抗 体 滴 度 采 用 间 接 ELISA 法 测 定 小 鼠 血 清 特 异 性 抗 体 滴 度 以 100 滋 L 无 GST 标 签 的 CT143 纯 化 蛋 白 10 滋 g / ml 包 被 酶 标 板,4 益 过 夜,10% BSA 室 温 封 闭 1 h, 加 入 倍 比 稀 释 的 不 同 浓 度 的 待 测 免 疫 血 清,37 益 孵 育 1 h,0. 05% PBST 洗 涤 3 次 后 分 别 加 入 1 颐 2 000 稀 释 的 HRP 标 记 的 羊 抗 鼠 IgG 孵 育, 加 入 显 色 剂 ABTS,37 益 避 光 反 应 10 min 后 用 10% SDS 20 滋 L / 孔 终 止 反 应, 酶 标 仪 读 取 405 nm 波 长 的 OD 值

1. 7摇 重组 CT143 蛋白的免疫活性测定 先将蛋白 Marker 纯化好的无 GST 标签 CT143 蛋白及 pgex6p鄄2 空质粒表达纯化产物进行 12% SDS鄄PAGE,然后在 200 V 条件下进行 SDS鄄PAGE 转 膜 10 份沙眼衣原体泌尿生殖道感染患者的混合 血清作为一抗,HRP鄄羊抗人 IgG 作为二抗,5 名健康 人混合血清作为阴性对照,进行 Western blot 分析, 鉴定 CT143 蛋白免疫反应性 图 1摇 CT143 基因 PCR 扩增产物 2摇 结摇 摇 果 1:1 kb DNA 标准分子量;2:CT143 基因 PCR 产物;3:阴性对照 2. 1摇 pgex鄄6p鄄ct143 原核表达质粒的构建 Glutathione Sepharose 4B beads 纯化得到 GST鄄CT143 产物:M1鄄D280),1% 琼脂糖凝胶电泳,结果如图 1 将表达产物 酶切后上清 Beads 洗脱液及酶切后的 摇 摇 PCR 扩增 Ct D 血清型 CT143 全长基因( 编码 所示,扩增片段长度约为 869 bp,与预期结果一致 ( 含酶切位点及保护碱基序列) 经 BamH玉和 Not 玉双酶切重组质粒以及对测序结果的 BLAST 分析 证实克隆质粒序列完全正确 2. 2摇 pgex鄄6p鄄ct143 重组质粒融合蛋白的表达与 纯化 重组质粒转化的 E. coli XL1鄄Blue,表达产物经 融合蛋白,纯化的融合蛋白再经酶切进一步纯化 Beads 均用 12% SDS鄄PAGE 胶电泳分析,考马斯亮 蓝染色结 果 如 图 2A 所 示, 在 相 对 分 子 质 量 约 57 kda 处可见一清晰蛋白条带,与预测 GST鄄CT143 融 合蛋 白 分 子 量 相 符 ( GST 相 对 分 子 质 量 26 kda, CT143 相对分子质量约 31 kda) 酶切后无 GST 标 签的纯化蛋白 CT143 大量存在于酶切上清及洗脱 液中,经浓缩后结果见图 2B 图 2摇 GST鄄CT143 融合蛋白表达及纯化产物 A:GST鄄CT143 融合蛋白表达及纯化过程中各步骤产物;1:蛋白标准分子量;2:未经酶切的 GST鄄CT143 融合蛋白;3:酶切后的上清; 4:洗脱液 1;5:洗脱液 2;6:洗脱液 3;7:酶切后的 CST鄄CT143 融合蛋白. 摇 B:无 GST 标签 CT143 蛋白纯化终产物;1:蛋白标准分子量; 2:2 滋L 纯化蛋白;3:0郾 2 滋L 纯化蛋白;4:0郾 02 滋L 纯化蛋白 2. 3摇 小鼠血清抗 CT143 特异性 IgG 的检测 CT143 蛋白作为检测抗原, 包被酶标板, 间接 ELISA 法对 0 14 28 42 天收集的小鼠实验组和对 照组血清中抗 CT143 特异性抗体 IgG 进行检测,405 种次数的增多抗体滴度逐渐升高,最高抗体滴度达 1颐 12 800( 图 3) 2. 4摇 重组蛋白 CT143 的免疫活性鉴定 Western blot 结果显示,10 份沙眼衣原体泌尿生殖 nm 吸光值实验组 / 对照组大于 2 为阳性反应,抗体 感染病人的混合血清在约 31 kda(ct143 蛋白)处有一 显示 CT143 蛋白可刺激小鼠产生免疫反应,随着接 重组 CT143 抗原与抗体有很好的反应活性(图 4) 反应呈阳性时的最高血清稀释度即抗体滴度 结果 明显条带,5 份健康人混合血清没有特异性条带,表明 613

细胞因子 IFN鄄酌 产生 本课题组随即用 99 份沙眼 衣原体泌尿生殖道感染患者血清对这 8 个 T 细胞抗 原的 Ct 同源物进行筛查,发现仅衣原体属特异性抗 原 TC0420( Ct 血清型同源物为 CT143) 能被患者血 清优势识别 [9],提示 T 细胞抗原 CT143 作为一种新 的免疫优势原可能为人类 Ct 疫苗的研制提供一个 新的潜在的靶标 本研究采用 PCR 法从 Ct D 标 准 株 D / UW鄄3 / 图 3摇 抗 CT143 特异性抗体水平动态变化 CX 基因组 DNA 模板扩增 Ct143 全长编码基因,核 苷酸序列测定证实扩增的目的基因与 GenBank 登 陆的基因序列完全一致 为高效表达并纯化 CT143 蛋白,本实验选取了带有强的启动子及 lac 操纵基 因 SD 序列 lacl 阻遏蛋白基因等的 pgex6p鄄2 作为 表达载体,该载体系统可高效表达 GST 融合蛋白, 且表达的融合蛋白可通过谷胱甘肽一琼脂糖柱进行 亲和层 析, 再 用 PreScission Protease 精 确 剪 切 GST 标签与目的蛋白间 LeuGluValLeuPheGlnGlyPro 基序 的 Gln鄄Gly 残基获得目的蛋白 [10] 该系统已被广泛 地应用于科研及工业领域,尤其在蛋白质分离纯化 膜蛋白结构研究 蛋白质生理功能研究等方面有着 图 4摇 CT143 蛋白的免疫印迹分析 1:CT143 蛋白纯化产物;2:pGEX6p鄄2 空质粒纯化产物 3摇 讨摇 摇 论 沙眼衣原体疫苗尽管经过了几十年的研究,但 目前仍没有成熟的疫苗问世 早期的 Ct 全菌灭活 疫苗,在人和猴免疫接种后可获得部分保护,但保护 作用不完全且保护时间短,更为严重的是机体再感 染时易引起严重的免疫病理反应 [5] 随着基因工 重要作用 [11,12] 本实验通过基因重组技术成功构 建了 pgex鄄6p鄄ct143 重组质粒,在 E. coli 中高效表 达并最终获得了无 GST 标签的目的蛋白,动物免疫 后可刺激小鼠产生强烈的体液免疫反应,其特异性 抗体滴度达 1颐 12 800;Western Blot 分析显示 CT143 抗原与 Ct 泌尿生殖道感染患者混合血清中的 IgG 有良好的的结合活性,而对健康对照的混合血清没 有结合活性,提示纯化蛋白具有良好的免疫学活性 和抗原特异性,为今后利用 CT143 蛋白研究基因工 程疫苗 Ct 致病机制和免疫诊断试剂奠定了基础 程技术的发展,人们一方面在研制其它类型的疫苗, 同时也致力于改造 Ct 菌体,保留其抗原性而消除超 敏反应 1998 年,Ct D 型全基因组序列测序完成, 极大的推动了 Ct 亚单位疫苗的研制 沙眼衣原体为胞内感染病原菌,对于最理想的 清除生殖道感染而言,CD4 + Th1 细胞和 Th1 型细胞 因子 IFN鄄酌 在介导抗 Ct 免疫方面占有主导地位,因 此能有效刺激机体 CD4 + Th1 细胞反应的 T 细胞抗 原是 Ct 亚单位疫苗研究的关键 [6,7] 免疫蛋白质组 学技术是一种快速 高效筛选免疫原性蛋白的方法, 致谢:摇 本研究部分工作在美国得克萨斯大学 圣安东尼奥健康科学中心微生物学和免疫学系 Dr. Zhong 实验室完成 参考文献: [1] 摇 Starnbach MN,Roan NR. Conquering sexually transmitted diseases[ J]. Nat Rev Immunol,2008,8(4) :313鄄317. [2] 摇 Anttila T,Saikku P,Koskela P,et al. Serotypes of Chlamydia trachomatis and risk for development of cervical squamous cell carcinoma[j]. Jama,2001,285(1):47鄄51. 最近加拿大 Karunakaran 等 [8] 采用免疫蛋白质组学 [3] 摇 陈摇 慧,连摇 石. 沙眼衣原体感染与不孕不育的关系 感染的树突状细胞成功鉴定出 8 个 T 细胞抗原,分 [4] 摇 Brunham RC,Pourbohloul B,Mak S,et al. The unexpect鄄 PmpE / F鄄2 和 Gap,并证实能在小鼠体内诱导 Th1 型 ( 下转第 618 页) 技术,从鼠沙眼衣原体( Chlamydia muridarum,cm) 别 是 RplF FabG Aasf PmpG鄄1 TC0420 ClpP鄄1 614 [ J]. 中国计划生育杂志,2011,19(1) :55鄄57. ed impact of a Chlamydia trachomatis infection control

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