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1 中 国 科 学 C 辑 : 生 命 科 学 2009 年 第 39 卷 第 6 期 : 534 ~ life.scichina.com SCIENCE IN CHINA PRESS 人 - 禽 双 价 流 感 新 型 DNA 疫 苗 构 建 及 免 疫 保 护 实 验 研 究 南 文 龙 12, 金 宁 一 2*, 鲁 会 军 2, 赵 翠 青 12, 田 明 尧 12, 张 金 双 12, 白 靓 23, 12 谭 磊 1 吉 林 大 学 农 学 部, 长 春 ; 2 军 事 医 学 科 学 院 11 所, 全 军 基 因 工 程 重 点 实 验 室, 长 春 ; 3 吉 林 大 学 药 学 院, 长 春 * 联 系 人, [email protected] 收 稿 日 期 : ; 接 受 日 期 : 国 家 高 技 术 研 究 发 展 计 划 ( 批 准 号 : 2006AA10A205) 和 国 家 科 技 支 撑 计 划 ( 批 准 号 : 2006BAD06A05) 资 助 项 目 摘 要 流 感 病 毒 是 威 胁 人 类 和 动 物 健 康 的 重 要 病 原. 研 究 表 明, 流 感 大 流 行 株 的 形 成 与 人 流 感 和 禽 流 感 毒 株 基 因 重 配 密 切 相 关. 因 此 在 目 前 流 感 流 行 趋 势 下, 在 人 流 感 和 禽 流 感 疫 苗 开 发 中 考 虑 对 人 流 感 和 禽 流 感 流 行 亚 型 进 行 共 预 防 具 有 重 要 意 义. 本 研 究 针 对 人 - 禽 多 价 流 感 疫 苗 进 行 了 尝 试, 构 建 了 共 表 达 H5 亚 型 HA 和 H3 亚 型 主 要 抗 原 区 HA1 的 DNA 疫 苗 pvax1-h5/h3, 并 进 行 了 小 鼠 免 疫 攻 毒 研 究. 结 果 表 明, 攻 毒 前 pvax1-h5/h3 有 效 诱 导 小 鼠 产 生 了 针 对 H5HA 和 H3HA1 的 体 液 抗 体 和 细 胞 免 疫 应 答. 当 采 用 H5 亚 型 和 H3 亚 型 流 感 病 毒 攻 击 时, pvax1-h5/h3 实 验 组 小 鼠 对 病 毒 攻 击 产 生 了 抵 抗 作 用, 显 示 了 更 快 的 体 重 回 复 及 肺 部 病 毒 清 除 速 度. 在 H3 亚 型 流 感 保 护 方 面, pvax1-h5/h3 作 用 显 著 优 于 单 表 达 H3HA1 的 pvax1-h3. 结 果 证 实, 共 表 达 双 亚 型 HA 策 略 可 对 相 关 流 感 病 毒 攻 击 产 生 保 护, 不 同 HA 间 未 发 现 免 疫 干 扰 现 象, 同 时 存 在 潜 在 的 增 益 效 果. 本 研 究 为 人 - 禽 多 价 流 感 疫 苗 的 研 发 奠 定 了 基 础. 关 键 词 人 流 感 禽 流 感 HA DNA 疫 苗 20 世 纪 30 年 代, 人 类 开 始 了 对 流 感 病 毒 (influenza virus, IV) 的 认 知 与 疫 苗 的 开 发, 但 今 天, 流 感 病 毒 依 然 是 威 胁 人 类 和 动 物 健 康 的 重 要 病 原. 目 前, 人 流 感 的 流 行 以 A 型 H3/H1 亚 型 以 及 B 型 流 感 为 主 年, 香 港 首 次 发 现 了 H5N1 亚 型 禽 流 感 病 毒 (avian influenza virus, AIV) 感 染 人 类 并 造 成 死 亡 的 情 况. 随 后 的 7 年 间, H5N1 亚 型 禽 流 感 病 毒 席 卷 了 整 个 东 南 亚 地 区, 并 蔓 延 到 了 俄 罗 斯 欧 洲 非 洲 印 度 次 大 陆 和 中 东 等 地. H5N1 亚 型 禽 流 感 病 毒 感 染 人 类 时, 死 亡 率 高 达 50%, 具 有 造 成 大 流 行 的 潜 在 可 能 [1,2]. 对 亚 洲 流 感 和 香 港 大 流 感 的 研 究 证 实, 两 株 大 流 行 株 的 形 成 均 是 由 当 时 流 行 的 人 流 感 与 禽 流 感 毒 株 基 因 重 配 产 生 的 即 抗 原 转 变 [3]. 基 于 此, 结 合 目 前 流 感 的 流 行 趋 势, 可 以 推 断 单 纯 地 对 人 流 感 主 要 亚 型 或 H5N1 亚 型 禽 流 感 免 疫 都 无 法 有 效 预 防 潜 在 的 流 感 大 流 行. 重 视 人 流 感 与 禽 流 感 的 共 预 防, 防 止 多 亚 型 流 感 病 毒 侵 入 同 一 宿 主 体 内 引 发 可 能 的 基 因 重 配, 是 预 防 流 感 大 流 行 株 形 成 的 关 键. 534 引 用 格 式 : 南 文 龙, 金 宁 一, 鲁 会 军, 等. 人 - 禽 双 价 流 感 新 型 DNA 疫 苗 构 建 及 免 疫 保 护 实 验 研 究. 中 国 科 学 C 辑 : 生 命 科 学, 2009, 39(6):

2 中 国 科 学 C 辑 : 生 命 科 学 2009 年 第 39 卷 第 6 期 疫 苗 是 预 防 流 感 的 重 要 手 段, DNA 疫 苗 是 继 减 毒 疫 苗 基 因 工 程 疫 苗 之 后 的 第 三 代 疫 苗, 具 有 很 多 明 显 优 势, 如 构 建 简 易 可 诱 导 机 体 同 时 产 生 细 胞 和 体 液 免 疫 且 免 疫 持 久 等. DNA 疫 苗 除 了 具 有 良 好 的 应 用 前 景 外, 还 被 广 泛 应 用 于 疫 苗 模 型 的 研 究 中. 之 [4~6] 前 的 研 究 显 示, 以 血 凝 素 (hemagglutinin, HA) 为 靶 抗 原 构 建 的 多 种 类 型 流 感 疫 苗 均 可 保 护 机 体 抵 抗 流 感 病 毒 致 死 性 攻 击. 本 研 究 拟 采 用 DNA 疫 苗 载 体 pvax1 共 表 达 H5 亚 型 HA 基 因 和 H3 亚 型 HA1 基 因, 通 过 小 鼠 免 疫 攻 毒 研 究, 探 索 其 对 人 流 感 H3 亚 型 和 禽 流 感 H5 亚 型 共 保 护 作 用, 为 人 - 禽 多 价 流 感 疫 苗 的 开 发 提 供 新 的 研 究 策 略. 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 (1) 试 剂. ExTaq DNA 聚 合 酶 T4 DNA 连 接 酶 AMV 逆 转 录 酶 及 各 种 限 制 性 内 切 酶, 及 核 酸 电 泳 分 子 质 量 标 准 marker 购 于 Takara 公 司 ; 胎 牛 血 清 MEM 和 RPMI 1640 培 养 基 购 自 Gibco 公 司 ; 脂 质 体 Lipofectatime TM 2000 和 pvax1 载 体 购 自 Invitrogen 公 司 ; 异 硫 氰 酸 荧 光 素 (FITC) 标 记 羊 抗 兔 IgG 和 辣 根 过 氧 化 物 酶 (HRP) 标 记 羊 抗 鼠 IgG 购 自 中 杉 金 桥 生 物 技 术 有 限 公 司 ; 兔 抗 流 感 病 毒 H5 和 H3 亚 型 HA1 抗 体 购 自 杰 恩 生 物 技 术 有 限 公 司 ; 小 鼠 IFN-γ 预 包 被 ELISPOT 检 测 试 剂 盒 购 自 达 科 为 生 物 技 术 有 限 公 司 ; WST-1 细 胞 增 殖 及 细 胞 毒 性 检 测 试 剂 盒 购 自 碧 云 天 生 物 技 术 研 究 所. (2) 病 毒 和 动 物. 流 感 病 毒 A/chicken/Jilin/9/ 2004(H5N1) 和 A/Wisconsin/67/2005(H3N2) 由 本 室 保 存 ; Balb/c 小 鼠, 雌 性, 体 重 16~18 g, 购 自 长 春 生 物 制 品 研 究 所. (3) 细 胞. 无 支 原 体 的 仓 鼠 肾 成 纤 维 细 胞 (BHK) 培 养 于 37, 5% CO 2 条 件 下 含 5% 胎 牛 血 清 的 MEM 培 养 液 中. 无 支 原 体 的 犬 肾 转 化 细 胞 (MDCK) 培 养 于 37, 5% CO 2 条 件 下 含 5% 胎 牛 血 清 的 PRMI1640 培 养 液 中. 1.2 方 法 (1) 重 组 真 核 表 达 载 体 的 构 建. 采 用 A/chicken/ Jilin/9/2004(H5N1), 常 规 方 法 RT-PCR 扩 增 获 得 H5HA 基 因, 在 基 因 两 端 引 入 NheI, ClaI 和 XhoI 酶 切 位 点, 并 于 下 游 引 物 中 加 入 (G 4 S) 3 柔 性 Linker. 采 用 A/Wisconsin/67/2005(H3N2), 常 规 方 法 RT-PCR 扩 增 获 得 H3HA1 基 因, 于 基 因 两 端 引 入 ClaI 和 XhoI 酶 切 位 点, 并 于 上 游 引 物 加 入 口 蹄 疫 病 毒 2A 基 因 Linker. NheI 和 XhoI 双 酶 切 获 得 H5HA 片 段, 与 pvax1 连 接 获 得 质 粒 pvax1-h5ha. ClaI 和 XhoI 双 酶 切 获 得 H3HA1 片 段, 并 连 接 入 pvax1-h5ha 中, 获 得 质 粒 pvax1-h5ha-h3ha1(pvax1-h5/h3), 测 序 分 析. 另 外, 分 别 构 建 单 独 表 达 H5HA 的 pvax1-h5 和 单 独 表 达 H3HA1 的 pvax1-h3 作 为 对 照 质 粒. (2) 间 接 免 疫 荧 光 鉴 定. 提 取 重 组 质 粒 pvax1- H5/H3 及 pvax1 空 载 体, 测 定 质 粒 DNA 含 量 和 纯 度. 按 Lipofectatime TM 2000 说 明 书 方 法 转 染 BHK 细 胞, 37, 5% CO 2, 培 养 48 h. 取 出 后 于 4 条 件 下 丙 酮 固 定 5 min. 置 于 含 5% 脱 脂 乳 的 Tris 盐 酸 缓 冲 液 中 封 闭 2 h. 先 后 与 含 0.05% 伊 文 斯 兰 的 兔 抗 流 感 病 毒 H5 和 H3 亚 型 HA1 阳 性 血 清 和 FITC 标 记 的 羊 抗 兔 IgG 于 37 温 育 2 h, PBS 洗 涤 两 次 后, 于 荧 光 显 微 镜 下 观 察. pvax1 转 染 细 胞 作 为 阴 性 对 照. (3) 动 物 免 疫 实 验. 大 量 提 取 重 组 质 粒, 聚 乙 二 醇 沉 淀 法 纯 化 DNA [7], 并 用 紫 外 分 光 光 度 计 测 定 浓 度. PBS 稀 释 调 整 质 粒 浓 度. 免 疫 方 法 采 用 小 鼠 胫 前 肌 分 点 注 射, 分 别 于 0, 21 和 35 天 免 疫 3 次. 首 次 免 疫 每 只 小 鼠 200 μg 质 粒 (2 μg/μl), 第 2 次 和 3 次 免 疫 每 只 小 鼠 100 μg(1 μg/μl). 分 组 如 下 : 第 1 组 为 pvax1- H5/H3 免 疫 组 ; 第 2 组 为 pvax1-h5 免 疫 组 ; 第 3 组 为 pvax1-h3 免 疫 组 ; 第 4 组 为 pvax1 对 照 组. 其 中 1, 4 组 小 鼠 分 设 两 平 行 组, 各 实 验 组 每 组 15 只 小 鼠. 每 周 尾 静 脉 采 血 进 行 血 清 ELISA 抗 体 分 析. 三 免 后 10 天, 处 死 部 分 小 鼠, 无 菌 分 离 脾 脏 淋 巴 细 胞, 进 行 淋 巴 细 胞 增 殖 实 验 和 IFN-γ ELISPOT 检 测. (4) 动 物 攻 毒 实 验. 三 免 后 10 天, 取 第 1, 2, 4 组 小 鼠 轻 微 麻 醉 后 滴 鼻 接 种 A/chicken/Jilin/9/2004 (H5N1), 取 第 1, 3, 4 组 小 鼠 轻 微 麻 醉 后 滴 鼻 接 种 A/Wisconsin/67/2005(H3N2), 病 毒 接 种 剂 量 TCID [8] 天 后 处 死 部 分 小 鼠 进 行 肺 病 毒 载 量 测 定, 其 余 小 鼠 观 察 体 重 变 化 至 2 周. 535

3 南 文 龙 等 : 人 - 禽 双 价 流 感 新 型 DNA 疫 苗 构 建 及 免 疫 保 护 实 验 研 究 (5) 血 清 ELISA 抗 体 检 测. 取 H5, H3 亚 型 灭 活 流 感 病 毒 4 过 夜 包 被 ELISA 板, 次 日 置 于 含 5% 脱 脂 乳 的 Tris 盐 酸 缓 冲 液 中 封 闭 1 h. 每 孔 加 入 各 实 验 组 鼠 血 清 ( 倍 稀 释 ), 37 温 育 1.5 h. PBS 洗 涤 5 次, 加 入 HRP 标 记 羊 抗 鼠 IgG( 倍 稀 释 ), 37 温 育 1.5 h. PBS 洗 涤 5 次, 加 入 OPD 显 色 液, 37 避 光 显 色 15 min 后 终 止, 492 nm 处 测 定 各 孔 吸 光 值. (6) 淋 巴 细 胞 增 殖 检 测. 三 免 后 10 天 分 离 淋 巴 细 胞, 分 别 加 入 H5 或 H3 亚 型 流 感 病 毒 (1MOI), 进 行 特 异 性 刺 激. 48 h 后, 按 WST-1 细 胞 增 殖 及 细 胞 毒 性 检 测 试 剂 说 明 书 进 行, 测 定 各 孔 吸 光 值. 计 算 刺 激 指 数 (SI)= 测 定 孔 cpm/ 对 照 孔 cpm (7) IFN-γ ELISPOT 检 测. 三 免 后 10 天 分 离 淋 巴 细 胞, 分 别 加 入 H5 或 H3 亚 型 流 感 病 毒 (1MOI), 进 行 特 异 性 刺 激. 48 h 后, 按 预 包 被 IFN-γ ELISPOT 检 测 试 剂 盒 说 明 书 进 行, 测 定 各 孔 斑 点 数. (8) 肺 病 毒 载 量 测 定. 攻 毒 后 5 天 分 离 肺 脏, 加 适 量 生 理 盐 水 研 磨 匀 浆, 离 心 获 取 上 清 液, 经 倍 比 稀 释 后 接 种 于 96 孔 板 中 MDCK 细 胞 上, 37, 5% CO 2 培 养 120 h, 采 用 Reed-Muench 方 法 计 算 TCID 50. (9) 统 计 学 分 析. 淋 巴 细 胞 增 殖 IFN-γ ELIS- POT 肺 病 毒 载 量 组 间 差 异 统 计 用 SPSS15.0 软 件 进 行 单 向 方 差 分 析. 血 清 ELISA 抗 体 检 测 和 小 鼠 体 重 变 化 组 间 差 异 统 计 用 SPSS15.0 软 件 进 行 双 向 方 差 分 析. 2 结 果 2.1 重 组 质 粒 的 构 建 策 略 采 用 pvax1 载 体, 分 别 成 功 构 建 单 独 表 达 H5HA 的 pvax1-h5, 单 独 表 达 H3HA1 的 pvax1-h3, 及 共 表 达 H5HA 和 H3HA1 的 pvax1-h5/h3, 策 略 见 图 pvax1-h5/h3 的 IFA 鉴 定 重 组 质 粒 转 染 细 胞 后, 经 与 荧 光 抗 体 孵 育 表 现 出 明 显 荧 光, 表 明 pvax1-h5/h3 可 有 效 表 达 H5HA 和 H3HA1 蛋 白, 且 蛋 白 主 要 表 达 于 细 胞 浆 内 和 细 胞 膜 上 ( 图 2). 图 1 重 组 质 粒 构 建 策 略 (A) pvax1-h5; (B) pvax1-h3; (C) pvax1-h5/h3 图 2 间 接 免 疫 荧 光 法 检 测 转 染 细 胞 中 H5HA 和 H3HA1 的 表 达 (A) H5 ; (B) H3 ; (C). P, N.,

4 中 国 科 学 C 辑 : 生 命 科 学 2009 年 第 39 卷 第 6 期 2.3 血 清 ELISA 抗 体 检 测 如 图 3 可 见, 免 疫 组 抗 体 水 平 在 首 免 1 周 后 出 现, 随 免 疫 次 数 的 增 加 抗 体 滴 度 迅 速 升 高. 抗 体 峰 值 结 果 显 示, 免 疫 后 pvax1-h5/h3 激 发 了 与 pvax1-h5 免 疫 组 水 平 相 当 的 H5HA 抗 体, 与 pvax1-h3 免 疫 组 水 平 相 当 的 H3HA1 抗 体, 免 疫 组 间 差 异 不 显 著, 而 各 免 疫 组 抗 体 滴 度 均 显 著 高 于 对 照 组 (P<0.01). 结 果 说 明, pvax1-h5/h3 免 疫 后 诱 导 小 鼠 同 时 产 生 了 针 对 H5HA 和 H3HA1 体 液 免 疫 应 答, 且 抗 体 水 平 与 相 应 的 抗 原 单 表 达 组 相 当. 2.4 淋 巴 细 胞 增 殖 检 测 当 受 到 抗 原 刺 激 时, 免 疫 组 均 表 现 出 特 异 性 T 淋 巴 细 胞 增 殖 反 应, SI 水 平 显 著 高 于 对 照 组 (P<0.01). 以 H5 或 H3 亚 型 流 感 病 毒 刺 激, pvax1-h5/h3 免 疫 组 SI 水 平 分 别 与 pvax1-h5 或 pvax1-h3 免 疫 组 相 当, 差 异 不 显 著 ( 图 4). 2.5 IFN-γ ELISPOT 检 测 与 淋 巴 细 胞 增 殖 检 测 结 果 相 符, 抗 原 刺 激 后 免 疫 组 T 淋 巴 细 胞 出 现 了 显 著 的 IFN-γ 分 泌 反 应, 各 免 疫 组 斑 点 数 显 著 多 于 对 照 组 (P<0.01)( 图 5). H5 或 H3 图 3 ELISA 抗 体 检 测 (A) H5 亚 型 抗 原 包 被 检 测 ; (B) H3 亚 型 抗 原 包 被 检 测. * 与 pvax1 对 照 组 相 比, P<0.01 图 4 淋 巴 细 胞 增 殖 检 测 * 与 pvax1 对 照 组 相 比, P<0.01 图 5 IFN-γ ELISPOT 检 测 * 与 pvax1 对 照 组 相 比, P<

5 南 文 龙 等 : 人 - 禽 双 价 流 感 新 型 DNA 疫 苗 构 建 及 免 疫 保 护 实 验 研 究 亚 型 流 感 病 毒 刺 激 后, 免 疫 组 pvax1-h5/h3 斑 点 数 稍 多 于 pvax1-h5 或 pvax1-h3 免 疫 组, 但 差 异 不 显 著. 综 合 淋 巴 细 胞 增 殖 结 果 说 明, pvax1-h5/h3 免 疫 组 小 鼠 同 时 产 生 了 针 对 H5HA 和 H3HA1 细 胞 免 疫 应 答. 2.6 攻 毒 小 鼠 体 重 变 化 分 析 当 受 到 病 毒 攻 击 时, 免 疫 组 和 对 照 组 小 鼠 均 不 同 程 度 地 出 现 临 床 症 状 且 体 重 迅 速 下 降, 与 对 照 组 相 比, 免 疫 组 小 鼠 出 现 了 更 快 的 体 重 回 复. 14 天 小 鼠 体 重 损 失 评 价, 采 用 H5 亚 型 流 感 病 毒 攻 击 时, 免 疫 组 pvax1-h5/h3(10.11%) 和 pvax1-h5(10.96%) 小 鼠 体 重 损 失 显 著 低 于 对 照 组 (17.19%)(P<0.01). 采 用 H3 亚 型 流 感 病 毒 攻 击 时, 免 疫 组 pvax1-h5/h3(7.29%) 和 pvax1-h3(10.58%) 小 鼠 体 重 损 失 显 著 低 于 对 照 组 (15.38%)(P<0.01), 且 免 疫 组 pvax1-h5/h3 小 鼠 体 重 损 失 显 著 低 于 免 疫 组 pvax1-h3(p<0.05)( 图 6). 2.7 肺 病 毒 载 量 测 定 如 图 7 所 示, 攻 毒 5 天 后 各 免 疫 组 小 鼠 肺 病 毒 载 量 显 著 低 于 对 照 组 (P<0.01), 说 明 免 疫 组 小 鼠 出 现 了 更 快 的 肺 部 病 毒 清 除 速 度. 无 论 采 用 H5 或 H3 亚 型 流 感 病 毒 攻 击, 均 以 pvax1-h5/h3 免 疫 组 小 鼠 肺 病 毒 载 量 最 低, 但 与 pvax1-h5 免 疫 组 相 比 差 异 不 显 著, 而 与 pvax1-h3 免 疫 组 相 比 差 异 显 著 (P<0.05). 综 合 攻 毒 小 鼠 体 重 变 化 结 果 分 析 表 明, pvax1-h5/h3 实 验 组 小 鼠 同 时 抵 抗 了 H5 和 H3 两 种 亚 型 流 感 病 毒 的 攻 击, 尤 其 在 对 H3 亚 型 流 感 病 毒 保 护 方 面, pvax1- H5/H3 实 验 组 小 鼠 较 pvax1-h3 实 验 组 小 鼠 显 示 了 更 快 的 肺 部 病 毒 清 除 及 体 重 回 复 速 度. 3 讨 论 禽 类 在 流 感 病 毒 的 流 行 中 扮 演 着 重 要 的 角 色, 目 前 已 经 从 家 禽 和 野 禽 中 分 离 到 所 有 亚 型 的 流 感 病 毒, 而 通 过 野 禽 的 迁 徙 活 动 和 禽 类 贸 易 等 方 式 又 将 流 感 病 毒 带 至 世 界 各 地 [9]. 近 年 来, 在 对 人 流 感 的 研 究 中 发 现, 除 了 现 有 传 统 亚 型 外, H5, H7, H9 亚 型 禽 流 感 也 开 始 不 断 突 破 种 间 屏 障 感 染 人 类. 对 之 前 流 感 大 流 行 起 源 的 研 究 显 示, 大 流 行 株 的 形 成 与 人 流 感 和 禽 流 感 毒 株 基 因 重 配 密 切 相 关. 因 此, 在 目 前 流 感 流 行 趋 势 下, 在 人 和 禽 流 感 疫 苗 开 发 中 考 虑 对 人 流 感 和 禽 流 感 主 要 流 行 亚 型 进 行 共 预 防 具 有 重 要 意 义, 只 有 这 样 才 能 有 效 预 防 潜 在 的 流 感 大 流 行, 而 目 前 流 感 疫 苗 的 设 计 主 要 针 对 各 物 种 感 染 的 相 关 亚 型. HA 蛋 白 是 构 成 病 毒 囊 膜 纤 突 的 主 要 成 分, 可 以 介 导 病 毒 粒 子 与 细 胞 表 面 受 体 的 结 合, 并 与 病 毒 的 图 6 攻 毒 后 小 鼠 体 重 变 化 检 测 (A) H5 流 感 病 毒 攻 击 检 测 ; (B) H3 流 感 病 毒 攻 击 检 测. * 与 pvax1 对 照 组 相 比, P<0.01; ** 与 pvax1-h3 免 疫 组 相 比, P<

6 中 国 科 学 C 辑 : 生 命 科 学 2009 年 第 39 卷 第 6 期 血 凝 素 活 性 相 关, 是 流 感 最 重 要 的 保 护 性 抗 原 [10]. 单 独 以 HA 靶 抗 原 构 建 的 多 种 类 型 流 感 疫 苗 均 可 有 效 保 护 机 体 抵 抗 相 同 亚 型 流 感 病 毒 的 攻 击. 为 了 提 高 疫 苗 的 交 叉 保 护 力 常 采 用 以 HA 辅 以 其 他 抗 原 组 分 的 形 式, 如 神 经 氨 酸 酶 (neuraminidase, NA) 或 核 蛋 白 (nucleoprotein, NP) 等 [11,12] [13]. Wang 等 人 的 研 究 显 示, 共 表 达 H3HA 和 H1HA 的 DNA 疫 苗 可 激 发 机 体 产 生 针 对 其 HI 和 NAb 反 应, 提 示 共 表 达 双 亚 型 HA 分 子 的 模 式 可 以 抵 抗 相 关 亚 型 病 毒 的 攻 击. 本 研 究 即 对 共 表 达 双 亚 型 HA 分 子 DNA 疫 苗 进 行 了 探 索, 设 计 采 用 完 整 的 H5 亚 型 HA 结 合 H3 亚 型 主 要 抗 原 区 HA1 分 子, 选 择 对 人 流 感 H3 亚 型 与 禽 流 感 H5 亚 型 进 行 共 预 防. 特 异 性 体 液 抗 体 和 细 胞 免 疫 应 答 的 出 现 是 机 体 对 流 感 病 毒 攻 击 产 生 保 护 的 基 础. pvax1-h5/h3 免 疫 后, ELISA 抗 体 水 平 的 升 高 淋 巴 细 胞 增 殖 反 应 的 出 现 和 IFN-γ 分 泌 的 增 加 均 证 实, 小 鼠 产 生 了 针 对 H5HA 和 H3HA1 的 特 异 性 体 液 抗 体 和 细 胞 免 疫 应 答. 为 判 定 其 免 疫 原 性 的 强 弱, 将 其 与 表 达 单 抗 原 的 pvax1-h5 和 pvax1-h3 进 行 比 较, 结 果 显 示, 其 水 [14] 平 与 抗 原 单 表 达 组 相 当. Robinson 等 人 采 用 表 达 单 HA 质 粒 免 疫 后, 成 功 保 护 鸡 抵 抗 了 相 应 亚 型 流 感 病 毒 致 死 性 攻 击, 预 示 本 研 究 采 用 pvax1-h5/h3 免 疫 也 可 同 时 获 得 对 H5 和 H3 亚 型 流 感 病 毒 的 保 护 作 用. [8] Qiu 等 人 通 过 鼠 肺 传 代 的 方 式 增 强 了 流 感 病 毒 对 小 鼠 的 致 病 性, 传 代 后 获 得 了 可 以 感 染 小 鼠 并 致 死 的 H9N2 亚 型 禽 流 感 毒 株. 本 研 究 在 攻 毒 前 对 流 感 病 毒 也 进 行 了 鼠 肺 传 代, 传 代 后 病 毒 可 以 有 效 感 染 小 鼠 发 病 并 显 著 减 轻 体 重, 但 未 获 得 致 死 性 毒 株. 同 [8] 时 参 考 Qiu 等 人 的 攻 毒 剂 量 进 行 了 小 鼠 感 染 研 究 : 在 H5 或 H3 亚 型 流 感 病 毒 攻 击 后, pvax1-h5/h3 实 验 组 小 鼠 较 对 照 组 显 示 了 更 快 的 体 重 回 复 及 肺 部 病 毒 清 除 速 度, 说 明 其 对 两 种 亚 型 流 感 病 毒 攻 击 产 生 了 抵 抗 作 用. 有 趣 的 是, 在 H3 亚 型 流 感 病 毒 保 护 方 面, pvax1-h5/h3 作 用 优 于 pvax1-h3, 推 测 其 可 能 与 pvax1-h5/h3 刺 激 机 体 产 生 更 高 水 平 的 免 疫 状 态, 以 及 H5HA 诱 导 机 体 产 生 的 免 疫 应 答 表 现 出 对 H3 亚 型 流 感 病 毒 更 好 的 交 叉 保 护 有 关, 而 在 攻 毒 前 指 标 中 未 有 体 现, 提 示 需 要 更 深 入 研 究. 结 果 还 预 示, 进 一 步 多 价 流 感 疫 苗 的 开 发 可 采 用 两 种 或 多 种 HA 分 子 为 核 心 的 模 式, 再 添 加 其 他 抗 原 组 分, 来 更 有 针 对 性 地 对 人 流 感 和 禽 流 感 主 要 亚 型 进 行 保 护 的 同 时, 获 得 更 好 的 交 叉 保 护 能 力. 本 实 验 采 用 肌 肉 注 射 DNA 疫 苗 的 方 式 对 pvax1- H5/H3 模 式 进 行 了 评 价, 但 攻 毒 后 小 鼠 均 不 同 程 度 地 出 现 了 临 床 症 状 及 体 重 下 降, 显 示 此 方 法 诱 导 的 免 图 7 攻 毒 5 天 后 小 鼠 肺 病 毒 载 量 检 测 * 与 pvax1 对 照 组 相 比, P<0.01; ** 与 pvax1-h3 免 疫 组 相 比, P<

7 南 文 龙 等 : 人 - 禽 双 价 流 感 新 型 DNA 疫 苗 构 建 及 免 疫 保 护 实 验 研 究 疫 保 护 力 相 对 有 限. 近 年 来, 在 提 高 DNA 疫 苗 免 疫 效 力 方 面, 各 国 研 究 者 进 行 了 大 量 的 探 索, 包 括 优 化 密 码 子, 采 用 基 因 枪 电 击 涂 抹 等 免 疫 途 径, 联 合 应 用 细 胞 因 子 等, 为 DNA 疫 苗 的 研 究 展 示 了 广 泛 的 应 用 前 景. 同 时 也 是 本 实 验 进 一 步 研 究 的 方 向 [15~18]. 近 期 研 究 显 示, 采 用 M2e 与 Hbc 偶 联 或 脂 质 体 包 裹 和 采 用 NP 与 VP22 偶 联 的 方 式, 也 可 以 抵 抗 多 种 亚 型 流 感 病 毒 的 攻 击 [19~21]. 与 之 相 比, DNA 疫 苗 具 有 构 建 简 便 成 本 低 廉 运 输 和 保 存 方 便 和 免 疫 保 护 持 久 等 优 势 [22], 通 过 迅 速 改 变 疫 苗 抗 原 组 分 ( 如 HA) 可 以 更 有 针 对 性 地 应 对 流 感 病 毒 的 变 异. 本 研 究 提 出 人 - 禽 流 感 共 预 防 的 设 想, 在 其 指 导 下 尝 试 了 共 表 达 双 分 子 HA DNA 疫 苗 的 策 略. 结 果 证 实 不 同 HA 分 子 间 未 发 现 免 疫 干 扰 的 现 象 并 存 在 潜 在 的 增 益 效 果, 可 以 针 对 相 关 亚 型 流 感 有 效 保 护, 为 人 - 禽 多 价 流 感 疫 苗 的 开 发 奠 定 基 础. 参 考 文 献 1 Sims L D, Domenech J, Benigno C, et al. Origin and evolution of highly pathogenic H5N1 avian influenza in Asia. Vet Rec, 2005, 157(6): World Health Organization. H5N1 influenza timeline. pdf(accessed Oct 2006) 3 Scholtissek C, Rohde W, Von Hoyningen V, et al. On the origin of the human influenza virus subtypes H2N2 and H3N2. Virology, 1978, 87(1): 13 20[DOI] 4 Chen Z, Sahashi Y, Matsuo K, et al. Comparison of the ability of viral protein-expressing plasmid DNAs to protect against influenza. Vaccine, 1998, 16(6): [DOI] 5 Gao W, Soloff A C, Lu X, et al. Protection of mice and poultry from lethal H5N1 avian influenza virus through adenovirus-based immunization. J Virol, 2006, 80(4): [DOI] 6 Webster G, Taylor J, Pearson J, et al. Immunity to Mexican H5N2 avian influenza virus induced by a fowl pox-h5 recombinant. Avian Dis, 1996, 40(2): [DOI] 7 萨 姆 不 鲁 克 J, 费 里 奇 E F, 曼 尼 阿 蒂 斯 T. 金 冬 雁, 黎 孟 枫, 等 译. 分 子 克 隆 实 验 指 南 ( 第 2 版 ). 北 京 : 科 学 出 版 社, Qiu M, Fang F, Chen Y, et al. Protection against avian influenza H9N2 virus challenge by immunization with hemagglutinin- or neuraminidase-expressing DNA in BALB/c mice. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 343(4): [DOI] 9 Van den Berga T, Lambrecht B, Marché S, et al. Influenza vaccines and vaccination strategies in birds. Comp Immunol Microbiol Infect Dis, 2008, 31(2-3): [DOI] 10 Carroll S M, Paulson J C. Differential infection of receptor-modified host cells by receptor-specific influenza viruses. Virus Res, 1985, 3(2): [DOI] 11 乔 传 玲, 姜 永 萍, 田 国 斌, 等. 表 达 禽 流 感 HA 和 NP 双 基 因 重 组 禽 痘 病 毒 的 免 疫 保 护 性. 畜 牧 兽 医 学 报, 2004, 35(2): 乔 传 玲, 姜 永 萍, 于 康 震, 等. 共 表 达 禽 流 感 病 毒 HA 和 NA 基 因 的 重 组 禽 痘 病 毒 在 SPF 鸡 的 免 疫 效 力 试 验. 中 国 农 业 科 学, 2004, 37(4): Wang S X, Taaffe J, Parker C, et al. Hemagglutinin(HA) proteins from H1 and H3 serotypes of influenza A viruses require different antigen designs for the induction of optimal protective antibody responses as studied by codon-optimized HA DNA vaccines. J Virol, 2006, 80(23): [DOI] 14 Robinson H L, Hunt L A, Webster R G. Protection against a lethal influenza virus challenge by immunization with a hemagglutinin expressing plasmid DNA. Vaccine, 1993, 11(9): [DOI] 15 Jiang Y P, Yu K Z, Zhang H B, et al. Enhanced protective efficacy of H5 subtype avian influenza DNA vaccine with codon optimized HA gene in a pcaggs plasmid vector. Antiviral Research, 2007, 75(3): [DOI] 16 Wang S X, Zhang C H, Zhang L, et al. The relative immunogenicity of DNA vaccines delivered by the intramuscular needle injection, electroporation and gene gun methods. Vaccine, 2008, 26(17): [DOI] 540

8 中 国 科 学 C 辑 : 生 命 科 学 2009 年 第 39 卷 第 6 期 17 Sharpe M, Lynch D, Topham S, et al. Protection of mice from H5N1 influenza challenge by prophylactic DNA vaccination using particle mediated epidermal delivery. Vaccine, 2007, 25(34): [DOI] 18 Operschall E, Schuh T, Heinzerling L, et al. Enhanced protection against viral infection by co-administration of plasmid DNA coding for viral antigen and cytokines in mice. J Clin Virol, 1999, 13(1-2): 17 27[DOI] 19 De Filette M, Min J W, Birkett A, et al. Universal influenza A vaccine: optimization of M2-based constructs. Virology, 2005, 337(1): [DOI] 20 Ernst WA, Kim H J, Tumpey T M, et al. Protection against H1, H5, H6 and H9 influenza A infection with liposomal matrix 2 epitope vaccines. Vaccine, 2006, 24(24): [DOI] 21 Saha S, Yoshida S, Ohba K, et al. A fused gene of nucleoprotein(np) and herpes simplex virus genes(vp22) induces highly protective immunity against different subtypes of influenza virus. Virology, 2006, 354(1): 48 57[DOI] 22 Dhama K, Mahendran M, Gupta P K, et al. DNA vaccines and their applications in veterinary practice: current perspectives. Vet Res Commun, 2008, 32(5): [DOI] 541