6 : 35 Key words: Oreochromis niloticus; Streptococcus agalactiae; genomic expression library ( Streptococcus agalactiae) B ( group B streptococcus, G
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- 俸赦 徐
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1 South China Fisheries Science Vol., No. 6 Dec., 205 doi: / j. issn ,,, 2,,,, (.,, 50380; 2., 50220) : ( Oreochromis niloticus) ( Streptococcus agalactiae), Hod- Sau3A Hod- DNA, kb DNA, BamH pet-28 a/ b/ c, BL2( DE3) Hod , ( ) PCR 94%, kb,, GenBank 99%, : ; ; : S 97. : A : ( 205) Construction and identification of genomic expression library of Streptococcus agalactiae virulent strain Hod- isolated from Oreochromis niloticus LIU Zhigang, KE Xiaoli, LU Maixin, FANG Wei 2, WANG Miao, ZHU Huaping, GAO Fengying, CAO Jianmeng (. Key Lab. of Tropical & Subtropical Fishery Resource Application & Cultivation, Ministry of Agriculture; Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fisheries Science, Guangzhou 50380, China; 2. Guangdong Provincial Aquatic Animal Epidemic Disease Prevention and Control Center, Guangzhou 50220, China) Abstract: To screen the specific genes of Streptococcus agalactiae induced in Oreochromis niloticus, the genomic expression library of the virulent strain Hod- was constructed. The Sau3Awas used to digest genomic DNA of S. agalactiae strain Hod- incompletely. The DNA fragments ranging from0. 5 kb to 2 kb were recycled and ligated into pet-28 a/b/ c expression vectors which had been digested by BamHand dephosphorylated by SAP before using. The recombinant vectors were transformed into BL2 ( DE3). The results show that the genomic expression library of S. agalactiae contained clones, considerably more than the minimum number of clones ( clones) covering the whole genomic DNA of S. agalactiae. Results of PCR detection show that the rate of fragment insertion was 94% and different sizes of inserted fragments ranged from 0. 5 kb to 2. 0 kb. The results of sequencing show that the homology between inserted sequences and the genomic DNA sequnce of S. agalactiae was over 99%. In conclusion, the genomic expression library of S. agalactiae strain Hod- was constructed successfully, which can be used for screening genes of S. agalactiae induced expression in O. niloticus. : ; : : ( ) ; ( CARS-49 ) ; ( KF20309) ; ( 203J400078, ) : ( ),,, wenliugang@ 63. com : ( ), mx-lu@ 63. com
2 6 : 35 Key words: Oreochromis niloticus; Streptococcus agalactiae; genomic expression library ( Streptococcus agalactiae) B ( group B streptococcus, GBS), Hod-, 0 ( a b ),. [ -2 ] Hod- 203, 7 [ 3-4 ], DH5a BL2( DE3), pet-28 a/b / c [ 5] ( Oreochromis niloticus). 2 DNA, Hod- BHI rmin -,, DNA ( Omega) DNA, [ 6],,, %, DNA, 4. 3 DNA,, Sau3A Hod- DNA, : Sau3A [ 7 ], 0. 5 U g U g U g U g U g - 0, U g - DNA, [ 6-9 ] DNA min,. 5%, Sau3A ( capsular polysaccharide synthesis, Cps) - ( -like protein, Alp) min20 min30 min40 min50 min60 min, C5 ( C5a peptidase, ScpB). 5% ( laminin binding protein, Lmb) 5 g DNA, ( cohemolysin, CAMP) FbsA ( Omega) 0. 5 ( Surface immunogenic protein, Sip) ( hemolysin, Hly), ( Eppendorf) [ 0],, 4 [ -3 ]. 4 [ 4] ZQ090 pet-28 a/ b /c DH5a, ORFs, LB, rmin -,, ( Omega) BamH ( in vi- pet-28 a/b / c, vo induced antigen technology,, Novagen 0. 2 g 37 DNA 5 min kb DNA,. 5% IVIAT) ( ) %,,,
3 36 5 g pet-28 a/ b/ c, ( SAP, ),, 65 5 min SAP,,, 4. 5 DNA DNA pet-28 a/ b/ c 6 T4 6 BL2( DE3), LB, h. 6 50, pet-28 a/b / c T7: 5 -TAATACGACTCACTATA-GGG- 3 T7-TER: 5 -TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3 ( ) PCR PCR 0 Buffer 2 L, dntp( 0 moll - ) 0. 4 L, T7 T7-TER ( 0 moll - ) 0. 4 L, Taq 0. 2 L, L, ddh 2 O 20 L; PCR 94 3 min, s, s, min, min 30 GenBank Blast, DNA ( GenBank CP ) U g - DNA, 2 2. DNA DNA 2. 0 kb DNA, 4 DNA, gml -, OD 260 nm /OD 280 nm. 98, % BamH pet-28 a/ DNA,, b / c BL2( DE3), 2. 2 DNA BamH Sau3A DNA, Hod- DNA N = ln( - P) / ln( - f/g), ( 2 3),, P ( 99. 9% ), f 2 Fig. Hod- DNA Genomic DNA of S. agalactiae strain Hod- DNA Sau3AI M. DL5000 DNA Marker; M2. /Hind DNA Marker; 6. U g U g U g U g U g - 0 U g - Sau3A DNA Fig. 2 Optimization of volumes of Sau3Adigesting genomic DNA of S. agalactiae M. DL5000 DNA Marker; M2. /Hind DNA Marker; 6. volumes of Sau3 Aused to digest genomic DNA were U g -, 0. 5 U g -, U g -, U g -, U g - and 0 U g -, respectively. 40 min, DNA kb DNA, 0. 5 Hod- DNA, 24 h, N
4 6 : DNA M. DL2000 DNA Marker; 7. Sau3A DNA 5 min0 min20 min30 min Fig min50 min 60 min Optimization of time of Sau3Adigesting genomic DNA of S. agalactiae M. DL2000 DNA Marker; 7. Time of genomic DNA digested by Sau3Awere 5 min, 0 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min and 60 min, respectively. DNA g ( 5, 2. 0 Mb) 000 bp 94%, kb, Hod- DNA M. DL5000 DNA Marker; kb DNA 5 93, 30 3,,, bp, Gen , Bank DNA ( Gen- 2, Bank CP ) 99% ( ) Fig. 4 Reclamed product of genomic DNA of S. agalactiae strain Hod- digested by Sau3Aincompletely M. DL5000 DNA Marker; kb reclamation product PCR Fig. 5 5 Hod- M bp DNA Marker; 48. Size of insertion fragments of genomic expression library of S. agalactiae Hod- strain M bp DNA Marker; 48. insertion fragments of genomic expression library
5 38 DNA( GenBank CP ) Tab. Homology between insertion fragments and genomic DNA sequence( GenBank CP ) of S. agalactiae isolated from O. niloticus /bp / % No. of clone insertion fragment homology / bp / % No. of clone insertion fragment homology ( IVIAT) DNA ( Omega), DNA, [ 5 ], BamH Sau3A IVIAT DNA,, 2 ( Streptococcus suis serotype 2) [ 6 ] ( Mycobacterium tuberculosis) [ 7 ] ( Salmonella enterica serovar Typhi) [ 8], DNA DNA, ;, DNA,,, Hod- parasuis) 2 CTAB DNA; kb, DNA [ 20-2 ] pet28 a/ b /c T7,,, DNA,, [ 9 ] [ 6, 22 ] GU [ 6] ( Haemophilus
6 6 : 39 [ 6-8 ], : [ 9-20 ] ,, ( 9 ) : , DNA ( SAP),, 65 5 min,, [ 9] DNA , 5, 80% ; [ 23 ] ( Campy- lobacter jejuni) , 4, 90% , PCR, bp, T7 T7-TER 39 bp, kb, 94% DNA ( GenBank CP ) ( > 99% ), Hod- 2( ) : , Hod- IVIAT [ 23 ],,, [ ] OHRI A K, PAOLETTI L C, GLASER P, et al. Group B Streptococcus: global incidence and vaccine development[ J]. Nat Rev Microbiol, 2006, 4 ( 2 ) : [ 2 ] PERSSON E, BERG S, TROLLFORS B, et al. Serotypes and clinicalm anifestations of invasive group B streptococcal infections in western Seden [ J]. Clin Microbiol Infect, 2004, 0 [ 3] PHARES C R, LYNFIELD R, FARLEY M M, et al. Epidemiology of invasive group B streptococcal disease in the United States, [ J]. J Am Med Assoc, 2008, 299 ( 7 ) : [ 4] CHAIWARITH R, JULLAKET W, BUNCHOO M, et al. Streptococcus agalactiae in adults at Chiang Mai University Hospital: a retrospective study[ J]. BMC Infect Dis, 20, : 49. [ 5] DELANNOY C M J, CRUMLISH M, FONTAINE M C, et al. Human Streptococcus agalactiae strain in aquatic mammals and fish [ J]. BMC Microbiol, 203, 3: 4. [ 6],,. [ J]., 200, 37 ( 5 ) : [ 7],. [ J]., 204, 38( ) : [ 8 ],. [ J]., 203, 35( 5) : [ 9],. ( Oreochromis niloticus) [ J]. 200, 4( 4) : [ 0],. [ J]., 2007, 9 ( 5) : [ ],,,. cpse [ J]., 20, 35( 5) : [ 2],,,. Sip [ J]., 202, 36 ( 4 ) : [ 3],. C5 a ( Scpb) [ J]., 204, [ 4]. ZQ090 [ D]. :, 203: 5-8. [ 5] HANDFIELD M, BRADY L J, PROGULSKE-FOX A, et al. IV- IAT: a novel method to identify microbial genes expressed specifically during human infection[ J]. Trends Microbiol, 2000, 8( 7) : [ 6] GU H W, ZHU H D, LU C P. Use of in vivo-induced antigen technology ( IVIAT) for the identification of Streptococcus suis serotype 2 in vivo-induced bacterial protein antigens[ J]. BMC Microbiol, 2009, 9: 20. [ 7],,.
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2 : 111 ( Pinctada maxima), 13, 11,,,,,, 15, 25 cm, cm, 4 5 kg 1-2],,, 3-7] 24] 25-26],,, ] min, 1, 5 m 4 m, 20 m , 9-22],,, (
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