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药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (8): 1001 1005 1001 消旋 TJ0711 长期给药对肾性高血压大鼠的药效学研究 李人杰, 裘军 *, 张学农, 陈静, 李高 ( 华中科技大学同济医学院药学院, 湖北武汉 430030) 摘要 : 观察消旋 TJ0711 长期给药对肾性高血压大鼠的血压 心率的影响及对心血管的保护作用 制备两肾一夹型肾性高血压大鼠模型 (renal hypertensive rats, RHR), 将血压升高 4 kpa 的大鼠随机分为消旋 TJ0711 10 20 及 40 mg kg 1 剂量组 卡维地洛阳性对照组和模型组以及假手术组 (n = 10) 每日 1 次灌胃给药 每周测量给药前后的血压和心率 于 6~8 周尾部取血, 测定血浆丙二醛 (MDA) 肾素 血管紧张素 II (Ang II) 和内皮素 -1 (ET-1) 含量 ; 9 周后取左心室测左心室重量指数 (LVWI) 和羟脯氨酸含量 给药 4 周后, TJ0711 40 mg kg 1 剂量组的血压较第 1 周给药前显著降低, 该作用一直延续至实验结束 TJ0711 10 20 及 40 mg kg 1 剂量组血浆中 MDA 肾素 Ang II 和 ET-1 含量均显著低于模型组 (P < 0.05, P < 0.01), LVWI 和心肌羟脯氨酸含量有降低趋势 结果显示, TJ0711 连续给药后使给药前的血压值持续下降, 除了直接阻断肾上腺素 α 和 β 受体产生降压外, 其持续降压作用与减少血浆中缩血管物质和氧化产物 MDA 有关, 这有利于对心血管发挥保护作用 关键词 : β 受体阻断剂 ; 肾性高血压大鼠 ; 丙二醛 ; 肾素 ; 血管紧张素 II; 内皮素 -1; 左心室重量指数 ; 羟脯氨酸中图分类号 : R965 文献标识码 : A 文章编号 : 0513-4870 (2012) 08-1001-05 Pharmacodynamic study of racemic TJ0711 on renal hypertensive rats after long-term administration LI Ren-jie, QIU Jun *, ZHANG Xue-nong, CHEN Jing, LI Gao (School of Pharmacy, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China) Abstract: The study is to observe the effect of racemic TJ0711 on blood pressure and heart rate as well as protection of cardiovascular system of renal hypertensive rats after long-term administration. The renal hypertensive models were established by the two-kidney, one-clip (2K1C) method in Wistar rats. Four weeks later, assigned the rats whose SBP had increased at least 4 kpa randomly into 5 groups: racemic TJ0711 10, 20 and 40 mg kg 1 groups, carvedilol control group, model group and sham group (n = 10), ig administration once daily. The changes of BP (blood press) and HR (heart rate) before and after administration were measured by tail-cuff method weekly. Plasma samples of all animals were taken in 6 8 weeks, and plasma MDA as well as renin, angiotensin II (Ang II) and endothelin-1 (ET-1) levels were measured. Left ventricle was cut off after 9 weeks, and left ventricular weight index (LVWI) and hydroxyproline were measured. The significant decrease of the BP of TJ0711 40 mg kg 1 group was observed after TJ0711 ig administration for 4 weeks, and this effect remained till the end of the study. In 8th week, the systolic blood pressure values were: TJ0711 40 mg kg 1 group 18.93 ± 1.82 kpa (vs 21.30 ± 2.30 kpa, P < 0.05); 20 mg kg 1 group 20.68 ± 3.29 kpa (vs 22.19 ± 2.88 kpa). The plasma MDA level of all treated groups was significantly lower than that of model 收稿日期 : 2012-01-09; 修回日期 : 2012-03-12. 基金项目 : 国家 重大新药创制 科技重大专项 (2009ZX09103-146); 湖北省研究与开发计划项目 (2008BCB103). * 通讯作者 Tel: 86-27-83650723, Fax: 86-27-83692762, E-mail: qiujun@mails.tjmu.edu.cn

1002 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (8): 1001 1005 group, so were the plasma renin, Ang II and ET-1 levels (P < 0.05). LVWI and hydroxyproline content of myocardial tissue decreased to some extent, but was not significant as compared with that of model group. The study showed that TJ0711 repeated dosing could reduce BP level beginning from drug administration; besides block adrenal α and β receptors to play an antihypertensive role. The sustained antihypertensive effect also related to reduce plasma vasoconstrictor substances and oxidation product MDA. These effects benefited cardiovascular protection. Key words: β-blocker; renal hypertensive rat; MDA; renin; angiotensin II; endothelin-1; left ventricular weight index; hydroxyproline 长期血压升高可引起血管内皮损伤和左心室肥厚, 目前对于高血压的药物治疗, 除能有效降低血压外, 还需要药物对心脏 肾脏 血管等靶器官具有保护作用, 以减少高血压病的并发症, 提高患者的生存质量 肾上腺素 β 受体阻断药是常用的一线抗高血压药物, 兼有抗心律失常 抗慢性心功能不全和抗心绞痛作用, 在降压的同时减少心律失常等并发症, 但由于肾上腺素受体的亚型种类较多, 各类受体亚型对心血管 支气管 肾脏等多种组织器官的调节作用有区别, 此类药物的临床应用选择需要因人而异, 目前新型肾上腺素 α, β 受体双重阻断药因具有降压作用稳定 同时有逆转左心室肥厚 抗氧化 降低肾素活性等药理学特性而受到关注 TJ0711 是根据药物构效关系合成的具有肾上腺素 α, β 受体阻断作用的新型化合物, 化学名为 : 1-[4- (2- 甲氧基乙基 ) 苯氧基 ]-3-[ [2-(2- 甲氧基苯氧基 ) 乙基 ] 胺基 ]-2- 丙醇盐酸盐, 分子式 : C 21 H 29 NO 5 HCl, 相对分子质量 : 411.5, 结构式见图 1 研究证实, TJ0711 具有选择性阻断肾上腺素 α 1 和 β 1 受体, 对 α 2 和 β 2 受体阻断作用弱的药理特性 ; 经单次给予正常和高血压模型大鼠的降压作用研究显示, 给药后 30 min 起效, 降压作用强, 但持续时间较短, 且对心率影响小 对 TJ0711 消旋体及 R- S- 两种旋光异构体的单次静脉及口服给药实验证实, 3 种光学异构体具有相似的降压特点 因此, 本研究将 TJ0711 消旋体作为候选对象, 进行连续给药实验, 观察其对肾血管性高血压大鼠的降压作用和对心率的影响, 并观察长期给药后是否具有后续效应, 以确定在降压作用之外是否具有对心血管的保护作用 Figure 1 Chemical structure of TJ0711 材料与方法试剂及仪器 TJ0711 由华中科技大学同济医学院药学院合成, 批号 : 20100310, 纯度 >99.8%; 卡维地洛 ( 齐鲁制药有限公司, 批号 : 908015KT) 丙二醛 肾素 血管紧张素 II 内皮素-1 和羟脯氨酸检测试剂盒 ( 南京建成生物制品研究所 ) RM6280C 型多道生理记录仪 ( 成都仪器厂 ); YP100 型压力换能器和 MP200 型脉搏换能器 ( 北京新航兴业科贸有限公司 ) Ω 形银夹, 自制, 内径 0.20 mm 实验动物模型与分组 Wistar 大鼠, 体重 180~ 200 g, 购自湖北省实验动物中心, 许可证号 : SCXK ( 鄂 ) 2008-0005; 实验期间寄养于同济医学院实验动物学部, 实验动物设施使用许可证号 : SYXK ( 鄂 ) 2004-0028 用两肾一夹法制备肾血管性高血压大鼠模型 取大鼠 100 只, 雌雄各半, 戊巴比妥钠 (40 mg kg 1, ip) 麻醉, 打开腹腔, 分离左侧肾动脉, 用内径 0.20 mm 的 Ω 形银夹夹住, 缝合创口 [1] 假手术动物不用银夹, 其他操作相同 术后 5 天, 每天注射青霉素钠 40 ku/ 只, 以防感染 术后每周测定血压, 至第 4 周时收缩压与术前相比升高 4 kpa 则视为建模成功 [2] 将模型大鼠随机分为 5 组 (n = 10): 消旋 TJ0711 10 20 和 40 mg kg 1 剂量组 ; 阳性对照组给予卡维地洛 20 mg kg 1 ; 模型组给予生理盐水 10 ml kg 1 另设假手术 (sham) 组 (n = 10), 给予生理盐水 10 ml kg 1 每日 1 次灌胃给药 血压和心率检测长期给药期间每周用尾套法测一次血压, 记下给药前后的收缩压 舒张压和心率 血浆丙二醛 (MDA) 肾素 血管紧张素 II (Ang II) 和内皮素 -1 (ET-1) 测定给药第 7 周时剪尾取血, 肝素抗凝, 离心取血浆 用 MDA 试剂盒, 按硫代巴比妥酸 (TBA) 法测血中 MDA 含量, 以分析

李人杰等 : 消旋 TJ0711 长期给药对肾性高血压大鼠的药效学研究 1003 TJ0711 的抗氧化作用 采用相应试剂盒分别测定肾素 Ang II 和 ET-1 的含量 左心室重量指数 (LVWI) 和羟脯氨酸含量测定给药 9 周后, 麻醉大鼠, 腹主动脉取血, 肝素抗凝 解剖取出心室, 剪去大血管, 用冰冷生理盐水充分灌洗后吸干, 称量全心室湿重后再称左心室湿重 称重后每个样本剪取左心室心肌 80~100 mg, 用羟脯氨酸检测试剂盒, 按碱水解法测定羟脯氨酸含量 通过测定 LVWI 和羟脯氨酸含量, 间接考察左心室肥厚的程度 [3] 统计学分析实验结果以 x ± s 表示 用 Origin 软件进行单因素方差分析 (one-way ANOVA), 比较组间显著性差异 结果 1 消旋 TJ0711 长期给药对肾性高血压大鼠血压 心率的影响在长期给药过程中, 假手术组血压保持平稳 ; 模型组的血压始终显著高于假手术组 (P < 0.01), 说明高血压模型稳定 从给药第 4 周开始, 消旋 TJ0711 的持续降压作用呈明显的量效关系, 其中 40 mg kg 1 剂量组的收缩压显著低于模型组 (P < 0.05), 40 和 20 mg kg 1 剂量组的持续降压作用优于卡维地洛 20 mg kg 1 剂量组 ( 图 2A) 消旋 TJ0711 对于舒张压的持续降低作用与收缩压的结果相似, 40 mg kg 1 剂量组与模型组比较有显著性差异 ( 图 2B) 长期给药过程中大鼠心率变化不大 ( 表 1) 2 消旋 TJ0711 长期给药对肾性高血压大鼠血浆肾素 Ang II 和 ET-1 的影响给药后模型组的血浆肾素 Ang II 和 ET-1 水平较假手术组显著提高 消旋 TJ0711 各组和阳性对照组的肾素 Ang II 水平均显著低于模型组 ; ET-1 水平也低于模型组, 但程度较弱 结果 ( 表 2) 表明, 消旋 TJ0711 各组均能显著降低肾性高血压大鼠的肾素 Figure 2 Effect of racemic TJ0711 long-term administration for 9 weeks on systolic blood pressure (SBP, A) and diastolic blood pressure (DBP, B) in renal hypertensive rats (RHR). n = 10. ## P < 0.01 vs sham group; * P < 0.05 vs model group Ang II 和 ET-1 水平 3 消旋 TJ0711 长期给药对肾性高血压大鼠血浆 MDA 含量的影响 长期给药后模型组血浆 MDA 水平较假手术组显 著提高 消旋 TJ0711 各组的 MDA 含量呈剂量依赖 性减少, 40 及 20 mg kg 1 剂量组的 MDA 水平显著低 于模型组 (P < 0.05); 40 mg kg 1 剂量组的 MDA 水平 与卡维地洛 20 mg kg 1 剂量组相当 ( 表 2) MDA 含 Table 1 Effect of racemic TJ0711 long-term administration for 9 weeks on heart rate of RHR. n = 10, x ± s Group Dose Heart rate/beats min 1 /mg kg 1 1st week 2nd week 3rd week 4th week 5th week 6th week 7th week 8th week 9th week Sham 386 ± 30 371 ± 53 378 ± 44 383 ± 53 343 ± 22 341 ± 26 369 ± 35 356 ± 33 346 ± 14 Model 387 ± 58 377 ± 51 381 ± 54 381 ± 53 375 ± 28 383 ± 51 353 ± 16 390 ± 46 388 ± 79 TJ0711 10 393 ± 37 388 ± 21 365 ± 27 343 ± 30 334 ± 17 352 ± 18 364 ± 25 349 ± 23 351 ± 2 20 379 ± 36 384 ± 34 379 ± 46 352 ± 44 360 ± 33 331 ± 52 346 ± 23 337 ± 24 346 ± 15 40 389 ± 42 368 ± 40 363 ± 38 344 ± 23 363 ± 23 368 ± 30 359 ± 24 342 ± 21 357 ± 18 Carvedilol 20 419 ± 42 399 ± 31 373 ± 32 378 ± 42 359 ± 35 351 ± 7 350 ± 21 342 ± 31 337 ± 10

1004 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (8): 1001 1005 Table 2 Effect of racemic TJ0711 long-term administration on plasma renin, Ang II (angiotensin II), ET-1 (endothelin-1) and MDA (malondialdehyde) level of RHR. n = 8, x ± s. * P < 0.05, ** P < 0.01 vs model group; P < 0.05, P < 0.01 vs sham group Group Dose/mg kg 1 Renin /ng L 1 Ang-II /ng L 1 ET-1 /ng L 1 MDA / nmol ml 1 Sham 110.8 ± 28.09 48.7 ± 9.29 92.0 ± 6.70 5.42 ± 1.55 Model 165.5 ± 27.59 74.3 ± 13.03 119.6 ± 14.79 7.42 ± 1.47 TJ0711 10 130.9 ± 19.22 * 46.5 ± 16.60 * 102.1 ± 11.93 * 6.04 ± 3.32 20 127.2 ± 26.24 * 49.2 ± 7.89 ** 106.6 ± 4.81 * 5.61 ± 1.79 * 40 119.3 ± 12.83 ** 45.3 ± 10.00 ** 105.8 ± 10.64 4.85 ± 0.96 * Carvedilol 20 116.9 ± 8.11 ** 47.3 ± 12.04 ** 99.1 ± 9.92 * 4.84 ± 1.68 * 量可以间接反映细胞受氧自由基攻击而损伤的程度 消旋 TJ0711 40 及 20 mg kg 1 连续给药后与模型组相比 MDA 水平降低, 提示其可能具有抗氧化作用 4 消旋 TJ0711 长期给药对肾性高血压大鼠 LVWI 的影响模型组 LVWI 最高, 假手术组最低, 两者差异显著 (P < 0.01) 消旋 TJ0711 各组的 LVWI 相近, 均小于模型组但无显著性差异 (P > 0.05); 与卡维地洛 20 mg kg 1 剂量组相比, LVWI 略高但无显著性差异 (P > 0.05) 为排除动物体重影响, 比较左心室重 / 全心室重 (LVW/VW) 消旋 TJ0711 10 和 20 mg kg 1 剂量组与模型组相比, LVW/VW 显著降低 (P < 0.05), 40 mg kg 1 剂量组降低不明显 见表 3 5 消旋 TJ0711 长期给药对肾性高血压大鼠左心室羟脯氨酸含量的影响模型组的左心室羟脯氨酸含量高于假手术组, 但无显著性差异 (P > 0.05) 消旋 TJ0711 各组和卡维地洛 20 mg kg 1 剂量组的左心室羟脯氨酸含量有降低趋势, 但各组间差异不显著 (P > 0.05, 表 3) 讨论交感神经系统和肾素 - 血管紧张素系统活性升高与高血压密切相关 β 受体阻断药能降低交感神经活性并阻断肾入球小动脉球旁细胞的 β 1 受体, 减少肾素分泌而降低血压, 同时阻断 α 1 受体能扩张外周血 [4, 管, 发挥降压和降低心脏负荷的作用 5] 因此, 新型的肾上腺素 α, β 受体双重阻断药在治疗高血压和慢性心衰方面的优势受到关注 在前期研究中发现, 消旋 TJ0711 对 α 1 和 β 1 受体的阻断强度相近, 对 α 2 和 β 2 受体阻断作用弱, 该特点不同于现有的 α 和 β 受体阻断药, 有望减少对 α 1 和 β 1 两种肾上腺素受体亚型的不均等影响, 并保留了对心血管系统有利的调节性受体亚型的功能 本研究中消旋 TJ0711 连续给药后可以降低 RHR 的给药前血压, 且存在量效关系, 其中 40 mg kg 1 剂量组的降压作用显著, 说明消旋 TJ0711 尽管半衰期较短 [6], 但存在较好的延时降压效应, 该作用可能与 TJ0711 其他药理效应有关 TJ0711 连续给药亦能有效对抗高血压引起的肾素 - 血管紧张素系统激活, 显著降低血浆肾素和 Ang II 水平 内皮素作为强效缩血管物质, 参与血管张力调节和高血压状态下的血管重构, 在高血压发生发展过程中起重要作用 [7] TJ0711 连续给药降低血浆 ET-1 水平, 有利于对心血管发挥保护作用 MDA 系氧自由基攻击生物膜中多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用终产物之一, 测试组织或血液中 MDA 的含量常可反映机体脂质过氧化的程度, 间接反映细胞受自由基攻击的损伤程度 [8] 在体外研究中曾发现, TJ0711 对血管内皮细胞和红细胞具有浓度相关性的抗氧化损伤作用 本研究表明, TJ0711 连续给药后 RHR 血浆 MDA 水平降低, 说明体内给药同样具有抗 Table 3 Effect of racemic TJ0711 long-term administration on the left ventricular weight index (LVWI) and hydroxyproline content of RHR. LVW/BW (LVWI): Left ventricular weight/body weight; LVW/VW: Left ventricular weight/ventricular weight. x ± s. * P < 0.05 vs model group; P < 0.01 vs sham group Group Dose /mg kg 1 LVW/BW (mg g 1 ) (n = 10) LVW/VW (n = 8) Hydroxyproline /μg mg 1 (n = 7) Sham 2.01 ± 0.24 0.739 ± 0.035 0.390 ± 0.045 Model 2.78 ± 0.58 0.800 ± 0.021 0.440 ± 0.101 TJ0711 10 2.45 ± 0.32 0.771 ± 0.015 * 0.414 ± 0.045 20 2.55 ± 0.39 0.778 ± 0.017 * 0.399 ± 0.072 40 2.44 ± 0.42 0.778 ± 0.030 0.395 ± 0.061 Carvedilol 20 2.37 ± 0.32 0.769 ± 0.033 * 0.387 ± 0.066

李人杰等 : 消旋 TJ0711 长期给药对肾性高血压大鼠的药效学研究 1005 氧化损伤作用 测定心肌羟脯氨酸含量能反映胶原蛋白的含量, 间接反映出心肌细胞胶原纤维增殖的程度 本研究表明, 消旋 TJ0711 能降低 LVWI; 也使左心室羟脯氨酸含量下降, 但未显示统计学差异, 可能与动物例数较少有关 综上所述, TJ0711 连续给药具有心血管保护作用, 该作用与减少内源性缩血管物质含量和抗氧化等多种作用有关 References [1] Xu SY, Bian RL, Chen X. Pharmacological Experimental Methodology ( 药理实验方法学 ) [M]. 3rd ed. Beijing: People s Medical Publishing House, 2002: 941 964. [2] Qiu J, Zhang JF, He LH et al. The hypotensive effect of TMEP a novel α 1 and β 1 receptor blocker [J]. J Huazhong Univ Sci Technol (Health Sci) ( 华中科技大学学报医学版 ), 2002, 31: 631 633. [3] Zhao HP, Hong Y, Xie JD, et al. Effect of berberine on left ventricular remodeling in renovascular hypertensive rats [J]. Acta Pharm Sin ( 药学学报 ), 2007, 42: 336 341. [4] Xiang JZ, Wang JL. Pharmacology ( 药理学 ) [M]. Beijing: Science Press, 2002: 296 299. [5] Feuerstein. GZ, Ruffolo RR. Carvedilol, a novel multiple action antihypertensive agent with antioxidant activity and the potential for myocardial and vascular protection [J]. Eur Heart J, 1995, 16: 38 42. [6] Sun SP, Si LQ, Fan ZZ, et al. Stereoselective HPLC assay of TJ0711 enantiomers by precolumn derivatization with GITC using UV detection and its application in pharmacokinetics in rats [J]. J Huazhong Univ Sci Technol (Med Sci), 2009, 29: 427 430. [7] Wang H, Long CL, Jia GD, et al. Effects of iptakalim hydrochloride on the functions of endothelin system [J]. Chin Pharmacol Bull ( 中国药理学通报 ), 2005, 21: 33 37. [8] Chaswal M, Das S. Cardiac autonomic function in acutely nitric oxide deficient hypertensive rats: role of the sympathetic nervous system and oxidative stress [J]. Can J Physiol Pharmacol, 2011, 89: 865 874.