Journal of Plant Protection Vol. 31, No. 3, Fall 2017, P. 362-373 نشریه حفاظت گیاهان (علوم و صنایع کشاورزي) جلد 31 شماره 3 پاییز 1396 ص 362-373. شناساي ی گونههاي تریکودرما با استفاده از توالییابی جزي ی ژنهاي nrrna و tef1α همراه با معرفی Trichoderma capillare براي میکوفلور ایران چکیده 3 مهدي مهرابی کوشکی 1* - مریم باورساد - 2 رضا فرخی نژاد تاریخ دریافت: 1394/06/30 تاریخ پذیرش: 1396/04/17 گونههاي تریکودرما به فراوانی در خاكهاي کشاورزي یافت میشوند و اغلب آنها بعنوان عامل بیوکنترلی علیه بیمارگرهاي گیاهی عمل میکنند. آنها همچنین بعنوان تولیدکنندههاي صنعتی آنزیمها شناخته میشوند. با توجه به اهمیت این قارچ شناساي ی صحیح آنها در سطح گونه ضروري میباشد. شناساي ی گونهها مبتنی بر خصوصیات ریختشناسی با توجه به هموپلاسی زیاد در صفات ظاهري مناسب نمیباشد. در این تحقیق 40 جدایه تریکودرما از استانهاي اصفهان اراك و همدان با استفاده از توالییابی جزي ی ژنهاي nrrna و tef1α شناساي ی شد. جدایهها در محیط PDB کشت شد و توده میسیلیومی با استفاده از کاغذ صافی جمعآوري شد. میسیلیومها در لیوفیلیزر خشک-انجمادي و سپس از آن استخراج DNA شد. واکنش زنجیرهاي پلیمراز جهت تکثیر حدود 550 و 900 جفت باز بترتیب از نواحی ITS و tef1α با استفاده از آغازگرهاي عمومی و تخصصی انجام شد. قطعات تکثیري توالییابی شد و بعد از ویراستاري و جستجو با استفاده از الگوریتم BLASTn در بانک ژن ذخیره گردید. بر اساس صفات ریختشناسی و آنالیز توالیهاي نوکلي وتیدي ITS و tef1α جدایهها در هفت گروه گونهاي شامل.T.T pleuroticola.t capillare Trichoderma harzianum.t brevicompactum.t koningiopsis asperellum و.T virens توزیع شدند. درخت فیلوژنتیکی این جدایهها با استرینهاي مرجع تیپ بر اساس توالی tef1α ترسیم شد که در آن خوشهبندي فیلوژنتیکی تولید شده اصالت گونهاي جدایههاي مورد بررسی را تا یید کرد. این اولین گزارش گونه.T capillare براي میکوفلور ایران است. واژههاي کلیدي: DNA -بارکدینگ خوشهبندي فیلوژنتیک ریختشناسی مقدمه تریکودرما یک جنس قارچی تکنیاي ی با تلي ومورف Hypocrea است (16). گونههاي تریکودرما اغلب به فراوانی در خاكهاي کشاورزي وجود دارند و بعنوان عامل بیوکنترلی بر علیه بیمارگرهاي گیاهی عمل میکنند (11). آنها همچنین بعنوان تولیدکنندههاي صنعتی بعضی از آنزیمها همچون سلولاز شناخته میشوند (17 و 18). به دلیل این اهمیت شناساي ی دقیق آنها در سطح گونه جهت انجام سایر تحقیقات ضروري میباشد. به منظور شناسایی جدایههاي تریکودرما در سطح گونه از مشخصات فیزیولوژیک و ریختشناسی همچون میزان رشد مشخصات ماکروسکوپی پرگنهها و مشخصات میکروسکوپی آنها شامل شکل اندازه و سایر ویژگیهاي کنیدیوفورها فیالیدها کنیدیومها کلامیدوسپورها ریسههاي هوایی و ریسههاي فرو رفته در محیط کشت استفاده شده است ) 8). استفاده از خصوصیات ریختشناسی به این دلیل که در مورد بعضی گونهها نیاز به مرحله جنسی میباشد و از طرفی هموپلاسی فراوانی در صفات فنوتیپی مشاهده شده است اغلب منجر به شناساي ی اشتباه میگردد (5). بعضی از گونههاي تریکودرما بصورت مخفی همراه جمعیتهاي گونهاي شناخته شده دیگر بصورت کمپلکس بسر میبرند و تنها روشهاي مولکولی قادر است آنها را متمایز کند. لذا ابداع روشهاي مولکولی روش شناساي ی مبتنی بر ریختشناسی و فیزیولوژي را در شرایط کنونی نامعتبر ساخته است (7). یک DNA -بارکدینگ مناسب توالی کوتاهی از یک ژن است که تنوع نوکلي وتیدي زیادي در بین گونهها و تنوع بسیار کمتري در بین 2 1 و 3- به ترتیب استادیار دانشآموخته کارشناسی ارشد و استاد بیماريشناسی گیاهی گروه گیاهپزشکی دانشکده کشاورزي دانشگاه شهید چمران اهواز (Email:mhdmhrb@scu.ac.ir (*- نویسنده مسي ول: DOI: 10.22067/jpp.v31i3.48738
شناساي ی گونههاي تریکودرما با استفاده از توالییابی جزي ی ژنهاي... 363 جمعیتهاي یک گونه نشان میدهد ) 12 و 13). اگرچه توالیهاي ITS مربوط به ژن RNAریبوزومی هسته ) (nrrna با موفقیت براي شناساي ی و تمیز گونههاي Trichoderma و Hypocrea استفاده شده است (4) لیکن این ناحیه ژنی مناسب براي بعضی گونهها نمیباشد. ژن tef1α یک بارکدینگ مناسب براي گونههاي فوزاریوم (9) و تریکودرما (4) شناخته شده است. امروزه توالییابی بعضی از ژنهاي شاخص همچون β-tubulin rpb2 tef1α calmodulin و chi18-5 و استفاده از آنها بصورت انفرادي یا چندگانه در بررسی فیلوژنی جمعیتهاي تریکودرما و نهایتا" تشخیص گونههاي فیلوژنتیک (GCPSR) دقیقترین روش جهت جداسازي گونهها میباشند (6 و 7). در ایران در مطالعات گذشته گونههاي.T.T pleuroticola T. T. T. longibrachiatum T. virens asperellum T. asperellum T. brevicompactum koningiopsis T. ghanense T. harzianum T. hamatum atroviride T. velutinum T. inhamatum T. citrinoviride T. ceramicum T. koningii T. spirale T. tomentosum T. reesei T. crassum آنامورف Hypocrea andinensis و آنامورف.H orientalis از مناطق مختلف ایران جداسازي و شناساي ی شده است (روحانی اطلاعات منتشر نشده 28 26 20 19 14 و 29). با در نظر گرفتن اینکه در یک دهه اخیر با بسط مطالعات مولکولی با استفاده از آنالیز چندین لوکوس ژنی ناپیوسته تعداد گونههاي تریکودرما افزایش یافته است و از طرفی هر گونه مطالعه در زمینه اکولوژي و تواناي ی بیوکنترلی قارچ تریکودرما مستلزم شناساي ی دقیق جدایههاي مورد استفاده در سطح گونه میباشد در این تحقیق 40 جدایه تریکودرما از کلکسیون قارچی گروه گیاهپزشکی دانشگاه شهید چمران اهواز با استفاده از روشهاي مبتنی بر ریختشناسی و مولکولی مورد شناساي ی قرار گرفت. مواد و روش کار جدایههاي تریکودرما و خالصسازي در این مطالعه از کلکسیون قارچی گروه گیاهپزشکی دانشگاه شهید چمران اهواز 40 جدایه تریکودرما انتخاب شد. این جدایه ها از خاكهاي زراعی استانهاي اصفهان همدان و اراك جداسازي شده بود. جدایهها براي کوتاهمدت روي محیط سیبزمینی- دکستروز- آگار (PDA) و براي درازمدت بصورت تودههاي اسپور مخلوط با ماسه نگهداري شدند. جدایههاي تریکودرما به ظروف پتري محتوي PDA مایهزنی و جهت اسپوردهی در شرایط نور و دماي 28 C به مدت یک تا چهار هفته بسته به نوع جدایه نگهداري شدند. سپس با استفاده از آب مقطر استریل محتوي 0/1 درصد تویین 80 سوسپانسیون اسپور تهیه شد. خالصسازي جدایهها به روش تکاسپور روي محیط کشت تا 1/4 ضعیف شده سیبزمینی-دکستروز- آگار PDA) (¼-strength انجام شد.(1) بررسی ریختشناسی جدایههاي تریکودرما روي محیط کشتهاي (Merck) PDA آرد ذرت - آگار Aldrich) (CMA, Sigma و سنتتیک حداقلی (SNA) در دماي 28 C و تناوب نوري 12 -ساعته رشد داده شدند. مشخصات ریخت شناسی و فیزیولوژیک بسته به نوع جدایه و صفت 3-25 روز بعد از مایهزنی برداشت شد. اندازهگیريهاي میکروسکوپی با استفاده از لنزهاي شیي ی 40X و 100x میکروسکوپ ماتیک Microscope) (Motic BA210 Basic Biological Light مجهز به نرمافزار اندازهگیري انجام شد. مشخصات کیفی و کمی مشاهده شده براي هر جدایه در محیط نرمافزاري کلید آنلین مخصوص گونههاي جنس تریکودرما (23) ثبت و گونههاي مورفومتریک بر اساس آن تفکیک شد. تولید بیوماس قارچی و استخراج DNA اسپورهاي تریکودرما با نسبت 10 5 اسپور در میلیلیتر به محیط کشت PDB مایهزنی و 48 ساعت در شرایط دماي ی 28 C و rpm 120 نگهداري شدند. با استفاده از قیف و گاز سترون توده میسیلیومی رشد یافته در محیط کشتهاي مایع PDB جمعآوري و با آب مقطر سترون شستشو شد. توده میسیلیومی حاصله بلافاصله بعد از آبگیري اولیه به لولههاي سانتریفوژ 50 میلیلیتري منتقل و به مدت دو ساعت در فریزر 80- نگهداري شدند. سپس درب لولهها با قطعات گاز سترون جایگزین و در دستگاه لیوفیلیزر که قبلا" در دماي حدود C 55 - تنظیم شده بود قرار داده شد و سپس پمپ خلاء روشن شد. نمونهها در مدت 16 ساعت نگهداري در این شرایط خشک-انجمادي شد. توده میسیلیومی خشک شده به هاون چینی سترون منتقل و با استفاده از دسته هاون در درون ازت مایع پودر گردید. پودر ایجاد شده در همان لوله سانتریفوژ جمعآوري دربگذاري با پارافیلم مسدود و تا زمان استخراج DNA در دماي 20 C- نگهداري شدند. جداسازي DNA به روش ریدر و برودا (21) با اندکی تغییر انجام گرفت. DNA با بارگذاري روي ژل آگاروز و میزان جذب در طول موج 260 و 280 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر (مدل eppendorf (BioPhotometer plus کمیتسنجی و کیفیتسنجی شد (شکل 1). تکثیر ژنهاي ITS و tef1α از جفت آغازگر عمومی (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) و ITS1-F ITS4-R
364 نشریه حفاظت گیاهان (علوم و صنایع کشاورزي) جلد 31 شماره 3 پاییز 1396 ITS براي تکثیر ناحیه (TCCTCCGCTTATTGATATGC) (27) و جفت آغازگر اختصاصی tef171-f tef1997-r و (CAAAATGGGTAAGGAGGASAAGAC) (CAGTACCGGCRGCRATRATSAG) براي تکثیر ژن tef1α (از اگزون 1 تا اگزون 5 حاوي اینترونهاي 3 2 1 و 4) استفاده شد (24). مخلوط واکنش زنجیرهاي پلیمراز در حجمهاي 3mM غلظت نهاي ی 10x Taq buffer بافر 5μl با استفاده از 50μl از 3μl MgCl 2 آغازگر پیشرو( 10μm ) 3μl آغازگر معکوس Taq آنزیم 0/5μl dntp (2.5μm each) از 2 μl (10μm) (5u/μl) DNA 2μl DNA Polymarase الگو (حدود 200 نانوگرم) و آب مقطر دوبار تقطیر شده میلیکیور تا حجم 50μl تهیه و تکثیر با رژیم حرارتی ذیل در دستگاه ترموسایکلر انجام شد. واکنش زنجیرهاي پلیمراز در یک ترموسیکلر (مدل MJ Mini TM Gradient (Thermal Cycler با رژیم حرارتی تجربی ذیل تنظیم شد: نوع رژیم ذوب اولیه چرخههاي اصلی پلیمریزاسیون نهاي ی تعداد چرخه 1 35 درجه حرارت (C ) 94 94 51 براي ITS 57 براي tef1α 72 72 مدت زمان (ثانیه) 180 30 30 90 300 1 خالص سازي قطعات تکثیري و توالییابی محصولات PCR مربوط به هر جدایه در دو گروه ژن ITS و tef1α در لولههاي سانتریفوژ جمعآوري و با استفاده از روش رسوب با اتانول تغلیظ و شستشو شد (2). براي این منظور 1/10 حجم استات سدیم 3 مولار با ph 5.4 و 2-3 برابر حجم اتانول مطلق اضافه و به مدت یک شب در دماي 80- نگهداري شد. سپس در دماي º4 C و دور 10000 xg به مدت 20 دقیقه سانتریفوژ شد و رسوب حاصله با استفاده از اتانول 70 درصد شستشو شد. رسوب نهاي ی در 25 µl آب مقطر میلیکیور حل و جهت توالییابی با استفاده از آغازگرهاي پیشرو و معکوس به شرکت ماکروژن ارسال شد. آنالیز توالیها و تایید فیلوژنتیکی گونهها توالیهاي بدست آمده از تکثیر ژنهاي ITS و tef1α با استفاده از نرمافزار.v 7.0.9.0 (10) BioEdit ویراستاري شد. خوانشهاي پیشرو و معکوس هر ژن براي هر جدایه با استفاده از نرم افزار DNA Baser Sequence Assembeler v4 (www.dnabaser.com) مونتاژ و بعنوان توالی تصحیحشدهاي نهاي ی مدنظر قرار گرفت. جهت تفسیر و تعیین نواحی اکسون و اینترون توالیهاي کد کننده پروتي ین tef1α در محیط نرمافزار BioEdit از توالیهاي مرجع تا یید شده در پایگاههاي اطلاعات ژنوم استفاده شد. توالیها به پایگاه اطلاعات ژنوم NCBI معرفی و با استفاده از الگوریتم BLASTn براي شناساي ی هیتهاي بلاست و توالیهاي شناخته شدهي مرتبط جستجو شد. هیتهاي ی که داراي و بالاترین درصد بالاترین درصد شناساي ی با کمترین شاخص 1 E پوشش توالی بودند بعنوان نزدیکترین توالی در تا یید شناساي یهاي قبلی مبتنی بر ریختشناسی مد نظر قرار گرفتند. جهت تایید فیلوژنتیکی هفت گونه شناساي ی شده توالیهاي tef1α مربوط به جدایههاي این مطالعه و هفت استرین تیپ از بانک ژن و پایگاه اطلاعات ژنوم کمسیون بین المللی جهت تاکسونومی Trichoderma و Hypocrea یا (http://www.isth.info) ISTH 2 انتخاب شدند و با استفاده از برنامه ClustalW در نرمافزار.v 7.0.9.0 BioEdit هم راستا شدند. درخت فیلوژنتیکی درست نماي ی بیشینه ) maximum (likelihood از طریق مدل (K2+G) Kimura 2-parameter با استفاده از نرمافزار MEGA 6 ترسیم شد (25). نتایج جهت شناساي ی اولیه مشخصات ریختشناسی و پرگنه که روي محیط CMD PDA و SNA رشد یافتند اندازهگیري شدند. با ورود این مشخصات در کلید آنلین شناساي ی تریکودرما ) 23) جدایهها در هفت گروه گونهاي قرار گرفتند (جدول 1). یازده نماینده از این گروهها براي شناساي ی دقیق مولکولی استفاده شد. پس از ارزیابی توالیهاي نوکلي وتیدي ITS و tef1α مربوط به جدایههاي مورد بررسی توالیهاي تاییدشده در پایگاه اطلاعات ژنوم NCBI نمایه شدند و دسترسی به آنها تحت شمارههاي درج شده در جدول 2 امکانپذیر است. با معرفی توالیهاي بدست آمده در بانک ژن و انجام عملیات جستجو با استفاده از الگوریتم BLASTn میزان شباهت آنها با توالی استرینهاي مرجع آشکار شد (جدول 2). بر اساس صفات ریختشناسی و تجزیه و تحلیل توالیهاي نوکلي وتیدي ITS و tef1α جدایهها در هفت گروه گونهاي شامل & Samuels.T capillare T. asperellum T. pleuroticola Yu & Park Kubicek T. virens (J.H. Mill., Samuels, Lieckf & Nirenberg T. koningiopsis Oudem. Giddens & A.A. Foster) Arx T. و T. brevicompactum Kraus, Kubicek & Gams harzianum Rifai توزیع شدند (جدول 2). این توالیها همچنین به محیطهاي نرمافزاري اختصاصی تریکودرما همچون TrichO Key 1- E Value: Expected value 2- International Subcommission on Trichoderma and Hypocrea Taxonomy
شناساي ی گونههاي تریکودرما با استفاده از توالییابی جزي ی ژنهاي... 365 کلادهاي با ارزش 99 98 96 86 94 99 و 99 درصد با استرینهاي تیپ همان گونهها ایجاد کردند (شکل 2) که این خوشهبندي فیلوژنتیکی اصالت گونهاي آنها را تا یید میکند. این مطالعه اولین توالی ITS و طول بیشتري از ژن tef1α (از اگزون 1 تا اگزون 5) را براي گونه.T capillare در بانک ژن نمایه کرد. در بررسی و تفسیر توالی tef1α مربوط به این گونه جهشهاي متعددي از نوع تغییر در نواحی کدکننده ناشی از اضافه شدن نوکلي وتید frameshift) (insertion مشاهده شد که موضوع جالبی براي مطالعات آینده میتواند باشد (شکل 3). علاوه بر استفاده از نواحی ITS و tef1α جهت شناساي ی مولکولی هفت گونه مطالعه شده مشخصات مهم ریختشناسی و رشدي جدایههاي مورد بررسی براي گونههاي ی که قبلا" از ایران گزارش شده است در جدول 1 بصورت خلاصه آورده شده است و گونه.T capillare Samuels & Kubicek که براي میکوفلور ایران جدید میباشد شرح داده میشود (شکل 4). (5) و (15) TrichoBLAST معرفی و با گونههاي موجود در ISTH اعتبارسنجی شدند. در جستجوي BLASTn هر کدام از توالیهاي ITS و tef1α براي جدایههاي مربوط به گونههاي.T koningiopsis.t virens و.T brevicompactum شناساي ی دقیق و بدون ابهامی اراي ه کردند در صورتیکه توالی ITS براي جدایههاي مربوط به گونههاي.T T. capillare و T. asperellum T. pleuroticola harzianum شناساي ی معتبري اراي ه نکرد و براي این گونهها توالی tef1α بعنوان -DNA بارکدینگ مناسب جهت تا یید نام گونه مد نظر قرار گرفت (جدول 2). درصد شناساي ی توالیها جدایههاي مورد بررسی به ترتیب براي توالیهاي 96-100 tef1α درصد و 88-99 ITS درصد اراي ه شد (جدول 2). جهت تا یید فیلوژنتیکی گونهها درخت فیلوژنتیکی این جدایهها با استرینهاي مرجع تیپ بر اساس توالی tef1α ترسیم شد که در آن جدایههاي شناساي ی شده گونههاي.T.T virens T. T. harzianum T. brevicompactum koningiopsis T. asperellum pleuroticola و T. capillare به ترتیب
366 نشریه حفاظت گیاهان (علوم و صنایع کشاورزي) جلد 31 شماره 3 پاییز 1396
شناساي ی گونههاي تریکودرما با استفاده از توالییابی جزي ی ژنهاي... 367
368 نشریه حفاظت گیاهان (علوم و صنایع کشاورزي) جلد 31 شماره 3 پاییز 1396
شناساي ی گونههاي تریکودرما با استفاده از توالییابی جزي ی ژنهاي... 369 38 100 75 T. pleuroticola Isf-11* 99 T. pleuroticola Isf-15* 100 T. pleuroticola CBS 124383 (TYPE HM142381) T. harzianum Isf-B* 100 T. harzianum CBS 226.95 (TYPE AY605833) T.virens GJS 01-287 (TYPE ISTH) T. virens Ham-65* 100 T. virens Isf-77* T. capillare ISf-7* T. capillare C.P.K. 2883 (TYPE JN182283) T. capillare C.P.K. 885(JN182277) T. capillare C.P.K. 3412(JN182284) T. capillare TW22166(KT862524) T. capillare GJS 06-66(JN175585) T. capillare GJS 99-3(JN175584) 100 T. brevicompactum Arak-146* T. brevicompactum GXNN2002 (TYPE JQ040332) 100 T. koningiopsis Arak-96* 68 T. koningiopsis GJS 93-20 (TYPE DQ284966) 99 T. asperellum Arak-12* 100 T. asperellum CBS 433.97 (TYPE AY376058) N. macroconidialis(ac:jf735693) 0.1 شکل 2- درخت فیلوژنتیکی جدایهها که در آنالیز درستنماي ی بیشینه بر اساس توالیهاي tef1α با استفاده از مدل K2+G بدست آمده است. درصد تکرار کلادها در 1000 بار نمونهگیري کاذب (بوتاستراپ) در محل ریشه کلادها درج شده است. درخت با استفاده از گونه نزدیک.N macroconidialis ریشهدار شده است Figure 2- The phylogram of isolates constructed through maximum likelihood analysis based on tef1α sequence under K2+G model. The percentages of replicate trees in the bootstrap test (1000 replicates) have been shown next to the branches. The tree was rooted to close species of N. macroconidialis شد. تراکم جوشها بیشتر در اطراف پرگنه مخصوصا مرز سطح محیط کشت با دیواره پتري مشاهده شد. اسپورزاي ی در شرایط تناوب نوري رشد کشتهاي قارچ بصورت دوایر متحدالمرکز مشاهده نگردید. تولید کلامیدوسپور مشاهده نشد. کنیدیوفورها بیرنگ داراي دیواره صاف و تولید انشعابات فرعی که هرکدام به تعدادي فیالید در انتها منجر شد اگرچه تعداد کمی از این کنیدیوفرها تولید فیالیدهاي منفرد بصورت انتهاي ی و گهگاهی جانبی کردند. فیالیدها تنگیشکل تا تقریبا استوانهاي کاملا" متورم در نیمه پایینی بیشتر مستقیم و متقارن ولی گاهی خمیده قلابمانند و نامتقاران اندازه آنها بر اساس 80 اندازهگیري (13) 10-5/5 (4/5) میکرومتر طول و (4) 2/5-3/5 (2) میکرومتر پهنا در متورمترین قسمت مشاهده شد. کنیدیومها تقریبا کروي تا بیضوي سطح زبر با رنگ سبز روشن ابعاد آنها بر اساس 80 اندازهگیري (4/5) 2/5-4 میکرومتر قطر طولی و ) 4) 3- (2) 2/5 میکرومتر قطر عرضی مشاهده شد. Trichoderma capillare G.J. Samuels & C.P. (2012) 83 Kubicek, Fungal Diversity 55: (شکل (4 میزان رشد شعاعی پرگنه بر اساس سه تکرار روي محیط کشت PDA در دماي 25±1 ºC و 35±1ºC با اصلاح اثر تنش انتقال دیسک میسیلیومی به ترتیب 55 و 60 میلیمتر پس از 72 ساعت مشاهده شد. این میزان روي محیط کشت SNA در دماي 35±1ºC 45 میلیمتر ثبت شد. ریسههاي قارچ روشن و عموما فرورفته و سطح پرگنه کاملا صاف مشاهده شد. سطح روي ی و پشتی پرگنه رشد کرده روي محیط PDA در ابتدا روشن و با تولید فراوان رنگدانه زرد به زردي گرایش پیدا کرد. زردي پرگنه با گذشت زمان و نگهداري دو هفتهاي در دماي آزمایشگاه کاهش پیدا کرد. بر خلاف اکثر گونهها اسپورزاي ی روي محیط PDA و در شرایط نگهداري در نور ممتد بسیار با تا خیر و از هفته دوم بصورت ظهور جوشهاي عموما کروي برجسته پرزدار سبز روشن و متراکم با اندازههاي متفاوت تا 5 میلیمتري انجام
370 نشریه حفاظت گیاهان (علوم و صنایع کشاورزي) جلد 31 شماره 3 پاییز 1396 بحث شناساي یهاي متفاوت گونهها بر اساس توالیهاي ITS و tef1α ثابت میکند که تشخیص گونهها بر اساس توالی یک ژن مخصوصا" توالی ITS براي گونههاي تریکودرما دقیق نمیباشد و این در مطالعات قبلی نیز به اثبات رسیده است (4). گونه.T capillare براي اولین بار در این مطالعه براي میکوفلور ایران گزارش میشود. این گونه در سال 2012 با استفاده از بررسیهاي فیلوژنتیک از سایر جمعیتهاي تریکودرما جدا و بعنوان گونه مستقل در بخش Longibrachiatum قرار گرفت (22). همچنین این مطالعه توالی ناحیه ITS و توالی اینترونهاي 2 و 3 مربوط به ژن tef1α را براي اولین بار به بانک ژن معرفی و آن را ثبت کرد. شکل 3- موتاسیونهاي چندگانه از نوع تغییر در نواحی کدکننده جدایه Isf-7.T capillare در مقایسه با سایر جدایههاي مورد بررسی Figure 3- Multiple insertion-type frame shifts in tef1α reading frame of T. capillare Isf-7 compere to other isolates surveyed در این بررسی شش گونه.T asperellum.t pleuroticola T. و T. brevicompactum T. koningiopsis T. virens harzianum نیز شناساي ی شدند که قبلا" براي میکوفلور ایران گزارش شده است (روحانی اطلاعات منتشر نشده 26 20 19 14 28 و ). 29 نعیمی و همکاران ) 19) جدایههاي ی از خاك و فیلوسفر مزارع برنج در نوار شمالی کشور و ساحل جنوبی دریاي خزر جمعآوري کردند و بعد از شناساي ی مولکولی با استفاده از نواحی ITS جدایهها در شش گروه گونهاي T. T. atroviride T. asperellum T. virens و T. harzianum T. hamatum brevicompactum قرار گرفتند. نظمی و همکاران (20) گونههاي تریکودرما همراه خاك و چوب پوسیده جمع آوري شده از استانهاي شمال کشور (گیلان مازندران و گلستان) را بررسی کردند و در این بررسی گونههاي Hypocrea آنامورف T. reesei T. crassum T. ceramicum andinensis و آنامورف.H orientalis را بعنوان گونههایی جدیدي براي میکوفلور قارچی ایران گزارش کردند. گونههاي.T harzianum و.T virens تقریب ا" در تمام تحقیق ات راجع ب ه تریکودرما در حوزههاي مختلف جغرافیاي ی در ایران گزارش شده است ) روحانی اطلاعات منتشر نشده 28 26 20 19 14 و 29) و این غالب بودن این گونهها را در جمعیت تریکودرماي خاك و فراریشه نشان میدهد. نتایج این تحقیق نشان میدهد که در مطالعات شناساي ی گونه و ارزیابیهاي فیلوژنتیک استفاده از چند ژن ضروري میباشد (جدول 1). تنها جدایه Isf-7.T capillare در این مطالعه با استفاده از جستجوي بلاست توالی ناحیه tef1α شناساي ی شد. همچنین تا یید گونهه اي.T pleuroticola و.T asperellum با استفاده از جستجوي بلاست ژن tef1α انجام شد. دود و همکاران (3) نیز اذعان کردند شناساي ی گونههاي جنس تریکودرما با استفاده از توالی ITS کافی براي جداکردن تمام گونهها نمیباشد.
شناساي ی گونههاي تریکودرما با استفاده از توالییابی جزي ی ژنهاي... 371 c b a d e f g h i شکل -4 Isf-7 a :T. capillare و.b پرگنه 7 روزه رشدیافته روي c PDA و.d پرگنه 10 روزه رشدیافته روي e PDA و.f پرگنه 25 روزه رشدیافته روي h g PDA و i. کنیدیوفور کنیدیوم و فیالیدها از کشتهاي 10 روزه. خط مقیاس 10 میکرومتر است Figure 4- a and b, T. capillare Isf-7: 7-days colony on PDA. c and d, 10-days colony on PDA. e and f, 25-days colony on PDA. Conidiophores, conidia and phialids from 10-days cultures, Scale bars: 10 μm یک ژن یا یک ناحیه از DNA که توالی نوکلي وتیدي کوتاهی باشد و تنوع آن در افراد داخل یک گونه بسیار کمتر از بین گونهها باشد (تنوع بین گونهاي بیشتر از تنوع درونگونهاي باشد) میتواند بعنوان DNA بارکدینگ جهت تشخیص گونهها استفاده شود ) 12 و 13) و تحقیقات اخیر نشان میدهد که نواحی ITS براي گونههاي تریکودرما این ویژگی را ندارد و به تنهاي ی قادر به جدا کردن گونهها نیست (5). ناحیه ژنی DNA tef1α بارکدینگ و مارکر مناسبی جهت تمییز گونههاي قارچی از جمله Trichoderma و تلومورف آن Hypocrea است (5). از طرفی توسعه مفهوم گونه فیلوژنتیک با استفاده از تعدادي ژن که ارزش طبقهبندي دارند و ارتولوگ آنها در موجودات مختلف یافت میشوند باعث افزایش گونههاي قارچی از جمله تریکودرما شده است (7). بطور کلی با توجه به شباهتهاي زیاد گونههاي نزدیک از نظر صفات ظاهري و هموپلاسی فراوان در گونههاي قارچی استفاده از صفات مولکولی از جمله توالیهاي DNA جهت شناساي ی گونه و کشف ارتباطات فیلوژنتیک آنها افقهاي روشنی را در علم سیستماتیک قارچی نوید خواهد داد و سیر شتابان تحول در سیستماتیک قارچها در سالهاي اخیر نیز محصول همین رویکرد میباشد. تحقیق اخیر نیز در همین راستا با شناساي ی مولکولی هفت گونه تریکودرما گونهاي جدید.T capillare را براي میکوفلور ایران معرفی کرده است.
372 نشریه حفاظت گیاهان (علوم و صنایع کشاورزي) جلد 31 شماره 3 پاییز 1396 1- Ainsworth G.C. 1971. Ainsworth and Bisby s dictionary of the fungi. 6th ed. Common wealth Mycological Institute, Kew, Surrey, England. 2- Crouse J., and Amorese D. 1987. Ethanol precipitation: ammonium acetate as an alternative to sodium acetate. Focus, 9: 3 5. 3- Dodd S., Crowhurst R.N., Rodrigo A.G., Samuels G.J., Hill R.A., and Stewart A. 2003. Examination of Trichoderma phylogenies derived from ribosomal DNA sequence data. Mycological Research, 4: 32-39. 4- Druzhinina I., and Kubicek C.P. 2005. Species concepts and biodiversity in Trichoderma and Hypocrea: from aggregate species to species clusters. Journal of Zhejiang University Science Botany, 6: 100-112. 5- Druzhinina I.S., Kopchinskiy A.G., Komon M., Bissett J., Szakacs G., and Kubicek C.P. 2005. An oligonucleotide barcode for species identification in Trichoderma and Hypocrea. Fungal Genetics and Biology, 42: 813-828. 6- Druzhinina I.S., Kopchinskiy A.G., and Kubicek C.P. 2006. The first one hundred of Trichoderma species is characterized by molecular data. Mycoscience, 47: 55-64. 7- Druzhinina I.S., Komo -Zelazowska M., Ismaiel A., Jaklitsch W., Mullaw T., Samuels G.J., and Kubicek C.P. 2012. Molecular phylogeny and species delimitation in the section Longibrachiatum of Trichoderma. Fungal Genetics and Biology, 49: 358-368. 8- Gams W., and Bissett J. 1998. Morphology and identification of Trichoderma. pp. 3-31. In C.P. Kubicek and G.E. Harman (eds.) Trichoderma and Gliocladium, Taylor & Francis, London. 9- Geiser D.M., Jimenz Gasco M.M., Kang S., Mkalowska I., Veeraraghavan N., Ward T.J., Zhang N., Kuldau G.A., and O Donnell K. 2004. Fusarium-IDv.1.0: A DNA sequence database for identifying Fusarium. European Journal of Plant Pathology, 110: 473-479. 10- Hall T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series, 41: 95-98. 11- Harman G.E., Howell C.R., Viterbo A., Chet I., and Lorito M. 2004. Trichoderma species-opportunistic, avirulent plant symbionts. Nature Review Microbiology, 2:43 56. 12- Hebert P.D.N., Cywinska A., Ball S.L., and dewaard J.R. 2003a. Biological identifications through DNA barcodes. Proceedings of the Royal Society of London: Series B, 270: 313 321. 13- Hebert P.D.N., Ratnasingham S., and dewaard J.R. 2003b. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proceedings of the Royal Society of London: Series B, 270: 96 99. 14- Karimi S. 2005. Help to identification of Trichoderma species and endomycorrhizae as useful fungi of walnut rhizosphere in Hamadan province. MSc thesis, agriculture faculty, Buali Sina University of Hamadan, Iran. ( In Persian with English abstract) 15- Kopchinskiy A.G., Komon M., Kubicek C.P., and Druzhinina I.S. 2005. TrichoBLAST: A multilocus database for Trichoderma and Hypocrea identifications. Mycological Research, 109:657 660. 16- Kullnig-Gradinger C., Szakacs G., and Kubicek C.P. 2002. Phylogeny and evolution of the genus Trichoderma: a multigene approach. Mycological Research, 106:757 767. 17- Mehrabi-Koushki M., Rouhani H., and Farsi M. 2011. Genetic manipulation of fungal strains for Improvement of heterologous genes expression (a minireview). African Journal of Biotechnology, 10: 7939-7948. 18- Mehrabi-Koushki M., Rouhani H., and Mahdikhani-Moghaddam E. 2012. Differential display of abundantly expressed genes of T. harzianum during colonization of tomato-germinating seeds and roots. Current Microbiology, 65:524 533. 19- Naeimi S., Khodaparast S.A., Javan-Nikkhah M., Vagvolgyi. C., and Kredics L. 2011. Species patterns and phylogenetic relationships of Trichoderma strains in rice fields of southern Caspian sea, Iran. Cereal Research Communications, 39: 560 568. 20- Nazmi-Roodsari F., Zafari D., Khodaparast A., and Rouhani H. 2007. Introducing some new species of Trichoderma for Iran. Rostaniha, 8:67-88. 21- Raeder U., and Broda P. 1985. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Letters in Applied Microbiology, 1: 17 20. 22- Samuels G.J., Ismaiel A., Mullaw T.B., Szakacs G., Druzhinina I.S., Kubicek C.P., and Jaklitsch W.M. 2012. The Longibrachiatum Clade of Trichoderma: a revision with new species. Fungal Diversity, 55:77-108. 23- Samuels G.J., Chaverri P., Farr D.F., and McCray E.B. 2016. Trichoderma Online, Systematic Mycology and Microbiology Laboratory, ARS, USDA, available from: http://nt.arsgrin.gov/taxadescriptions/keys/trichodermaindex.cfm. 24- Shoukouhi E., and Bissett J. 2008. Preferred primers for sequencing the 50 end of the translation elongation factor 1-alpha gene (EF1 -a1) and subunit 2 of the RNA polymerase B gene (RPB2). ISTH available from: http://www.isth.info/methods. 25- Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., and Kumar S. 2013. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution, 30: 2725-2729. منابع
شناساي ی گونههاي تریکودرما با استفاده از توالییابی جزي ی ژنهاي... 373 26- Vahabi K. 2004. Genetic diversity of Trichoderma species related to Agaricus bisporus mushroom using morphological and molecular methods. MSc. Thesis, agriculture faculty, Isfahan University of the technology, Iran. (In Persian with English abstract) 27- White T.J., Bruns T., Lee S., and Taylor J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. P315 322. In: MA Innis et al. (ed.) PCR Protocols: a guide to methods and applications. Academic Press, New York, USA. 28- Zafari D., Zare R., Ershad D., and Alizadeh A. 2003. A contribution to the identification of Trichderma species in Iran. Iranian Journal of Plant Pathology, 38: 9-15. (In Persian with English abstract) 29- Zafari D., Zare R., Ershad D., and Alizadeh A. 2004. Introduction of three new species of Trichoderma for mycoflora of Iran. Rostaniha, 5: 63-65. (In Persian with English abstract)