NR612-v9.2

VAHTS Stranded mrna-seq Library Prep Kit for Illumina V2 NR612 Vazyme Biotech Co., Ltd. Web: Tel: 400-600-9335 Sales: sales@vazyme.com Support: support@vazyme.com Service: service@vazyme.com Vazyme biotech co., ltd. 使用说明书 Version 9.2

目录 Contents 01/ 产品概述 VAHTS Stranded mrna-seq Library Prep Kit for Illumina V2 是针对 Illumina 高通量测序平台定向开发的链特异性转录组文库构建专用试剂盒 本试剂盒适用于起始模板量为 0.05-4 μg 完整度良好的动 植物及真菌等真核生物的总 RNA 的链特异转录组文库构建, 与常规转录组建库不同的是在第二链合成时底物掺入了 dutp, 并在 PCR 扩增富集文库前将带 U 标记的第二链模板用 UDG 酶消化, 确保了最终的测序信息都来自于第一链 cdna, 从而保留了 mrna 的链方向性, 后期数据分析可确定转录本是来自 DNA 的正义还是反义链 本试剂盒是 VAHTS Stranded mrna-seq Library Prep Kit for Illumina 的升级产品, 该版本极大的简化了操作流程, 提高了文库转化效率, 兼容更低起始投入量, 利用磁珠分选的方式, 可以快速获得特定长度的文库, 满足不同实验的个性化需求 试剂盒包含的所有酶和缓冲液都经过了严格的质量控制和功能验证, 最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性 02/ 产品组分 组分 NR612-01 (24 rxn) NR612-02 (96 rxn) 01/ 产品概述... 02 02/ 产品组分... 02 03/ 保存条件... 02 04/ 适用范围... 03 05/ 自备材料... 03 06/ 注意事项... 04 07/ 实验原理与流程概要... 05 08/ 使用方法... 07 08-1/mRNA 分离与片段化... 07 08-2/ 双链 cdna 合成... 08 08-3/ 接头连接... 09 08-4/ 连接产物纯化和片段大小分选... 09 08-5/ 文库扩增... 12 09/ 常见问题及解决方案... 15 Box 1 mrna Capture Beads Beads Binding Buffer Beads Wash Buffer Tris Buffer Frag/Prime Buffer Actinomycin D (5 mg/ml) 1st Strand Buffer 2 1st Strand Enzyme Mix 2 2nd Strand Marking Buffer 2 1.2 ml 1.2 ml 9.6 ml 1.2 ml 468 μl 24 μl 144 μl 48 μl 600 μl 4.8 ml 4.8 ml 38.4 ml 4.8 ml 2 936 μl 96 μl 576 μl 192 μl 4 600 μl Box 2 2nd Strand Enzyme Super Mix 360 μl 2 720 μl Rapid Ligation Buffer 3 600 μl 4 600 μl Rapid DNA Ligase 2 PCR Primer Mix 3 VAHTS HiFi Amplification Mix Heat-labile UDG 120 μl 120 μl 600 μl 24 μl 480 μl 480 μl 4 600 μl 96 μl 产品组分表中标注的颜色代表各组分管盖颜色, 大于 1.5 ml 体积的组分均保存于 HDPE 瓶中 BOX 1 及 BOX 2 可单独购买, 货号分别为 N401 NR604 03/ 保存条件 Box1:2 ~ 8 保存 ;2 ~ 8 运输 Box2:-30 ~ -15 保存 ;-20 ~ 0 运输 01/ 02

04/ 适用范围 本试剂盒适用于 0.05-4 μg 动 植物及真菌等真核生物总 RNA; 真核生物的 mrna 带 ploy(a) 尾可被表面带多聚 T 的磁珠分离纯化, 排除总 RNA 中 rrna 的干扰 不同样品的总 RNA 中 mrna 的含量差异较大, 若总 RNA 起始投入量过低不能确保得到足够的 mrna 用于后续文库构建 本试剂盒适用于 RNA 完整度较好的样本 (RIN 值 7); 低质量的样本 RNA 会发生断裂, 用磁珠法抓取 mrna 的建库方式会引入 偏好性,RIN 值 <7 的 RNA 样本请采用探针法去除 rrna 的方式建库 VAHTS Total RNA-seq (H/M/R) Library Prep Kit for Illumina (Vazyme #NR603) 本试剂盒适用于针对 mrna 的链特异分析 ; 若需分析人 大鼠 小鼠等动物的 lnc-rna 及 cirrna, 请选择 VAHTS Total RNA-seq (H/M/R) Library Prep Kit for Illumina (Vazyme #NR603) 基因表达 (gene expression analysis); 单核苷酸变异 (single nucleotide variation calling); 可变剪切 (alternative splicing detection); 融合基因 (gene fusion detection); 目标转录组分析 (target transcriptome analysis) 05/ 自备材料 RNA 评价 : Equalbit RNA HS Assay Kit (Vazyme#EQ211); Agilent RNA 6000 Pico Kit (Agilent #5067-1513); 纯化磁珠 : VAHTS DNA Clean Beads (Vazyme #N411) 或 Agencourt AMPure XP Reagent (Beckman #A63880/A63881/A63882); 连接接头 : VAHTS RNA Adapters set1/2 for Illumina (Vazyme #N803/N804) 或 VAHTS RNA Adapters set3 - set6 for Illumina (Vazyme #N809/N810/N811/N812) 或 VAHTS RNA Multiplex Oligos set1/2 for Illumina (Vazyme #N323/N324); 文库质控 : Equalbit dsdna HS Assay Kit (Vazyme#EQ111); Agilent DNA 1000 Kit (Agilent #5067-1504); 其他材料 : 80% 乙醇 ( 现配 ) Nuclease-free H2O; 低吸附 Nuclease-free PCR 管及吸头 离心管 ; PCR 仪 磁力架 Qubit Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer 或其他等效产品 06/ 注意事项 06-1/ 试剂保存注意事项 Box1 中包含 mrna Capture Beads, 必须于 2 ~ 8 保存, 否则会影响磁珠抓取效率 ;Box2 中包含各种 Enzyme Mix, 必须于 -30 ~ -15 保存, 使用时应置于冰上, 使用后及时按条件保存, 否则可能降低酶的活性 ; Beads Binding Buffer 和 Box2 中的 Buffer 在低温条件可能会产生沉淀, 平衡至室温后涡旋混匀即可, 不影响正常使用 ; 06-2/ 操作过程注意事项 建议使用带滤芯的吸头, 在吸取不同样品时更换吸头 在二链合成前使用的耗材必须为 RNase-free, 二链合成及之后为 DNase-free 实验过程中务必使用新鲜的 Nuclease-free H2O, 建议分装至小管中逐个取用, 用后弃去 务必佩戴手套操作, 接触 RNase-free 空间外设备或其他工作区间后, 请更换手套 所有的试剂使用后务必立即盖上盖子, 避免污染 06-3/RNA 样品质控为保证建库质量, 在开始实验前必须对 RNA 样品进行质控,RNA 样品总量 纯度和完整性须满足以下条件 : 总 RNA 模板的起始投入量应 50 ng, 若起始投入量过低, 不能确保得到足够的 mrna 用于后续文库构建 OD260/OD280 比值介于 1.8-2.1 之间, 若比值 > 2.1 则 RNA 样品中可能有基因组污染, 若比值 < 1.8 则可能有蛋白质污染 ;OD230/OD260 比值介于 0.4-0.5 之间, 若比值 > 0.5 则可能 RNA 样品中有盐或小分子杂质污染, 比值 < 0.4 可能有基因组污染 若使用 Bioanalyzer 进行 RNA 完整性检测,RIN 值 7.0; 若使用琼脂糖凝胶电泳检测, 则 28 s 和 18 s 条带无明显降解, 且无蛋白质和基因组污染 06-4/RNA 样品准备 尽量使用 RIN 值高 杂质少的 RNA 样品, 否则会影响建库质量 混匀含 RNA 样品的溶液时应小心操作, 轻柔吹打, 切勿涡旋振荡, 否则会使 RNA 断裂, 影响文库的均一性 Nuclease-free H2O 稀释 RNA 至 50 μl 后置于冰上并尽快进行后续操作, 避免 RNA 降解 如果 RNA 的初始浓度较低时, 可使用冻干 乙醇沉淀 过柱回收或磁珠纯化 (VAHTS RNA Clean Beads,Vazyme #N412) 等方法浓缩 RNA 03/ 04

07/ 实验原理与流程概要 07-2/ 流程概要 07-1/ 实验原理 1. mrna 富集 (mrna capture) rrna mrna non-coding RNA NNNNNN 随机引物 Oligo dt 磁珠与带有 poly(a) 尾的 mrna 结合 将结合上的 mrna 洗脱下来, 在打断 Buffer 中, 通过二价阳离子和高温条件实现打断 投入 0.05-4 μg 总 RNA mrna 富集 mrna 洗脱 片段化及随机引物结合 约 1 h mrna Capture Beads Beads Binding Buffer Beads Wash Buffer Tris Buffer Frag/Prime Buffer mrna Capture Beads 约 1.5 h 2. mrna 片段化 (mrna fragmentation) 3. 一链合成 (First strand cdna synthesis) NNNNNN Adapter UDG 酶 根据随机引物进行 mrna 的逆转录, 实现 cdna 第一链合成 通过 RNase H 消化杂合双链中的 mrna 链, 合成 cdna 互补链, 实现 cdna 第二链合成, 并进行末端修复和 da-tailing 第一链合成 第二链合成末端修复 da-tailing 接头连接 Actinomycin D(5 mg/ml) 1st Strand Buffer 2 1st Strand Enzyme Mix 2 2nd Strand Marking Buffer 2 2nd Strand Enzyme Super Mix Rapid Ligation Buffer 3 Rapid DNA Ligase 2 RNA Adapter 4. 二链合成 (Second strand cdna synthesis) 末端修复 (End repair) 末端加 da(da-tailing) P A A U U U U P 5. 接头连接 (Adapter ligation) 片段分选 A 方案 : 连续两轮纯化, 获得 150-200 bp 插入片段 B 方案 : 先纯化, 再进行两轮分选, 插入片段长度可以个性化选择 A 方案 连续两轮磁珠纯化 B 方案 0.45 磁珠纯化 两轮分选 约 1 h VAHTS DNA Clean Beads 80% ethanol Nuclease-free H2O 约 1 h T A U 6. 去除含 U 链 (Second strand cdna digestion) U U U A T UDG 酶消化含 U 的第二链, 然后进行 PCR 扩增富集文库 消化含 U 的第二链 PCR 富集 0.9 磁珠纯化 Heat-labile UDG PCR Primer Mix 3 VAHTS HiFi Amplification Mix VAHTS DNA Clean Beads 80% ethanol,nuclease free H2O U U U U 表示同时构建 8 个文库所需, 完成全部操作总耗时约 4-5 h 文库质控 Qubit, 2100, qpcr 7. PCR 富集 (PCR enrichment) P5 P7 05/ 06

08/ 使用方法 08-1/mRNA 分离与片段化 1. 提前将 Box1 各组分 (mrna Capture Beads,Beads Wash Buffer,Tris Buffer,Beads Binding Buffer) 从 2 ~ 8 取出, 静置使其平衡至室温 2. 按下表配制如下体系 : 组分体积稀释的 RNA 50 μl mrna Capture Beads 50 μl 用移液器吹打 10 次以彻底混匀 mrna Capture Beads Beads Wash Buffer 和 Beads Binding Buffer 含去污剂, 混匀时请勿高速涡旋或剧烈振荡, 使用移液器吸打时避免起泡 3. 在 PCR 仪中运行如下程序, 使 mrna 与磁珠进行第一次结合 : 温度 65 25 5 min 5 min 4. 将样品置于磁力架上, 待溶液澄清后 ( 约 5 min), 小心移除上清 5. 将样品从磁力架上取出, 加入 200 μl Beads Wash Buffer 重悬磁珠, 使用移液器轻轻吸打 10 次充分混匀并置于磁力架上, 待溶液澄清后 ( 约 5 min), 小心移除上清 步骤 3-5 为第一轮 mrna 分离纯化, 步骤 6-11 为第二次 mrna 分离纯化, 以保证 rrna 的去除效率 6. 将样品从磁力架上取下, 加入 50 μl Tris Buffer 用移液器轻轻吸打 10 次将磁珠充分混匀 7. 在 PCR 仪中运行如下程序, 洗脱 mrna: 温度 80 25 2 min Hold 8. 加入 50 μl Beads Binding Buffer, 使用移液器轻轻吸打 10 次充分混匀 9. 室温放置 5 min, 使 mrna 结合到磁珠上 10. 将样品置于磁力架上, 使 mrna 与总 RNA 分离, 待溶液变澄清后 ( 约 5 min), 小心移除上清 11. 将样品从磁力架上取出, 加入 200 μl Beads Wash Buffer 重悬磁珠, 使用移液器轻轻吸打 10 次充分混匀并置于磁力架上, 待溶液澄清后 ( 约 5 min), 小心移除上清 务必保证将残留液体吸干净,Beads Wash Buffer 移除不彻底将影响 mrna 片段化效果 12. 将样品从磁力架上取出, 加入 18.5 μl Frag/Prime Buffer 重悬磁珠, 使用移液器轻轻吸打 10 次充分混匀 将样品置于 PCR 仪中, 根据插入片段大小的需要, 选择片段化条件 : 插入片段大小 (bp) 150-200 200-300 250-450 450-550 温度 94 94 85 85 从片段化到第一链 cdna 合成过程中不可停留,mRNA 在该体系下容易降解 可提前将 08-2( 步骤 1) 需要的组分从 -30 ~-15 取出, 冰上放置备用 8 min 4 hold 5 min 4 hold 6 min 4 hold 5 min 4 hold 13. 将样品置于磁力架上, 待溶液变澄清后 ( 约 5 min), 小心吸取 16 μl 上清至一个新的 Nuclease-free PCR 管中, 立刻进行第一链 cdna 合成反应 08-2/ 双链 cdna 合成 将双链 cdna 所需组分从 -30 ~ -15 取出, 冰上溶解, 上下颠倒混匀, 短暂离心收集于管底, 并于冰上放置备用 1. 按下表将 Actinomycin D (5 mg/ml) 稀释至 120 ng/μl: 组分 Nuclease-free H2O Actinomycin D (5 mg/ml) Total 2. 按下表配制第一链 cdna 合成反应体系 : 组分 Fragmented mrna Actinomycin D (120 ng/μl) 1st Strand Buffer 2 1st Strand Enzyme Mix 2 Total 3. 将移液器调至 20 μl 量程, 并轻轻吸打 10 次充分混匀 如同时进行多个样品的操作, 可选择先在大小合适的离心管中预配制 1st Strand Buffer 2 和 1st Strand Enzyme Mix 2 的混合液再分装到各 PCR 管中, 建议按照以实际反应数 1.1 倍配制混合液以弥补损耗 4. 在 PCR 仪中进行第一链 cdna 合成反应 : 温度热盖 105 25 42 70 4 体积 48.8 μl 1.2 μl 50 μl 稀释的 Actinomycin D 溶液对光非常敏感, 且会逐渐吸附在塑料和玻璃的表面 因此未用完的 Actinomycin D 稀释液应丢弃 体积 16 μl 1 μl 6 μl 2 μl 25 μl 结束后立刻进行第二链 cdna 合成反应 可提前将步骤 4 需要的组分从 -30 ~-15 取出, 冰上放置备用 5. 按下表配制第二链 cdna 合成反应体系 : 组分 1st Strand cdna 2nd Strand Marking Buffer 2 2nd Strand Enzyme Super Mix Total On 10 min 15 min 15 min Hold 体积 25 μl 25 μl 15 μl 65 μl 6. 将移液器调至 50 μl 量程, 并轻轻吸打 10 次充分混匀 如同时进行多个样品的操作, 可选择先在大小合适的离心管中预配制 2nd Strand Marking Buffer 2 和 2nd Strand Enzyme Super Mix 的混合液再分装到各 PCR 管中, 建议按照以实际反应数 1.1 倍配制混合液以弥补损耗 07/ 08

7. 在 PCR 仪中进行第二链 cdna 合成反应 : 温度热盖 105 On 16 30 min 65 15 min 4 Hold 可提前将步骤 08-3 需要的组分从 -30 ~-15 取出, 冰上放置备用 08-3/ 接头连接 1. 按下表中配制如下连接体系 : 组分 体积 ds cdna 65 μl Rapid Ligation buffer 3 25 μl Rapid DNA Ligase 2 5 μl RNA Adapter* x μl Nuclease-free H2O To 100 μl Rapid Ligation buffer 3 与 Rapid DNA ligase 2 预混后, 可于 2 ~ 8 存放不超过 24 h 建议先将 RNA adapter 加入到 ds cdna 中, 充分混匀, 再加入 Rapid Ligation Buffer 3 与 Rapid DNA Ligase 2 的混合液 方案 B 为先经过一轮纯化后, 再进行两轮分选, 根据表二不同分选条件可得到 200 bp 以上的不同插入片段并去除接头残留 方案 A. 获得插入片段长度约 150-200 bp 的文库 ( 适用于 mrna 片段化条件为 94 8 min) A1. 将 VAHTS DNA Clean Beads 提前 30 min 从 2 ~ 8 取出, 静置使其平衡至室温 A2. 颠倒或旋涡振荡使 VAHTS DNA Clean Beads 充分混匀, 吸取 45 μl (0.45 ) 加入到连接产物中, 使用移液器轻轻吸打 10 次充分混匀 A3. 室温孵育 10 min, 使 DNA 结合到磁珠上 A4. 将样品置于磁力架上, 待溶液澄清后 ( 约 5 min), 小心移除上清 A5. 保持样品处于磁力架上, 加入 200 μl 新鲜配制的 80% 乙醇漂洗磁珠 ( 注意不要吹散磁珠 ), 室温孵育 30 sec, 小心移除上清 A6. 重复步骤 A5 一次 A7. 保持样品处于磁力架上, 在室温下开盖干燥磁珠约 5-10 min 加入 80% 乙醇时不要吹散磁珠 最后移除上清时需要使用 10 μl 移液器将残留液体吸干净 磁珠干燥时避免因过分干燥 ( 龟裂 ) 降低回收效率 若使用 VAHTS RNA Multiplex Oligos set1 - set2 for Illumina (Vazyme #N323/N324), 则 RNA adapter 都为其中配套 RNA adapter-s for Illumina 接头使用量如下表所示 : A8. 将样品从磁力架上取出, 加入 52.5 μl Nuclease-free H2O, 涡旋振荡或使用移液器轻轻吸打充分混匀, 室温静置 2 min 后置于磁力架上, 待溶液澄清后 ( 约 5 min), 小心吸取 50 μl 上清至一个新的 Nuclease-free PCR 管中 起始投入量 1-4 μg 200-999 ng 50-199 ng 接头体积 5 μl 2 μl 0.8 μl A9. A10. 颠倒或旋涡振荡使 VAHTS DNA Clean Beads 充分混匀, 吸取 50 μl(1 ) 加入到上一步纯化产物中, 使用移液器轻轻吸打 10 次充分混匀 室温孵育 10 min, 使 DNA 结合到磁珠上 2. 将移液器调至 80 μl 量程, 并轻轻吸打 10 次充分混匀 A11. 将样品置于磁力架上, 待溶液澄清后 ( 约 5 min), 小心移除上清 3. 在 PCR 仪中进行连接反应 : A12. 保持样品处于磁力架上, 加入 200 μl 新鲜配制的 80% 乙醇漂洗磁珠, 室温孵育 30 sec, 小心 温度热盖 105 20 4 On 15 min Hold 可提前将 08-4 需要的 VAHTS DNA Clean Beads 从 2 ~ 8 取出, 室温放置备用 A13. A14. 移除上清 重复步骤 A12 一次 保持样品始终处于磁力架上, 在室温下开盖干燥磁珠约 5-10 min 加入 80% 乙醇时不要吹散磁珠 连接产物可在 2 ~ 8 暂存 1 h 最后移除上清时需要使用 10 μl 移液器将残留液体吸干净 磁珠干燥时避免因过分干燥 ( 龟裂 ) 降低回收效率 08-4/ 连接产物纯化和片段大小分选 该步骤提供两种方案, 请根据需要慎重选择 : 方案 A 为两轮纯化, 无分选操作, 由于 94 8 min 打断条件得到的插入片段集中在 150-200 bp, 该方案可得到去除接头残留的 150-200 bp 插入片段 ; A15. 将样品从磁力架上取出, 加入 21.5 μl Nuclease-free H2O, 涡旋振荡或使用移液器轻轻吸打充分混匀, 室温静置 2 min 后置于磁力架上, 待溶液澄清后 ( 约 5 min), 小心吸取 19 μl 上清至一个新的 Nuclease-free PCR 管中, 立刻进行 PCR 转移上清时切勿吸取磁珠, 即使微量残留都将影响后续文库产量 可提前将 08-5( 步骤 1) 需要的组分从 -30 ~-15 取出, 冰上放置备用 09/ 10

方案 B. 获得插入片段长度大于 200 bp 的文库 ( 适用于 mrna 片段化条件为 94 5 min 85 6 min 和 85 5 min) B-1/ 用 0.45 VAHTS DNA Clean Beads 纯化连接产物 B1. 将 VAHTS DNA Clean Beads 提前 30 min 从 2 ~ 8 取出, 静置使其平衡至室温 B2. 颠倒或旋涡振荡使 VAHTS DNA Clean Beads 充分混匀, 吸取 45 μl(0.45 ) 加入到接头连接产物中, 使用移液器轻轻吸打 10 次充分混匀 B3. B4. 室温孵育 10 min, 使 DNA 结合到磁珠上 将样品置于磁力架上, 待溶液澄清后 ( 约 5 min), 小心移除上清 B5. 保持样品处于磁力架上, 加入 200 μl 新鲜配制的 80% 乙醇漂洗磁珠, 室温孵育 30 sec, 小心移除上清 B6. 重复步骤 B5 一次 B7. 保持样品处于磁力架上, 在室温下开盖干燥磁珠约 5-10 min 加入 80% 乙醇时不要吹散磁珠 最后移除上清时需要使用 10 μl 移液器将残留液体吸干净 磁珠干燥时避免因过分干燥 ( 龟裂 ) 降低回收效率 B8. 将样品从磁力架上取出, 加入 102.5 μl Nuclease-free H2O, 涡旋振荡或使用移液器轻轻吸打充分混匀, 室温静置 2 min 后置于磁力架上, 待溶液澄清后 ( 约 5 min), 小心吸取 100 μl 上清至一个新的 Nuclease-free PCR 管中 B-2/ 用两轮 VAHTS DNA Clean Beads 进行片段大小分选 ( 以 85 6 min 打断, 插入片段约 350-450 bp 为例, 其他长度文库请根据表格选择相应的磁珠使用量 ) 表一 : 不同插入片段大小的分选条件 插入片段长度 (bp) 文库长度 (bp) 打断条件第一轮磁珠体积 (μl) 第二轮磁珠体积 (μl) 200-300 320-420 94 5 min 70 (0.7 ) 250-350 370-470 85 6 min 65 (0.65 ) 350-450 470-570 85 6 min 60 (0.6 ) 450-550 570-670 85 5 min 55 (0.55 ) 本表格的分选条件适用于 VAHTS RNA Adapters set1 2 for Illumina (Vazyme #N803/N804) 或 VAHTS RNA Adapters set3 - set6 for Illumina (Vazyme #N809/N810/N811/N812) 此处的文库长度是插入片段长度 + 接头长度 (30 bp), 分选中磁珠加样体积偏差将影响最终文库大小 分选中使用的磁珠体积比是相对于初始 DNA 体积, 例如 : 初始体积 100 μl DNA 溶液, 第一轮磁珠体积 60 μl 是 100 μl 的 60%, 即 0.6, 第二轮磁珠体积 10 μl 是 100 μl 的 10%, 即 0.1, 而非吸取出的 155 μl 上清的 10% B9. 颠倒或旋涡振荡使 VAHTS DNA Clean Beads 充分混匀, 吸取 60 μl (0.6 ) 加入到纯化过的连接产物中, 使用移液器轻轻吸打 10 次充分混匀 B10. 室温孵育 10 min, 使 DNA 结合到磁珠上 B11. 将样品置于磁力架上, 待溶液澄清后 ( 约 5 min), 保持样品始终处于磁力架上, 吸取 155 μl 上清 ( 此步骤保留上清, 切勿丢弃!) 至一个新的 Nuclease-free PCR 管中 此处为总体积 160 μl 取 155 μl 上清, 以便转移上清时更好地做到不吸到磁珠 如果吸取到磁珠, 磁珠上结合的大片段 DNA 会进入下一步骤, 导致最终文库有大片段残留 ; 其他分选条件中总体积不是 160 μl, 则吸取转移的上清体积较比总体积少 5 μl 即可 B12. 加入 10 μl (0.1 ) VAHTS DNA Clean Beads, 使用移液器轻轻吸打 10 次充分混匀 B13. 室温孵育 10 min, 使 DNA 结合到磁珠上 B14. 将样品置于磁力架上, 待溶液澄清后 ( 约 5 min), 小心移除上清 B15. 保持样品处于磁力架上, 加入 200 μl 新鲜配制的 80% 乙醇漂洗磁珠, 室温孵育 30 sec, 小心移除上清 B16. 重复步骤 B15 一次 B17. 保持样品始终处于磁力架上, 在室温下干燥磁珠约 5-10 min 加入 80% 乙醇时不要吹散磁珠 最后移除上清时需要使用 10 μl 移液器将残留液体吸干净 磁珠干燥时避免因过分干燥 ( 龟裂 ) 降低回收效率 B18. 将样品从磁力架上取出, 加入 21.5 μl Nuclease-free H2O, 涡旋振荡或使用移液器轻轻吸打充分混匀, 室温静置 2 min 置于磁力架上, 待溶液澄清后 ( 约 5 min), 小心吸取 19 μl 上清至一个新的 Nuclease-free PCR 管中 转移上清时切勿吸取磁珠, 即使微量残留都将影响后续文库产量 可提前将 08-5( 步骤 1) 需要的组分从 -30 ~-15 取出, 冰上放置备用 洗脱产物可在 -30 ~ -15 暂存 24 h 当使用非完整长度 Adapter, 例如 VAHTS RNA Multiplex Oligos set1/2 for Illumina (Vazyme #N323/N324) 时, 其分选方案请参考下表选择最适分选参数 表二 : 不同插入片段大小的分选条件 插入片段长度 (bp) 文库长度 (bp) 打断条件第一轮磁珠体积 (μl) 第二轮磁珠体积 (μl) 200-300 260-360 94 5 min 80 (0.8 ) 20 (0.2 ) 250-350 310-410 85 6 min 65 (0.65 ) 20 (0.2 ) 350-450 410-510 85 6 min 60 (0.6 ) 450-550 510-610 85 5 min 55 (0.55 ) 08-5/ 文库扩增 1. 按下表配制 PCR 反应体系 : 组分纯化过的接头连接产物 PCR Primer Mix 3 VAHTS HiFi Amplification Mix Heat-labile UDG Total 体积 19 μl 5 μl 25 μl 1 μl 50 μl 11/ 12

本反应体系适用于 VAHTS RNA Adapters set1 2 for Illumina (Vazyme #N803/N804) 或 VAHTS RNA Adapters set3 - set6 for Illumina (Vazyme #N809/N810/N811/N812) 当使用 VAHTS RNA Multiplex Oligos set1/2 for Illumina (Vazyme #N323 /N324) 时, 则引物需使用其中配套 i5 PCR Primer RM5XX 和 i7 PCR Primer RM7XX, 每种引物使用量为 2.5 μl 如同时进行多个样品的操作, 可选择先在大小合适的离心管中预配制混合液再分装到各 PCR 管中, 建议按照以实际反应数 1.1 倍配制混合液以弥补损耗 2. 将移液器调至 30 μl 量程, 并轻轻吸打 10 次充分混匀 3. 将样品置于 PCR 仪中, 进行文库扩增反应 : 步骤热盖 On 消化含 U 链预变性变性退火延伸完全延伸 从不同物种和个体提取的等量总 RNA 中,mRNA 的占比也不一定相同 根据物种实际情况, 可适 当调整 PCR 循环数, 一般为 10-17 个循环 RNA 起始量扩增循环数 2-4 μg 1-2 μg 200-999 ng 50-199 ng 4. PCR 产物纯化 : a. 温度 105 37 95 98 60 72 72 4 10-12 12-13 14-15 16-17 10 min 3 min 20 sec 15 sec 30 sec 5 min Hold 循环数 1 1 10-17 将 VAHTS DNA Clean Beads 提前 30 min 从 2 ~ 8 取出, 静置使其平衡至室温 b. 颠倒或旋涡振荡使 VAHTS DNA Clean Beads 充分混匀, 吸取 45 μl(0.9 ) 加入到 PCR 产物中, 使用移液器轻轻吸打 10 次充分混匀 1 h. 将样品从磁力架上取出, 加入 25 μl Nuclease-free H2O, 涡旋振荡或使用移液器轻轻吸打充分混匀, 室温静置 2 min 后置于磁力架上, 待溶液澄清后 ( 约 5 min), 小心吸取 22.5 μl 上清至一个新的 Nuclease-free PCR 管中 吸打充分混匀, 室温静置 2 min 后置于磁力架上, 待溶液澄清后 ( 约 5 min), 小心吸取 22.5 μl 上清至一个新的 Nuclease-free PCR 管中 转移上清时请勿吸取磁珠, 即使微量残留都将影响后续文库质量的分析 洗脱产物可在 -30 ~ -15 保存 5. 用 Agilent 2100 Bioanalyzer 评价文库质量 取 1 μl 纯化后的 PCR 产物, 用 Agilent DNA 1000 kit (Agilent,Cat.No.5067-1504) 进行分析 良好的文库应在预计大小的位置有一个较窄的峰, 如图 1 所示 如果在 128 bp 左右出现峰, 则提示文库中有 adapter-dimer 污染 此时, 将文库用 Nuclease-free H 2O 稀释至 50 μl, 重复步骤 08-5 ( 步骤 4) 以再次纯化 PCR 产物 图 1-A/B 1 μg/100 ng 293T 细胞 RNA, 片段化条件为 94 8 min, 并用 0.9 VAHTS DNA Clean Beads 两次纯化 First bead/ Second bead: 0.70/0.10 0.65/0.10 0.60/0.10 0.55/0.10 c. d. e. 室温孵育 10 min, 使 DNA 结合到磁珠上 将样品置于磁力架上, 待溶液澄清后 ( 约 5 min), 小心移除上清 保持样品处于磁力架上, 加入 200 μl 新鲜配制的 80% 乙醇漂洗磁珠, 室温孵育 30 sec, 小心移除上清 f. g. 重复步骤 e 一次 保持样品处于磁力架上, 在室温下开盖干燥磁珠约 5-10 min 加入 80% 乙醇时不要吹散磁珠 最后移除上清时需要使用 10 μl 移液器将残留液体吸干净 磁珠干燥时避免因过分干燥 ( 龟裂 ) 降低回收效率 320-420 bp 370-470 bp 470-570 bp 570-670 bp 图 2 200 ng 293T 细胞 RNA, 不同的片段化条件, 一次 0.45 VAHTS DNA Clean Beads 纯化后, 根据不同比例的 VAHTS DNA Clean Beads 进行片段大小分选 13/ 14

09/ 常见问题及解决方案 错误操作及补救措施 步骤 步骤 5 步骤 6 步骤 8 步骤 11 步骤 12 步骤 13 08-2 步骤 2 08-4 08-4 08-4 A 方案 加入 200 μl Beads Wash Buffer 重悬和漂洗 mrna Capture Beads 加入 50 μl Beads Binding Buffer 使 mrna 与 mrna Capture Beads 再结合 加入 200 μl Beads Wash Buffer 重悬 mrna Capture Beads 加入 Frag/Prime Buffer 打断 mrna 对加过 Frag/Prime Buffer 的样品做高温打断处理 打断 mrna 后, 转移上清至新管中 (16 μl) 一链合成 正确操作错误操作补救措施 加入 50 μl Tris Buffer 重悬 mrna Capture Beads 连接产物纯化和片段分选 误加为 200 μl 80% 乙醇 误加为 Beads Binding Buffer 误加为 Tris Buffer 未加入 Wash Buffer 重悬而直接加入 Frag/Prime Buffer 误加为 Nuclease-free H2O 丢弃 Wash Buffer 后, 发现 Frag/Prime Buffer 仍未融化 片段化条件与最初设置不符, 如将 85 6 min 处理为 94 8 min) 上清不足 16 μl Actinomycin D 未稀释, 或加错试剂 没有纯化, 直接分选 不分选条件 第一轮纯化中, 洗脱水体积加错 吸取 100 μl 纯化产物进入分选阶段 收集上清不足 100 μl 弃尽乙醇, 并晾干, 重新用 200 μl Beads Wash Buffer 重悬磁珠, 并继续后续操作 若未做 80 2 min 处理, 可以用磁力架吸附, 弃掉上清后, 重新加 Tris Buffer 放大反应体系, 再补加与 Tris Buffer 等体积的 Beads Binding Buffer 若还未加热打断, 可重新放上磁力架, 将 Frag/Prime Buffer 丢弃后, 重新加入 Wash Buffer 若条件允许, 加入等体积 2 Frag/Prime Buffer, 之后反应体系均放大, 直至做到纯化步骤, 恢复体系 再加入 Beads Wash Buffer 浸泡 mrna Capture Beads, 至 Frag/prime buffer 融化, 弃尽 Wash Buffer, 继续实验 后续分选步骤必须选择与此处打断条件对应的操作, 否则会建库失败 最终得到的文库插入片段大小也会相应改变 可加入 Nuclease-free H2O 补足 可加 3.0 RNA Clean Beads 进行纯化, 用 Frag/Prime Buffer 洗脱继续实验 实际片段会略偏小, 文库峰型及产量均受影响, 根据 2100 结果判断文库大小是否符合要求 可相应调整后面的磁珠用量, 保证比例 加入 Nuclease-free H2O 补足即可 如果文库浓度过低, 可以从哪些角度去寻找原因并如何改进? 1 起始量 : 提高样品起始量, 最大可做到 4 μg; 2 做几个重复的样品, 到打断步骤合并在一起, 或做到 PCR 前合并在一起 ; 3 不分选方案 :94 8 min 打断条件下 RNA 片段虽然偏小, 但分布集中, 均一性也较好, 有些个性化样品会出现打断不均一 某些大小的片段较多, 经过 PCR 后更明显, 出现刺峰, 这种情况在不分选方案中出现很少 rrna 残留较高的问题 mrna 获取方法的不同, 其兼容的起始量有所不同, 请选择规格范围内的起始总 RNA 投入 文库定量常见问题文库定量有两种方式 :Qubit 和 qpcr 分别测定文库质量浓度和文库摩尔浓度 其中由于 qpcr 利用成簇反应引物进行扩增定量, 较为真实的反映出文库中可用于上机测序的 DNA 片段的数量, 所以 qpcr 得到的文库定量结果较为可信 一般可同时使用两种方式定量文库, 相互校正 关于选择接头的说明目前, 该试剂盒适用接头分为三套组合 : 组合一 :VAHTS RNA Adapters set1/2 for Illumina (Adapter 1-27, Vazyme #N803/N804) 共包括 24 个不同接头, 分为两个单独包装, 依序号各含有 12 个不同接头 ; 组合二 :VAHTS RNA Adapters set3 - set6 for Illumina (Adapter 1-96, Vazyme #N809/N810/N811/N812) 共包括 96 个不同接头, 分为四个单独包装, 依序号各含有 24 个不同接头 ; 以上两套接头可在同批测序样品中混合使用, 可参考以下建议 : 1 同批测序样品数 < 24 时, 建议选择组合一 ; 当样品数 < 12 时, 可选择该组合的单独包装 ; 2 24 < 同批测序样品数 < 96 时, 建议选择组合二 ; 也可根据具体样品数选择该组合的单独包装 组合三 :VAHTS RNA Multiplex Oligos set1-set2 for Illumina (Vazyme #N323/N324) 分别包含 VAHTS RNA Adapter-S for Illumina 8 种 VAHTS i5 PCR Primers 以及 12 种 VAHTS i7 PCR Primers, 共同配合使用可用于构建多至 384 种不同组合的双端 Index 标记文库 本试剂盒是否适合用于 small RNA 文库制备? 不适用 因为 small RNA 的长度仅为 22 nt 左右, 而本试剂盒中磁珠抓取片段最低为 100 bp 以上, 无法有效富集到 small RNA 片段 本试剂盒是否适用于非真核生物 mrna 建库? 由于该试剂盒通过带有 Oligo dt 的磁珠直接抓取 mrna 从而达到 mrna 分离, 因此不适用于非真核生物 FFPE 样本是否可以用该试剂盒建库? FFPE 样本中的 mrna 会有一定降解, 完整度较差, 建议使用 VAHTS Total RNA-seq (H/M/R) Library Prep Kit for Illumina (Vazyme #NR603) 试剂盒进行文库构建 收到试剂盒后, 误将 Box1 放置 -30 ~-15 保存, 是否还可以继续使用? 低温会破坏磁珠结构, 不可再继续使用 可另行采购对应模块 VAHTS mrna Capture Beads (Vazyme #N401) 按照说明书方案进行分选, 为什么得到的文库与预期文库大小有偏差? 使用磁珠分选过程中, 磁珠未平衡至室温 未混匀 移液器不准 枪头挂壁严重等均会致使磁珠加入量与规定体积不符, 导致所分选的插入片段偏差 15/ 16

文库扩增最高可以使用多少循环? 可根据起始量来调整循环数 ; 如果不确定, 建议取 1 μl 进行 Qubit 检测后酌情再补 1-2 个循环, 最多不超过 17 个循环 文库进行 Agilent 2100 Bioanalyzer 质检, 发现产生双峰, 产生的原因? 1 RNA 有杂质残留, 建库过程中发生降解, 到 PCR 步骤前的有效模板量低,PCR 时由于模板不足发生了非特异性扩增 建议将 RNA 样品在 65 条件下加热 15 min, 检测是否降解, 如果确实为 RNA 的问题则需要重新提取 RNA 2 物种本身比较特殊,RNA 打断后片段不是连续且均一的分布, 做分选方案时可能分选到了两个范围的片段 为何 Agilent 2100 Bioanalyzer Qubit 及 qpcr 检测时, 高产量文库出现过度扩增现象? 高产量文库通常会出现不同程度的过度扩增现象 因为在文库扩增后期, 通常引物被最先耗尽, 大量文库片段在无法结合到引物的情况下, 片段之间通过不完全匹配关系退火结合, 从而形成部分双链 + 部分单链的杂合链, 且片段更大 根据不同检测方式的对应原理, 过度扩增产物在 Agilent 2100 Bioanalyzer 峰型中表现为 upper marker 之后有轻微翘尾 ; 在 Qubit 测定时, 单链部分不计入有效浓度, 但在 qpcr 过程单链能够被有效测定, 因此表现为 Qubit 测定浓度低于 qpcr 定量浓度约 10% - 50% 17/ 18