18-07 高效率逆转录试剂盒 First Strand cdna Synthesis Kit ReverTra Ace -α- (Code No. FSK-101) 使用说明书 科研用 TOYOBO CO., LTD. Life Science Department OSAKA JAPAN
目录 1 简介... 1 2 RT-PCR 法的原理... 2 3 试剂盒的组成... 3 4 操作步骤... 3 5 添付引物的说明... 5 6 处理 RNA 过程中的注意事项... 5 7 进行 RT-PCR 过程中的注意事项... 6 8 参考文献... 6 9 常见问题... 7 10 相关产品... 9 注意 本产品为科研用试剂 请勿作为诊断 临床试剂使用 此外, 对于本产品的有害性调查还不十分全面, 因此, 在使用过程中, 请严格遵守实验室作业的一般注意事项, 适当使用保护用品, 安全操作 组分中的 5 RT Buffer 在溶解时, 可能会出现白色沉淀现象, 但不影响其品质 此时, 请使用振荡器等仪器使其混合均匀, 等完全溶解后再使用 保存 各组分请均保存于 -20 条件下 为了保证实验效果, 请在收到产品的一年之内使用完毕
1 简介 将逆转录 (Reverse Transcription;RT) 反应和 PCR (Polymerase Chain Reaction) 反应组合在一起的 RT-PCR 法能够比较简便和迅速地检测来自多个样品的 RNA, 近年来作为一般的方法被广泛应用于 mrna 表达量高低 长度等检测分析和 cdna 克隆中 本公司利用基因工程学的方法改造了来自 M-MLV (Molony murine leukemia virus) 的逆转录酶, 去掉了阻碍合成长链 cdna 的 RNase H 活性, 开发出能够大幅度提高 cdna 合成能力的改良型酶 ReverTra Ace ReverTra Ace -α-(code No. FSK-101) 是以 ReverTra Ace 为核心酶的 First strand cdna 合成试剂盒 由于本试剂盒包含了 RT 用引物及 Positive Control, 所以能够简单地进行逆转录反应 也可以应用于手头上各种 DNA 聚合酶的 PCR 反应模板的制备 例如, 通过和 High fidelity PCR 用酶,Long PCR 用酶等的结合, 能够进行目的性更强的 RT-PCR 本产品特征 1. 高 cdna 合成能力 本产品中使用的 ReverTra Ace 是具有大幅度提高 cdna 合成能力的改良型酶, 已确认能够合成 14kb 以上的 cdna 2. 高检测灵敏度 由于对 ReverTra Ace -α- 进行了最优化处理, 即便带入全量的逆转录反应液也不会对 PCR 反应造成阻碍, 所以可以使用各种 DNA 聚合酶, 在同一个离心管中进行 RT 反应和 PCR 反应 1 http://www.bio-toyobo.cn
东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 2 RT-PCR 法的原理 RT-PCR 法, 如图 1 所示 : 由从模板 RNA 开始合成 First Strand cdna 的逆转录反应步骤, 和以此 cdna 为模板合成 Second Strand cdna, 并对目的遗传基因片段进行扩增的 PCR 步骤组成 RNA 5 3 3 5 Primer Reverse Transcriptase ReverTra Ace Reverse Transcription (Synthesis of the First Strand cdna) RT ReverTra Ace -α- 3 cdna 5 DNA Polymerase Synthesis of the Second Strand cdna DNA Polymerase Amplification PCR 图 1. RT-PCR 法的原理 垂询电话 :021-58794900 2
3 试剂盒的组成 No 组成成分 FSK-101 100 次份 1 ReverTra Ace 100μl 2 RNase lnhibitor(10u/μl) 100μl 3 5 RT Buffer( 含有 25mM MgCl2) 400μl 4 dntp Mixture( 各 10mM) 200μl 5 RNase Free H2O 1200μl 6 Oligo(dT)20(10pmol/μl) 100μl 7 Random Primer (25pmol/μl) 100μl 所有组分请均保存在 -20 条件下 组分中的 5 RT Buffer 在溶解时, 可能会出现白色沉淀现象, 但不影响其品质 此时, 请使用振荡器等仪器使其混合均匀, 等完全溶解后再使用 [ 添附的引物 ] Oligo(dT) 20 5 -(dt) 20-3 Random Primer 5 -(dn) 9-3 关于这些引物的选择, 请参照后面的 添付引物的说明 (P7) 4 操作步骤 1. RNA 的热变性 ( 热变性步骤可消除 RNA 大多数二级结构, 从而使引物更容易结合 因 此, 对于容易形成高级结构的 RNA 可以提高逆转录的效率 ) RNase Free H2O (11-X)μl Primer( 任选以下一个种类 ) Random Primer * (25 pmol/μl) 1μl Oligo(dT) 20 * * (10 pmol/μl) 1μl 序列特异性下游引物 ** (10 pmol/μl) 1μl RNA( 任选以下一个种类 Yμl) Total RNA (1μg 以下 ) mrna (10~100 ng) 12μl 65,5min. 后, 立即置于冰上 3 http://www.bio-toyobo.cn
东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 2. 反应液配置 3. 逆转录反应 试剂 使用量 第 1 步变性后的 RNA 溶液 12μl 5 RT Buffer 4μl dntp Mixture ( 各 10 mm) 2μl RNase Inhibitor (10 U/μl) 1μl ReverTra Ace *** 1μl *** Total Volume 20μl (30 10 min.) * 42 20 min. **** 99 5 min. ***** 4 5 min. 瞬间离心 * 注 使用随机引物时, 为了能够充分退火, 请在 30 条件下, 进行 10 分钟的培养 ** 作为模板使用 Positive Control RNA 的时候, 请使用 Control Primer R *** 请注意 : 请务必使用本试剂盒添附的 ReverTra Ace, 使用量 1μl/ 反应 如果添加过 量, 则不能充分进行热处理, 从而会阻碍 PCR 反应 **** 片段较长时, 可适当延长此步骤时间 (20-60min) ***** 由于逆转录酶在反应后和 cdna 结合, 所以请在 99 下进行 5 分钟的热处理 4. PCR 基本上遵从普通 DNA 聚合酶的使用方法 以下介绍一般的使用例 试剂 使用量 (3. 逆转录反应的 ) 产物 20μl 灭菌蒸馏水 67μl 10 PCR Buffer * 10μl 序列特异性上游引物 (10 pmol/μl) 1μl ** 序列特异性下游引物 (10 pmol/μl) 1μl DNA 聚合酶 (2.5 U/μl) 1μl Total Volume 100μl PCR( 目的片段长度为 1 kb 左右 ) 94 30 sec. 60 30 sec. 72 1 min. *** (30 循环 ) 取一部分样品, 进行琼脂糖凝胶电泳, 确认目的扩增片段的生成 垂询电话 :021-58794900 4
注 * 若购入的是 Mg 2+ 另外添付的产品, 请添加 Mg 2+ ** 已将序列特异的下游引物用于逆转录反应步骤的情况下, 请以 1μl 灭菌蒸馏水代替本步骤中的该引物 *** 根据使用的酶的不同调整延伸时间 使用 Taq 聚合酶时, 如果目的片段长度超过 1 kb, 请以 1min./kb 为基准延长延伸时间 5 添付引物的说明 请遵照以下标准, 选择逆转录反应的引物 1 序列特异性下游引物一般情况下, 当使用具有和模板 RNA 有互补性序列的引物时, 有必要事先了解目的片段的序列 2 Oligo(dT)20 只限于在具有 Poly(A)tail 的 mrna 逆转录反应中使用 请不要在原核生物的 RNA 以及真核生物的 rrna trna 中使用 3 Random Primer 无论 Poly(A)tail 的有无, 一般情况下都可以使用 通过 Random Primer 进行逆转录反应时, 能够利用任何成对的序列特异的引物进行 PCR 反应 通过 Random Primer 进行逆转录反应时, 为了让引物充分退火, 请在 30 环境中温育 10 分钟 6 处理 RNA 过程中的注意事项 1. 抑制 RNase 的混入 在 RT-PCR 法中, 抑制 RNase 的活性是非常重要的 因此, 在避免从使用的器具和试剂中混入 RNase 的同时, 得到纯度较高的 RNA 也非常重要 在注意实验环境的同时, 为防止从唾液和汗水带入 RNase, 建议使用口罩 手套等防护用品 5 http://www.bio-toyobo.cn
东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 2. 关于器具类 实验器具应尽可能将一次性塑料制品进行高温高压湿热灭菌后再使用 使用玻璃器具时, 应进行干热灭菌, 或者在 0.1% Diethylpyrocarbonate (DEPC) 溶液中 37 条件下浸泡 12 小时, 再进行高温高压湿热灭菌 (121 30 分钟 ) 后使用 7 进行 RT-PCR 过程中的注意事项 本产品按可利用 Total RNA trna mrna rrna 作为模板的思路设计 但为确保无论在何种条件下都能得到高效的扩增产物, 建议使用纯度较高的 RNA 样品 使用本公司的核酸抽提试剂盒 MagExtractor -RNA- (Code No.: NPK-201F) 和磁珠分离专用台架 Magical Trapper(Code No.:MGS-101) 能够在短时间内简便地配制高纯度的 Total RNA 8 参考文献 1. Takagi, M., Nishioka, M., Kakihara, H., Kitabayashi, M., Inoue, H., Kawakami, B., Oka, M., and Imanaka, T., Appl. Environ. Microbiol., 63, 4504-4510 (1997) 垂询电话 :021-58794900 6
9 常见问题 1. 不能确认扩增条带, 且扩增效率较差 模板 RNA 引物 PCR 条件其它 可能原因 纯度不够 模板量不够 失活 有高级结构 Tm 值过低 序列不合适 引物量太少 Mg 2+ 浓度低 退火温度过高 延伸时间短 热循环仪工作不正常 RNase 的污染 逆转录酶的量太多 酶失活 对策 重新配制 增加模板量 增加 PCR 的循环次数 重新配制 使用频率较高时, 事先进行少量多管分装 在 RT 中使用 Random Primer 将含有除酶以外试剂的 RT 反应液在 65 条件下加热 5min. 后冰浴 5min., 再进行 RT 反应 降低退火温度或重新设计引物 以不具有 Poly(A) tail 的 RNA 为模板时, 不能使用 Oligo(dT) 20 确认序列是否正确 确认引物内或引物之间有无互补的领域 确认 PCR 引物对是否没有结合在同一条带上 使用和 RT primer 适合的量 每一反应使用 10pmole 以上 提高 Mg 2+ 浓度 ( 如 :2mM) 探讨 PCR 条件 ( 如 : 降低退火温度 2~5 ) 探讨 PCR 条件 ( 如 : 将延伸时间设置为 1min./kb) 确认热循环仪工作是否正常 重新配制模板 RNA 模板 RNA 变性时添加预先准备的 RNase Inhibitor 使用新的试剂 每次反应, 使用 1μl 添附的 ReverTra Ace 使用新的试剂 7 http://www.bio-toyobo.cn
东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 2. 非特异性条带较多 模板 RNA 引物 PCR 条件其它 可能原因 模板量过多 基因组 DNA 的污染 目的片段以外含有其他可使引物较容易退火的领域 序列不合适 引物量不合适 Mg 2+ 浓度过高 退火温度过低 样品间的交叉污染 对策 减少模板量 将没有进行逆转录反应的 Negative Control RNA 同时进行 PCR 进行 DNase I 处理 重新设计引物 重新设计引物 探讨引物用量 降低 Mg 2+ 浓度 ( 如 :1mM) 提高退火温度 (2~5 ) 探讨 2 步法 step down PCR 经常更换 TIP 头 使用过滤 TIP 头 区分配制 RT-PCR 反应液的器具和进行电泳的器具 区分配制 RT-PCR 反应液的配制场所和电泳场所 垂询电话 :021-58794900 8
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