(before co-culture: 5.85 ±.35 vs ±.72, t = , P <.5; after co-culture: 9.45 ±.84 vs 3. ± 1.36, t = , P <.5). CONCLUSION: The phagocyt

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1 在线投稿 : 帮助平台 : DOI: /wcjd.v24.i 世界华人消化杂志 216 年 8 月 18 日 ; 24(23): ISSN (print) ISSN (online) 216 aishideng Publishing Group Inc. ll rights reserved. 基础研究 SIC RESERCH 自身免疫性肝炎小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬及溶酶体功能异常 许瑞蕊, 伍银银, 周璐, 王邦茂, 郑荣秀 背景资料自身免疫性肝炎 (autoimmune hepatitis, IH) 是自身免疫反应介导的慢性进行性肝脏炎症性疾病, 临床特征为不同程度的血清转氨酶升高 高 γ- 球蛋白血症 自身抗体阳性, 组织学特征为以淋巴细胞 浆细胞浸润为主的界面性肝炎. 近年来随着我国 IH 发病率逐年升高, 对于其发病机制的研究已经成为医学界探索的热点问题. 同行评议者姚定康, 教授, 中国人民解放军第二军医大学附属长征医院内科 许瑞蕊, 伍银银, 周璐, 王邦茂, 郑荣秀, 天津医科大学总医院消化内科天津市 356 许瑞蕊, 医师, 主要从事消化科疾病的研究. 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目, Nos , ; 天津市卫生局科技攻关基金资助项目, No. 12KG133. 作者贡献分布 : 此课题由许瑞蕊 伍银银 周璐及王邦茂设计 ; 研究过程由许瑞蕊 伍银银及周璐操作完成 ; 研究所用新试剂及分析工具由王邦茂 周璐及郑荣秀提供 ; 数据分析由许瑞蕊与伍银银完成 ; 本论文写作由许瑞蕊完成. 通讯作者 : 王邦茂, 教授, 主任医师, 356, 天津市和平区鞍山道 154 号, 天津医科大学总医院消化内科. gi.tmuh@sohu.com 电话 : 传真 : 收稿日期 : 修回日期 : 接受日期 : 在线出版日期 : Dysfunction of phagocytosis and lysosome activities of intraperitoneal macrophages in autoimmune hepatitis mice Rui-Rui Xu, Yin-Yin Wu, Lu Zhou, ang-mao Wang, Rong-Xiu Zheng Rui-Rui Xu, Yin-Yin Wu, Lu Zhou, ang-mao Wang, Rong- Xiu Zheng, Department of Gastroenterology, Tianjin Medical University General Hospital, Tianjin 356, China Supported by: National Natural Science Foundation of China, Nos and ; and Scientific Research Foundation of Tianjin Public Health ureau, No. 12KG13. Correspondence to: ang-mao Wang, Professor, Chief Physician, Department of Gastroenterology, Tianjin Medical University General Hospital, 154 nshan Road, Heping District, Tianjin 356, China. gi.tmuh@sohu.com Received: Revised: ccepted: Published online: bstract IM: To evaluate the phagocytic function and lysosome activities of intraperitoneal macrophages in autoimmune hepatitis (IH) mice. METHODS: Eighty C57L/68 mice were divided into an IH group and a control group. IH was induced by intraperitoneal injection of liver-specific antigen S-1 and Freund s complete adjuvant. Intraperitoneal macrophages were obtained through peritoneal washing. Macrophages were co-cultured with fluorescein isothiocyanate (FITC) labeled Escherichia coli (E. coli) and lysotracker red. The phagocytic rate/index and lysotracker fluorescence intensities were analyzed by fluorescence microscopy or flow cytometry. RESULTS: oth the phagocytic rate (24.7% ± 1.21% vs 47.27% ± 15.57%, t = , P <.5) and index (.36 ±.19 vs.89 ±.34, t = , P <.5) of macrophages from IH mice were lower than those from control mice. Most of FITC-labeled E. coli bacteria were transported into lysosomes after phagocytosis, which enhanced the activities of lysosomes. No matter before or after co-culture with FITClabeled E. coli, the activities of lysosome in the IH group were less than those of control mice WCJD

2 (before co-culture: 5.85 ±.35 vs ±.72, t = , P <.5; after co-culture: 9.45 ±.84 vs 3. ± 1.36, t = , P <.5). CONCLUSION: The phagocytic and lysosome functions of macrophages in IH mice are reduced, which may be pathogenic factors in IH. The uthor(s) 216. Published by aishideng Publishing Group Inc. ll rights reserved. Key Words: utoimmune hepatitis; Macrophages; Phagocytosis; Lysosome Xu RR, Wu YY, Zhou L, Wang M, Zheng RX. Dysfunction of phagocytosis and lysosome activities of intraperitoneal macrophages in autoimmune hepatitis mice. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 216; 24(23): URL: full/v24/i23/3488.htm DOI: org/ /wcjd.v24.i 摘要目的 : 研究自身免疫性肝炎 (autoimmune hepatitis, IH) 模型小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬及溶酶体功能及其与 IH 发病的关系. 方法 : 8 只 C57L/6 小鼠平均分为 IH 模型组及对照组, 应用腹腔注射小鼠肝特异性抗原 S-1 与氟式佐剂乳化物建立 IH 小鼠模型, 提取 IH 模型组和对照组小鼠腹腔巨噬细胞, 应用荧光显微镜和流式细胞仪检测巨噬细胞对荧光标记大肠杆菌的吞噬率和吞噬指数, 比较各组细胞 Lysotracker 荧光强度分析溶酶体含量. 结果 : I H 模型组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率 (24.7%±1.21% vs 47.27%±15.57%, t = , P <.5) 及吞噬指数 (.36±.19 vs.89±.34, t = , P <.5) 较对照组明显下降. IH 模型组巨噬细胞的溶酶体含量低于对照组 (5.85±.35 vs 15.39±.72, t = , P <.5); FITC-E. coli 被细胞吞噬后, 绝大部分进入溶酶体并刺激巨噬细胞中的溶酶体增多, 刺激后 IH 模型小鼠巨噬细胞的溶酶体含量仍显著低于对照组 (9.45±.84 vs 3.±1.36, t = , P <.5). 结论 : IH 模型组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬及溶酶体功能较对照组明显下降, 这可能是 IH 发病机制中的重要一环. The uthor(s) 216. Published by aishideng Publishing Group Inc. ll rights reserved. 关键词 : 自身免疫性肝炎小鼠 ; 巨噬细胞 ; 吞噬 ; 溶酶体 核心提示 : 自身免疫性肝炎 (a u t o i m m u n e hepatitis, IH) 是自身免疫反应介导的慢性进行 性肝脏炎症性疾病, 病因至今未明. 有研究显示 IH 的发病机制与单核 - 巨噬细胞系统功能异常 有关. 本文旨在研究 IH 模型小鼠的腹腔巨噬 细胞吞噬及溶酶体功能及其与 IH 发病的关系. 许瑞蕊, 伍银银, 周璐, 王邦茂, 郑荣秀. 自身免疫性肝炎小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬及溶酶体功能异常. 世界华人消化杂志 216; 24(23): URL: com/19-379/full/v24/i23/3488.htm DOI: org/ /wcjd.v24.i 引言自身免疫性肝炎 (autoimmune hepatitis, IH) 是自身免疫反应介导的慢性进行性肝脏炎症性疾病, 临床特征为不同程度的血清转氨酶升高 高 γ- 球蛋白血症 自身抗体阳性, 组织学特征为以淋巴细胞 浆细胞浸润为主的界面性肝炎 [1-4], 该病病因至今未明 [5-7]. 近年来随着我国 IH 发病率逐年升高, 对于其发病机制的研究已经成为医学界探索的热点问题 [8,9]. 有研 [1-13] 究显示 IH 的发病机制主要表现为肝脏免疫功能及免疫耐受的破坏, 其中固有免疫系统功能的紊乱, 尤单核 - 巨噬细胞系统功能异常可造成持续性肝细胞损伤, 在 IH 发病过程中发挥重要作用. 由此, 研究 IH 模型小鼠腹腔巨噬细胞功能, 探索单核 - 巨噬细胞在 IH 发病中的作用和机制, 将为 IH 的治疗开辟一条新道路. 1 材料与方法 1.1 材料由天津医科大学实验动物中心购进并饲养 C57L/6 小鼠 8 只, 4-6 周龄, 体质量 17-2 g 之间, 清洁级, 正常饮食水. 氟式佐剂 (CF, 购自美国 Sigma 公司 ), RPMI 164 培养基 ( 购自北京中杉金桥试剂公司 ), 小牛血清 ( 购自美国 Gibco 公司 ), Lysotracker Red DND-99( 购自美国 bcam 公司 ), DPI 试剂 ( 购自北京中杉金桥试剂公司 ), FITC 粉剂 ( 购自美国 Sigma 公司 ), L 培养基 ( 购自北京中杉金桥试剂公司 ). 1.2 方法 动物模型的建立 : 8 只 C57L/6 小鼠按 研发前沿有研究显示 IH 的发病机制主要表现为肝脏免疫功能及免疫耐受的破坏, 其中固有免疫系统功能的紊乱, 尤单核 - 巨噬细胞系统功能异常可造成持续性肝细胞损伤, 在 IH 发病过程中发挥重要作用. 由此, 研究 IH 模型小鼠腹腔巨噬细胞功能, 探索单核 - 巨噬细胞在 IH 发病中的作用和机制, 将为 IH 的治疗开辟一条新道路. WCJD

3 相关报道近期有文献报道在 Co 急性免疫性肝损伤小鼠模型中, 小鼠外周单核细胞吞噬功能下降, 凋亡细胞清除障碍, 加重了肝脏的炎症反应. C D 图 1 小鼠肝脏组织学形态 HE 染色., : 正常对照组 ; C, D: 实验组., C: 2;, D: 4. 体质量配对平均分为两组, 提取同种系小鼠肝脏匀浆即 S-1 [14,15], 两组小鼠分别腹腔注射试剂 1(S-1 抗原 +C F) 或试剂 2( 生理盐水 +CF)l ml/ 只, 注射试剂 1 组称为 IH 模型组, 注射试剂 2 组称为对照组. 第一次免疫后第 7 天给予同等剂量注射, 4 wk 后开始试验. 随机抽取每组各 1 只小鼠, 统计分析两组小鼠的血清谷丙转氨酶 (alanine aminotransferase, LT) 和谷草转氨酶 (aspartate aminotransferase, ST) 水平以及肝脏病结果, 验证模型的建立成功与否 IH 小鼠腹腔巨噬胞吞噬及溶酶体功能研究 : 取出剩余的每组各 3 只小鼠, 脱颈处死, 提取腹腔冲洗液的巨噬细胞 [16,17], 培养备用. 随机抽取每组各 1 份标本放入经 FITC 标记的大肠杆菌 (Escherichia coli, E. coli ), 胞菌比为 1 5, 避光共培养 1 h, 加入新鲜制备的含 Lysotracker 的培养液, 继续温箱培育 1 h, 冲洗固定后, 用 DPI( 蓝色荧光细胞核染色 ) 荧光染色并制成细胞涂片, 于荧光显微镜下观察, S 形计数每个不重复视野中的细胞数 (DPI 细胞核染色确定细胞总数 ) 吞噬 E. coli 的巨噬细胞数 (FITC 阳性细胞 ) 和吞噬大肠杆菌总数 ( 细胞内 FITC-E. coli 总数 ), 共计数 1 个巨噬细胞, 计算其吞噬率 (phagocytic rate) 及吞噬指数 (phagocytic index) [18,19], 并利用 IPP6. 软件分析 FITC-E. coli 与溶酶体的共定位度. 另取每 组各 1 份标本, 使用上述方法予溶酶体标记及 FITC-E. coli 共孵育处理, 剩余每组各 1 份标本只标记溶酶体而不经过与大肠杆菌孵育过程, 冲洗后放入无菌放免管中, 经流式细胞仪检测验证吞噬功能结果并分析其 Lysotracker 荧光强度. 相应公式为 : 吞噬率 = 巨噬细胞中吞噬大肠杆菌的细胞数 / 巨噬细胞总数 1%; 吞噬指数 = 巨噬细胞吞噬的大肠杆菌总数 / 巨噬细胞总数 ( 个 ). 统计学处理采用 SPSS19. 统计学软件, 计量资料以 mean±sd 表示, 各组数据分布特征为正态分布, 采用单样本 t 检验 配对 t 检验进行比较, P <.5 为差异具有统计学意义. 2 结果 2.1 IH 小鼠模型的建立和对照小鼠相比, IH 模型组小鼠皮毛晦暗, 精神状态不佳. 肝酶血清生化检测示 : IH 模型组小鼠 LT ST 水平分别较对照组升高 (156.8 U/L±52.86 U/L vs 29.9 U/L±8.43 U/L, t = 7.39, P <.5; U/L±125.8U/L vs U/L±3.61 U/L, t = 3.82, P <.5); 肝病理分析结果示 : IH 模型组小鼠肝脏中重度损害, 细胞形态结构紊乱, 局灶性肝细胞坏死伴肝小叶内大量炎细胞浸润 ; 而对照组小鼠肝脏细胞形态正常, 肝小叶结构规则, 呈正常肝组织形态 ( 图 1). WCJD 349

4 2 Counts M1 M FITC-E. coli 2 Counts M1 M2 创新盘点本研究提示, 在 IH 起病过程中, 可能存在巨噬细胞吞噬功能下降及溶酶体减少, 从而导致应清除的细菌 非致病性外来抗原以及自身凋亡小体等内源性抗原堆积, 打破了免疫耐受与应答之间的平衡状态, 启动了自身免疫反应, 从而造成肝脏损害, 这可能是导致 IH 发病的因素之一. 1 μm 图 2 荧光显微镜下巨噬细胞吞噬 FITC-E. coli ( 1). : 巨噬细胞核 DPT 染色 ( 蓝色 ) 和 CD68-PE 染色 ( 红色 ); : 巨噬细胞吞噬 FITC 荧光标记的大肠杆菌 ( 绿色 ), TRITCphalloidin 染色显示细胞骨架 ( 红色 ). E. coli : 大肠杆菌 FITC-E. coli 图 3 流式细胞仪检测巨噬细胞吞噬功能. : 对照组的流式吞噬结果 ; : IH 模型组的流式吞噬结果. 图中 M2 标识下的曲线面积代表吞噬了大肠杆菌的细胞数. E. coli : 大肠杆菌 ; IH: 自身免疫性肝炎. 2.2 IH 模型组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能较对照组下降 IH 模型组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率较对照组明显下降 (24.7%±1.21% vs 47.27%±15.57%, t = , P <.5); 相对应的, I H 模型组吞噬指数也显著低于对照组 (.36 个 ±.19 个 vs.89 个 ±.34 个, t = , P <.5), 说明 IH 模型小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬功能有显著下降. 流式细胞仪验证结果也提示 IH 模型组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率较对照组明显下降 (13.69%±3.62% vs 35.72%± 7.93%, t = , P <.5)( 图 2, 3). 2.3 I H 模型组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬的 E. coli 与溶酶体共定位度较对照组无明显差异荧光显微镜下观察可见 : 溶酶体分布于胞浆中, FITC-E. coli 被细胞吞噬后, 绝大部分进入溶酶体. 利用 IPP 6. 软件分析溶酶体 ( 红色荧光 ) 与 E. coli ( 绿色荧光 ) 重叠的程度 ( 图 4), 即为 FITC-E. coli 与溶酶体的共定位度, 结果显示两组比较无统计学差异 (96.92%±3.19% vs 97.28%±1.77%, t = -.252, P >.5). 2.4 IH 小鼠巨噬细胞溶酶体活性 Lysotracker 的平均荧光强度代表细胞内溶酶体的活性, 结果显示 IH 模型组巨噬细胞的溶酶体活性低于对照组 (5.85±.35 vs 15.39±.72, t = , P <.5); FITC-E. coli 被细胞吞噬后, 绝大部分进入溶酶体并刺激巨噬细胞中的溶酶体增多, 刺激后 IH 模型小鼠巨噬细胞的溶酶体活性仍显著低于对照组 (9.45±.84 vs 3.±1.36, t = , P <.5)( 表 1, 图 5). 3 讨论 IH 是一种慢性肝脏疾病, 其多基因遗传特征决定了单项免疫调节基因缺失的动物模型无法模拟其复杂的遗传背景, 而多数报道的肝炎模型仅仅是短暂性或急性的免疫性肝损伤, 如刀豆蛋白 (Co) 模型 [2], 因此目前还没有一种动物模型可完全体现人类 IH 由于自身免疫所造成的肝细胞损伤的所有特性, 迄今尚无标准的 IH 动物模型 [21-23]. 本文采用的 IH 模型是以同种系小鼠的肝组织提供的半抗原与氟式佐剂联合形成的自身抗原, 通过两次腹腔注射建立的. 我们观察到造模后小鼠肝脏组织中可见大量炎症细胞特别是淋巴细胞的浸润, 其分布主要以汇管区为主, 肝细胞出现明显肿胀 坏死, 伴有血清转氨酶升高, 造模周期为 4 周, 自身免疫性炎症的发展呈慢性过程, 与人类 IH 的发病过程相似, 是在 IH 研究中应用较多的模型之一. WCJD

5 应用要点巨噬 - 溶酶体途径可能在 IH 发病中发挥着重要作用, 基于肝 K u p ff e r 细胞的后续研究对阐释 IH 发病机制和探索新的治疗手段将有重要意义. C D E F G H 图 4 FITC-E. coli 与溶酶体的共定位 ( 1). : 对照组 DPI 染色 ; : IH 模型组 DPI 染色 ; C: 对照组 Lysotracker Red DND-99 染色 ; D: IH 模型组 Lysotracker Red DND-99 染色 ; E: 对照组 FITC 染色 ; F: IH 模型组 FITC 染色 ; G: 对照组荧光染色融合 ; H: IH 模型组荧光染色融合. DPI 染色 ( 蓝色荧光 ): 代表巨噬细胞核 ; Lysotracker Red DND-99 染色 ( 红色荧光 ): 代表溶酶体 ; FITC 染色 ( 绿色荧光 ): 代表 E. coli. E. coli : 大肠杆菌 ; IH: 自身免疫性肝炎. 本研究提取小鼠腹腔巨噬细胞, 与 FITC 荧光标记的大肠杆菌共孵育后, 计算吞噬率 及吞噬指数, 并分析细胞的溶酶体活性. 结果 显示 IH 模型组小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬率 及吞噬指数均显著低于对照组 (P <.5), 证明 IH 组巨噬细胞吞噬功能有明显的下降, 同时 IH 模型组小鼠腹腔巨噬细胞的溶酶体活性较 对照组减低. 单核 - 巨噬细胞的吞噬清除作用 是机体固有免疫的第一道防线 [24,25]. 细菌和病 毒被吞噬后, 在溶酶体消化降解 [13,26]. 在肝脏, Kupffer 细胞 ( 肝脏的巨噬细胞 ) 持续接受来富 含肠道细菌抗原的刺激, 通过吞噬 清除和抗 原递呈功能维持肝脏的免疫耐受耐受 [27,28]. 近 [13] 期有文献报道在 Co 急性免疫性肝损伤小 表 1 Lysotracker 的平均荧光强度 (n = 1, mean±sd) 分组 FITC-E. coli 荧光强度 IH 模型组 加入前 5.85±.35 加入后 9.45±.84 a 对照组 加入前 15.39±.72 c 加入后 3.±1.36 ae a P <.5 vs 同组 FITC-E. coli 加入前 ; c P <.5 vs IH 模型组 FITC-E. coli 加入前 ; e P <.5 vs IH 模型组 FITC-E. coli 加入 后. E. coli : 大肠杆菌 ; IH: 自身免疫性肝炎. 鼠模型中, 小鼠外周单核细胞吞噬功能下降, 凋亡细胞清除障碍, 加重了肝脏的炎症反应. 本研究进一步提示, 在 IH 起病过程中, 可能存 WCJD

6 荧光强度 C 荧光强度 细胞数 荧光强度 D 荧光强度 细胞数 同行评价本文通过动物模型研究验证了巨噬细胞吞噬及溶酶体在自身免疫性肝炎发病中可能的机制, 提出自身免疫性肝炎巨噬细胞吞噬及溶酶体功能下降, 导致清除细菌 外来抗原及自身凋亡小体能力下降, 诱发免疫反应, 观点新颖, 实验设计科学, 结果可靠, 证据可信, 统计合理, 结论分析科学, 具有较高学术价值 细胞数 细胞数 图 5 腹腔巨噬细胞溶酶体的表达. : 对照组加入 FITC-E. coli ; : 对照组未加入 FITC-E. coli ; C: IH 模型组加入 FITC-E. coli ; D: IH 模型组未加入 FITC-E. coli. E. coli : 大肠杆菌 ; IH: 自身免疫性肝炎. 在巨噬细胞吞噬功能下降及溶酶体减少, 从而 导致应清除的细菌 非致病性外来抗原以及 自身凋亡小体等内源性抗原堆积, 打破了免疫 耐受与应答之间的平衡状态, 启动了自身免疫 反应, 从而造成肝脏损害, 这可能是导致 IH 发 病的因素之一. 总之, 巨噬 - 溶酶体途径可能在 IH 发病中 发挥着重要作用, 基于肝 Kupffer 细胞的后续研 究对阐释 IH 发病机制和探索新的治疗手段将 有重要意义. 4 参考文献 1 邱德凯. 自身免疫性肝炎的诊断 分型和治疗. 中华消化杂志 1999; 19: Gleeson D, Heneghan M. ritish Society of Gastroenterology (SG) guidelines for management of autoimmune hepatitis. Gut 211; 6: [PMID: DOI: /gut ] 3 赵景民, 王松山, 孙艳玲, 周光德, 刘平, 孟二红, 辛绍杰, 张泰和, 王福生, 毛远丽, 李莉, 李迎新, 张鸿飞, 张玲霞, 陈菊梅. 自身免疫性肝炎临床病理特征及发病机理的研究. 中华实验和临床病毒学杂志 22; 16: Ishibashi H, Komori, Shimoda S, Gershwin ME. Guidelines for therapy of autoimmune liver disease. Semin Liver Dis 27; 27: [PMID: DOI: 1.155/s ] 5 éland K, Lapierre P, lvarez F. Influence of genes, sex, age and environment on the onset of autoimmune hepatitis. World J Gastroenterol 29; 15: [PMID: DOI: / wjg ] 6 Liberal R, Mieli-Vergani G, Vergani D. utoimmune hepatitis: From mechanisms to therapy. Rev Clin Esp 216 May 6. [Epub ahead of print] [PMID: DOI: 1.116/j.rce ] 7 Longhi MS, Ma Y, Mieli-Vergani G, Vergani D. etiopathogenesis of autoimmune hepatitis. J utoimmun 21; 34: 7-14 [PMID: DOI: 1.116/j.jaut ] 8 贾继东, 段维佳. 自身免疫性肝病的诊治进展. 中国继续医学教育 21; 2: 林菊生, 余金玲. 自身免疫性肝病重叠综合征的临床诊治进展. 中华肝脏病杂志 21; 18: Longhi MS, Ma Y, Mieli-Vergani G, Vergani D. daptive immunity in autoimmune hepatitis. Dig Dis 21; 28: [PMID: DOI: /28266] 11 Seki E, Schnabl. Role of innate immunity and the microbiota in liver fibrosis: crosstalk between the liver and gut. J Physiol 212; 59: [PMID: DOI: /jphysiol ] 12 Lleo, owlus CL, Yang GX, Invernizzi P, Podda M, Van de Water J, nsari, Coppel RL, Worman HJ, Gores GJ, Gershwin ME. iliary apotopes and anti-mitochondrial antibodies activate innate immune responses in primary biliary cirrhosis. Hepatology 21; 52: [PMID: DOI: 1.12/hep.23783] 13 Martynova TV, leksieieva IM. [Functional activity of peritonal macrophages in liver immune damage of cellular and antibody genesis in mice]. WCJD

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8 Published by aishideng Publishing Group Inc 8226 Regency Drive, Pleasanton, C 94588, US Fax: Telephone: bpgoffice@wjgnet.com I SSN > aishideng Publishing Group Inc. ll rights reserved.

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