目录 出血和血栓... 2 一 出血和血栓的基础理论 血管的作用 血小板的作用 血液凝固 凝血因子 凝血机制 机体的止凝血模式 机体的抗血液凝固机制 纤维

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1 第七讲 出血和血栓

2 目录 出血和血栓... 2 一 出血和血栓的基础理论 血管的作用 血小板的作用 血液凝固 凝血因子 凝血机制 机体的止凝血模式 机体的抗血液凝固机制 纤维蛋白溶解系统 二 出血性疾病的分类 临床表现 出血性疾病的分类 出血性疾病的临床表现 出血性疾病的诊断 常见出血性疾病... 25

3 出血和血栓 机体凝血激活和止血栓形成, 是一旦出血时防止血液过度流失的主要机制之一, 正常的机体止血机制有赖于血管壁 血小板 凝血因子 抗凝血因子 纤维蛋白溶解系统 ( 纤溶 ) 的完整性以及它们之间的生理性平衡和调节 各个系统相互制约, 处于动态平衡状态 只有通过凝血与抗凝血之间的平衡, 才确保在必须形成止血栓的局部形成血栓, 其它部位无血栓形成, 使血液循环得以畅通 一 出血和血栓的基础理论 1. 血管的作用血管是一个密闭的管道系统, 以保证血液有序地在其中不停顿 不外溢地流动 血管及其固有的内皮在维持血管的流动性 止血 防止血栓形成及调节炎症过程等方面起关键作用, 内皮组织分布在体内的各个部位, 与血液的流动性和血细胞功能密切相关 然而, 不同的血管床之间的内皮细胞的形态学 基因表达谱及其功能各不相同 例如, 在直行的动脉段, 内皮细胞朝着血流方向并行排列, 而在动脉和静脉的分支或弯曲部位则不是这样 同样地, 毛细血管后微静脉的内皮组织主要是调节白细胞的黏附和迁移, 而微动脉的内皮组织在调节血管张力中起重要作用 血管壁的结构血管壁的结构主要有三部分组成 : 1 内膜层: 由单层内皮细胞组成, 主要与血液接触 可产生或释放 ET( 内皮素 ) PGI 2 ( 前列环素 ) vwf( 血管性血友病因子 ) t-pa( 组织型纤溶酶原激活物 ) 等 2 中膜层: 由基底膜 胶原 平滑肌 弹力纤维等组成, 含丰富的 TF( 组织因子 ) PGI 2 合成酶等 保持血管形状 弹性和伸缩作用 3 外膜层: 由结缔组织来分隔血管壁与机体 其他组织 所有血管都有内膜层和外膜层 外膜层因血管的大小而厚薄不等 血管的止血作用主要通过与血液流动密切相关的内膜层进行的 血管的主要功能 1 收缩功能: 收缩作用是血管参与止血最快速的反应, 可直接引起血流减慢 血管损伤处的闭合 血管断端的回缩以及出血的终止 由 ET PGI 2 TXA 2( 血栓素 A 2) 等调控 2 激活血小板: 胶原 基底膜等激活 增加 vwf( 血管性血友病因子 ) 的合成和释放, 进而激活血小板, 使血小板通过 vwf 黏附在内皮细胞表面 释放 PFA( 血小板活化因子 ), 诱导血小板活化 聚集 3 激活凝血系统: 合成和分泌纤溶酶原活化抑制剂 (PAI) 入血,PAI 活性的增高, 在血液凝固调节中起到阻止血液凝块溶解的作用, 可以加强止血作用 胶原激活内源性凝血系统 (FⅫ 激活 ) TF( 组织因子 ) 激活外源性凝血系统 (FⅢ 释放 ) 4 促进血液凝固: 血管收缩, 血流减慢, 血管通透性升高, 血浆外渗

4 5 血液凝固调节 内皮的作用内皮是介于流动的血液和血管壁之间的一种动态的界面, 它能产生许多种调节血液流动的因子 内皮细胞容易受血流的剪切力 血液可溶性因子 循环中来自各类细胞的信号以及血管中细胞之间的相互作用的影响, 由此造就了内皮细胞区域特异性表现型 ( 图 1) 除了调节血管渗透性和脆性外, 内皮细胞通过其抗血栓和促纤溶作用来调节血流状态 这些活动起到维持血管腔内血液循环畅通的作用 图 1. 内皮细胞血栓调节分子图表描述 箭头代表内皮细胞在液态阶段时分泌并发挥效应的产物 矩形代表细胞表面连接分子 图的左边表示血栓调节分子的血小板激活 聚集 血管收缩作用 图的顶部是凝血 / 纤溶系统的调节因子 图的右边代表由炎症介质调节其表达及活性的炎症分子 A2, 膜联蛋白 A2;AT, 抗凝血酶 ;CAMs, 细胞黏附分子 ;CD39/ENTPD1, 腺苷三磷酸双磷酸酶 ;EPCR, 内皮细胞蛋白 C 受体 ; ET, 内皮素 ;HS, 硫酸乙酰肝素 ;NO, 一氧化氮 ;PC, 蛋白 C;PGI2, 前列环素 ;PLG, 纤溶酶原 ;TF, 组织因子 ;TFPI, 组织因子通路抑制物 ;TM, 血栓调节蛋白 ;t-pa, 组织型纤溶酶原激活物 ;u-pa, 尿激酶纤溶酶原激活物 ;upar,u-pa 受体 ;VIIa,VIIa 因子 血管壁完整时, 内皮细胞主要表现为抗血栓活性 在血栓形成的早期阶段, 血栓调节复合物控制着血小板和血管的反应性 ( 表 1) 这些复合物包括花生酸类 一氧化氮 内皮素 CD39 三磷酸盐去磷酸酶 1 内皮细胞去花生四烯酸类物质是来源于饮食中必须脂肪酸的碳氢化合物 最重要的花生四烯酸类物质是前列环素 (PGI 2), 它能够阻断血小板的反应性, 诱导血管舒张, 并刺激细胞介素的产生 一氧化氮是当血管扩张剂结合到内皮细胞的膜表面受体后由内皮细胞所产生和释放的天然气体, 是一种短效的血管扩张剂和血小板反应抑制剂 它通过激活鸟苷酸环化酶, 使环磷鸟苷生成增多, 从而抑制了血小板的功能并诱导血管舒张 内皮素是个短效的多肽, 它通过结合平滑肌细胞上的 G 蛋白偶联受体来调节血管舒张和收缩节律 内皮细胞 CD39/ENTPDI 是一种膜偶联的腺苷三磷酸酶, 在初始的血小板释放过程中能够代谢成腺苷二磷酸 (ADP) 这就能够进一步地抑制血小板的活化和重新分布, 并具有一定的治疗潜力 表 1 早期促血栓和抗血栓调节分子与人内皮细胞的关系

5 表 2 不同时期的内皮细胞血栓调节蛋白 一旦纤维蛋白 / 血小板凝块在损伤部位形成, 凝血过程必然被终止以避免邻近血管正常区域发生血栓栓塞 若凝血机制未得以控制, 即便是适度的促凝刺激也可导致整个血管分支产生凝块 因此, 后续形成的血栓调节因子能够抑制过度的凝血酶形成, 或者是促进血管内血栓溶解 ( 表 2) 抗凝血酶是一种天然抗凝血剂, 它作为循环中的凝血酶抑制剂和第十因子抑制剂起抗凝作用, 而内皮细胞的肝素蛋白聚多糖能够作为抗凝血酶辅助因子 组织因子通路抑制剂能够抑制第七因子和组织因子之间形成复合物 血管壁的血栓调节蛋白 / 内皮细胞蛋白 C 受体 (EPCR)/ 蛋白 C 系统通过直接对凝血酶的抗凝效应来调节止血过程 纤维蛋白溶解系统与血管内皮细胞息息相关, 内皮细胞不仅合成和分泌纤溶系统的各种成分, 而且通过表达受体来调节纤溶酶原前体转变成血纤溶酶的过程 纤溶蛋白合成和装配系统的异常可能在血栓性疾病的病因病理学中起重要作用 因此, 内皮抗血栓作用主要有以下几点 : 1 血管松弛和舒张作用 内皮细胞直接产生两种松弛舒张物质: 前列环素 (PGI 2) 和一氧化氮 (NO), 可有效防止因小血管的持续收缩导致的血栓形成 PGI 2 是花生四烯酸在内皮细胞内的特有代谢产物 内皮细胞是 NO 的主要合成细胞,NO 可使平滑肌细胞的 CGMP 水平升高, 使平滑肌松弛 2 抑制血小板聚集的作用 NO 有抑制 ADP 等对血小板的诱聚作用, 以及减少血小板内 Ca 2+ 而直接抑制血小板聚集 PGI 2 在扩张血管的同时, 也有血小板聚集抑制作用 3 血液凝固和调节作用 血管内皮细胞是抗凝血酶(AT) 蛋白 C 系统的血栓调节蛋白 (TM) 组织因子途径抑制物(TFPI) 和 t-pa 合成和释放的主要场所 这些产物可直接或间接地通过灭活凝血活化因子 促进血块溶解 抑制血小板活化等途径来对抗血栓形成 而当血管壁受损时, 血小板黏附在受损内皮细胞的表面 在血小板黏附的同时, 血小板和内皮细胞一起被激活 内皮细胞受到刺激释放 (1) 表达 TF 增多, 并能结合 Ⅸa 和 Xa, 使局部促凝作用增强 ;(2) 局部 TFPI TM ATⅢ 和 t-pa 减少, 而 PAI-1 增多, 导致局部抗凝和纤溶活性降低 ;(3) 受损 VEC 分泌内皮素 (ET) TXA 2 PAF 等缩血管物质增多, 而分泌 PGI 2 NO 等扩血管物质减少, 引起血管强烈收缩和痉挛 而由局部聚集的血小板释放的花生四烯酸 (AA) 代谢产物 PGG 2 PGH 2 和 TXA 2 也具有缩血管作用

6 2. 血小板的作用血小板的膜脂质的主要成分为磷脂, 由鞘磷脂 (SPH) 磷脂酰胆碱(PC) 磷脂酰 乙醇胺 (PE) 磷脂酰丝氨酸(PS) 磷脂酰肌醇(PI) 溶血卵磷脂组成 血小板的活化 1 血小板形态改变 无论是血小板与胶原间的粘连, 还是血小板与血小板间的黏附, 都可以发现血小板, 由静寂状态的圆碟形变成了骨架蛋白滑动后出现的多角形或多伪足活化状态 2 血小板表面特殊蛋白的表达 每个血小板表面都有大量作为各种物质受体的糖蛋白 但有个别糖蛋白在静寂的血小板表面是不表达或极少表达的 其中就有 GPIIb/IIIa 复合物和 a 颗粒膜上的 P 选择素 这种 GPIIb/IIIa 和 P 选择素在血小板表面的双重表达, 已成为观察血小板活化最可靠的指标 3 血浆血小板特异产物水平增高 有三种物质只能在血小板内生成: 血小板球蛋白 血小板第四因子和血栓烷 A 2 由于静寂血小板很少合成释放上述三种物质, 一旦血浆中上述三种物质和血栓烷 A 2 的代谢产物血栓烷 B 2 水平明显增高就预示着血小板活化 血小板的止血作用 1 粘附功能 : 血小板可直接粘附于血管内皮下成分, 如胶原及弹性蛋白等, 亦可通过 vwf 及纤维连接蛋白等粘附蛋白介导而发生粘附 图 2 血小板黏附 2 聚集功能 : 血小板聚集是血小板参与止血和血栓形成的重要环节, 当血小板粘附于血管破损处或受到凝血酶 ADP 等活化剂作用后即被活化, 活化的血小板相互粘附在一起即为血小板聚集 血小板聚集与 GPIIb-IIIa 纤维蛋白原 钙离子有关

7 图 3 血小板聚集血小板聚集目前认为有三条途径 ( 1)ADP 途径,ADP 胶原 凝血酶 肾上腺素等均可诱导血小板释放内源性 ADP 后者可引起血小板聚集 (2)TXA 2 途径 :PGG 2 PGH 2 及 TXA 2 可诱导血小板发生聚集反应, 但不依赖 ADP 途径 (3)PAF 途径 : 不依赖上两者 3 释放反应 : 血小板活化剂可以直接引起血小板释放反应并引起二相血小板聚集 图 4 血小板释放 4 促凝作用:PF3 可提供催化表面 ; 完成因子 X 和因子 II 的活化 另外, 血小板内容物中包含有种类较多的凝血因子, 血小板活化释放时, 因凝血因子的释放而加强局部的凝血作用 5 血块收缩功能: 活化的血小板释放血块收缩蛋白, 使血块收缩, 有利于创口的缩小和愈合 6 维护血管内皮的完整性: 血小板能填充受伤内皮细胞所造成的空隙, 参与血管内皮细胞的再生和修复过程, 能增强血管壁的抗力, 减低血管壁的通透性和脆性 3. 血液凝固血液凝固是血液由液体状态变为凝胶状态的过程, 也简称凝血 血液凝固是一个受到精确调控的平衡系统 正常情况下, 血液以流动状态存在于脉管系统中, 也可以快速形成凝块以封堵伤口 止血功能受损时, 即会出现出血或血栓症状 根据凝血瀑布学说, 认为血液凝固是使一系列的凝血因子活化的酶促反应过程, 每个凝血因子都被其前因子所激活, 最后导致纤维蛋白生成

8 凝血因子也称凝血蛋白, 迄今为止已证实有 14 个因子参与凝血过程, 除 Ca 2+ 外, 都是蛋白质 除组织因子 (TF) 外, 其他凝血因子均存在于正常血浆中, 大部分由肝脏合成 按国际凝血因子命名委员会规定, 以罗马数字命名除激肽系统以外的凝血因子 3.1. 凝血因子凝血因子分为以下几类 :(1) 维生素 K 依赖的凝血因子 ( 凝血酶原 凝血因子 Ⅶ 凝血因子 Ⅸ 凝血因子 Ⅹ 蛋白 C);(2) 可溶性辅因子 ( 蛋白 S 凝血因子 Ⅴ 凝血因子 Ⅷ 血管性血友病因子 );(3) 凝血因子 XI 和其他 接触 因子 ;(4) 细胞相关的辅因子 ( 组织因子和血栓调节蚕白 );(5) 纤维蛋白原 ;(6) 凝血因子 XIII 和凝血酶可活化的纤溶抑制物 (TAFI):(7) 血浆凝血蛋白酶抑制物 维生素 K 依赖的凝血因子维生素 K 依赖的凝血因子酶原是水解活化后表现出酶活性的丝氨酸蛋白酶前体 它们有相似的蛋白结构域 每一个成熟的维生素 K 依赖的凝血酶原蛋白其氨基端都是由 9~12 个 GLA 构成的 γ- 羧基谷氨酸结构域 其后是疏水结构域 ( 图 5) 除凝血酶原以外的因子都包含有两个表皮生长因子样结构域, 其羧基端都是由丝氨酸蛋白酶所构成 凝血酶原有两个 kringle 结构域来代替表皮生长因子样结构域 至少部分相应的功能与相应的结构域相关 图 5 包含 GLA 结构域的酶原之间的比较除了在成熟的蛋白中发现的功能结构域以外, 在合成时, 每种维生素 K 依赖的因子在氨基端都有一段信号肽, 后者可以将其定向转运入内质网 在信号肽之后还有一段 19~25 个氨基酸的前肽, 可被 γ- 谷氨酰羧化酶识别, 从而催化这些分子氨基端部分的谷氨酸残基羧

9 基化 定位于内质网后, 其信号序列被微粒体的信号肽酶去除 在成熟蛋白分泌之前, 前肽在羧基化之后被切除 这些蛋白不仅同源, 它们的基因结构也有着高度的相似性 这些维生素 K 依赖的因子的编码序列的长度也很相似 然而, 内含子的长度差异很大, 因此导致基因的整体长度有很大差别 ( 凝血酶原基因为 20kb, 凝血因子 Ⅶ 基因为 13kb, 凝血因子 Ⅸ 基因为 33kb, 凝血因子 Ⅹ 基因为 25kb, 蛋白 C 基因为 10kb) 尽管这些维生素 K 依赖因子的 cdna 已经测序成功, 但对非编码序列的了解还有较大差异 这些维生素 K 依赖的凝血因子酶原主要是在肝脏合成的, 因此它们都存在着调控元件以控制肝脏特异的表达 只是这些因子的调控元件有所不同 对于凝血因子 Ⅶ Ⅸ Ⅹ 和蛋白 C 蛋白 Z 而言, 它们的内含子在基因中的定位是相同的, 表明这些酶原都由共同的祖基因进化而来 基因分子中构成 功能 结构域的部分往往被完整地编码在单独的外显子内, 也就是说, 一个外显子编码信号肽, 下一个外显子编码前肽和 GLA 结构, 以此类推 这种模块化的设计表示出不同的蛋白外显子是通过怎样的移动和剪切组成完整的功能单位来生产具有新功能的蛋白 GLA 结构域是维生素 K 依赖因子的特征性结构, 它可以介导蛋白与膜脂质的相互作用 GLA 结构域是以在成熟蛋白开始的 42 个氨基酸经过修饰后而命名的 GLA 结构域是特异性的 γ- 谷氨酰基羧化酶在内质网中对谷氨酸残基经过翻译后修饰而成 这个羧化过程需要氧气 二氧化碳和还原的维生素 K 对于每一个羧化的谷氨酰基而言, 一个还原的维生素 K 分子转变成环氧化物形式 前肽序列是 γ- 羧基化所必需的, 而且在维生素 K 依赖因子中它们具有高度保守性 位于 和 -10 的氨基酸是被羧化酶特异识别的 羧化酶的突变会导致这些包含 GLA 的因子含量减少 图 6. 维生素 K 羧化酶活性 谷氨酰基在特异性羧化酶作用下转变为 γ-- 羧化谷氨酰基 这个过程需要氧气 二氧化碳 ( 图中用绿色表示 ) 和以对苯二酚形式存在的还原型维生素 K 二氧化碳被结合到碳原子, 提供了该残基的第二个羧化物 这个过程中, 还原型的维生素 K 转变为环氧化物 还原型的维生素 K 在一种特异性的环氧化物还原酶作用下可以循环利用, 这个过程可以被华法林所阻断 尽管 γ- 谷氨酰羧基化酶直接影响到维生素 K 依赖因子的修饰, 但一种游离的酶原复合物 - 维生素 K 环氧化物还原酶, 可以将维生素 K 的环氧化物形式转变为还原形式 华法林可以抑制维生素 K 环氧化物还原酶的活性, 组织维生素 K 转变为其还原形式 因此华法林的作用是通过抑制 γ- 谷氨酰羧基化, 导致循环中出现异型的低羧基化的含 GLA 因子 这种低羧基化形式的因子活性降低 由于华法林是通过抑制还原酶而不是用过抑制羧基化阻止维生素 K 的循环利用, 因此华法林中毒可以用补充维生素 K 得到暂时的缓解 环氧化物还原酶的基因已经被测序成功 它的基因突变做认为与华法林抵抗和维生素 K 依赖的凝血因子联合缺陷 (2 型 ) 有关

10 维生素 K 环氧化物还原酶复合物 1(VKORC1) 和代谢华法林的细胞色素 P450 复合物 (CYP2C9) 中的基因变异与要达到抗凝疗效的华法林服用剂量有关 有意思的是,γ - 谷氨酰羧化酶的基因多态性与个体间华法林的敏感性并不相关 在不同个体之间服用华法林的剂量有很大差异, 无论是抗凝剂量过度还是不足都会造成很严重的临床后果 因此, 华法林治疗剂量的个体化也体现了药物基因组学在在临床应用中的前景 GLA 结构域的钙离子结合形式与磷脂膜表面可以发生相互作用 带有阴离子电荷的脂类, 主要是磷脂酰丝氨酸 (PS), 负责与钙离子的结合 即使是在没有适合的蛋白辅因子存在的情况下, 和磷脂的结合也能促进包含 GLA 结构域蛋白酶的水解活性 PS 与合成的磷脂膜活性有关 PS 在细胞膜 ( 如血小板 ) 上调节凝血功能的作用十分复杂 在与血流接触过程中,PS 通常不暴露于细胞膜外 然而, 活化的细胞 ( 尤其是血小板 ) 常常会有 PS 在细胞外膜的暴露 因为细胞活化有利于提高凝血功能, 所以就假设细胞膜外 PS 的暴露是细胞凝血反应所必需的 然而, 也有一些研究表明细胞的凝血功能和 PS 暴露量并没有直接的关系 这个结果与细胞的凝血功能直接和 PS 的表达相关的研究相反 从这些研究来看, 可以得出以下推沦,PS 的暴露对细胞的凝血功能是必需的, 但是其他特征, 比如细胞受体和 ( 或 ) 结合蛋白,PS 的暴露也是必需的 含有 GLA 结构域蛋白的前 42 个氨基酸具有高度的同源性 这意味着 GLA 结构域的三维结构是高度保守的, 很少有特异性的相互作用 曾经一度认为这类蛋白和磷脂的结合是由钙离子 桥 介导负电荷的 GLA 残基和负电荷的瞵脂之间的结合 这个机制对为何结合同时需要钙离子和磷脂做了一个很好的解释 然而, 现在普遍认为, 这种结合是由 GLA 结构域前 10 个氨基酸的疏水残基的膜插入所介导的 钙离于对于该反应的发生是必需的, 这是因为钙离子与某些 GLA 残基的结合可以诱导构象的巨大改变, 从而在接触部位暴露疏水氨基酸残基 疏水性的片段位于含 GLA 结构的蛋白酶表面伸出的结构性区域的顶端, 就像船的龙骨 这些结构允许 龙骨 插入到磷脂中, 计算机模型研究进一步改进了这种假设 模型表明 龙骨 插入膜的程度比想象的还要深 这些疏水的结构被埋在其中, 但是如图所示 龙骨 插入的程度要足以保证 GLA 残基可以通过钙离子桥与细胞膜外的 PS 分子发生相互作用 ( 图 7) 此外,GLA 残基中的赖氨酸和精氨酸也能与膜内的 PS 发生直接作用 图 7. 钙离子与 GLA 结构域的结合改变了 GLA 结构域的构象 这幅图表示的是凝血酶原的 GLA 结构域的分子模型 钙离子结合形式是通过凝血酶原 X 射线晶体结构衍射得到的 (PDB 结构 2PF2) 非钙离子结合形式是通过因子 X 的磁共振显像所得的模型 (PDB 结构 1WHE) 每一个圆圈表示一个氨基酸 GLA 用红色标出 图中深蓝色表示的疏水区在膜插入中被认为是有重要作用的 (6,7,9 残基 ) 在没有钙离子存在的情况下, 带有负电荷的 GLA 暴露于溶液中, 疏水区包埋在内部 当钙离子与 GLA 结合后提供了充

11 分的能量改变 GLA 的结构并使疏水区暴露 (6,7,9 残基 ) 7 个钙离子中只有 3 个可以被看到 如图所示疏水区插入膜内 这个模型表明,GLA 结构插入到膜中, 该处钙离子与带有负电的膦酯头部相互作用 分子模型利用 PyMol 程序制作 这些维生素 K 依赖凝血因子的 GLA 结构域的高度同源性提示钙离子 -GLA 与磷脂形成复合物的亲和力也非常相似 但是事实并非如此 因子 Ⅸ 和因子 Ⅹ 与含磷酯酰胆碱 / 瞵脂酰丝氨酸泡囊的结合程度要远远强于 Ⅶ 因子 对于这种显著差异, 其原因并不明确, 但也许和 GLA 结构域中带正电荷的氨基酸的不同相关, 而这些氨基酸可能直接与 PS 相互作用 维生素 K 依赖凝血因子的第一个 EGF 结构域含有一个钙离子结合位点, 不包含 GLA 残基, 但是包含一个 β- 羧基天冬氨酸 这个保守的天冬氨酸位点被一个目前还不太了解的 β- 羧基化酶进行了翻译后修饰 钙离子和 ECF-1 结构域的结合对反应活性来说是非常重要的, 同时相对于分子的其他部位来说, 该结合可能更有助于 GLA 结构域的定向 ECF-1 和 ECF-2 结构域至少能部分将在脂膜表面上的丝氨酸蛋白酶结构域从空间上分开 活化的因子 Ⅶ 和它的辅因子 ( 组织因子 ) 的相互作用至少部分是受组织因子和活化因子 Ⅶ 的两个 ECF 结构域的直接 - 相互作用所调节的, 如图 8 所示 图 8. 活化的因子 Ⅶ 和组织因子的复合物 组织因子 (PDB 结构 2HFT) 和组织因子复合物 (PDB 结构 1DAN) 的晶体模型在图中和活化因 Ⅶ 的游离结构一并表示 ( 构建自 PDB 结构 1QHK 1WHF 1RFN23 和 1DAN) 组织因子的跨膜结构图中尚未阐明, 故只表示其膜外的部分 图中表示了活化因子 Ⅶ 的 GLA 结构域 EGF 结构域和催化结构域 钙离子用黑色表示, 与组织因子的结合改变了活化因子 Ⅶ 的整体结构 复合物的晶体模型表明活化因子 Ⅶ 和组织因子的结合是多角度的结合 分子模型是用 PyMol 程序制作 所有包含 GLA 酶原的活化都经历了至少一次肽段的剪切 ( 图 5) 活化形式常住因子的名称后加字母 a 来表示, 除了蛋白 C 是缩写为 APC 剪切后的活化形式产生个新的氨基末端, 该末端折叠后与丝氨酸蛋白酶结构域中的特异性残基相互作用 这种相互作用改变了蛋白的构象, 从而使活化位点 (His Ser Asp) 排列成行, 同时使因子的蛋白酶活性得以表达 所有含 GLA 蛋白酶的丝氨酸蛋白酶结构域间及其与糜蛋白酶 胰蛋白酶之间都具有高度的同源性 ; 它们都有胰蛋白酶样的活性, 都可以在精氨酰残基羧基端进行特异性的剪切 然而和胰蛋白酶所不同的是, 胰蛋白酶除切割精氨酸和赖氨酸残基之外没有很高的特异性, 但是活化的凝血因子有广泛的底物特异性口袋, 因此每个活化的凝血因子只能识别一小部分的氨基酸序列 尽管蛋白 C 凝血酶原和凝血因子 Ⅶ Ⅸ 和 Ⅹ 的蛋白酶结构域具有高度同源性, 但是这些因子都有特定的凝血功能, 由非高度同源的表面环状结构调节

12 因子 Ⅶ Ⅸ 和 Ⅹ 的活化形式各自有一个特定的辅因子 组织因子是活化 Ⅶ 因子的辅因子 : 活化的因子 Ⅷ 是活化因子 Ⅸ 的辅因子 ; 活化的因子 Ⅴ 是活化因子 Ⅹ 的辅因子 这些因子和辅因子在细胞膜表面形成蛋白水解的活化复合物 凝血酶执行凝血功能不需要辅因子 然而, 当它一旦和辅因子血栓调节蛋白 (TM) 相互作用时, 它的功能就从凝血 ( 形成纤维蛋白原 ) 变成了抗凝 ( 剪切形成活化蛋白 C) 尽管每一种蛋白没有辅因子也能表现一定的活性, 但是辅因子的存在可以使这种活性大大增强 复合物常常以它的生理性底物所命名 ; 活化因子 Ⅸ/Ⅷ 复合物常常命名为 X 酶或内源性 X 酶复合物 ; 活化因子 Ⅶ/ 组织因子复合物常命名为外源性 X 酶复合物 ; 活化因子 Ⅹ/Ⅴ 复合物常命名为凝血酶原酶复合物 辅因子通过 2 种机制增强活性 :(1) 它们有底物和酶原的结合位点, 可以使两者接近 ;(2) 它们和蛋白酶相互作用产生结构性改变, 从而增加酶原活性 X 射线晶体扫描可以得到活化因子 Ⅶ/TF 的结构 图 8 显示了活化因子 Ⅶ 和它的辅因子组织因子相结合的结构性改变, 活化因子 Ⅸ/Ⅷ 和活化因子 Ⅹ/Ⅴ 复合物没有晶体化结构, 似它们形成复合物引起的结构改变可能基本类似 凝血酶原 ( 因子 II) 和其他维生素 K 依赖的酶原一样, 血浆中的凝血酶原主要是在肝脏中合成 血浆中它以单链形式存在, 分子量为 72000, 血浆中半衰期为 60 小时 凝血酶原有 10 个 GLA 残基 和其他维生素 K 依赖的酶原不同的是, 它没有 EGF 样结构域, 被 2 个 Kringle 结构域所替代 Kringle 结构域的特征是有 3 个二硫键, 像丹麦语中的一种糕点 Kringle Kringle 结构域的主要功能是结合其他蛋白如活化物 底物 辅因子或受体 因子 Xa/Va 凝血酶原酶复合物在两个位置 (Arg271 和 Arg320) 剪切凝血酶原, 如图 9 所示 分子量 36600Da 的催化结构域 ( 即凝血酶 ) 从残余的分子 ( 凝血酶原片段 1.2) 中释放出来 因为每释放一个凝血酶分子会伴随一个凝血酶原片段 1.2 的释放, 所以检测片段 1.2 可以反映凝血酶原活化的水平 图 9. 凝血酶原的活化凝血酶可以以对一系列具生物学重要性的底物进行剪切 凝血酶将纤维蛋白原的纤维蛋白肽段 A 和 B 切除形成纤维蛋白单体, 然后纤维蛋白单体自发性聚集形成纤维蛋白凝块 阴离子的外结合位点横跨第 387 位至第 398 位残基, 且与结合纤维蛋白原 血栓调节蛋白 水蛭素 肝素辅因子 II(HC II) 以及蛋白水解活化的凝血酶受体相关 有意思的是, 凝血酶的这个区域在人类 牛和小鼠中是完全一样的 除了直接形成纤维蛋白凝块外, 凝血酶还可以通过参与活化血小板和凝血因子 V VIII XI 和 XIII 所构成的正反馈环起促凝效应 凝血酶是一种血小板强激活因子, 它至少通过两类受体起作用 包括 G 蛋白偶联的蛋白水解活化受体 PAR-1 和 PAR-4, 以及血小板糖蛋白 I

13 凝血酶的另一项功能是使一种羧肽酶原 B 样酶活化, 血栓调节蛋白可以加强该反应过程 纤维蛋白羧基端的赖氨酸残基可促进纤溶酶原的结合, 活化的羧肽酶通过去除纤维蛋白或部分降解纤维蛋白的该残基, 抑制纤溶酶介导的纤维蛋白溶解 因此, 该羧基肽酶被命名为 凝血酶活化的纤溶抑制物 (TAFI) 除了促凝活性, 凝血酶还有抗凝功能 凝血酶原结合到内皮细胞上的辅因子血栓调节蛋白后可以活化蛋白 C, 蛋白 C 可以使因子 Va 和 VIIIa 失活 凝血酶还有生长因子和细胞因子样活性, 可能在动脉粥样硬化 伤口愈合和炎症过程中发挥作用 凝血酶在血浆中的主要抑制物是抗凝血酶 HCII 也抑制凝血酶, 可能还发挥着血管外凝血酶抑制物的作用, 调控凝血酶的生长因子和细胞因子样活性 接触凝血因子指参与内源性凝血途径接触相激活的凝血因子, 包括 FXII XI PK HMWK 共同特点 : 通过接触反应启动内源凝血途经, 并与激肽 纤溶和补体等系统相联系 缺乏并不出现出血现象 ( 除 FXI 缺乏有轻度出血外 ), 反而表现出不同程度的血栓形成倾向或纤溶活性下降 可溶性辅因子可溶性辅因子包括蛋白 S Ⅴ 因子 Ⅶ 因子和血管性血友病因子 (vwf) 蛋白 S 蛋白 S 是分子量为 的单链糖蛋白, 血浆中半衰期大约为 42 小时 它的合成需要依赖维生素 K, 在其氨基端包含 11 个 GLA 残基 它的结构和其他依赖维生素 K 的酶原差异很大 蛋白 S 由 1 个 GLA 结构域 1 个凝血酶敏感指环结构 4 个 EGF 结构域和 1 个与糖皮质激素结合蛋白同源的结构域组成 和其他维生素 K 依赖因子不同的是, 蛋白 S 没有丝氨酸蛋白酶结构域, 也不具备催化反应的潜力 每个 EGF 结构域包含一个修饰氨基酸 - 羧基化天冬氨酸或者 - 羧基化天冬酰胺 蛋白 S 在循环中以游离形式存在 蛋白 S 的糖皮质激素结合球蛋白样结构域是与 C4b 结合蛋白的亚基相结合 和其他包含 GLA 结构域酶原相同的是, 蛋白 S 在合成时以信号肽引导其至内质网, 前肽结合 - 谷氨酰羧化酶成熟蛋白分泌之后信号肽和前肽被切去 蛋白 S 主要在肝脏细胞内合成, 也有部分在内皮细胞 巨核细胞 睾丸间质细胞和成骨细胞内合成 蛋白 S 是 APC 灭活活化的因子 Ⅴ 和因子 Ⅷ 的辅因子 和因子 Ⅴ 和因子 Ⅷ 不同 蛋白 S 不具备水解活性 直至不久前, 蛋白 S 被认为只有在游离形式下才具备作为 APC 辅因子的能力, 与 C4b 结合蛋白的结合形式不能作为 APC 的辅因子 然而, 又有更新的数据显示与 C4b 结合蛋白结合的蛋白 S 实际上可以表现出 APC 辅因子的活性 单独的蛋白 S 由于可以和活化的因子 Ⅴ 结合竞争活化的因子 Ⅹ 而表现出一种低水平的抗凝活性, 而且这种活性不会因 C4b 结合蛋白而降低 另外, 还有数据显示, 蛋白 S 可以增强 TFPI 抑制活化因子 Ⅶ/ 组织因子复合物的能力 VWF VWF 是一种大分子多聚体糖蛋白, 是因子 Ⅷ 的载体, 是正常血小板与血管壁黏附所必需的成分 VWF 被合成时为前多肽原, 含一条由 22 个氨基酸组成的信号肽, 一条称为 VWF 抗原 Ⅱ 的由 741 个氨基酸组成前导肽及成熟的 CWF 多肽链 成熟的 VWF 蛋白包含 3 个 A 结构域 3 个 B 结构域 2 个 C 结构域及 4 个 D 结构域 A 结构域和参与细胞外基质或细胞黏附功能的蛋白家族结构同源 因子 Ⅷ 与 VWF 的氨基端结合, 结合部位在 VWF 成熟蛋白

14 亚单位的起始部位的 272 个氨基酸内 在内质网中, 前 VWF 单体形成由二硫键稳定的二聚体 此二聚体移动到高尔基体并组装成为高分子量的多聚体, 同样也是通过二硫键作用而结合 前肽是形成多聚体所必需的 它通常在成熟的 VWF 多聚体分泌前被去除 从内发细胞分泌出来后,VWF 被一个称为 ADAMTS13 的金属蛋白酶蛋白进行进一步的裂解 110 体内循环的 VWF 多聚体分子量范围可以从 以上 高分子量的多聚体对于促进血小板的黏附是最有效的, 然而所有的多聚体都可以与因子 Ⅷ 结合, 增强其稳定性 血浆中 VWF 的半衰期约为 12 小时 细胞相关辅因子组织因子组织因子是细胞的受体和凝血因子 Ⅶ 及活化凝血因子 Ⅶ 的辅因子, 组织因子由 263 个氨基酸组成, 包括 219 个氨基酸组成的胞外端 23 个氨基酸残基组成的跨膜区和 21 个氨基酸残基组成的胞质内区 位于胞质内结构域的半胱氨酸与十二烷基脂肪酸相连, 从而可以下调胞质区结构域的磷酸化 虽然多数凝血因子具有高度同源性, 但组织因子的结构是独特的 它是促凝蛋白中唯一的跨膜蛋白, 与 2 型细胞因子受体具有同源性 该受体家族包括白介素 10 和干扰素 α β 和 γ 组织因子的胞外区与活化的凝血因子 Ⅶ 形成结晶状复合物, 同时胞外区折叠成一种细胞因子受体特有的同源单位 这些结构显示组织因子可能是一种具有信号传导和促凝等多种功能的蛋白质 活化因子 Ⅶ/ 组织因子复合物被认为是生理状态下血液凝固的重要启动剂 组织因子广泛表达于血管周围的外皮细胞 表皮 间质和神经胶质细胞 正常情况下, 单核细胞无组织因子活性, 但当其暴露于血管介质及胶原时也能表达组织因子 一般认为, 血管破损后, 血液与血管外组织因子接触, 血液中的凝血因子 Ⅶ 与血管外的组织因子结合就会诱发血液凝固 然而事实是血管周围的组织因子在血管未受损时已与活化因子 Ⅶ 发生结合 血管损伤促使细胞外活化的凝血因子 Ⅶ 与组织因子形成的复合物与血小板结合, 同时诱发血小板表面大量凝血酶生成 活化凝血因子 Ⅶ 与组织因子结合后其蛋白水解活性将显著提高约三个数量级 同时组织因子与活化的凝血因子 Ⅶ 形成的复合物将激活凝血因子 Ⅸ 和 Ⅹ 然而, 同活化因子 Ⅸ 或活化因子 Ⅹ 结合至其辅因子不同的是, 活化因子 Ⅶ 与组织因子的结合并不严格需要钙离子, 且带负电荷磷脂的存在只能轻微增高其反应的亲和性 然而, 带负电荷的磷脂可以增强活化因子 Ⅶ/ 组织因子复合物对因子 Ⅸ 或因子 Ⅹ 的裂解 这种增强作用是由于同底物的结合增强, 而非磷脂本身对活化因子 Ⅶ/ 组织因子复合物催化效率的影响 活化因子 Ⅶ 与组织因子在细胞上的结合的亲和力很高 活化因子 Ⅶ 与合成磷脂小体的组织因子结合可增强其蛋白水解活性, 然而, 活化凝血因子 Ⅶ 与细胞来源的组织因子的结合并不总是与其蛋白水解活性的增强相关 这些表明细胞并非以依赖合成磷脂小体的方式调节组织因子的辅因子活性 组织因子表达活性并不是通过蛋白水解活化 然而, 组织因子以一种潜在加密的形式存在 即细胞表面检测到组织因子抗原并不代表其凝血活性 目前有一种假说认为组织因子可形成二聚体从而封闭底物在组织因子上的结合位点 二聚化的组织因子仍然可以与因子 Ⅶ 结合, 但将失去活性, 因为它既不能与因子 Ⅸ 结合, 也不能与因子 Ⅹ 结合 控制组织因子 加密 的生理调节剂还不明确, 这种 加密 是不是体内一种重要的调节形式也需要进一步证实 组织因子除了作为凝血因子的辅因子, 在细胞信号通路中它也起着重要作用 这种信号

15 通路发生于活化的凝血因子 Ⅶ 与组织因子结合后的蛋白水解活化以及活化因子 Ⅶ/ 组织因子 / 活化因子 Ⅹ 复合物的形成 这条细胞信号通路在创伤愈合 炎症及脉管形成过程中细胞的迁移起着重要作用 其对脉管形成的重要性发现于一个组织因子基因敲除小鼠, 该小鼠在胚胎形成期部分由于卵黄囊血管系统形成障碍而死亡 纤维蛋白原纤维蛋白原可转换为纤维蛋白, 形成一种网状结构, 将初始形成的血小板栓子变成稳间的止血血拴 纤维蛋白原有非常重要的生理止血功能, 无纤维蛋白原血症和一些异常纤维蛋白原血症可以导致出血症状, 而其他的异常纤维蛋白原血症可以导致血栓性疾病的发生 虽然无纤维蛋白原血症存在出血趋势, 但并不像典型的血友病那么严重 小鼠实验显示纤维连接蛋白可引起血小板聚集, 推测纤维蛋白原的黏附功能所起的作用有限, 这也可能是出血并不严重的原因 纤维蛋内原是一个二聚体糖蛋白, 分子量为 , 存在于血浆和血小板的 α 颗粒中 纤维蛋白原的每个亚基都包括 3 条由二硫键连接的多肽链, 多肽链分别命名为 Aα (66500) Bβ (52000) 和 γ(46500) 凝血酶分别在 Aα 链 Arg16-rGly17 和 Bβ 链 Arg14-Glyl5 处裂解 Aα 链和 Bβ 链, 从氨基端释放纤维蛋白肽 A 和肽 B 纤维蛋内原的中央球状区域被命名为 E- 结构域, 它含有经二硫键连接的 6 条链的氨基末端, 因此也称为 N 端二硫键结 三条链羧基末端的球状区域组成 D 结构域, 与 E 结构域之间通过螺旋的卷曲螺旋结构相互连接 凝血酶与纤维蛋白原的中央结构区结合, 纤维蛋白原经蛋白水解后释放出 2 个纤维蛋白肽 A(Aα 1-16) 和 2 个肽 B(Bβ 1-14), 纤维蛋白肽的释放可使 E 结构域中的结合位点暴露, 其他纤维蛋白单体的 D 结构域中有与之相互补的位点 这些互补结合位置导致双链原纤维初步形成, 双链原纤维为交叉重叠结构 ( 图 10) 原纤维随后聚集成由 原纤维组成的粗纤维蛋内, 其原纤维的分支互联形成粗纤维蛋内的网状结构 半交错重叠的纤维蛋白单体使其在电镜下呈现独特的交叉带结构, 钙离子可通过结合人纤维蛋白原上的位点而增强纤维侧面的延长 图 10. 纤维蛋白聚集过程纤维蛋白网一旦形成, 就能被纤维蛋白溶解系统降解 纤溶酶通过裂解纤维蛋白和纤维蛋白原中特定的精氨酸和赖氨酸键, 产生一系列的可溶性降解产物 另外, 除在稳定血小板栓子中表现出明显的促凝作用外, 纤维蛋白也是凝血酶产生的重要抑制剂 纤维蛋白在纤维蛋内凝块发展的过程中分离凝血酶, 降低与纤维蛋白结合的凝血酶的催化功能, 从而表现出 抗凝血酶 Ⅰ 的功能

16 凝血酶活化的纤溶抑制物 (TAFI) TAFI 的激活依靠纤溶酶或凝血酶的裂解, 当凝血酶和凝血酶调节蛋白结时, 对 TAFI 的激活速度可被放大 1000 倍 这两个酶作用于 Arg-92, 产生一个分子量为 的活化蛋白 (TAFIa) 并释放出一个大片段的活性肽 TAFIa 可催化去除纤维蛋白或纤维蛋白降解产物羧基端的精氨酸和赖氨酸残基, 这些残基对纤溶酶原结合和活化十分重要 TAFIa 对这些残基位点的去除可使纤溶酶的催化形式减少, 从而降低血凝块的溶解 TAFIa 可能具有抗炎功能, 因为其对缓激肽有剪切作用 TAFI 的一个多态件位点的纯合状态可能与某件个体的低血压有关 3.2. 凝血机制 20 世纪 60 年代, 有 2 个研究组提出一种凝血模型 : 认为有一系列的步骤可使一个凝血因子顺序激活另一个凝血因子, 最终导致凝血酶的大量生成 每个凝血因子以酶原的形式存在, 并可转化为有活性的酶 ( 图 11) 图 11. 凝血的 瀑布 ( 级联 ) 模型 该模型表明了从图顶端的各种凝血因子连续激活到图底部凝血酶的产生和纤维蛋白形成的过程 内 外源凝血途径如图所示 随后对早期瀑布模型进行修正, 包括发现一些促凝物是辅因子, 其并不具有酶活性 此外, 外源凝血途径包括 FVIIa 组织因子, 后者相对于循环血液来说被认为是外源的 內源性途径中的凝血因子均被认为是在血管内的 两种凝血途径均可活化 FX FXa 可与辅因子 Va 结合, 使凝血酶原转化为凝血酶 虽然早期有关凝血的概念极其价值, 但研究人员意识到内 外源途径不能完全独立执行止血功能, 但研究人员意识到内 外源途径不能完全独立执行止血功能, 所有凝血因子都有一定的内在联系, 只有这样才能解释体内止血的过程 凝血模型的修正几个研究小组的重要发现对凝血早期模型进行了修正 其中一个主要的发现就是 VIIa/TF 复合物不仅可以激活 FX, 也可以激活 FIX, 另外的发现就是凝血酶可直接激活 FXI, 结合其他重要发现, 得出这样的结论 : 体内止血主要是源于损伤处 VIIa/TF 复合物的形成 这使人们相信尽管 FVIII 和 FIX 是内源性凝血途径的成分, 但是由于 FVIII 和 FIX 的缺乏而引起的血友病 A 和血友病 B 实际上是由于 VIIa/TF 途径异常所致 体内凝血途径是由调控机制来调节的, 其中之一就是将凝血过程每一环节中血浆抑制物的作用 其中包括 :TFPI

17 可以抑制 VIIa/TF/Xa 复合物, 蛋白 C 和蛋白 S 可灭活 Fva FVIIa,AT 可抑制凝血酶和其他凝血酶蛋白 3.3. 机体的止凝血模式以细胞为基础的凝血模式止血的目的是产生纤维蛋白栓以封闭血管壁的损伤及破口处 当 TF 负载细胞暴露于受损处的血液时, 这一过程即被触发 TF 可通过跨膜结构域锚定与细胞上, 作为血浆 FVII 的受体, 一旦结合 TF, 酶原因子 FVII 可通过尚未明了的机制 ( 可能包括自身激活及 Fxa 的参与 ), 快速转化为 FVIIa TF 在血管周围及上皮细胞表达, 该两处被认为是 止血分套 的所在地 即使未有损伤,TF 或许也已于 FXII(a) 形成复合物 形成的 FVIIa/TF 复合物催化 2 个极为重要的反应 :1FX 活化为 Fxa;2FIX 活化为 FIXa 形成于 TF 负载细胞上的 Fxa 和 FIXa 各自在血凝过程中具有独特的功能 当血管受损, 血小板随血液到达受损处, 并与血管外的成分结合形成初期止血血栓, 同时其也被部分激活 血小板在接近 FVIIa/TF 复合物的局部汇集 在 TF 负载细胞上形成的 Fxa 可与活化小细胞的辅因子 FVa 相互作用, 形成凝血酶原酶复合物, 该复合物足以在 TF 负载细胞附近产生少量的凝血酶 ( 图 12) 尽管这一数量的凝血酶并不足以凝结纤维蛋白原, 但已足够启动凝血系统, 随后引起凝血酶大量的生成 基于细胞模型的试验表明, 即使是在缺乏血小板的情况下, 如果 TF 负载细胞暴露于血浆中的促凝物, 也会有痕量凝血酶形成 少量的 FVa 是凝血酶原酶在 TF 负载细胞上结合所必需, 其可来源于血小板的释放或被 FXa 及非凝血蛋白酶所活化 产生于 TF 负载细胞 h 的少量凝血酶能有如下作用 :1 活化血小板 ;2 激活 FV;3 活化 FVIII 并使 FVIII 从 VWF 上分离 ;4 活化 FXF( 图 13) VIIa/TF 激活的 FXa 的活性严格限制在 TF 负载细胞上, 扩散出细胞表面的 FXa 可被 TFPI 或 AT 快速抑制 图 12.TF 负载细胞的作用

18 图 13. 由 TF 负载细胞产生凝血酶的作用 : 放大 FXa 最初由 TP 负载细胞产生, 当 TFPI 与 FXa 反应而灭活 FVIIa/TF 复合物时, 随后 FXa 的产生将完全终止 TF 负载细胞产生的少量凝血酶在促进血小板参与随后的凝血步骤中起关键作用 凝血酶有如下作用 : 活化血小板 使 α 颗粒释放 FV 活化 FV 活化 FW 并使其从 VWF 中释放 活化 FXI 除了在血管外 TF 锚定细胞之外 很多报道表明, 在循环的血液中存在 TF 抗原及活化 TF 蛋白 组织因子以与所谓的微粒相结合的方式或以选择性剪接的形式存在, 后者不与膜发生结合 微粒为一种膜状小囊泡, 能从很多种细胞上脱落, 在细胞炎症及凋亡的情况下尤其如此据报道, 微粒的存在与多种炎症及血栓前状态相关 如动脉粥样硬化性血管疾病 炎症感染及肿瘤 对选择性剪接状态的 TF 的研究现在较少, 对于其能否有效促进 FXa 及凝血酶的产生尚不明确 有数据表明在血流中形成的血栓在发展过程中可聚集大量 TF: 该 TF 聚集方式与伤口处的 TF 聚集方式大不相同 后者其 TF 只存在于损伤组织处血栓凝块的周围由血流淤滞引发的血栓动物模型中, 含 TF 的微粒以剂量依赖方式对血栓的形成起促进作用 小鼠动物模型研究表明微粒中的 TF 促进体内血栓的形成 然而, 其他小鼠血栓模型 实验研究表明, 血流中的 TF 对血栓形成未有显著的作用 因此, 根据现有的数据, 暂时可得出这样的结论 : 正常个体中, 血液中的 TF 处于低水平, 而在某些疾病状态下,TF 水平则升高 ; 血液中的 TF 在常规止血中不起主要作用, 而在某些情况下则促进血栓形成 4. 机体的抗血液凝固机制机体的抗凝机制主要包括细胞抗凝 ( 单核巨噬细胞系统 ) 和体液抗凝 (TFPI ATⅢ 以及蛋白 C 系统等 ) 细胞抗凝包括单核 / 巨噬细胞系统 : 吞噬清除 TF 免疫复合物 内毒素等促凝物质, 或者活化凝血因子 纤溶酶等与相应抑制物形成复合物 以及肝细胞 : 摄取并灭活已活化的凝血因子 体液抗凝包括 TFPI ATⅢ 等 蛋白 C 系统 组织因子途径抑制物 TFPI TFPI 主要由内皮细胞合成, 广泛存在于肺 肝 肾 胎盘等组织, 巨核细胞和某些恶性肿瘤细胞也能合成 TFPI 它属于单链糖蛋白, 与脂蛋白结合的生理性丝氨酸蛋白酶抑制

19 物 在 Ca 2+ 参与下,TFPI 能够结合并灭活因子 Xa 与 Ca 2+ 和因子 Xa 结合的 TFPI 又能与 TF-Ⅶa 结合, 进而抑制 Ⅶa 的活性 抗凝血酶 (AT) AT 属于丝氨酸蛋白酶抑制物大家族 (serpins) 的成员之一, 系统命名为 SERPINCI 这类抑制物是靶蛋白酶的 自杀性 底物 : 通过暴露的表面结构 ( 活性部位反应环 ) 作用于靶蛋白酶 靶蛋白酶切割 AT 反应性位点环上的一个氨基酸序列, 两者形成一个 1:1 的共价复合物, 从而阻断靶蛋白酶的活性位点 AT 是重要的生理性凝血酶抑制物, 其缺乏可显著增加血栓风险 AT 主要抑制凝血酶 FⅩa FⅨa 肝素或细胞表面糖胺聚糖存在的的情况下,FⅦa/TF 复合物可被 AT 抑制 蛋白 C 系统在负反馈调节反应, 由内皮细胞表面生成的抗凝性活化蛋白 C( 图 14)( APC) 可下调凝血反应 ( 图 15) 除此之外,APC 还可通过涉及某类受体的反应而发挥细胞保护效应 参与这类反应的受体包括内皮细胞蛋白 C 受体 (EPCR)( 图 16) 和蛋白酶活化受体 -l(par-l), 载脂蛋白 E 受体 -2(apoER2) 也可能参与其中 APC 细胞保护效应包括抗炎和抗凋亡作用, 以及基因表达谱改变和内皮细胞屏障的稳定 由于炎症 凋亡 血管屏障破坏明显有助于促进凝血酶生成, 因此 APC 对细胞的直接保护效应可间接地下调凝血酶生成 图 14. 内皮细胞表面蛋白 C 活化 在内皮细胞表面, 当蛋白 C 与内皮细胞蛋白 C 受体 (EPCR) 结合, 通 过凝血酶 : 凝血酶调节蛋白复合物 (Ila:TM) 限制性蛋白水解, 生成活化蛋白 C(APC) 凝血酶酶解作用 使得蛋白 C 释放出十二肽 (158~169 位氨基酸残基 ), 从而生成多功能蛋白酶 APC

20 图 15. 蛋白 C(APC) 在含磷脂的膜表面通过蛋白水解灭活因子 Va 和 VIIIa 发挥抗凝作用, 磷脂来源于细 胞 脂蛋白或细胞微粒 多种脂质和蛋白辅因子可加速因子 Va 和 VIIIa 的灭活, 生成不可逆性失活形式的 因子 Va 和 VIIIa 图 16. 活化蛋白 C(APC) 对细胞信号及多种细胞保护效应启动模式 APC 对细胞的直接效应系通过 APC 与内皮细胞蛋白 C 受体 (EPCR) 结合介导的 G 蛋白偶联受体 (PAR-1) 活化及蛋白酶活化性受体 -1 活化方式所启动 APC 的 γ- 羧基谷氨酸结构域与 EPCR 结合有助于 APC 蛋白酶结构域定位从而有效裂解 PAR-1 胞外 N 末端尾部,PAR-1 激活引起蛋白 C 偶联受体活化并发挥抗炎 抗凋亡效应 基因表达谱改变和稳定内皮细胞连接 蛋白 Z/ 蛋白 Z 依赖蛋白酶抑制剂蛋向 Z 依赖蛋向酶抑制剂 (ZPI) 是分子量为 丝氨酸蛋白酶抑制剂 ( 系统命名法中的 SERPINA10), 对凝血因子 XIa 和 Xa 起抑制作用 在维生素 K 依赖的血浆蛋白 Z 的存在下,ZPI 对 Xa 的抑制作用增强 1000 倍 蛋白 Z 是分子量为 的血浆糖蛋白, 如同其他含 GLA 的蛋白, 蛋白 Z 含一个 GLA 结构域 一个疏水区和两个 ECF 结构域 ; 然而, 蛋白 Z 的羧基末端含有这样一个区域, 虽然它与其他含 GLA 蛋白的催化区域同源, 但由于无胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶催化三联体中特有的组氨酸和丝氨酸蛋白酶残基, 故无催化活性 在正常血浆中,ZPI 的摩尔分子数多于蛋白 Z, 因此所有循环中的蛋白 Z 都与 ZPI 结合成复合物 蛋白 Z/ZPI 在凝血系统中的生理作用尚不明确 在小鼠模型中, 蛋白 Z 的缺乏不会导致血栓的形成 V 因子 Leiden 突变表型是已知的血栓形成风险因子, 如果小鼠同时表达 V 因

21 子 Leiden 突变表型, 则会大大加重血栓的形成 5. 纤维蛋白溶解系统纤维蛋白溶解系统, 简称纤溶系统, 是指纤溶酶原经特异性激活物使其转化为纤溶酶 (PL), 以及 PL 降解纤维蛋白和其他蛋白质的过程 纤维蛋白是凝血酶作用于纤维蛋白原所产生的不可溶的终末产物, 可见于血管内和血管外部位 当血管损伤时, 交叉连接的纤维蛋白沉积于组织和血管中, 因此导致血流障碍 一旦血管愈合, 纤溶系统被激活, 通过丝氨酸蛋白酶即纤溶酶的作用, 将纤维蛋白水解为可溶性降解产物 在生理条件下, 纤溶系统的激活剂 抑制剂和辅助因子的衡量参与, 精确地调节纤溶过程 另外, 内皮细胞 单核样细胞和骨髓样细胞表达的受体提供了特化的受保护的环境, 使得产生的纤溶酶不被循环抑制物中和 除此之外, 内皮细胞 单核细胞 巨噬细胞和骨髓细胞均参与纤溶调节的所有方面而且, 最近的研究表明除了降解纤维蛋白的传统作用外, 纤溶系统还参与多种组织重塑机制 纤溶系统的组成酶原纤溶酶原 (plasminogen,plg) 组织型纤溶酶原激活物 (tissue plasminogen activator, t-pa) 尿激酶型纤溶酶原激活物 (urokinase-type plasminogen activator,u-pa, 即尿激酶, UK) 纤溶抑制物纤溶酶抑制物 (plasmin inhibitors) a2 纤溶酶抑制物 (a2-plasmin inhibitor, a2 PI) a2 巨球蛋白 (a2-macroglobin, a2-mg) 纤溶酶原激活物抑制物 (plasminogen activator inhibitors,pai) PAI-1, PAI-2 C1 酯酶抑制物 (C1-esterase inhibitor) 蛋白酶连接素 (protease nexin) 纤溶拮抗物 (attenuator) 凝血酶活化的纤溶抑制物 (thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor, TAFI) 相关受体膜联蛋白 2(annexin 2) amb2 整合素 (amb2 integrin)

22 尿激酶受体 (urokinase receptor, upar) 纤维蛋白溶解系统的作用 T-PA: 组织型纤溶酶原激活物 U-PA: 尿激酶型纤溶酶原激活物 PLG( 纤溶酶原 )-PL( 纤溶酶 ) PAI-1( 纤溶酶原激活抑制物 -1) a2-ap(a2- 抗纤溶酶 ) 二 出血性疾病的分类 临床表现 出现下列情况时通常要考虑出血性疾病可能 :1 患者本人或其医生怀疑该患者有出血倾向 ;2 家族成员中至少有一人有出血倾向 ;3 发现血凝常规检查结果异常 ;4 术前检查发现凝血象异常 ;5 患者术中 术后或外伤后发生无法解释的弥漫性出血 为了评估上述任何一种情况可能导致的出血性疾病, 这就要求医生必须掌握各类出血性疾病的相关知识 病史 体检结果以及一些基本的实验室止血功能检查有助于医生作出初步诊断, 而确诊则需进行更加特异的检查 1. 出血性疾病的分类出血性疾病可被简单地分为遗传性和获得性两大类 ( 表 3) 此外, 还可以根据发病机制进行分类 在获得性出血性疾病中, 血小板减少症是最常见的类型, 其发病原因可能是抗体或其他消耗性进程导致的血小板产生减少 破坏过多, 或者脾功能亢进所致血小板在脾脏内滞留过多, 但是, 如果脾功能亢进是导致出血性疾病的唯一原因, 这种情况一般很少引起严重病理性出血 表 3. 出血性疾病的分类

23 2. 出血性疾病的临床表现在明确诊断或实施治疗前, 要仔细分析患者的出血症状 以下将讨论一些较常见的出血症状, 同时表 4 总结了特异性出血性疾病中的一些典型临床表现 表 4. 与特异性出血性疾病相关的典型的临床表现 1. 鼻出血是血小板疾病和血管性血友病最常见的症状之一, 也是遗传性出血性毛细血管扩张症最常见的症状 后者的鼻出血常随着年龄的增加而加重 正常儿童常发生鼻出血 但通常在青春期之前都能自愈 处于干燥的空气加热环境中, 即使在正常人也能引起鼻出血 如果只有一个鼻腔出血, 则局部血管因素致出血的可能性要大于凝血系统的异常 2. 牙龈出血也是血小板质或量异常性疾病和血管性血友病的常见症状 正常个体如果使用硬质牙刷和牙齿保健品刷牙, 偶尔也会发生牙龈出血 这时, 很难鉴别出血是否异常 此外, 止血功能正常个体如有牙龈疾患也可能频发牙龈出血 3. 口腔黏膜血泡是重度血小板减少症的常见症状, 好发于易被牙齿咬伤的颊黏膜 4. 皮肤出血表现如瘀点 瘀斑是出血性疾病的常见体征, 然而, 皮肤出血也可见于没有出血性疾病的正常个体中 大片瘀斑在女性中更为常见, 而且瘀斑的严重程度常随月经周期而变化, 虽然不同的个体变化不同 瘀斑的一些特点有助于确定皮肤出血严重程度, 如瘀斑的大小 瘀斑的发生频率 瘀斑是否自发发生还是创伤后出现的, 以及瘀斑出现的部位 另外, 瘀斑的颜色也能提供一些信息 : 如手和手臂背侧表面的红色瘀斑提示皮肤缺乏可支撑组织, 常见于 Cushing 综合征 糖皮质激素治疗 老年性紫癜及慢性阳光暴晒所致的损伤等 ; 乌黑色瘀斑见于华法林中毒所致的皮肤坏死和类似的疾病 皮肤瘀斑也常发生于 Ehlers-Danlons 综合征患者, 这类患者还表现为皮肤疏松 极度的韧带松弛和拇指可过度屈伸 5. 拔牙是对止血功能最常见的考验, 也有助于评价出血的风险 拔除磨牙比拔除其他的牙齿更易出血 对大量出血是否需要血制品或者拔除部位是否需要包扎或缝合等客观资料的获取是非常有价值的 6. 血小板疾病或血管性血友病患者微小伤口大量出血比较常见 7. 咯血并不是出血性疾病的提示症状, 而且即使在重症出血性疾病患者中也很少发生 实际上, 这类患者上呼吸道感染后出现痰中血丝的症状更常见 8. 与咯血一样, 呕血并不能提示患有出血性疾病, 然而, 出血性疾病患者可以因上消化道解剖结构异常的出现呕血 一些出血性疾病患者的呕血更多的是综合作用的结果, 如合并有肝脏疾病引起的凝血因子合成缺陷和食管静脉曲张 胃炎患者服用阿司匹林类药物等 9. 血尿也并不能提示患有出血性疾病 ( 血友病除外 ) 但是, 出血性疾病能加重其他

24 疾病包括单纯尿道感染引起的血尿 10. 便血的常见病因是痔疮, 但当各种不同的隐性因素如憩室 痔疮 血管发育不良等存在时, 血管性血友病和血小板疾病能导致便血反复发作 精确地确定出血的部位通常是很难的 黑便也非出血性疾病的提示症状, 但出血性疾病患者会反复发作黑便 11. 血小板疾病和血管性血友病的女性患者常表现为月经过多 如果患者经量过多持续三天以上或者经期超过六七天, 则可认为月经过多 然而, 要想在月经过多 ( 每周期出血达 80ml) 与正常月经之间作一个客观评价吋以通过每周期使用的卫生巾数量绘制的图标来判定 12. 产后出血 分娩具有很大的出血风险, 出血性疾病患者分娩过程中或产后常发生大量出血需要输血控制 13. 习惯性的自发性流产患者提示可能患有纤维蛋白原质或量的异常 凝血因子 XIII 缺陷或抗磷脂综合征 14. 关节积血是血友病的特征性表现, 除了凝血因子 VIII 严重缺陷及 3 型血管性血友病外, 其他出血性疾病较少出现 由于积血关节表面的肤色没有变化, 所以患者可能不会意识到如疼痛 肿胀以及运动受限等症状是由关节出血造成的 15. 出血性疾病患者手术可引起大量的出血, 而涉及局部高纤溶活性的组织器官的手术如尿道 鼻腔 扁桃体或口腔等更易出血 16. 男性包皮环切术后过量出血常见于血友病 A 或 B 血小板无力症 而且常常是患者的首发症状 17. 脐带残端出血常见于凝血因子 XIII 缺陷或无纤维蛋白原血症 3. 出血性疾病的诊断体格检查对于鉴别出血或其后遗症是必要的, 同时可以发现能引起止血功能紊乱的可能病因 必须仔细检查皮肤是否有瘀点 疲斑, 在流体静水压最高的腿部或者因维生素 C 缺乏的皮肤毛囊周围可能更明显 毛细血管扩张病变形态不一, 小到针尖样加压后褪色的红色斑点, 大到几厘米的樱桃样血管瘤 许多正常个体随着年龄的增大也发生毛细血管扩张症 遗传性毛细血管扩张症患者口唇及舌缘 ( 包括舌下 ) 有较多的鲜红色病灶, 但并非所有的患者均有此典型表现 因此, 对全身皮肤进行系统性检查是很有必要的 肝病患者的蜘蛛痣样毛细血管扩张与遗传性毛细血管扩张症是有区别的, 肝病性毛细血管扩张呈匐形, 伪足较长, 常集中于肩部 胸部和面部 病史和体格检查为判别患者是否存在止血功能缺陷甚至可能的原因提供了重要的信息 然而进行一些基本的实验室检查包括凝血酶原时间 (PT) 活化的部分凝血活酶时间(APTT) 和血小板计数是很重要的, 这是因为 :1 病史有时是不可靠的 ;2 轻度出血性疾病患者可能由于从未经历过引起出血的风险因而没有明显的出血症状 ;3 获得性止血功能缺陷患者可能尚未表现出任何症状 ;4 实验室检查可能会暴露不止一种因素的异常

25 图 17. 依据患者的出血史和初步的出凝血实验室检查结果建立的出血性疾病诊断步骤 APTT, 活化的部分凝血活酶时间 ;BT, 出血时间 ;DIC, 弥漫血管内凝血,HK, 高分子量激肽原 ;N, 正常 ;PK, 前激肽释放酶 ;PLT, 血小板 ;PT, 凝血酶原时间 ;VWD, 血管性血友病 图 17 显示了结合患者的出血史和初步的出凝血实验室检査结果的诊断路径 如仅有 APTT 延长见于凝血 VIII IX XI XII 缺乏或存在上述某种凝血因子抑制物, 这种抑制物可以是特异性的, 如抗 VIII 因子抗体 ; 也可能是非特异性的, 如肝素或狼疮型抗凝物 ( 图 17A) 仅有 PT 延长提示凝血因子 VII 缺乏或存在抑制物 ( 图 l7b) 当 PT 和 APTT 均表现为异常时可能为纤维蛋白原 凝血酶原 凝血因子 V 或 X 缺陷或存在其中某一凝血因子的抑制物或者凝血因子的联合缺陷 ( 图 17C) 为了区分是否是凝血因子缺陷还是抑制物的存在, 将患者血浆和正常血浆按 1:1 的比例混合后重复进行 PT 和 ( 或 )APTT 实验是非常有效的 若 PT 和 APTT 延长得以纠正则提示可能存在凝血因子缺陷, 因为在相关性的凝血因子活性达到 50% 以上的情况下, 太多凝血功能检查结果是正常的 ; 若 PT 和 APTT 仍然显著延长则提示可能存在抑制物 有些抑制因子如抗凝血因子 VIII 抗体发挥其抑制活性需要一段时间, 而其他抑制物如狼疮抗凝物或肝素则不需要 因此, 在进行凝血功能检查之前最好让混合物在 37 温育 1~2 个小时 当初步的实验室检查 (PT APTT 血小板计数) 中任何一项出现异常而患者又确实有出血的症状时, 可用出血时间 (BT) 瑞斯托霉素辅因子活性(RCF) 以及血涂片等进一步检查来鉴别各种止血功能异常 尽管出血时间检査对于诊断是有价值的, 但由于该项检测在很大程度上依赖于检测人员的操作, 因此检查结果应当由其作出评判 图 就是根据上述这些进一步检查结果进行的推论 通常 1 型和 2 型血管性血友病患者的初步的实验室检查结果是正常的, 因为其凝血因子 VIII 的水平 (>30U/dl) 足以维持正常的 APTT 血涂片检查对于鉴别 Bernard-Soulier 综合征和血管性血友病是很有用的, 前者特征性的表现为巨大血小板 轻型血管性血友病与正常人鉴别是很困难的, 因为血浆 VWF 水平正常值范围分布很广, 且与 ABO 血型部分相关 事实上, 一些研究者已经就 VWF 水平低于 35% 定义为血管性血友病 提出质疑 因此, 判断是否是血管性血友病应当依据出血评分 血浆 VWF 水平 伴有 VWF 水平降低的家族成员的数目

26 瑞斯托霉素诱导的血小板聚集试验有助于把 IIB 型或血小板型血管性血友病与其他类型血管性血友病区别开,IIB 型和血小板型血管性血友病对低浓度的瑞斯托霉素反应性增强, 而其他类型血管性血友病的反应性则减弱 血块退缩功能不良和非抗凝血制作的血涂片中血小板散在不聚为血小板无力症的典型表现 图 18. 经初步诊断出有出血体征的出凝血实验室检查正常的患者可进行进一步的实验室检查 Abn, 异常 ; APTT, 活化的部分凝血活酶时间 ;BT, 出血时间 ;CR, 血凝块退缩试验 ;N, 正常 ;PK, 前激肽释放酶 ; PLT, 血小板 ;PT, 凝血酶原时间 ;RCF, 瑞斯托霉素辅因子 ;VWD, 血管性血友病 另一个可用于鉴别出血性疾病的简单试验是凝血酶时间测定 ( 也就是加入凝血酶后血浆凝固时间 ) 凝血酶时间延长见于:1 无纤维蛋白原血症 低纤维蛋白原血症和异常纤维蛋白原血症 ;2 肝素存在 ;3 弥散性血管内凝血 (DIC) 引起的纤维蛋白 ( 原 ) 降解产物增加, 增加的降解产物抑制纤维蛋白单体聚集 ;4 淀粉样变性或凝血酶抑制物的存在 以上检查可建立一个暂时的假设性诊断, 而确诊需要进一步的检查 4. 常见出血性疾病紫癜一词来源于拉丁词 紫色, 是指皮肤黏膜由于表浅小血管内红细胞渗出和局部含铁血黄素沉着呈现出可见的出血表象 紫癜定义上异于红斑在于压之不能完全褪色 通常采用玻片按压病变皮肤观察有无褪色来鉴别紫癜, 临床上称之为玻片压诊法 ( 图 19) 某些特殊情况下, 如静脉迂曲导致红细胞流动受阻, 皮肤表现酷似紫癜, 按压不能完全褪色, 但并未发生出血 判断皮损是否突出皮肤表面 ( 可触性 ) 是评价紫癜性病变的首要步骤 皮损突出皮肤表面的病因各异, 包括纤维蛋白沉积 局限性水肿 明显的细胞浸润和红细胞渗入皮下

27 图 19. A. 蜘蛛痣 B. 蜘蛛痣压之褪色 注意蜘蛛痣以玻片压之褪色 紫癜是红细胞外渗进入黏膜或皮肤出现的一种临床表现, 可由多种病理状态引起, 诸如风湿免疫性疾患 感染 皮肤病 创伤及血液系统疾病 分为血小板 凝血因子量或质的缺陷导致的紫癜以及各种病因导致的非血小板减少性紫癜 后者基于鉴别诊断目的可分为三类 : 1 可触性紫癜或网状 非炎性紫癜, 如 Waldenström 血症的高球蛋白血症性紫癜 ;2 可触性或不可触性的炎性紫癜, 如过敏性紫癜 (Henoch- Schönlein purpura); 3 不可触性和非炎性紫癜, 如老年性紫癜 通过对紫癜大小 形状 是否突出皮肤表面 有无炎症反应等诸多性状的评价, 可明显简化对特定疾病的鉴别诊断 过敏性紫癜过敏性紫癜又称 Henoch-Schonlein 紫癜, 是一种侵犯皮肤和其他器官细小动脉和毛细血管的过敏性血管炎, 常伴腹痛 关节痛和肾损害, 但血小板不减少 过敏性紫癜好发于儿童及青少年, 开始可有发热 头痛 关节痛 全身不适等 皮损表现为针头至黄豆大小瘀点 淤斑或荨麻疹样皮疹, 严重者可发生水疱 血疱, 甚至溃疡 好发于四肢伸侧, 尤其是双下肢和臀部 皮损对称分布, 成批出现, 容易复发 仅有皮肤损害者称单纯性紫癜, 伴有腹痛 腹泻 便血, 甚至胃肠道出血者称为胃肠型紫癜 ; 伴有关节肿胀 疼痛 甚至关节积液者称为关节型紫癜 ; 伴血尿 蛋白尿, 肾损害者称为肾型紫癜 双下肢紫癜 伴腹痛 关节痛或肾脏损害, 诊断不难 但当全身症状出现于皮肤紫癜之前时, 容易误诊为风湿性关节炎或急腹症, 临床上需与这些疾病及其他类型的紫癜和血管炎鉴别 免疫性血小板减少性紫癜免疫性血小板减少性紫癜 (ITP) 是一种常见的获得性免疫性疾病, 由于血小板自身抗体的存在导致血小板破坏加速或血小板生成障碍, 出现血小板减少 诊断 ITP 需要外周血涂片证实血小板减少, 同时排除其他原因导致的血小板减少 大部分 ITP 患者骨髓巨核细胞数量正常或增加 根据有无导致血小板减少的其他疾病,ITP 可分为原发性和继发性 ITP 根据患者年龄可分为成人 ITP 和儿童 ITP 根据血小板减少的持续时间可分为急性 ITP 和慢性 ITP 某些感染性疾病 淋巴系统增值性疾病 自身免疫疾病以及药物诱导的血小板减少症患者, 其血小板减少可能为自身抗体所致 ( 表 5) 表 5. 免疫介导的血小板减少的原因

28 50 多年前,Harrington 等首次证实 ITP 患者的血小板减少可能由于血小板抗体所致 他们把 ITP 患者的血浆输入倒健康志愿者体内后, 可使受血者产生严重的血小板减少 然而其发病原因尚未完全阐明, 可能是多种因素综合引起 1. 免疫因素 血小板减少的直接原因是血小板破坏增加, 即血小板存活时间显著缩短, 导致的原因是病人血浆中存在抗血小板抗体, 这种抗体对同种和自身血小板均有破坏作用 2. 血管因素 临床上发现, 有些病人的出血程度与血小板数量的减少不成比例, 这可能是本病的出血与毛细血管功能障碍也有关系 例如脾切除后, 虽然部分病例血小板数并未上升, 但出血现象则可改善 ; 用肾上腺皮质激素治疗后, 血小板数量不一定增加, 但毛细血管脆性试验转为阴性, 出血也可减轻 凡此皆足以说明毛细血管缺陷对本病出血的重要意义 3. 脾脏因素 经研究发现脾脏可能是产生抗血小板抗体的重要部位之一 当脾脏产生大量抗血小板抗体时, 正常血小板经过脾脏与抗血小板抗体结合而致敏, 致敏的血小板极易被吞噬细胞所吞噬, 因此患者周围血中血小板计数明显减少 4. 遗传因素 据研究表明, 患者及其直系健康的家属中都存在不同程度的免疫学缺陷, 提示此病可能与遗传有很大关系 除作血常规外尚需查血小板计数 ( 急性型一般低于 /L, 慢性型多在 (30~80) 10 9 /L 之间 ) 并注意观察血小板形态, 促凝血时间, 血块收缩时间, 凝血酶原时间, 血小板表面相关免疫球蛋白 (PAIg) 测定, 抗人球蛋白试验, 补体测定, 毛细血管脆性试验, 骨髓象检查 血友病血友病可分为三类 : 1. 血友病 A( 血友病甲 ), 即因子 Ⅷ 促凝成分 (Ⅷ:C) 缺乏症, 也称 AGH 缺乏症, 是一种性联隐性遗传疾病, 女性传递, 男性发病 2. 血友病 B( 血友病乙 ), 即因子 Ⅸ 缺乏症, 又称 PTC 缺乏症 凝血活酶成分缺乏症, 亦为性联隐性遗传, 其发病数量较血友病 A 少 但本型中有出血症状的女性传递者比血友病 A 多见 3. 血友病 C( 血友病丙 ), 即因子 Ⅺ(FⅪ) 缺乏症, 又称 PTA 缺乏症 凝血活酶前质缺乏症 为常染色体不完全隐性遗传, 男女均可患病, 是一种罕见的血友病 15~20/10 万男孩中有发病, 此发病率在所调查的不同的种族和地域之间没有差异 发病率以血友病 A 最多占 85%, 血友病 B 占 15%, 血友病 C 较少见

29 临床表现血友病 A 1 出血为本病主要的表现 终身有轻微损伤或手术后长时间出血的倾向 出血程度及发病的早晚与患者血浆中 FⅧ 活性水平有关 根据出血轻重与血浆中凝血因子活性的水平, 将本病分为 4 型 : (1) 重型 血浆中 FⅧ 活性 <1%, 常在 2 岁以前就出血, 在婴儿开始学爬 学走后出现出血症状, 甚至结扎脐带时出血不止 患者出血部位多且严重, 常有皮下 肌肉及关节等部位的反复出血, 关节内血肿畸形多见 此外, 还可见肾脏出血导致血尿 胃肠道出血 腹腔内出血, 肺 胸腔 颅内出血少见 (2) 中间型 FⅧ 活性为 1%~5%, 起病在童年时期以后, 以皮下及肌肉出血居多, 亦有关节出血, 但反复次数较少, 严重程度也轻于重型 (3) 轻型 FⅧ 活性为 5%~25%, 出血多在青年期, 由于运动 拔牙或外科手术后出血不止而被发现, 出血轻微, 可以正常生活, 参加运动, 偶尔发生关节血肿 (4) 亚临床型 只有大手术后才发生出血, 实验室检查可以证实为本病,FⅧ 活性为 25%~40% 一般而言, 凡出血症状出现越早, 病情越重, 随年龄的增长, 出血症状可逐渐减轻, 有时可出现无出血症状的缓解期 出血可在创伤后数小时或数天后发生, 也可在创伤或手术后即渗血不止 2 出血所导致的压迫症及并发症出血形成血肿后可导致压迫症状 : (1) 周围神经受累, 发生率为 5%~15%, 病人有麻木 剧痛 肌肉萎缩 (2) 上呼吸道梗阻, 口腔底部 喉 舌 扁桃体 后咽壁或颈部的严重出血甚为危险可引起窒息 (3) 压迫附近血管, 可发生组织坏死 血友病 B 血友病 B 也可出现类似于血友病 A 的典型症状 不同点在于 :1 血友病 B 重型患者 (FⅨ 活性小于 2%) 较血友病 A 少, 而轻型较多, 因此临床表现较血友病 A 为轻 ;2 女性传递者 也可出血 ;3 发生抗 FⅨ 抗体者较少, 仅占 1% 血友病 C 因子 Ⅺ(FⅪ) 缺乏症症状轻, 有时仅在手术 拔牙或损伤后出血 ; 其传递者一般无临床症状, 但拔牙后, 较正常人容易出血 ;FⅪ 缺乏症常合并其他先天性凝血因子异常, 如合并 FV Ⅶ 缺乏症 检查 1 一般项目血小板计数正常, 束臂试验阴性, 出血时间正常, 血块回缩正常 ; 凝血酶原时间正常, 凝血酶时间正常, 纤维蛋白原定量正常 ; 凝血时间延长为本病的特征, 但仅在 FⅧ:C 活性低于 1%~2% 时才延长,>4% 可正常

30 2 初筛试验凝血酶原消耗试验 (PCT) 白陶土部分凝血活酶时间(APTT, 当 Ⅷ Ⅸ 的活性 30% 时, 即可延长, 可以检测轻型病例 ) 简易凝血活酶生成试验(STGT) 有助于轻型和重型血友病 A B 的诊断 3 确诊试验可用 APTT STGT Biggs 凝血活酶生成 (BiggsTGT) 纠正试验来鉴定血友病类型 如凝血酶原消耗及凝血活酶生成试验不正常时, 可做纠正试验 正常血浆经硫酸钡吸附后, 尚含有 FⅧ FⅪ; 正常血清中含有 FⅨ IXa 因子, 因此如果患者血浆的部分凝血活酶时间仅被正常硫酸钡吸附血浆纠正时, 为 FⅧ 缺乏症 ; 仅被正常血清纠正时, 为 FⅨ 缺乏症 ; 如二者皆可纠正, 则为 FⅪ 缺乏症 可将三者加以鉴别 4.FⅧ FⅨ IXa 因子活性测定采用凝血酶原时间一期法, 将已知有关因子缺乏的血浆作为基质血浆, 加入兔脑浸出液 白陶土悬液 氯化钙及不同稀释度血浆或血清后, 按凝固时间制成有关因子活性曲线后, 对受检标本进行换算 5.FⅧRAg 的测定血友病 A 患者血浆中含量正常或增高 6.FⅧCAg 的测定在血友病 A 患者中, 血浆 Ⅷ:CAg 与 Ⅷ:C 平行减少 7.VWFAg 的测定血友病 A 患者正常或增高 8. 基因诊断血友病分子水平存在着显著的遗传异质性, 基因诊断血友病是一种有效精确快速的方法, 目前主要采用 PCR 进行基因分析 9. 血友病 A 携带者及胎儿期的诊断和遗传咨询大多数血友病 A 携带者血浆中因子 Ⅷ:C 的水平仅为正常妇女平均值的 50% 近年来, 大多数人认为检测 Ⅷ:C 与 ⅧR:Ag 的意义较大,70%~98% 的携带者比值小于正常 在妊娠第 8~12 孕周, 通过胎儿镜羊膜穿刺或绒毛取样, 用放射免疫微量法测定 ⅧR:Ag 及 Ⅷ: C, 可在产前诊断胎儿是否患血友病, 以便考虑中止妊娠问题 近年来基因诊断技术的开展, 目前已应用于对传递者及产前的检查 鉴别诊断 1. 血管性假血友病又称 vonwillebrand 氏病, 为常染色体显性遗传 III 型为隐性遗传, 男女均可患病 家系调查也有助于区别 ; 出血时间延长 阿司匹林耐量试验阳性, 血小板粘附率降低, 对瑞斯托霉素血小板无聚集反应, 血浆中因子 Ⅷ:C/ⅧR:Ag 的比例增高或正常, 血浆中 VW 因子缺乏或减少, 而血友病 A 除 Ⅷ,C 和 Ⅷ:C/Ⅷ:Ag 比例降低外, 其他实验室检查均正常 2. 获得性第 Ⅷ 因子减少常见于甲亢 弥散性血管内凝血等疾病, 以往无出血史, 无家族史, 两性均可发病 ; 临床伴有原发性疾病症状和体征, 凝血因子的减少除第 Ⅷ 因子外尚有其他因子不足, 不难与血友病 A 鉴别 3. 凝血酶复合体减低症出血症状及凝血时间与血友病 A 相似, 但患者凝血酶原时间延长, 维生素 K 治疗有效 治疗 1. 局部止血治疗

31 伤口小者局部加压 5min 以上 ; 伤口大者, 用纱布或棉球蘸正常人血浆或凝血酶 肾上腺素等敷于伤口, 加压包扎 国外有人配制止血剂内含冷沉淀 5ml 氨基己酸 750mg 凝血酶 50U 于生理盐水中, 当口腔 皮肤 包皮损伤部位出血时, 可外用止血, 疗效较好 关节腔内出血时应减少活动, 局部冷敷, 当肿胀不再继续加重时改为热敷 2. 替代疗法是治疗血友病的有效方法, 目的是将患者血浆因子水平提高到止血水平 当 FⅧ:C 水平达正常人的 3%~5% 时, 患者一般不会有自发性出血, 外伤或手术时才出血 ; 但重型患者, 出血频繁, 需替代治疗 (1) 输血浆为轻型血友病 A B 的首选治疗方法 但由于用量过多易致血容量过大, 其应用受到限制 (2) 冷沉淀物冰冻 (-20 ) 冷沉淀制剂中, 每袋含因子 Ⅷ 的活性平均为 100U, 可使体内因子 Ⅷ 的血浆浓度提高到正常的 50% 以上 具有效力大而容量小的优点 室温下放置 1h, 活性丧失 50%, 冷冻干燥存于 -20 以下可保存 25d 以上 适用于轻型和中型患者 (3) 因子 Ⅷ Ⅸ 浓缩剂为冻干制品, 每单位因子 Ⅷ Ⅸ 活性相当于 1ml 正常人新鲜血浆内平均的活性 每瓶内含 200U, 每千克体重注入 1U 的因子 Ⅷ, 可使体内 Ⅷ 因子的活性升高 2%, 但注入每 1U 因子 Ⅸ 仅提高活性 0.5%~1% 因子 Ⅷ 及 Ⅸ 在循环中的半衰期短, 必须每 12h 补充 1 次, 以维持较高因子水平, 控制出血 (4) 凝血酶原复合物 (PPSB) 每瓶 200U, 相当于 200ml 血浆中含有因子 Ⅸ, 适用于血友病 B (5) 重组 FⅧ 的替代治疗优点是不受病毒污染, 药代动力学试验表明其与血浆 FⅧ 的生物半寿期极其相似, 从 1987 年始, 已试用于临床, 与血浆 FⅧ 作用相同, 亦无明显的毒副作用 3.DDAVP(1- 去氨基 -8- 右旋 - 精氨酸加压素 ) 一种人工合成的抗利尿激素衍生物, 有抗利尿及增加血浆因子 Ⅷ 水平的作用, 静脉注射后可使 Ⅷ:C 及 ⅧR:Ag 增加 2~3 倍 适用于轻型血友病和血友病传递者 4. 替代治疗的不良反应 (1) 肝炎见于 40%~50% 经常使用血制品者, 转氨酶可持续升高, 肝功能异常占 50% 以上, 尤其是儿童患者 ; 现用干扰素 γ 治疗丙型肝炎 300 万 U,3/ 周, 共 6 个月 (2) 溶血 FⅧ 浓缩剂制备于大量混合血浆中, 不同程度上存在 IgM 和 IgG 型抗 A 抗 B 同种凝集素, 大量接受 FⅧ 浓缩剂治疗的患者, 常发生溶血反应, 程度与剂量有关 ; 血友病患者多次输血, 血清中结合珠蛋白降低, 此与患者体内存在的慢性亚临床型溶血有关 (3) 获得性免疫缺陷病 ( 艾滋病,AIDS) 是近年来普遍受到重视的一种严重并发症, 返期死亡率 40%, 远期可达 100% 将血浆制品加热处理可将 HIV 病毒杀灭, 减少因输注血浆所致的 AIDS 病 5. 血友病患者外科手术问题即使系拔牙等小手术, 也应尽量避免 随着因子 Ⅷ 等制剂的应用, 如手术过程有充分准备, 危险性已大为减少 术前应充分估计凝血因子缺乏程度, 手术中补充达到需要止血的浓度, 替代疗法必须维持到创口完全愈合 6. 基因治疗正在研究中, 动物试验中取得初步成功 弥散性血管内凝血当促凝物产生或进入血液并中和凝血的抗凝机制时, 血管内凝血酶系统性地产生, 这就导致了弥散性血管内凝血 (disseminated or diffuse intravascular coagulation, DIC) 血管内凝

32 血的临床表现包括 :1 微血栓所致的多脏器功能紊乱 ;2 血小板 纤维蛋白原及其他凝血因子消耗引起的出血 ;3 继发性纤溶 血液中组织因子的出现是最常见的启动因素 当在系统性炎症反应综合征 ( 如革兰阴性或革兰阳性细菌感染 真菌血症 烧伤 严重创伤 ) 中, 单个核细胞和内皮细胞被活化产生及表达组织因子时或当血液与组织因子在血液外的细胞膜 ( 如恶性肿瘤 胎盘 脑 外膜细胞或创伤组织 ) 表面接触时, 这种情况就可发生 实验室特征包括血小板减少, 纤维蛋白原及其他凝血因子水平降低 ( 导致 PTT PT 及 TT 延长 ), D- 二聚体及纤维蛋白 ( 原 ) 降解产物水平升高 一些基础疾病影响这些止血参数, 能导致 DIC 的假阳性诊断 ( 如肝病相关的凝血异常及血小板减少 ) 或 DIC 假阴性诊断 ( 如妊娠相关的高纤维蛋白原 ) 每 6~8 小时重复检测这些指标可得到特异性的诊断早期发现, 基础疾病的有力治疗及生命功能的支持治疗对受累患者的存活很重要 对严重出血的患者的血液成分的治疗也是有效的, 而在有限的情况下, 也可用肝素治疗 重组蛋白 C 具有抗炎与抗凝的作用, 重组蛋白 C 的输注能降低败血症相关的管内凝血引起的死亡率 管内凝血及相关的基础疾病均有高的死亡率 器官的紊乱严重程度, 止血障碍的范围和患者年龄的增加都与凶险的预后相关 弥散性血管内凝血 (DIC) 是一临床病理综合征, 即促凝物的产生及暴露不足以因生理的抗凝和内源的纤溶系统平衡而引起广泛性的血管内凝血 在伴随活化炎症细胞和炎症介质释放的微循环中, 内皮的紊乱在其发病机制中发挥重要的作用 DIC 可有微血栓的阻塞而致组织的缺血和血小板及凝血因子的消耗而致的出血, 在某些情况下还有过度的纤溶反应 DIC 合并多种疾病, 并且大量的相关的研究文献报道了其复杂的病理生理情况 诱发 DIC 的基础疾病包括 :1 全身感染 / 严重感染, 包括细菌 病毒 寄生虫 立克次体等 2 外伤, 包括多发性创伤 大面积的灼伤 脂肪栓塞等 3 器官损害, 见重症胰腺炎等 4 恶性肿瘤, 包括各种实体瘤 白血病 骨髓增生性疾病等 5 产科灾难, 包括羊水栓塞 胎盘早剥 死胎综合征等 6 其他, 如严重肝衰竭 严重中毒或蛇咬伤 输血反应 器官移植排异反应等等 DIC 的临床表现何种蛋白溶解过程 ( 凝血或纤溶 ) 处于优势, 将在很大程度上决定临床表现的特征 以凝血为主者可只表现为血栓栓塞性 DIC; 以纤溶为主者可发展为急性消耗性出血 也可在上述之间呈现一种广谱的, 涉及不同类型的 DIC 临床表现 1 出血 多部位出血常预示急性 DIC 以皮肤紫癜 瘀斑及穿刺部位或注射部位渗血多见 在手术中或术后伤口部位不断渗血及血液不凝固 2 血栓栓塞 由于小动脉 毛细血管或小静脉内血栓引起各种器官微血栓形成, 导致器官灌注不足 缺血或坏死 表现皮肤末端出血性死斑 ; 手指或足趾坏疽 3 休克 DIC 的基础疾病和 DIC 疾病本身都可诱发休克 4 各脏器功能受损 重要器官 1 肾脏受损率 25%~67%, 表现为血尿 少尿 甚至无尿 ;2 中枢神经功能障碍表现意识改变 抽搐或昏迷 ;3 呼吸功能受影响表现肺出血 不同程度的低氧血症 ;4 消化系统表现消化道出血等 ;5 肝功能障碍 22%~57%, 表现黄疸 肝功能衰竭 检查 1 常用的快速简易的实验室筛选检查包括: 血小板计数 凝血酶原时间 激活的部分

33 凝血活酶时间 凝血酶时间 纤维蛋白原水平 D- 二聚体 2 DIC 特殊的检查适用于筛选检查后仍不能确诊者 诊断 DIC 诊断的一般标准 : 1 存在易致 DIC 的基础疾病无论是国内, 还是国外的诊断标准, 是否存在基础疾病极为重要 若没有明确诱发 DIC 的基础疾病诊断应慎重 如感染 恶性肿瘤 大型手术或创伤 病理产科等 2 有下列 2 项以上的临床表现 (1) 严重或多发性出血倾向 (2) 不能用原发病解释的微循环障碍或休克 (3) 广泛性皮肤黏膜栓塞 灶性缺血性坏死 脱落及溃疡形成, 或不明原因的肺 肾 脑等器官功能衰竭 (4) 抗凝治疗有效 3 实验室符合下列条件 (1) 同时有下列 3 项以上实验异常 : 血小板计数 凝血酶原时间 激活的部分凝血活酶时间 凝血酶时间 纤维蛋白原水平 D- 二聚体等 (2) 疑难或特殊病例进行特殊检查 治疗由于 DIC 的诱发因素以及临床表现的严重程度各不相同, 治疗决策应是个体化 1 基础疾病治疗 加强基础疾病治疗是消减 DIC 促发因素, 增加患者存活的首要措施 2 血液制品的应用 应用血液制品实际是一种替代性治疗 包括浓缩血小板悬液 新鲜冰冻血浆 冷沉淀 新鲜全血 凝血酶原复合物等等 3 肝素应用 肝素治疗可使某些慢性 DIC 患者受益 也用于急性 DIC 患者, 应用时需审慎 4 纤溶抑制剂 应用时需慎重