864 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 7 期 213 年 4 月 痈 等 功 效, 以 及 抑 菌 抗 炎 抗 氧 化 抗 肿 瘤 调 血 脂 等 药 理 作 用 [1-2] 而 蒲 公 英 降 血 糖 作 用 的 研 究 报

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1 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 7 期 213 年 4 月 863 蒲 公 英 水 提 取 物 对 链 脲 佐 菌 素 致 糖 尿 病 大 鼠 的 降 血 糖 作 用 及 其 机 制 李 雪 石 1, 张 彦 文 2 1. 天 津 市 环 湖 医 院 药 剂 科, 天 津 天 津 医 科 大 学 药 学 院, 天 津 371 摘 要 : 目 的 研 究 蒲 公 英 水 提 取 物 降 低 链 脲 佐 菌 素 (STZ) 致 糖 尿 病 大 鼠 餐 后 血 糖 水 平 的 作 用 及 其 机 制 方 法 考 察 蒲 公 英 水 提 取 物 mg/kg 对 STZ 致 糖 尿 病 模 型 大 鼠 餐 后 血 糖 水 平 的 影 响, 并 采 用 ELISA 法 检 测 各 组 大 鼠 血 清 胰 岛 素 水 平 ; 正 糖 钳 实 验 考 察 蒲 公 英 水 提 取 物 对 正 常 大 鼠 胰 岛 素 敏 感 性 的 影 响, 检 测 葡 萄 糖 输 注 率 (GIR); 以 pnpg 为 底 物, 测 定 蒲 公 英 水 提 取 物 4 mg/kg 体 外 对 α- 糖 苷 酶 活 性 的 影 响 ; 采 用 Caco-2 细 胞 单 层 模 拟 的 小 肠 上 皮 模 型, 评 价 蒲 公 英 水 提 取 物 2 1 mg/l 对 小 肠 麦 芽 糖 水 解 和 葡 萄 糖 吸 收 能 力 的 影 响 结 果 蒲 公 英 水 提 取 物 mg/kg 给 药 7 d, 可 显 著 降 低 正 常 大 鼠 及 STZ 致 糖 尿 病 大 鼠 餐 后 血 糖 水 平, 但 对 血 清 胰 岛 素 水 平 GIR 均 无 影 响 蒲 公 英 水 提 取 物 对 α- 糖 苷 酶 活 性 具 有 抑 制 作 用, 但 半 数 抑 制 浓 度 (IC 5 ) 高 于 阳 性 药 ; 蒲 公 英 水 提 取 物 2 mg/l 可 同 时 抑 制 Caco-2 细 胞 单 层 对 麦 芽 糖 的 水 解 和 对 葡 萄 糖 的 转 运 结 论 蒲 公 英 水 提 取 物 具 有 降 低 餐 后 血 糖 的 作 用, 其 作 用 机 制 与 抑 制 小 肠 对 麦 芽 糖 的 水 解 和 对 葡 萄 糖 的 吸 收 有 关 关 键 词 : 蒲 公 英 水 提 取 物 ; 降 血 糖 ; 葡 萄 糖 输 注 率 ; 胰 岛 素 敏 感 性 ;α- 糖 苷 酶 ;Caco-2 细 胞 中 图 分 类 号 :R 文 献 标 志 码 :A 文 章 编 号 : (213) DOI: 1.751/j.issn Hypoglycemic effects of aqueous extract from Taraxaci Herba on diabetic rats induced by Streptozotocin and its mechanism LI Xue-shi 1, ZHANG Yan-wen 2 1. Department of Pharmacy, Tianji Huanhu Hospital, Tianjin 36, China 2. College of Pharmacy, Tianjin Medical University, Tianjin 371, China Abstract: Objective To evaluate the hypoglycemic effect of aqueous extract from Taraxaci Herba (AETH) on postprandial blood glucose (PBG) in diabetic rats induced by Streptozotocin (STZ) and to explore the mechanism. Methods The PBG within 12 min was measured after 7 d ig administration of AETH (4, 2, and 1 mg/kg) in normal rats and diabetic model rats induced by STZ, and ELISA was performed to detect the serum insulin of rats in each group. The euglycemic clamp assay was performed to investigate the effect of AETH (4 mg/kg) on the insulin sensitivity in normal rats, and the glucose infusion rate (GIR) was detected. The 5% inhibiting concentration (IC 5 ) against α-glucosidase was measured in vitro, using pnpg as substrate. Caco-2 cells were preincubated for 72 h with AETH (2 and 1 mg/l), and then the capacities of Caco-2 monolayer on maltose hydrolysis and glucose absorption were measured. Results The 7 d ig administration of AETH decreased the PBG significantly in diabetic rats induced by STZ, but had no effect on serum insulin level and GIR. AETH inhibited α-glucosidase in vitro, and the IC 5 was higher than that of acarbose. AETH (2 mg/l) inhibited the capacities of Caco-2 monolayer on both maltose hydrolysis and glucose absorption. Conclusion AETH has the hypoglycemic effect on PBG in diabetic rats, and the mechanism is related to the inhibition of maltose hydrolysis and glucose absorption in small bowel. Key words: aqueous extract from Taraxaci Herba; hypoglycemic effects; glucose infusion rate; insulin sensitivity; α-glucosidase; Caco-2 cells 蒲 公 英, 别 名 黄 花 地 丁 黄 花 郎, 为 菊 科 植 物 蒲 公 英 Taraxacum mongolicum Hand. -Mazz. 碱 地 蒲 公 英 T. borealisinense Kitam 或 同 属 数 种 植 物 的 干 燥 全 草, 具 有 清 热 解 毒 消 肿 散 结 利 胆 利 尿 消 乳 收 稿 日 期 : 作 者 简 介 李 雪 石 (1972 ), 女, 本 科, 毕 业 于 成 都 中 医 药 大 学 中 药 药 理 专 业, 现 任 天 津 市 环 湖 医 院 药 剂 科 主 管 药 师 Tel/Fax: (22) [email protected]

2 864 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 7 期 213 年 4 月 痈 等 功 效, 以 及 抑 菌 抗 炎 抗 氧 化 抗 肿 瘤 调 血 脂 等 药 理 作 用 [1-2] 而 蒲 公 英 降 血 糖 作 用 的 研 究 报 道 较 少, 故 本 实 验 考 察 蒲 公 英 水 提 取 物 对 链 脲 佐 菌 素 (STZ) 致 糖 尿 病 模 型 大 鼠 血 糖 水 平 的 影 响, 并 初 步 探 讨 其 作 用 机 制 1 材 料 1.1 药 品 与 试 剂 蒲 公 英 购 自 河 北 康 派 中 药 材 有 限 公 司, 经 天 津 市 百 兴 医 药 批 发 有 限 责 任 公 司 吕 芳 鉴 定 为 菊 科 植 物 蒲 公 英 Taraxacum mongolicum Hand. -Mazz. 的 全 草 ; 片, 拜 耳 医 药 保 健 有 限 公 司, 批 号 ; 盐 酸 二 甲 双 胍 片, 北 京 四 环 制 药 有 限 公 司, 批 号 21117; 胰 岛 素 注 射 液, 江 苏 万 邦 生 化 医 药 股 份 有 限 公 司, 批 号 麦 芽 糖, 海 蓝 季 科 技 发 展 有 限 公 司 ;STZ( 质 量 分 数 98%) α- 糖 苷 酶 4- 硝 基 酚 -α-d- 吡 喃 葡 糖 苷 (pnpg, 质 量 分 数 98%) 3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one(PMP, 质 量 分 数 98%) D-(+)- 半 乳 糖 Hepes 根 皮 苷 ( 质 量 分 数 98%),Sigma 公 司 ; 葡 萄 糖, 天 津 市 大 茂 化 学 试 剂 厂 ;DMEM 培 养 基,Gibco 公 司 ; 胎 牛 血 清 非 必 需 氨 基 酸,HyClone 公 司 ; 青 霉 素 - 链 霉 素 溶 液, 碧 云 天 生 物 技 术 研 究 所 ; 胰 蛋 白 酶 (1 25), Biosharp 公 司 ; 乙 二 胺 四 乙 酸, 天 津 博 迪 化 工 有 限 公 司 Hanks 平 衡 盐 溶 液 (HBSS, 本 实 验 室 配 制 : 8 g/l NaCl,.4 g/l NaCl,1 g/l 葡 萄 糖,6 mg/l KH 2 PO 4,47.5 mg/l Na 2 HPO 4, 调 ph 7.2) 1.2 动 物 与 细 胞 Wistar 大 鼠, 雄 性, 体 质 量 18~22 g, 北 京 华 阜 康 生 物 科 技 股 份 有 限 公 司, 许 可 证 号 :SCXK ( 京 )211-7 所 有 动 物 每 日 实 验 前 禁 食 自 由 饮 水 12 h 以 上 Caco-2 细 胞, 购 自 中 国 科 学 院 上 海 细 胞 库, 细 胞 传 代 数 为 2~3 代 1.3 仪 器 测 利 得 超 优 血 糖 仪, 台 湾 厚 美 德 生 物 科 技 股 份 有 限 公 司 ; 大 鼠 胰 岛 素 ELISA 试 剂 盒, 南 京 建 成 生 物 工 程 研 究 所 ;Thermo Scientific MK3 型 酶 标 仪, Thermo Fisher 公 司 ;Transwell Permeable Supports ( 聚 碳 酸 酯 膜,24 孔, 孔 径.4 μm, 直 径 6.5 mm), Corning Incorporated 公 司 ;Millicell-ERS 电 阻 仪, Millipore 公 司 ;LC 1P 液 相 泵 LC 1UV 检 测 器, 大 连 江 申 分 离 科 学 技 术 公 司 ;Diamonsil C 18 (2) 反 相 色 谱 柱 (15 mm 4.6 mm,5 μm),dikma Technologies 公 司 ;Easy3 工 作 站, 中 辉 科 学 器 材 有 限 公 司 2 方 法 2.1 药 物 制 备 蒲 公 英 水 提 取 物 制 备 称 取 干 燥 的 蒲 公 英 药 材, 加 入 3 倍 质 量 纯 净 水,6 水 浴 4 h, 滤 过 后 减 压 蒸 馏 浓 缩 冷 冻 干 燥, 得 蒲 公 英 水 提 取 物,4 保 存 备 用 根 据 蒲 公 英 有 效 成 分 的 水 溶 性 推 测, 其 水 提 取 物 中 主 要 成 分 可 能 为 黄 酮 类 和 酚 酸 类 [2] 溶 液 制 备 每 片 片 ( 含 阿 卡 波 糖 5 mg) 加 纯 净 水 5 ml,4 静 置 过 夜, 搅 拌 后 滤 过, 即 得 1 g/l 水 溶 液 2.2 对 正 常 大 鼠 餐 后 血 糖 与 胰 岛 素 水 平 的 影 响 5 只 大 鼠 以 空 腹 血 糖 为 准 均 衡 分 为 5 组 : 组 ( 生 理 盐 水 ), (4 mg/kg) 组, 蒲 公 英 水 提 取 物 mg/kg 组 各 给 药 组 每 天 ig 给 药 1 次, 连 续 给 药 7 d, 末 次 给 药 1 h 后 ig 给 予 麦 芽 糖 2 g/kg 分 别 于 给 予 麦 芽 糖 前 及 给 予 麦 芽 糖 后 min, 大 鼠 尾 部 取 外 周 血, 血 糖 仪 测 定 血 糖 水 平 ; 给 药 后 1 h, 采 集 组 和 蒲 公 英 水 提 取 物 组 大 鼠 外 周 血 3 μl( 因 对 胰 岛 素 水 平 无 明 显 影 响, 故 仅 对 这 4 组 大 鼠 胰 岛 素 水 平 进 行 检 测 ), 按 ELISA 试 剂 盒 说 明 书 方 法 测 定 胰 岛 素 水 平 [3] 2.3 对 STZ 致 糖 尿 病 大 鼠 餐 后 血 糖 水 平 的 影 响 取 8 只 大 鼠, 其 中 1 只 作 为 组, 给 予 正 常 饲 料, 其 余 7 只 大 鼠 喂 饲 高 脂 饲 料 4 周 后, 一 次 性 ip 给 予 STZ 5 mg/kg, 继 续 给 予 高 脂 饲 料,3 d 后 测 空 腹 血 糖, 选 取 空 腹 血 糖 高 于 12 mmol/l 的 5 只 大 鼠 用 于 实 验 以 空 腹 血 糖 为 准 将 大 鼠 均 衡 分 为 5 组 : 模 型 组 ( 生 理 盐 水 ), (4 mg/kg) 组, 蒲 公 英 水 提 取 物 mg/kg 组, 每 天 ig 给 药 1 次, 连 续 给 药 7 d 末 次 给 药 后 1 h, 各 组 大 鼠 ig 给 予 麦 芽 糖 2 g/kg, 分 别 于 给 予 麦 芽 糖 前 及 给 予 麦 芽 糖 后 min, 大 鼠 尾 部 取 外 周 血, 血 糖 仪 测 血 糖 水 平 [4] 2.4 正 糖 钳 实 验 [5] 正 糖 钳 实 验 按 文 献 报 道 的 方 法 进 行 3 只 健 康 大 鼠 随 机 分 为 组 ( 生 理 盐 水 ) 盐 酸 二 甲 双 胍 (2 mg/kg) 组 和 蒲 公 英 水 提 取 物 (4 mg/kg) 组, 每 组 1 只, 每 天 ig 给 药 1 次, 连 续 给 药 7 d 末 次 给 药 后 1 h 开 始 手 术, 胰 岛 素 灌 流 速 率 为 1 mu/(kg min), 葡 萄 糖 注 射 液 质 量 浓 度 为 1 g/l,

3 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 7 期 213 年 4 月 865 每 1 min 测 1 次 颈 动 脉 血 样 中 的 葡 萄 糖 水 平, 并 据 此 调 节 葡 萄 糖 灌 流 速 率 使 血 糖 水 平 在 1 h 内 均 保 持 在 (8±1)mmol/L 的 某 个 固 定 的 葡 萄 糖 输 注 率 (GIR), 记 为 该 动 物 的 GIR 2.5 对 α- 糖 苷 酶 活 性 的 影 响 [6] 采 用 文 献 报 道 方 法 检 测 蒲 公 英 水 提 取 物 对 α- 糖 苷 酶 活 性 的 影 响 本 实 验 所 用 溶 液 均 以 ph mmol/l 磷 酸 盐 缓 冲 液 配 制 将 蒲 公 英 水 提 取 物 或 阳 性 溶 液 (.54~1.739 mg/ml)2 ml.5 U/mL α- 糖 苷 酶.1 ml 以 及 1 mg/ml 的 谷 胱 甘 肽 (GSH).1 ml 混 合,37 培 养 1 min, 加 入 16 mmol/l 的 pnpg.1 ml,37 再 培 养 1 min 检 测 混 合 液 4 nm 处 的 吸 光 度 (A) 值, 计 算 α- 糖 苷 酶 抑 制 率 (IR), 采 用 Bliss 法 计 算 α- 糖 苷 酶 半 数 抑 制 浓 度 (IC 5 ) IR= (A 空 白 -A 样 品 ) / A 空 白 2.6 对 Caco-2 细 胞 麦 芽 糖 水 解 与 葡 萄 糖 吸 收 功 能 的 影 响 色 谱 条 件 采 用 Diamonsil C 18 (2) 反 相 色 谱 柱, 流 动 相 为 乙 腈 -.1 mol/l 磷 酸 盐 缓 冲 液 (2 8),pH 值 7., 体 积 流 量 1. ml/min, 进 样 量 2 μl, 柱 温 3, 紫 外 检 测 器 波 长 254 nm 细 胞 培 养 与 处 理 Caco-2 细 胞 置 于 含 1% 胎 牛 血 清 1 mmol/l Hepes 1% 非 必 需 氨 基 酸 1 U/L 青 霉 素 和 1 mg/l 链 霉 素 的 DMEM(pH 7.4) 中, 于 Transwell Permeable Supports 上 培 养 21 d [7], 最 后 3 d 顶 面 培 养 液 中 分 别 加 入 阳 性 药 (α- 糖 苷 酶 抑 制 剂 [8], 终 质 量 浓 度 25 mg/l) 根 皮 苷 (Na + - 葡 萄 糖 同 向 转 运 体 抑 制 剂 [9], 终 质 量 浓 度 2 mg/l) 蒲 公 英 水 提 取 物 ( 终 质 量 浓 度 分 别 为 2 1 mg/l), 跨 上 皮 电 阻 2 Ω cm 2 表 示 形 成 紧 密 细 胞 单 层 开 始 实 验 时, 弃 去 各 孔 顶 面 及 底 外 侧 面 的 HBSS 溶 液, 将 含 有 底 物 麦 芽 糖 ( 终 浓 度 为 28 mmol/l)2 μl 和 各 药 物 的 HBSS 加 到 顶 面 作 为 供 给 池 ( 各 药 物 终 浓 度 与 上 述 最 后 3 d 预 培 养 时 的 相 同 ), 同 时 底 外 侧 面 加 入 无 葡 萄 糖 无 底 物 的 HBSS 溶 液 8 μl 作 为 接 收 池 将 Transwell 培 养 板 置 于 恒 温 水 浴 振 荡 仪 中, 在 振 荡 速 率 5 r/min 温 度 37 下 作 用 4 min, 分 别 吸 出 顶 面 和 底 外 侧 面 的 全 部 溶 液, 并 将 顶 面 溶 液 用 纯 净 水 稀 释 4 倍 后, 所 有 样 品 于 2 保 存 备 HPLC 检 测 用 葡 萄 糖 测 定 葡 萄 糖 检 测 采 用 PMP 柱 前 衍 [1] 生 化 HPLC 法 进 行 柱 前 衍 生 化 主 要 步 骤 : 配 制 1 mmol/l 葡 萄 糖 水 溶 液 作 为 品, 与 待 测 样 品 平 行 检 测 将 待 测 样 品 或 葡 萄 糖 品 2 μl 1 mmol/l 半 乳 糖 2 μl( 内 标 物 ) 1.5 mol/l 的 NaOH 水 溶 液 1 μl.5 mol/l 的 PMP 甲 醇 溶 液 5 μl 混 合 均 匀,7 下 水 浴 3 min, 水 浴 后 放 置 至 室 温, 加 1.5 mol/l 盐 酸 1 μl 中 和, 再 加 1 ml 氯 仿 涡 旋 振 荡 2 s, 取 上 层 水 相 7 μl, 再 加 7 μl 氯 仿 涡 旋 振 荡 2 s, 取 上 层 水 相 4 μl, 以 1 g 离 心 15 min 使 微 粒 沉 淀, 备 HPLC 进 样 记 录 Easy3 色 谱 工 作 站 给 出 的 葡 萄 糖 峰 和 半 乳 糖 峰 的 峰 面 积, 用 内 标 法 计 算 样 品 中 葡 萄 糖 的 量 用 得 出 的 所 有 样 品 中 的 葡 萄 糖 浓 度 计 算 培 养 板 中 每 个 孔 的 C AG +C BG 值 C BG / (C AG +C BG ) 值 (C AG 为 供 给 池 中 葡 萄 糖 浓 度,C BG 为 接 收 池 葡 萄 糖 浓 度 ) C X =f A X / (A S / C S ) f= (A S / C S ) / (A R / C R ) C X 为 各 样 品 中 葡 萄 糖 浓 度,f 为 校 正 因 子,A X 为 各 样 品 中 葡 萄 糖 的 峰 面 积,A S 为 内 标 物 峰 面 积,C S 为 内 标 物 浓 度,A R 为 品 中 葡 萄 糖 的 峰 面 积,C R 为 品 中 葡 萄 糖 的 浓 度 2.7 统 计 学 处 理 所 有 数 据 统 计 均 用 SPSS 13. 软 件 进 行 分 析, 数 据 均 以 x ± s 表 示, 组 间 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析 3 结 果 3.1 对 正 常 大 鼠 餐 后 血 糖 与 胰 岛 素 水 平 的 影 响 与 组 相 比, 蒲 公 英 水 提 取 物 4 mg/kg 连 续 给 药 7 d, 使 正 常 大 鼠 麦 芽 糖 餐 后 血 糖 水 平 在 min 显 著 降 低 (P<.5), 蒲 公 英 水 提 取 物 2 mg/kg 使 餐 后 血 糖 在 9 min 1 mg/kg 使 餐 后 血 糖 在 6 min 显 著 降 低 (P<.5) 结 果 见 图 1 蒲 公 英 水 提 取 物 mg/kg 连 续 给 药 7 d, 对 正 常 大 鼠 血 清 胰 岛 素 水 平 无 显 著 影 响 结 果 见 图 对 STZ 致 糖 尿 病 大 鼠 餐 后 血 糖 水 平 的 影 响 与 组 相 比, 模 型 组 大 鼠 血 糖 水 平 显 著 升 高 (P<.5) 与 模 型 组 相 比, 蒲 公 英 水 提 取 物 4 mg/kg 使 糖 尿 病 大 鼠 麦 芽 糖 餐 后 血 糖 水 平 在 min 显 著 降 低 (P<.5), 蒲 公 英 水 提 取 物 2 mg/kg 使 餐 后 血 糖 在 3 min 显 著 降 低 (P<.5) 结 果 见 图 对 正 常 大 鼠 GIR 的 影 响 正 糖 钳 实 验 显 示, 与 组 相 比, 盐 酸 二 甲 双 胍 显 著 升 高 正 常 大 鼠 的 GIR(P<.5), 而 蒲 公 英 水 提 取 物 4 mg/kg 对 正 常 大 鼠 GIR 无 显 著 影 响

4 866 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 7 期 213 年 4 月 12 血 糖 水 平 / (mmol L 1 ) 蒲 公 英 水 提 取 物 4 mg kg 1 蒲 公 英 水 提 取 物 2 mg kg 1 蒲 公 英 水 提 取 物 1 mg kg 1 4 min 3 min 6 min 9 min 12 min 与 组 比 较 : P<.5 P <.5 vs control group 图 1 蒲 公 英 水 提 取 物 对 正 常 大 鼠 餐 后 血 糖 水 平 的 影 响 ( x ± s, n = 1 ) Fig. 1 Effects of AETH on PBG in normal rats ( x ± s, n = 1 ) 血 清 胰 岛 素 水 平 / (mu L 1 ) 蒲 公 英 水 提 取 物 (mg kg 1 ) 图 2 蒲 公 英 水 提 取 物 对 正 常 大 鼠 血 清 胰 岛 素 水 平 的 影 响 ( x ± s, n = 1 ) Fig. 2 Effects of AETH on serum insulin level in normal rats ( x ± s, n = 1 ) 结 果 见 图 对 α- 糖 苷 酶 活 性 的 影 响 蒲 公 英 水 提 取 物 和 对 α- 糖 苷 酶 活 性 均 显 示 抑 制 作 用, 并 与 质 量 浓 度 有 良 好 的 相 关 性 以 IR 为 纵 坐 标 (Y), 药 物 质 量 浓 度 为 横 坐 标 (X), 得 蒲 公 英 水 提 取 物 对 α- 糖 苷 酶 的 抑 制 曲 线 方 程 为 Y= lnx+81.47,r 2 =.984 4,IC 5 为.477 mg/ml,95% 可 信 限 为.412~.559 mg/ml; 阿 卡 波 糖 对 α- 糖 苷 酶 的 抑 制 曲 线 方 程 则 为 Y= lnx+69.38,r 2 =.979,IC 5 为.251 mg/ml,95% 可 信 限 为.211~.296 mg/ml 结 果 见 图 对 Caco-2 细 胞 麦 芽 糖 水 解 与 葡 萄 糖 吸 收 功 能 的 影 响 PMP 柱 前 衍 生 化 HPLC 检 测 葡 萄 糖 浓 度 结 果 显 示, 待 测 物 葡 萄 糖 与 内 标 物 半 乳 糖 实 现 基 线 分 离, 血 糖 水 平 / (mmol L 1 ) 模 型 蒲 公 英 水 提 取 物 4 mg kg 1 蒲 公 英 水 提 取 物 2 mg kg 1 蒲 公 英 水 提 取 物 1 mg kg 1 5 min 3 min 6 min 9 min 12 min 与 组 比 较 : P<.5; 与 模 型 组 比 较 : P<.5 P <.5 vs control group; P <.5 vs model group 图 3 蒲 公 英 水 提 取 物 对 STZ 致 糖 尿 病 大 鼠 餐 后 血 糖 水 平 的 影 响 ( x ± s, n = 1 ) Fig. 3 Effects of AETH on PBG in diabetic rats induced by STZ ( x ± s, n = 1 )

5 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 7 期 213 年 4 月 867 GIR / (mg min 1 ) 二 甲 双 胍 蒲 公 英 水 提 取 物 4 mg kg 1 (CAG+CBG) / (mmol L 1 ) 根 皮 苷 蒲 公 英 水 提 取 物 2 mg L 1 蒲 公 英 水 提 取 物 1 mg L 1 与 组 比 较 : P<.5, 下 图 同 图 6 蒲 公 英 水 提 取 物 对 Caco-2 细 胞 培 养 体 系 中 C AG +C BG P <.5 vs control group, same as below 值 的 影 响 图 4 蒲 公 英 水 提 取 物 对 正 常 大 鼠 GIR 的 影 响 ( x ± s, n = 1 ) Fig. 6 Effects of AETH on C AG +C BG values in Caco-2 cell culture system IR / % Fig. 4 Effects of AETH on GIR in normal rats ( x ± s, n = 1 ) CBG / (CAG+CBG) 根 皮 苷 蒲 公 英 水 提 取 物 2 mg L 1 蒲 公 英 水 提 取 物 1 mg L 蒲 公 英 水 提 取 物 ρ / (mg ml 1 ) 图 7 蒲 公 英 水 提 取 物 对 Caco-2 细 胞 培 养 体 系 中 C BG /(C AG +C BG ) 值 的 影 响 Fig. 7 Effects of AETH on C BG /(C AG +C BG ) value in Caco-2 cells culture system 图 5 蒲 公 英 水 提 取 物 对 α- 糖 苷 酶 活 性 的 影 响 Fig. 5 Effects of AETH on activities of α-glucosase 经 与 不 含 葡 萄 糖 和 半 乳 糖 的 顶 面 HBSS 图 谱 对 比, 二 峰 所 在 保 留 时 间 均 无 其 他 杂 质 峰 干 扰 与 组 相 比, 25 mg/l 组 和 蒲 公 英 水 提 取 物 2 mg/l 组 C AG +C BG 值 显 著 降 低 (P<.5); 根 皮 苷 2 mg/l 组 与 蒲 公 英 水 提 取 物 1 mg/l 组 则 无 显 著 改 变 结 果 见 图 6 与 组 相 比, 根 皮 苷 2 mg/l 组 和 蒲 公 英 水 提 取 物 2 mg/l 组 的 C BG / (C AG +C BG ) 值 显 著 降 低 (P<.5); 25 mg/l 组 与 蒲 公 英 水 提 取 物 1 mg/l 组 则 无 显 著 改 变 结 果 见 图 7 4 讨 论 [11] 王 东 亮 等 用 蒲 公 英 水 煎 液 给 小 鼠 ig 15 d, 未 [12] 观 察 到 其 能 降 低 小 鼠 空 腹 血 糖 水 平 ; 而 宋 晓 勇 等 的 实 验 证 实 蒲 公 英 多 糖 在 体 外 可 抑 制 α- 糖 苷 酶 活 性 α- 糖 苷 酶 是 食 物 中 淀 粉 寡 糖 和 双 糖 水 解 为 单 糖 的 必 需 酶, 而 只 有 单 糖 才 可 从 肠 道 吸 收 入 血 α- 糖 苷 酶 活 性 被 抑 制, 可 以 减 少 葡 萄 糖 在 肠 道 的 生 成 从 而 降 低 餐 后 血 糖 因 此 推 测 蒲 公 英 水 提 取 物 可 能 具 有 与 阻 碍 糖 类 在 肠 道 吸 收 相 类 似 的 作 用 本 实 验 旨 在 验 证 这 种 推 测 实 验 结 果 表 明, 蒲 公 英 水 提 取 物 连 续 给 药 7 d, 可 降 低 大 鼠 餐 后 血 糖 水 平 正 糖 钳 实 验 中 测 定 的 GIR 是 某 个 组 织 对 胰 岛 素 敏 感 性 的 定 量 评 价 指 标 本 实 验 结 果 显 示, 蒲 公 英 水 提 取 物 对 大 鼠 血 清 胰 岛 素 和 GIR 均 无 影 响, 表 明 其 在 不 升 高 胰 岛 素 不 增 加 组 织 对 胰 岛 素 敏 感 性 的 前 提 下 降 低 大 鼠 餐 后 血 糖, 因 此 推 测 蒲 公 英 水 提 取 物 降 血 糖 作 用 可 能 是 减 少 了 肠 道 吸 收 葡 萄 糖 入 血 的 缘 故 药 物 减 少 葡 萄 糖 经 肠 道 入 血, 可 能 是 阻 碍 了 糖 类 的 水 解 或 葡 萄 糖 在 小 肠 上 皮 细 胞 的 转 运 体 外 实 验 证 实 蒲 公 英 水 提 取 物 对 α- 糖 苷 酶 活 性 有 抑 制 作 用 采 用 Caco-2 细 胞 进 行 糖 类 在 小 肠 消 化 吸 收 的 研

6 868 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 7 期 213 年 4 月 究 较 多 [13], 但 较 少 见 采 用 可 渗 透 支 持 膜 进 行 Caco-2 细 胞 培 养, 并 在 考 察 糖 类 水 解 的 同 时 研 究 葡 萄 糖 转 运 的 鉴 于 可 渗 透 支 持 膜 在 药 物 吸 收 研 究 中 普 遍 应 用 [14-15], 以 及 Caco-2 细 胞 有 葡 萄 糖 转 运 体 的 表 达 [16], 本 实 验 尝 试 将 Caco-2 细 胞 培 养 在 Transwell 聚 碳 酸 酯 膜 上, 同 时 考 察 蒲 公 英 水 提 取 物 是 否 具 有 抑 制 麦 芽 糖 水 解 和 ( 或 ) 抑 制 葡 萄 糖 转 运 的 作 用, 评 估 这 两 种 作 用 同 时 存 在 时 分 别 对 药 物 总 降 糖 作 用 所 作 出 的 贡 献 在 带 有 可 渗 透 支 持 膜 的 Caco-2 细 胞 培 养 体 系 中, 顶 面 相 当 于 小 肠 的 肠 腔 面, 底 外 侧 面 相 当 于 小 肠 的 基 底 侧 面 因 此 顶 面 和 底 外 侧 面 葡 萄 糖 量 之 和 (C AG +C BG ) 即 可 反 映 麦 芽 糖 水 解 能 力 而 底 外 侧 面 葡 萄 糖 的 量 与 顶 面 + 底 外 侧 面 葡 萄 糖 的 量 的 比 值 [C BG / (C AG +C BG )] 可 以 反 映 葡 萄 糖 转 运 能 力 另 外 为 了 简 化 计 算, 将 收 集 的 顶 面 样 品 稀 释 4 倍, 达 到 与 底 外 侧 面 样 品 同 体 积 之 后 再 进 行 葡 萄 糖 浓 度 测 定, 这 样 就 可 以 用 葡 萄 糖 浓 度 来 代 替 其 量 在 对 葡 萄 糖 的 测 定 中, 选 择 PMP 柱 前 衍 生 化 的 HPLC 法 并 加 以 改 进 ( 省 略 3 处 减 压 干 燥 以 节 约 时 间 和 设 备, 分 别 是 在 加 盐 酸 中 和 以 及 2 次 氯 仿 萃 取 另 外 采 用 成 本 低 且 容 易 得 到 的 半 乳 糖 代 替 鼠 李 糖 作 为 内 标 物 ), 因 为 这 种 方 法 检 测 限 低, 适 合 检 测 细 胞 培 养 液 中 浓 度 较 低 的 葡 萄 糖 结 果 证 明 实 验 方 法 可 行 综 上 所 述, 蒲 公 英 水 提 取 物 具 有 降 低 正 常 大 鼠 和 STZ 致 糖 尿 病 大 鼠 餐 后 血 糖 的 作 用 其 机 制 与 抑 制 小 肠 内 麦 芽 糖 水 解 和 葡 萄 糖 吸 收 有 关, 而 抑 制 麦 芽 糖 水 解 的 作 用 与 其 抑 制 α- 糖 苷 酶 活 性 有 关, 但 其 具 体 降 血 糖 物 质 基 础 与 作 用 机 制 仍 需 深 入 研 究 参 考 文 献 [1] 吉 枫, 丛 晓 东, 张 云, 等. 蒲 公 英 药 理 作 用 综 述 [J]. 亚 太 传 统 医 药, 211, 7(9): [2] 林 云, 江 林, 蒋 健, 等. 蒲 公 英 的 药 理 作 用 研 究 进 展 [J]. 中 国 现 代 中 药, 211, 13(8): [3] 陈 新 龙, 夏 照 帆, 韦 多, 等. 烧 伤 后 胰 岛 素 抵 抗 的 实 验 研 究 [J]. 第 二 军 医 大 学 学 报, 24, 25(1): [4] 李 成 军, 陈 鹏. 当 归 多 糖 对 STZ 诱 导 的 糖 尿 病 大 鼠 的 降 血 糖 作 用 及 其 机 制 [J]. 齐 齐 哈 尔 医 学 院 学 报, 27, 28(1): [5] 龚 文 波, 陈 霞 波, 周 建 扬, 等. 正 糖 钳 技 术 观 察 降 浊 合 剂 对 大 鼠 胰 岛 素 敏 感 性 的 影 响 [J]. 浙 江 中 医 药 大 学 学 报, 21, 34(2): [6] 陈 浙 江, 袁 萍, 叶 晓 平, 等. 治 疗 糖 尿 病 常 用 中 药 对 α- 葡 萄 糖 苷 酶 和 α- 淀 粉 酶 的 抑 制 活 性 研 究 [J]. 中 成 药, 28, 3(11): [7] Sambuy Y, De Angelis I, Ranaldi G, et al. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: Influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics [J]. Cell Biol Toxicol, 25, 21(1): [8] Huang Y N, Zhao Y L, Gao X L, et al. Intestinal alpha-glucosidase inhibitory activity and toxicological evaluation of Nymphaea stellata flowers extract [J]. J Ethnopharmacol, 21, 131(2): [9] Yamaguchi K, Kato M, Suzuki M, et al. Pharmacokinetic and pharmacodynamic modeling of the effect of an sodium-glucose cotransporter inhibitor, phlorizin, on renal glucose transport in rats [J]. Drug Metab Dispos, 211, 39(1): [1] Honda S, Akao E, Suzuki S, et al. High-performance liquid chromatography of reducing carbohydrates as strongly ultraviolet-absorbing and electrochemically sensitive 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone derivatives [J]. Anal Biochem, 1989, 18(2): [11] 王 东 亮, 李 延 杰. 蒲 公 英 对 糖 尿 病 小 鼠 模 型 降 血 糖 作 用 的 研 究 [J]. 吉 林 农 业, 211(4): 18. [12] 宋 晓 勇, 刘 强, 王 子 华. 蒲 公 英 多 糖 降 糖 药 理 作 用 研 究 [J]. 中 国 药 房, 29, 2(27): [13] Mizuma T, Fuseda N, Hayashi M. Kinetic characterization of glycosidase activity from disaccharide conjugate to monosaccharide conjugate in Caco-2 cells [J]. J Pharm Pharmacol, 25, 57(5): [14] Foglieni C, Cavarelli M, Piscopiello M, et al. Mn bioavailability by polarized Caco-2 cells: comparison between Mn gluconate and Mn oxyprolinate [J]. Nutr J, DOI: / [15] Smetanova L, Stetinova V, Svoboda Z, et al. Caco-2 cells, biopharmaceutics classification system (BCS) and biowaiver [J]. Acta Med (Hradec Kralove), 211, 54(1): 3-8. [16] Harris D S, Slot J W, Geuze H J, et al. Polarized distribution of glucose transporter isoforms in Caco-2 cells [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89(16):