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1 (hyaluronic acid HA) -N Dalton 200, ~4000 ( ) 1
2 Meyer Palmer 1 connective tissue polysaccharides mucopolysacchrides glycosaminoglycans" chondroitin sulfatedermatan sulfatekeratan sulfateheparan sulfate heparin [D-glucuronic acid1--3]n- [N-acetyl-D-glucosamine1--4] 爲 爲 爲 酶 2
3 ph 860 NaCl 0.11 M NaOH 産 酶 酶 酶 酶 酶 肽 酶 1937 産 Lancefield's A C 産 UDPUridin-5'-Diphosphate Lancefield's A C 産 S. Dysgalactiae, S. Equi, S. Equisimilis, S. Pyogenes S. Zooepidemics ATP 2 NAD 1 acetyl-coa 8 D-glucuronic acid N-acetyl-D-glucosamine 3
4 Glucose Glucose-6-p Fructose-6-p Glucose-6-p UDP-Glucuronic AcidFructose-6-p UDP N-Acetyl Glucosamine 酶 HA HAS, Hyaluronate synthase; NOX, NADH oxidase; LDH, lactate dehydrogenase; PFL, pyruvate formate lyase; PDH, pyruvate dehydrogenase; ADH, alcohol dehydrogenase; AK, acetate kinase 4 HAS operon hasahasbhasc 酶 UDP-glucose dehydrogenaseudp-glucose pyrophosphorylase 酶 UDP-Glucuronic Acid UDP N-Acetyl Glucosamine UDP-glucose dehydrogenase UDP-Glucuronic Acid UDP-glucose pyrophosphorylase 9,10 A hasa hasb has operon hasahasb hasc 酶 酶 UDP-Glucuronic Acid UDP N-Acetyl 4
5 Glucosamine NH COO - CH 爲 (1 µg/ml) 爲 (Extra Cellular Matrix) Fibroblast CD-44 receptor Aggregation Fibroblast CD-44 receptor 5
6 産 Streptococcus zooepidemicus Streptococcus pyogenes Streptococcus dysgalactiaestreptococcal A groups Streptococcal C groups 17 6
7 X- NH 2 OHHCl 18 Streptococcus zooepidemicuc NUF-035 産 爲 Dalton 産 1.88 g/l NaOH % 19 酶, 酶 酶 酶 酶,, 肽 酶 ph 20 3 CH 3 COONapH 3 CH 3 COONa M NaCl (> 95 %) (< 0.2 %) (10 6 ) 1 formaldehyde 0.02 dodecyl sulphate 16 formaldehydedodecyl sulphate rpm4 7
8 M NaCl 0.1 para-hydroxybenzoic acidmethyl ester rpm g 1 N HCl Toyo No.1 Toyo No m 10 CPC cetylpyridinium chloride CPC COO NaCl 0.15 M NaCl 10 1 M NaCl 40 mesh activated of Florisil 4 g 200 ml 1M NaCl HA ml 0.15M NaCl 0.45 m MWCO M PBS buffer 37 2 RNase DNase10 l/ml rpm M NaCl rpm 10CPC rpm 20 1M NaCl rpm rpm 5 1M NaCl 2 95 MWCO rpm4 8
9 M NaCl 10 CPC rpm M NaCl rpm 爲 爲 爲 産 23 爲 14 爲 12 barrier Casado 1.5~
10 hydrolipic barrier Fibroblast CD-44 receptor Miller 10
11 27 vinyl sulfone Hylaform Viscoelastic Gel fermentation fervere CO 2 11
12 DNA 苷 酶 DNA (lag phase) 12
13 (log phase) (stationary phase) (decline phase) N hours stirred-reactor kg / cm 2 13
14 0.3 Mpa brine d / D / circulatory revolve d / D 0.1~0.2 Mpa 14
15 ph air-lift reactor hold-up hold-up normal ameliorate packed formed liquid cycle membrane rolling-up 15
16 2.2.4 Batch culture Continuous culture Semi-continuous culture
17 ph lag phase log phase static phase ph turbidostat chemostat 17
18 ph medium
19 K Pa VVMcm 3 /h r/minrpm KW Pas /m 3 m 3 L DO K L a K L a K L a K L a l/h K L a 1/h /h /h /h /h 19
20 2.2-2 RNADNA mg/gdcw ATPADPAMP NADH O 2 CO 2 CO 2 RQ rh gdcw 1 /L u/mlg/l mg/gdcw mg/ml mg/100ml mol Fe 2 Mg 2 Ca 2 Na 1 NH 4 PO SO 4 mg/gdcw go 2 /Lh go 2 g h ph mv 1DCWDry cell weight CO 2 20
21 ph ph ph ph ph ph ph ph ph ph 6.3~7.5 3~6 綫 7~8 ph ph H 2 SO 4 NaOH 21
22 22
23 23
24 (NUNR) (NIKONECLIPSE TE2000-U) -80 HPLC U-1500 UV-Vis Spectrophotometer HITACHI 5L (BIOTRON) SORVALL RC 5C PLUS HSIANG TAI CN-820 VortexSHIN KWANG 4 KANSIN KCC-1 (ASPIRATORA-3A TOKYO RIKAKIKAI) DENG YNG DOV-40 SV-3A DENG YNG AMICON 8400 HANIL MEGA 17R 24
25 Yeast extract Sigma Glucose Tryptone Sigma 95% Ethanol K 2 HPO 4 anhydrate MgSO 4 anhydrate NaCl Cabazole reagent Sigma D-glucuronic acid Sigma Borax Sigma Sigma MnCl 2 H 2 SO 4 Sigma Phenol Merck NaOH Merck RO LB medium 25
26 Yeast Extract 10 g/l Tryptone5 g/l NaCl5 g/l Glucose30 g/l RO ml ~ ~5 ml rpm 12~15 8. LB medium petri-dish ~ yeast extract20 g/l NaCl1 g/l K 2 HPO 4 8 g/l MgSO 4 1 g/l Glucose30 g/l RO ml ~ rpm 15~17 OD 600nm 3~3.5 26
27 L ml 4. OD 600nm rpm M NaCl rpm rpm OD OD OD 600nm OD 600nm OD 27
28 1. 15 ml L sample 10 ml 3. RO rpm 10 RO 10 ml rpm OD OD OD g/100 ml ml 5% phenol 0.5 ml 2.5 ml nm
29 OD OD600nm 4-1 OD
30 uronic acid Carbazole :, carbazole reagent,,,, , : Carbarzole D-glucuronic acid ml 1.8 UV 2. : 2.1 A:2.39 g 250 ml ( ) 2.2 B:0.125 g Carbazole 100 ml ( 4,12 ) 2.3 (g/ml):0.02 g D-glucuronic acid 20 ml ,7.8125,15.625,31.25,62.5,125(g/ml) : 1.5 ml, : ml, ml, ml 900l A, l 150l,
31 B 30l, (VIS 530nm) (blank: 0 g/ml) (µg/ml)
32 GPC HPLCHigh Performance Liquid Chromatography SESize Exclusion IR TSK-GEL GMPWXL CARBOSep CORE GEL-87H3 100µl 0.45µm 60~ ml/mincolumn 37 pump 25 psi dextran
33 4-2 Dextran Log M.W. M.W (RT)min , , , , , , , ,414, GPC 33
34 ,18 16,18 Yeast extract 20 g/lk 2 HPO 4 8 g/lnacl 1 g/l MgSO 4 1 g/lglucose 60 g/l rpm rpm OD 600nm rpm 100 rpm K 2 HPO 4 K 2 HPO 4 K 2 HPO 4 0 g/l8 g/l16 g/l K 2 HPO 4 K 2 HPO 4 0 g/l8 g/l16 g/l OD 600nm K 2 HPO 4 K 2 HPO 4 8 g/l 16 g/l K 2 HPO 4 16g/L K 2 HPO 4 8 g/l 34
35 ( rpm OD600nm (hours) 5.1-2K 2 HPO 4 0 g/l8 g/l16 g/l 35
36 5.1.3 MgSO 4 MgSO 4 MgSO 4 0 g/l1 g/l2 g/l MgSO 4 0 g/l1 g/l2 g/l OD 600nm MgSO 4 1 g/l MgSO 4 1 g/l NaCl NaCl 0 g/l1 g/l2 g/lnacl NaCl 0 g/l1 g/l2 g/l OD 600nm NaCl 36
37 OD600nm ( 5.1-3MgSO 4 0 g/l1 g/l2 g/l NaCl ( 5.1-4NaCl 0 g/l1 g/l2 g/l 37
38 5.1.5 MnCl 2 MnCl 2 0 g/l1 g/lmn DNA MnCl MnCl 2 MnCl 2 0 g/l1 g/l OD 600nm g/l MnCl 2 MnCl 2 MnCl yeast extract bacto-tryptone yeast extract 20 g/lyeast extract 10 g/l+tryptone 10 g/ltryptone 20 g/l yeast extract yeast extract 20 g/lyeast extract 10 g/l + tryptone 10 g/ltryptone 20 g/l OD 600nm yeast extract tryptone yeast extract yeast extract yeast extract 38
39 ( 5.1-5Mn 0 g/l1 g/l ( yeast extract 20g/L yeast extract 10g/L+tryptone 10g/L tryptone 20g/L 39
40 g/l g/l OD 600nm 60 g/l30 g/l g/l 30 g/l ( g/l60 g/l 40
41 5L yeast extract 20 g/lmgso 4 1 g/l K 2 HPO 4 8 g/lnacl 1 /Lglucose 60 g/l 5 L 3 L OD 200 rpmod 1.5~2 250 rpmod 8~9 350 rpmod rpm OD 0.5 vvmod 8~9 1 vvmph 7~ OD 600nm 3.2~ ml OD 600nm ~ OD 600nm 33 5~
42 ( (
43 OD 600nm OD 600nm
44 ( (
45 5.2.2 Cabazole assay ~ g/l OD g/l 25 3 g/l g/l 45
46 ( ( ( (
47 g/l g/l 37 47
48 ( ( ( (
49 ~13 5~6 37 OD 600nm OD 600nm OD 600nm OD 600nm ~ ~ g/l g/l g/l g/l
50 5.3 0 g/l30 g/l60 g/l ~ g/l glucose OD cps OD g/l OD GPC 22~ ~ Dalton Dalton 50
51 ( cps (
52 5.3-3 OD (
53 5.3-5 (
54 Intensity (mv) Retention Time (min)
55 g/l 30 glucose OD ph 60 g/l cps OD OD g/l g/l GPC 20~ ~ Dalton Dalton 55
56 (hours) g/l cps (hours) g/l 56
57 g/l OD ( ( g/l 57
58 g/l (hours) g/l 58
59 Intensity (mv) Retention Time (min) g/l 9 59
60 g/l 60 glucose OD cps OD ~11 OD 10~ g/l OD GPC 20~ ~ Dalton Dalton 60
61 (hours) g/l (hours) g/l 61
62 g/l OD ( ( g/l 62
63 (g/l) g/l ( g/l 63
64 Intensity (mv) Retention Time (min) g/l 13 64
65 g/l30 g/l60 g/l g/l g/l g/l g/l 7 OD 600nm g/l 13 OD 600nm g/l OD 600nm g/l g/l g/l g/l g/l 1.11 g/l6.61 g/l g/l 60g/L g/l g/l g/l GPC ~ Dalton ~ Dalton ~ Dalton Dalton Dalton Dalton
66 60 g/l 66
67 L 3 L g/l glucose60 g/l glucose 400 ml 3 ml/min kgglucose/h 37 OD 600nm OD g/l 5~ cps OD OD 9~ g/l g/l g/l 8 g/l GPC 20~ ~ Dalton Dalton 67
68 ( g/l glucose3 ml/min (hours) g/l glucose3 ml/min 68
69 g/l glucose3 ml/min OD ( ( g/l glucose3 ml/min 69
70 g/l glucose3 ml/min (hours) g/l glucose3 ml/min 70
71 Intensity (mv) Retention Time (min) g/l glucose3 ml/min13 71
72 g/l glucose60 g/l glucose 400 ml 6 ml/min kgglucose/h 37 OD600nm OD ml/min cpsod ~ g/L g/l3 ml/min 0.5 g/l g/l g/l 6.43 g/l cps g/l g/l4 g/l 300 cps ml/min GPC 25~ ~ Dalton Dalton 72
73 (hours) g/l glucose6 ml/min (hours) g/l glucose6 ml/min 73
74 g/l glucose6 ml/min OD (hours) g/l glucose6 ml/min 74
75 cps g/l g/l glucose6 ml/min (hours) g/l glucose6 ml/min 75
76 Intensity (mv) Retention Time (min) g/l glucose6 ml/min 12 76
77 g/l glucose 60 g/l glucose 200 ml 20 ml/min kgglucose/h 37 OD 600nm OD OD ml/min ml/min OD 600nm 5~6 8~13 13~ cps OD OD g/l g/l g/l 3 ml/min g/l 6 ml/min 1.5~2 g/l ~ GPC 25~ ~ Dalton Dalton 77
78 (hours) g/l20 ml/min cps (hours) g/l20 ml/min 78
79 g/l20 ml/min OD g/l (hours) g/l20 ml/min 79
80 g/l20 ml/min (hours) g/l20 ml/min 80
81 160 Intensity (mv) Retention Time (min) g/l20 ml/min 20 81
82 g/l glucose 30 g/l glucose 400 ml 3 ml/mins kgglucose/h 37 OD 600nm OD g/l3 ml/min cpsod ~ g/l g/l3 ml/min 2 g/l ~ GPC 21~ ~ Dalton Dalton 82
83 ( g/l glucose 30 g/l glucose3 ml/min cps ( g/l glucose 30 g/l glucose3 ml/min 83
84 g/l glucose 30 g/l glucose3 ml/min OD ( ( g/l glucose 30 g/l glucose3 ml/min 84
85 g/l glucose 30 g/l glucose3 ml/min (hours) g/l glucose 30 g/l glucose3 ml/min 85
86 Intensity (mv) Retention Time (min) g/l glucose 30 g/l glucose3 ml/min 9 86
87 g/l glucose 30 g/l glucose 200 ml 20 ml/min kgglucose/h 37 OD 600nm OD g/l 20 ml/min cps OD OD 12~ g/l 3 ml/min12.34 g/l g/l GPC 20~ ~ Dalton Dalton 87
88 g/l glucose 30 g/l glucose20 ml/min cps ( g/l glucose 30 g/l glucose20 ml/min 88
89 g/l glucose 30 g/l glucose20 ml/min OD (hours) g/l glucose 30 g/l glucose20 ml/min 89
90 g/l glucose 30 g/l glucose20 ml/min (hours) g/l glucose 30 g/l glucose20 ml/min 90
91 Intensity (mv) Retention Time (min) g/l glucose30 g/l glucose20 ml/min 12 91
92 g/l 60 g/l 3 ml/min g/l 60 g/l 6 ml/min g/l 60 g/l 20 ml/min g/l 30 g/l 3 ml/min g/l 30 g/l 20 ml/min g/l 4 60 g/l 5~ OD OD OD OD OD g/l ~9 120 g/l ~13 60 g/l 60 g/l g/l 30 g/l 3 ml/min OD 600nm g/l g/l g/l g/l g/l g/l g/l 60 g/l 20 ml/min 92
93 g/l 30 g/l 3 ml/min 0.18 g/l g/l~120 g/l ~ Dalton ~ Dalton ~ Dalton ~ Dalton ~ Dalton Dalton Dalton Dalton Dalton Dalton
94 5.5 K 2 HPO K 2 HPO 4 K 2 HPO 4 OD 600nm K 2 HPO 4 yeast extract 20 g/lk 2 HPO 4 8 g/lmgso 4 1 g/lnacl 1 g/lglucose 60 g/l 5 L 3 L ph 7~7.2 OD 200 rpmod 1.5~2 250 rpmod 8~9 350 rpmod rpm OD 0.5 vvmod 8~9 1 vvm g/l K 2 HPO OD K 2 HPO K 2 HPO 4 8 g/l 3 K 2 HPO cps 10 OD ~ g/l GPC 22~ ~ Dalton Dalton 94
95 ( K 2 HPO 4 16 g/l ( K 2 HPO 4 16 g/l 95
96 5.5-3 K 2 HPO 4 16 g/l OD ( ( K 2 HPO 4 16 g/l 96
97 5.5-5 K 2 HPO 4 16 g/l (hours) K 2 HPO 4 16 g/l 97
98 Intensity (mv) Retention Time (min) K 2 HPO 4 16 g/l 13 98
99 g/l K 2 HPO 4 8 g/l K 2 HPO 4 6 ml/min 100 ml kgglucose/h 37 OD OD g/l K 2 HPO 4 K 2 HPO g/l K 2 HPO g/l K 2 HPO 4 K 2 HPO ~4 K 2 HPO cps 8 g/l K 2 HPO OD OD g/l GPC 20~ ~ Dalton Dalton 99
100 (hours) g/l K 2 HPO 4 (hours) g/l K 2 HPO 4 100
101 g/l K 2 HPO 4 OD (hours) g/l K 2 HPO 4 101
102 g/l K 2 HPO 4 (hours) g/l K 2 HPO 4 102
103 Intensity (mv) Retention Time (min) g/l K 2 HPO
104 5.5.3 K 2 HPO 4 8 g/l K 2 HPO 4 16 g/l 8 g/l 5 L K 2 HPO 4 8 g/l g/l K 2 HPO 4 K 2 HPO g/l K 2 HPO g/l K 2 HPO 4 8 g/l K 2 HPO ~4 K 2 HPO L K 2 HPO 4 K 2 HPO 4 K 2 HPO g/l K 2 HPO 4 K 2 HPO g/l K 2 HPO g/l K 2 HPO 4 8 g/l K 2 HPO g/l10.23 g/l g/l K 2 HPO 4 K 2 HPO g/l K 2 HPO 4 K 2 HPO g/l K 2 HPO g/l K 2 HPO 4 8 g/l K 2 HPO ~ Dalton ~ Dalton ~ Dalton Dalton Dalton Dalton g/l K 2 HPO 4 K 2 HPO g/l K 2 HPO 4 8 g/l K 2 HPO 4 104
105 K 2 HPO 4 105
106 yeast extract 20 g/lk 2 HPO 4 8 g/lmgso 4 1 g/l NaCl 1 g/lglucose 60 g/l 5 L 3 L ph 7~7.2 OD 200 rpmod 1.5~2 250 rpmod 8~9 350 rpmod rpm OD 0.5 vvmod 8~9 1 vvm OD cps OD g/l K 2 HPO 4 51 cps g/l GPC 23~ ~ Dalton Dalton 106
107 ( (hours)
108 5.6-3 OD (hours)
109 5.6-5 (hours)
110 Intensity (mv) Retention Time (min)
111 OD ~5 13 OD OD cps OD g/l g/l 2~3 g/l GPC 25~ ~ Dalton Dalton 111
112 ( (hours)
113 OD (hours)
114 (hours)
115 Intensity (mv) Retention Time (min)
116 g/l g/l 708 cps g/l g/l6.52 g/l14.93 g/l 4 g/l 1/ ~ Dalton ~ Dalton ~ Dalton Dalton Dalton Dalton
117 117
118 L yeast extract 20 g/lk 2 HPO 4 8 g/lmgso 4 1 g/lnacl 1 g/lglucose 60 g/l glucose 60 g/l 0.3~0.4 kg/cm 3 OD 200 rpmod 1.5~2 250 rpmod 8~9 350 rpmod rpm OD 0.5 vvmod 8~9 1 vvm 37 ph 7~ L 3 LOD L 3 LOD OD L 5 L 60 g/lod cps OD L 100 L OD 5 L g/l 5 L 1 g/l g/l 8 g/l GPC 23~ ~ Dalton Dalton 118
119 (hours) L (hours) L 119
120 L OD (hours) L 120
121 L (hours) L 121
122 (mv) Intensity Retention Time (min) L
123 100 L 5 L L 60 g/l L 100 L 5 L 100 L OD 5 L 100 mlod L 3 LOD L L L 100 L 100 L 5 L L L L 100 L L g/l L g/l 100 L 5 L 5 L L L ~ Dalton ~ Dalton Dalton Dalton 5 L 100 L 100 L 123
124 1. yeast extract 20 g/lnacl 1 g/lk 2 HPO 4 8 g/lmgso 4 1 g/lglucose 60 g/l OD OD g/l g/l 60 g/l 0.1 g/l 120 g/l 60 g/l 60 g/l~120 g/l g/l60 g/l 20 ml/min kg/h OD 600nm g/l g/l 7. K 2 HPO 4 124
125 GPC 8 g/l K 2 HPO 4 8 g/l K 2 HPO Dalton L 5 L 100 L g/l 5 L g/l 1 g/l GPC 100 L Dalton 5 L Dalton 100 L 5 L 5 L HA hours hoursod 600nm g/l Dalton Dalton ~ ~ ~ g/l 2 3~ ~ g/l 4~ ~ g/l ~ g/l ~ g/l3 ml/min 60 g/l ~ g/l6 ml/min 60 g/l ~ g/l20 ml/min 30 g/l ~ g/l3 ml/min 30 g/l ~ g/l20 ml/min ~ ~ K 2 HPO 4 16 g/l ~ K 2 HPO ~ g/l 8 g/l 100 L 1~ ~
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