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1 微 生 物 学 实 验 指 导 黄 文 芳 张 松 编 著 华 南 师 范 大 学 生 命 科 学 学 院 第 一 部 分 基 础 实 验 实 验 1 培 养 基 的 配 制 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 学 习 和 掌 握 配 制 培 养 基 的 一 般 方 法 和 步 骤 内 容 :1. 牛 肉 膏 蛋 白 陈 培 养 基 的 配 制 2. 高 氏 1 号 培 养 基 的 配 制 3. 马 丁 氏 培 养 基 的 配 制 二 实 验 材 料 和 用 具 牛 肉 膏 蛋 白 胨 琼 脂 可 溶 性 淀 粉 葡 萄 糖 孟 加 拉 红 链 霉 素 1mol/L NaOH lmol/l HCl KNO 3 NaCl K 2 HPO 4 3H 2 O MgSO 4 7H 2 O FeSO 4 7H 2 O 试 管 三 角 瓶 烧 杯 量 筒 玻 璃 棒 天 平 牛 角 匙 ph 试 纸 棉 花 牛 皮 纸 记 号 笔 线 绳 纱 布 漏 斗 漏 斗 架 胶 管 止 水 夹 等 三 操 作 步 骤 ( 一 ) 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 的 配 制 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 是 一 种 应 用 最 广 泛 和 最 普 通 的 细 菌 基 础 培 养 基 其 配 方 如 下 : 牛 肉 膏 3g, 蛋 白 胨 10g,Nacl5g, 琼 脂 15~20g, 水 1000mL,PH7.4~ 称 药 品 按 实 际 用 量 计 算 后, 按 配 方 称 取 各 种 药 品 放 入 大 烧 杯 中 牛 肉 膏 可 放 在 小 烧 杯 或 表 面 皿 中 称 量, 用 热 水 溶 解 后 倒 入 大 烧 杯 ; 也 可 放 在 称 量 纸 上 称 量, 随 后 放 入 热 水 中, 牛 肉 膏 使 与 称 量 纸 分 离, 立 即 取 出 纸 片 蛋 白 胨 极 易 吸 潮, 故 称 量 时 要 迅 速 2. 加 热 溶 解 在 烧 杯 中 加 入 少 于 所 需 要 的 水 量, 然 后 放 在 石 棉 网 上, 小 火 加 热, 并 用 玻 棒 搅 拌, 待 药 品 完 全 溶 解 后 再 补 充 水 分 至 所 需 量 若 配 制 固 体 培 养 基, 则 将 称 好 的 琼 脂 放 入 己 溶 解 的 药 品 中, 再 加 热 融 化, 此 过 程 中, 需 不 断 搅 拌, 以 防 琼 脂 糊 底 或 溢 出, 最 后 补 足 所 失 的 水 分 3. 调 ph 检 测 培 养 基 的 ph, 若 ph 偏 酸, 可 滴 加 lmol/l NaOH, 边 加 边 搅 拌, 并 随 时 用 ph 试 纸 检 测, 直 至 达 到 所 需 ph 范 围 若 偏 碱, 则 用 lmol/l HCl 进 行 调 节 ph 的 调 节 通 常 放 在 加 琼 脂 之 前 应 注 意 ph 值 不 要 调 过 头, 以 免 回 调 而 影 响 培 养 基 内 各 离 子 的 浓 度 4. 过 滤 液 体 培 养 基 可 用 滤 纸 过 滤, 固 体 培 养 基 可 用 4 层 纱 布 趁 热 过 滤, 以 利 培 养 的 观 察 但 是 供 一 般 使 用 的 培 养 基, 这 步 可 省 略 5. 分 装 按 实 验 要 求, 可 将 配 制 的 培 养 基 分 装 入 试 管 或 三 角 瓶 内 分 装 时 可 用 漏 斗 以 免 使 培 养 基 沾 在 管 口 或 瓶 口 上 而 造 成 污 染 分 装 量 : 固 体 培 养 基 约 为 试 管 高 度 的 l/5, 灭 菌 后 制 成 斜 面 分 装 入 三 角 瓶 内 以 不 超 过 其 容 积 的 一 半 为 宜 半 固 体 培 养 基 以 试 管 高 度 的 1/3 为 宜, 灭 菌 后 垂 直 待 凝 6. 加 棉 塞 试 管 口 和 三 角 瓶 口 塞 上 用 普 通 棉 花 ( 非 脱 脂 棉 ) 制 作 的 棉 塞 棉 塞 的 形 状 大 小 和 松 紧 度 要 合 适, 四 周 紧 贴 管 壁, 不 留 缝 隙, 才 能 起 到 防 止 杂 菌 侵 入 和 有 利 通 气 的 作 用 要 使 棉 塞 总 长 约 3/5 塞 入 试 管 口 或 瓶 口 内, 以 防 棉 塞 脱 落 有 些 微 生 物 需 要 更 好 的 通 气, 则 可 用 8 层 纱 布 制 成 通 气 塞 有 时 也 可 用 试 管 帽 或 塑 料 塞 代 替 棉 塞 7. 包 扎 加 塞 后, 将 三 角 瓶 的 棉 塞 外 包 一 层 牛 皮 纸 或 双 层 报 纸, 以 防 灭 菌 时 冷 凝 水 沾

2 湿 棉 塞 若 培 养 基 分 装 于 试 管 中, 则 应 以 5 支 或 7 支 在 一 起, 再 于 棉 塞 外 包 一 层 牛 皮 纸, 用 绳 扎 好 然 后 用 记 号 笔 注 明 培 养 基 名 称 组 别 日 期 8. 灭 菌 将 上 述 培 养 基 于 湿 热 灭 菌 20min 如 因 特 殊 情 况 不 能 及 时 灭 菌, 则 应 故 人 冰 箱 内 暂 存 9. 摆 斜 面 灭 菌 后, 如 制 斜 面, 则 需 趁 热 将 试 管 口 端 搁 在 一 根 长 木 条 上, 并 调 整 斜 度, 便 斜 面 的 长 度 不 超 过 试 管 总 长 的 1/2 10. 无 菌 检 查 将 灭 菌 的 培 养 基 放 入 37 温 箱 中 培 养 24~48h, 无 菌 生 长 即 可 使 用, 或 贮 存 于 冰 箱 或 清 洁 的 橱 内, 备 用 ( 二 ) 高 氏 l 号 培 养 基 的 配 制 高 氏 1 号 培 养 基 是 用 于 分 离 和 培 养 放 线 菌 的 合 成 培 养 基 其 配 方 如 下 : 可 溶 性 淀 粉 20g,KNO 3 1g,NaCl 0.5g,K 2 HPO 4 3H 2 O 0.5g,MgSO 4 7H 2 O 0.5g, FeSO 4 7H 2 O 0.01g, 琼 脂 15~20g, 水 1000mL,pH7.4~7.6 l. 称 量 和 溶 解 先 计 算 后 称 量, 按 用 量 先 称 取 可 溶 性 淀 粉, 放 入 小 烧 杯 中, 并 用 少 量 冷 水 将 其 调 成 糊 状, 再 加 至 少 于 所 需 水 量 的 水, 继 续 加 热, 边 加 热 边 搅 拌, 至 其 完 全 溶 解 再 加 入 其 他 成 分 依 次 溶 解 对 微 量 成 分 FeSO 4 7H 2 O 可 先 配 成 高 浓 度 的 贮 备 液 后 再 加 入, 方 法 是 先 在 1000mL 中 加 入 1g 的 FeSO4 7H 2 O, 配 成 浓 度 为 0.01g/mL 的 贮 备 液, 再 在 1000mL 培 养 基 中 加 入 以 上 贮 备 液 1mL 即 可 待 所 有 药 品 完 全 溶 解 后, 补 充 水 分 到 所 需 的 总 体 积 如 要 配 制 固 体 培 养 基, 其 琼 脂 溶 解 过 程 同 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 配 制 2.pH 调 节 分 装 包 扎 及 无 菌 检 查 同 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 配 制 ( 三 ) 马 丁 氏 培 养 基 的 配 制 马 丁 氏 培 养 基 是 用 于 分 离 真 菌 的 选 择 培 养 基 其 配 方 如 下 : K 2 HPO 4 1g,MgSO 4 7H 2 O 0.5g, 蛋 白 胨 5g, 葡 萄 糖 l0g, 琼 脂 15~20g, 水 1000mL, 自 然 ph 1. 称 量 和 溶 解 先 计 算 后 称 量, 按 用 量 称 取 各 成 分, 并 将 其 溶 解 在 少 于 所 需 的 水 中 待 各 成 分 完 全 溶 解 后, 补 充 水 分 到 所 需 体 积 再 将 孟 加 拉 红 配 成 1% 的 水 溶 液, 在 1000mL 培 养 液 中 加 入 以 上 孟 加 拉 红 溶 液 3.3mL, 混 匀 后, 加 入 琼 脂 加 热 融 化, 方 法 同 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 配 制 2. 分 装 包 扎 灭 菌 及 无 菌 检 查 同 牛 肉 膏 蛋 白 膝 培 养 基 配 制 3. 链 霉 素 的 加 入 链 霉 素 受 热 容 易 分 解, 所 以 临 用 时, 将 培 养 基 融 化 后 待 温 度 降 至 45 左 右 时 才 能 加 入 可 先 将 链 霉 素 配 成 1% 的 溶 液 ( 配 好 的 链 霉 素 溶 液 保 存 于 -20 ), 在 100mL 培 养 基 中 加 1% 链 霉 素 0.3mL, 使 每 毫 升 培 养 基 中 合 链 霉 素 30μg 四 注 意 事 项 称 药 品 用 的 牛 角 匙 不 要 混 用, 称 完 药 品 应 及 时 盖 紧 瓶 盖 调 ph 时 要 小 心 操 作, 避 免 回 调 不 同 培 养 基 各 有 配 制 特 点, 要 注 意 具 体 操 作 五 实 验 报 告 记 录 本 实 验 配 制 培 养 基 的 名 称 数 量, 并 图 解 说 明 其 配 制 过 程, 指 明 要 点 六 问 题 和 思 考 l. 配 制 培 养 基 有 哪 几 个 步 骤? 在 操 作 过 程 中 应 注 意 些 什 么 问 题? 为 什 么? 2. 培 养 基 配 制 完 成 后, 为 什 么 必 须 立 即 灭 菌? 若 不 能 及 时 灭 菌 应 如 何 处 理? 已 灭 菌 的 培 养 基 如 何 进 行 无 菌 检 查? 3. 试 设 计 实 验 对 饮 料 进 行 无 菌 检 查 实 验 2 消 毒 与 灭 菌 一 干 热 灭 菌 ( 一 ) 目 的 要 求 1. 了 解 干 热 灭 菌 的 原 理 和 应 用 范 围 2. 学 习 干 热 灭 菌 的 操 作 技 术 ( 二 ) 基 本 原 理 干 热 灭 菌 是 利 用 高 温 使 微 生 物 细 胞 内 的 蛋 白 质 凝 固 变 性 而 达 到 灭 菌 的 目 的 细 胞 内 的 蛋 白 质 凝 固 性 与 其 本 身 的 含 水 量 有 关, 在 菌 体 受 热 时, 当 环 境 和 细 胞 内 含 水 量 越 大, 则 蛋 白

3 蛋 凝 固 就 越 快, 反 之 含 水 量 越 少, 凝 固 缓 慢 因 此, 与 湿 热 灭 菌 相 比, 干 热 灭 菌 所 需 温 度 要 高 (160~170 ), 时 间 要 长 (1~2h), 但 干 热 灭 菌 温 度 不 能 超 过 180, 否 则, 包 器 皿 的 纸 或 棉 塞 就 会 烧 焦, 甚 至 引 起 燃 烧 干 热 灭 菌 使 用 的 电 烘 箱 的 结 构 如 图 2-1 图 2-1 电 烘 箱 的 外 观 和 结 构 A. 外 观 B. 结 构 1. 温 度 计 ; 2. 排 气 阀 ; 3. 箱 体 ; 4. 控 温 器 旋 钮 ; 5. 箱 门 ; 6. 指 示 灯 ; 7. 加 热 开 关 ; 8. 温 度 控 制 阀 ; 9. 控 制 室 ; 10. 侧 门 ; 11. 工 作 室 ; 12. 保 温 室 ; 13. 电 热 器 ; 14. 散 热 板 ; 15. 搁 板 ( 三 ) 器 材 培 养 皿 试 管 吸 管 电 烘 箱 等 ( 四 ) 操 作 步 骤 1. 装 入 待 灭 菌 物 品 将 包 好 的 待 灭 菌 物 品 ( 培 养 皿 试 管, 吸 管 等 ) 放 入 电 烘 箱 内, 关 好 箱 门 物 品 不 要 摆 得 太 挤, 以 免 妨 碍 空 气 流 通, 灭 菌 物 品 不 要 接 触 电 烘 箱 内 壁 的 铁 板, 以 防 包 装 纸 烤 焦 起 火 2. 升 温 接 通 电 源, 拨 动 开 关, 打 开 电 烘 箱 排 气 孔, 旋 动 恒 温 调 节 器 至 绿 灯 亮, 让 温 度 逐 渐 上 升 当 温 度 升 至 100 时, 关 闭 排 气 孔 在 升 温 过 程 中, 如 果 红 灯 熄 灭, 绿 灯 亮, 表 示 箱 内 停 止 加 温, 此 时 如 果 还 未 达 到 所 需 的 温 度, 则 需 转 动 调 节 器 使 红 灯 再 亮, 如 此 反 复 调 节, 直 至 达 到 所 需 温 度 3. 恒 温 当 温 度 升 达 到 160~170 时, 恒 温 调 节 器 会 自 动 控 制 调 节 温 度, 保 持 此 温 度 2h 干 热 火 菌 过 程 严 防 恒 温 调 节 的 自 动 控 制 失 灵 而 造 成 安 全 事 故 4. 降 温 切 断 电 源 自 然 降 温 5. 开 箱 取 物 待 电 烘 箱 内 温 度 降 到 70 以 下 后, 打 开 箱 门, 取 出 灭 菌 物 品 电 烘 箱 内 温 度 末 降 到 70, 切 勿 自 行 打 开 箱 门 以 免 骤 然 降 温 导 致 玻 璃 器 皿 炸 裂 ( 五 ) 实 验 报 告 思 考 题 l. 在 干 热 灭 菌 操 作 过 程 中 应 注 意 哪 些 问 题, 为 什 么? 2. 为 什 么 干 热 火 菌 比 湿 热 灭 菌 所 需 要 的 温 度 要 高, 时 间 要 长? 请 设 计 干 热 灭 菌 和 湿 热 灭 菌 效 果 比 较 实 验 方 案 二 高 压 蒸 气 灭 菌 ( 一 ) 目 的 要 求 1. 了 解 高 压 蒸 气 灭 菌 的 基 本 原 理 及 应 用 范 围 2. 学 习 高 压 蒸 气 灭 菌 的 操 作 方 法 ( 二 ) 基 本 原 理

4 高 压 蒸 气 灭 菌 是 将 待 灭 菌 的 物 品 放 在 一 个 密 闭 的 加 压 灭 菌 锅 内, 通 过 加 热, 使 灭 菌 锅 隔 套 间 的 水 沸 腾 而 产 生 蒸 气 待 水 蒸 气 急 剧 地 将 锅 内 的 冷 空 气 从 排 气 阀 中 驱 尽, 然 后 关 闭 排 气 阀, 继 续 加 热, 此 时 由 于 蒸 气 不 能 溢 出, 而 增 加 了 灭 菌 锅 内 的 压 力, 从 而 使 沸 点 增 高, 得 到 高 于 100 的 温 度 导 致 菌 体 蛋 白 质 凝 固 变 性 而 达 到 灭 菌 的 目 的 在 同 一 温 度 下, 湿 热 的 杀 菌 效 力 比 干 热 大 其 原 因 有 三 : 一 是 湿 热 中 细 菌 菌 体 吸 收 水 分, 蛋 白 质 较 易 凝 固, 因 蛋 白 质 含 水 量 增 加, 所 需 凝 固 温 度 降 低 ( 表 2 1), 二 是 湿 热 的 穿 透 力 比 干 热 大 ( 表 2 2), 三 是 湿 热 的 蒸 气 有 潜 热 存 在 1g 水 在 100 时, 由 气 态 变 为 液 态 时 可 放 出 2.26kJ( 千 焦 ) 的 热 量 这 种 潜 热, 能 迅 速 提 高 被 灭 菌 物 体 的 温 度, 从 而 增 加 灭 菌 效 力 表 2 1 蛋 白 质 含 水 量 与 凝 固 所 需 温 度 的 关 系 卵 白 蛋 白 含 水 量 /% 30 分 钟 内 凝 固 所 需 温 度 / ~ ~ ~170 在 使 用 高 压 蒸 气 灭 菌 锅 灭 菌 时, 灭 菌 锅 内 冷 空 气 的 排 除 是 否 完 全 极 为 重 要, 因 为 空 气 的 膨 胀 压 大 于 水 蒸 气 的 膨 胀 压, 所 以, 当 水 蒸 气 中 含 有 空 气 时, 在 同 一 压 力 下, 含 空 气 蒸 气 的 温 度 低 于 饱 和 蒸 气 的 温 度 灭 菌 锅 内 留 有 不 同 分 量 空 气 时, 压 力 与 温 度 的 关 系 见 ( 表 2 3) 温 度 / 时 间 /h 干 热 表 2-2 干 热 温 热 穿 透 力 及 灭 菌 效 果 比 较 透 过 布 层 的 温 度 / 灭 菌 20 层 10 层 100 层 不 完 全 湿 热 完 全 压 力 数 表 2 3 灭 菌 锅 留 有 不 同 分 量 空 气 时, 压 力 与 温 度 的 关 系 全 部 空 气 2/3 空 气 1/2 空 气 1/3 空 气 空 气 全 不 Mpa Kg/cm 2 Ib/in 2 排 出 时 的 温 度 / 排 出 时 的 温 度 / 排 出 时 的 温 度 / 排 出 时 的 温 度 / 排 出 时 的 温 度 / 现 在 法 定 压 力 单 位 己 不 用 磅 和 kg/cm 2 表 示, 而 是 用 Pa 或 bar 表 示, 其 换 算 关 系 为 : 1kg/cm 2 = Pa;1Ib/in 2 = Pa. 一 般 培 养 基 用 0.1Mpa( 相 当 于 15 Ib/in 2 或 1.05kg/cm 2 ),121.5,15~30min 可 达 到 彻 底 灭 菌 的 目 的 灭 菌 的 温 度 及 维 持 的 时 间 随 灭 菌 物 品 的 性 质 和 容 量 等 具 体 情 况 而 有 所 改 变 例 如 含 糖 培 养 基 用 0.06Mpa(8Ib/in 2 或 0.59kg/cm 2 )112.6 灭 菌, 然 后 以 无 菌 操 作 手 续 加 入 灭 菌 的 糖 溶 液 又 如 盛 于 试 管 内 的 培 养 基 以 0.1Mpa,121.5 灭 菌 20min 即 可, 而 盛 于 大 瓶 内 的 培 养 基 最 好 以 0.1Mpa,122 灭 菌 30min 实 验 中 常 用 的 非 自 控 高 压 蒸 气 灭 菌 锅 有 卧 式 ( 图 2-2,A) 和 手 提 式 ( 图 2 2,B) 二 种, 其 结 构 和 工 作 原 理 相 同, 本 实 验 以 手 提 式 高 压 蒸 气 灭 菌 锅 为 例, 介 绍 其 使 用 方 法, 有 关 自 控 高 压 蒸 气 灭 菌 锅 (autoclave) 的 使 用 可 参 照 厂 家 说 明 书

5 图 2 2A 卧 式 灭 菌 锅 图 2 2B 手 提 式 灭 菌 锅 1. 安 全 阀 ; 2. 压 力 表 ; 3. 放 气 阀 ; 4. 软 管 ; 5. 紧 固 螺 栓 ; 6. 灭 菌 桶 ; 7. 筛 架 ; 8. 水 ( 三 ) 器 材 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基, 培 养 皿 (6 套 一 包 ), 手 提 式 高 压 蒸 气 灭 菌 锅 等 ( 四 ) 操 作 步 骤 1. 首 先 将 内 层 锅 取 出, 再 向 外 层 锅 内 加 入 适 量 的 水, 使 水 面 与 三 角 搁 架 相 平 为 宜 切 勿 忘 记 加 水, 同 时 水 量 不 可 过 少, 以 防 灭 菌 锅 烧 干 而 引 起 炸 裂 事 故 2. 放 回 内 层 锅, 并 装 入 待 灭 菌 物 品 注 意 不 要 装 得 太 挤, 以 免 防 碍 蒸 气 流 通 而 影 响 灭 菌 效 果 三 角 烧 瓶 与 试 管 口 端 均 不 要 与 锅 壁 接 触, 以 免 冷 凝 水 淋 湿 包 口 的 纸 而 透 入 棉 塞 3. 加 盖, 并 将 盖 上 的 排 气 软 管 插 入 内 层 锅 的 排 气 槽 内 再 以 两 两 对 称 的 方 式 同 时 旋 紧 相 对 的 两 个 螺 栓, 使 螺 栓 松 紧 一 致, 勿 使 漏 气 4. 用 电 炉 或 煤 气 加 热, 并 同 时 打 开 排 气 阀, 使 水 沸 腾 以 排 除 锅 内 的 冷 空 气 待 冷 空 气 完 全 排 尽 后, 关 上 排 气 阀, 让 锅 内 的 温 度 随 蒸 气 压 力 增 加 到 逐 渐 上 升 当 锅 内 压 力 升 到 所 需 压 力 时, 控 制 热 源, 维 持 压 力 至 所 需 时 间 本 实 验 用 0.1Mpa,121.5,20min 灭 菌 灭 菌 的 主 要 因 素 是 温 度 而 不 是 压 力 因 此 锅 内 冷 空 气 必 须 完 全 排 尽 后, 才 能 关 上 排 气 阀, 维 持 所 需 压 力 5. 灭 菌 所 需 时 间 到 后, 切 断 电 源 或 关 闭 煤 气, 让 灭 菌 锅 内 温 度 自 然 下 降, 当 压 力 表 的 压 力 降 至 0 时, 打 开 排 气 阀, 旋 松 螺 栓, 打 开 盖 子, 取 出 灭 菌 物 品 压 力 一 定 要 降 到 0 时, 才 能 打 开 排 气 阀, 开 盖 取 物 否 则 就 会 因 锅 内 压 力 突 然 下 降, 使 容 器 内 的 培 养 基 由 于 内 外 压 力 不 平 衡 而 冲 出 烧 瓶 口 或 试 管 口, 造 成 棉 塞 沾 染 培 养 基 而 发 生 污 染, 甚 至 灼 伤 操 作 者 6. 将 取 出 的 灭 菌 培 养 基, 需 摆 斜 面 的 则 摆 成 斜 面, 然 后 放 入 37 温 箱 培 养 24h, 经 检 查 若 无 杂 菌 生 长, 即 可 待 用 ( 五 ) 实 验 报 告 l. 结 果

6 检 查 培 养 基 灭 菌 是 否 彻 底 2. 思 考 题 (1) 高 压 蒸 气 灭 菌 开 始 之 前, 为 什 么 要 将 锅 内 冷 空 气 排 尽? 灭 菌 完 毕 后, 为 什 么 待 压 力 降 低 0 时 才 能 打 开 排 气 阀, 开 盖 取 物? (2) 在 使 用 高 压 蒸 气 灭 菌 锅 灭 菌 时, 怎 样 杜 绝 一 切 不 安 全 的 因 素? (3) 灭 菌 在 微 生 物 实 验 操 作 中 有 何 重 要 意 义? (4) 黑 曲 霉 的 孢 子 与 芽 孢 杆 菌 的 孢 子 对 热 的 抗 性 哪 个 最 强? 为 什 么? 三 紫 外 线 灭 菌 ( 一 ) 目 的 要 求 了 解 紫 外 线 灭 菌 的 原 理 和 方 法 ( 二 ) 基 本 原 理 紫 外 线 灭 菌 是 用 紫 外 线 灯 进 行 的 波 长 为 200~300nm 的 紫 外 线 都 有 杀 菌 能 力, 其 中 以 260nm 的 杀 菌 力 最 强 在 波 长 一 定 的 条 件 下, 紫 外 线 的 杀 菌 效 率 与 强 度 和 时 间 的 乘 积 成 正 比 紫 外 线 杀 菌 机 理 主 要 是 因 为 它 诱 导 了 胸 腺 嘧 啶 二 聚 体 的 形 成 和 DNA 链 的 交 联, 从 而 抑 制 了 DNA 的 复 制 另 一 方 面, 由 于 辐 射 能 使 空 气 中 的 氧 电 离 成 [O], 再 使 O 2 氧 化 生 成 臭 氧 (O 3 ) 或 使 水 (H 2 O) 氧 化 生 成 过 氧 化 氢 (H 2 O 2 ) O 3 和 H 2 O 2 均 有 杀 菌 作 用 紫 外 线 穿 透 力 不 大, 所 以, 只 适 用 于 无 菌 室, 接 种 箱, 手 术 室 内 的 空 气 及 物 体 表 面 的 灭 菌 紫 外 线 灯 距 照 射 物 以 不 超 过 1.2m 为 宜 此 外, 为 了 加 强 紫 外 线 灭 菌 效 果, 在 打 开 紫 外 灯 以 前 ; 可 在 无 菌 室 内 ( 或 接 种 箱 内 ) 喷 洒 3%~5% 石 炭 酸 溶 液, 一 方 面 使 空 气 中 附 着 有 微 生 物 的 尘 埃 降 落, 另 一 方 面 也 可 以 杀 死 一 部 分 细 菌 无 菌 室 内 的 桌 面 凳 子 可 用 2%~3% 的 来 苏 尔 擦 洗, 然 后 再 开 紫 外 灯 照 射, 即 可 增 强 杀 菌 效 果, 达 到 灭 菌 目 的 ( 三 ) 器 材 1. 培 养 基 牛 肉 膏 蛋 白 胨 平 板 2. 溶 液 或 试 剂 3%~5% 石 炭 酸 或 2%~3% 来 苏 尔 溶 液 3. 仪 器 或 其 他 用 具 紫 外 线 灯 ( 四 ) 操 作 步 骤 l. 单 用 紫 外 线 照 射 (1) 在 无 菌 室 内 或 在 接 种 箱 内 打 开 紫 外 线 灯 开 关, 照 射 30min, 将 开 关 关 闭 (2) 将 牛 肉 膏 蛋 白 胨 平 板 盖 打 开 15min, 然 后 盖 上 皿 盖 置 37 培 养 24h 共 做 三 套 (3) 检 查 每 个 平 板 上 生 长 的 菌 落 数 如 果 不 超 过 4 个, 说 明 灭 菌 效 果 良 好, 否 则, 需 延 长 照 射 时 间 或 同 时 加 强 其 他 措 施 2. 化 学 消 毒 剂 与 紫 外 线 照 射 结 合 使 用 (1) 在 无 菌 室 内, 先 喷 洒 3%~5% 的 石 炭 酸 溶 液, 再 用 紫 外 线 灯 照 射 15imn (2) 无 菌 室 内 的 桌 面, 凳 子 用 2%~3% 来 苏 尔 擦 洗, 再 打 开 紫 外 线 灯 照 射 15min (3) 检 查 灭 菌 效 果 [ 方 法 同 单 用 紫 外 线 照 射 (3)] 因 紫 外 线 对 眼 结 膜 及 视 神 经 有 损 伤 作 用, 对 皮 肤 有 刺 激 作 用, 故 不 能 直 视 紫 外 线 灯 光 下 工 作 ( 五 ) 实 验 报 告 1. 结 果 记 录 两 种 灭 菌 效 果 于 下 表 中 处 理 方 法 平 板 菌 落 数 灭 菌 效 果 比 较 紫 外 线 照 射 3%~5% 石 炭 酸 + 紫 外 线 照 射 2%~3% 来 苏 尔 + 紫 外 线 照 射 2. 思 考 题 (1) 细 菌 营 养 体 细 胞 和 细 菌 芽 孢 对 紫 外 线 和 的 抵 抗 力 会 一 样 吗, 为 什 么?

7 (2) 你 知 道 紫 外 线 灯 管 是 用 什 么 玻 璃 制 作 的? 为 什 么 不 用 普 通 灯 用 玻 璃? (3) 在 紫 外 灯 下 观 察 实 验 结 果 时, 为 什 么 要 隔 一 块 普 通 玻 璃? 四 微 孔 滤 膜 过 滤 除 菌 ( 一 ) 目 的 要 求 1. 了 解 过 滤 除 菌 的 原 理 2. 掌 握 微 孔 滤 膜 过 滤 除 菌 的 方 法 ( 二 ) 基 本 原 理 过 滤 除 菌 是 通 过 机 械 作 用 滤 去 液 体 或 气 体 中 细 菌 的 方 法 根 据 不 同 的 需 要 选 用 不 同 的 滤 器 和 滤 板 材 料 微 孔 滤 膜 过 滤 器 是 由 上 下 二 个 分 别 具 有 出 口 和 入 口 连 接 装 置 的 塑 料 盖 盒 组 成, 出 口 处 可 连 接 针 头, 人 口 处 可 连 接 针 筒, 使 用 时 将 滤 膜 装 入 两 塑 料 盖 盒 之 间, 旋 紧 盖 盒, 当 溶 液 从 针 筒 注 入 滤 器 时, 此 滤 器 将 各 种 微 生 物 阻 留 在 微 孔 滤 膜 上 面, 从 而 达 到 除 菌 的 目 的 根 据 待 除 菌 溶 液 量 的 多 少, 可 选 用 不 同 大 小 的 滤 器 此 法 除 菌 的 最 大 优 点 是 可 以 不 破 坏 溶 液 中 各 种 物 质 的 化 学 成 分, 但 由 于 滤 量 有 限, 所 以 一 般 只 适 用 于 实 验 室 中 小 量 溶 液 的 过 滤 除 菌 ( 三 ) 器 材 1. 培 养 基 2% 的 葡 萄 糖 溶 液, 肉 汤 蛋 白 胨 平 板 2. 仪 器 或 其 他 用 具 注 射 器, 微 孔 滤 膜 过 滤 器,0.22μm 滤 膜, 无 菌 试 管, 镊 子, 玻 璃 刮 棒 ( 四 ) 操 作 步 骤 l. 组 装 灭 菌 将 0.22μm 孔 径 的 滤 膜 装 入 清 洗 干 净 的 塑 料 滤 器 中, 旋 紧 压 平, 包 装 灭 菌 后 待 用 (0.lMPa,121.5 灭 菌 20min) 2. 连 接 将 灭 菌 滤 器 的 入 口 在 无 菌 条 件 下, 以 无 菌 操 作 方 式 连 接 于 装 有 待 滤 溶 液 (2% 葡 萄 糖 溶 液 ) 的 注 射 器 上, 将 针 头 与 出 口 处 连 接 并 插 入 带 橡 皮 塞 的 无 菌 试 管 中 见 图 压 滤 将 注 射 器 中 的 待 滤 溶 液 加 压 缓 缓 挤 入 过 滤 到 无 菌 试 管 中, 滤 毕, 将 针 头 拨 出 压 滤 时, 用 力 要 适 当, 不 可 太 猛 太 快, 以 免 细 菌 被 挤 压 通 过 淀 胶. 4. 无 菌 检 查 无 菌 操 作 吸 取 除 菌 滤 液 0.1ml 于 肉 汤 蛋 白 胨 平 板 上, 涂 布 均 匀, 置 37 温 室 中 培 养 24h, 检 查 是 否 有 菌 生 长 5. 清 洗 弃 去 塑 料 滤 器 上 的 微 孔 滤 膜, 将 塑 料 滤 器 清 洗 干 净, 并 换 上 一 张 新 的 微 孔 滤 膜, 组 装 包 扎, 再 经 无 菌 后 使 用 整 个 过 程 应 在 无 菌 条 件 下 严 格 无 菌 操 作, 以 防 污 染, 过 滤 时 应 避 免 各 连 接 处 出 现 渗 漏 现 象 ( 五 ) 实 验 报 告 l. 结 果 记 录 无 菌 检 查 结 果 2. 思 考 题 (1) 你 做 的 过 滤 除 菌 实 验 效 果 如 何? 如 果 经 培 养 检 查 有 杂 菌 生 长, 你 认 为 是 什 么 原 因 造 成 的? (2) 如 果 你 需 要 配 制 一 种 含 有 某 抗 生 素 的 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基, 其 抗 生 素 的 终 浓 度 ( 或 工 作 浓 度 ) 为 50μg/ml, 你 将 如 何 操 作? (3) 过 滤 除 菌 应 注 意 哪 些 问 题? 实 验 3 土 壤 的 稀 释 分 离 纯 化 微 生 物 及 无 菌 操 作 技 术 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 学 习 从 土 壤 中 分 离 微 生 物 的 方 法, 学 习 无 菌 操 作 技 术

8 内 容 : l. 用 稀 释 法 分 离 细 菌 放 线 菌 和 霉 菌 2. 用 平 板 划 线 方 法 分 离 微 生 物 3. 学 习 斜 面 接 种 及 穿 刺 接 种 等 无 菌 操 作 技 术 二 实 验 材 料 和 用 具 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus) 和 普 通 变 形 菌 (Proteus vulgaris) 斜 面 菌 种 已 灭 菌 的 牛 肉 膏 高 氏 1 号 土 豆 蔗 糖 固 体 培 养 基 各 1 瓶,49.5mL 无 菌 水 ( 带 玻 璃 珠 )1 瓶,4.5mL 无 菌 水 6 管,80% 乳 酸,10% 酚 液,95% 乙 醇 无 菌 培 养 皿 12 套,1mL 无 菌 移 液 管 10 支, 土 壤 样 品 及 天 平 称 量 纸 药 勺 试 管 架 玻 璃 铅 笔 橡 皮 头 ( 用 75% 乙 醇 浸 泡 ) 玻 璃 刮 三 操 作 步 骤 ( 一 ) 土 壤 稀 释 分 离 1. 取 土 壤 取 表 层 以 下 5 10cm 处 的 土 样, 放 入 无 菌 的 袋 中 备 用, 或 放 在 4 冰 箱 中 暂 存 2. 制 备 稀 释 液 ( 要 无 菌 操 作 ) (1) 制 备 土 壤 悬 液 : 称 土 样 0.5g, 迅 速 倒 入 带 玻 璃 珠 的 49.5mL 无 菌 水 瓶 中 ( 玻 璃 珠 用 量 以 充 满 瓶 底 力 最 好 ), 振 荡 5~10min, 使 土 样 充 分 打 散, 即 成 为 10-2 的 土 壤 悬 液 (2) 稀 释 : 用 无 菌 移 液 管 吸 10-2 的 土 壤 悬 液 0.5mL, 放 入 4.5mL 无 菌 水 中 即 为 10-3 稀 释 液, 如 此 重 复, 可 依 次 制 成 10-3 ~10-8 的 稀 释 液 ( 图 3-1) 注 意 : 操 作 时 管 尖 不 能 接 触 液 面, 每 一 个 稀 释 度 换 用 一 支 移 液 管, 每 次 吸 入 土 液 后, 要 将 移 液 管 插 入 液 面, 吹 吸 3 次, 每 次 吸 上 的 液 面 要 高 于 前 一 次, 以 减 少 稀 释 中 的 误 差 ] 图 3 1 稀 释 法 分 离 土 壤 微 生 物 操 作 过 程 图 解 3. 混 菌 法 测 定 菌 落 数 的 方 法 (1) 细 菌 : 取 两 管 稀 释 液 各 1mL, 分 别 接 人 相 应 标 号 的 平 皿 中, 每 个 稀 释 度 接 两 个 平 皿 然 后 取 冷 却 至 50 的 牛 肉 膏 琼 脂 培 养 基, 分 别 倒 入 以 上 培 养 皿 中 ( 装 量 以 铺 满 皿 底 高 1.5~2mm 为 宜 ), 迅 速 轻 轻 摇 动 平 皿, 使 菌 液 与 培 养 基 充 分 混 匀, 但 不 沾 湿 皿 的 边 缘, 待 琼 脂 凝 固 即 成 细 菌 平 板 倒 平 板 时 要 注 意 无 菌 操 作, 见 图 3-2

9 图 3 2 倒 平 板 的 方 法 (2) 放 线 菌 : 取 两 管 稀 释 液, 在 每 管 中 加 入 10% 酚 液 5~6 滴, 摇 匀, 静 置 片 刻, 然 后 分 别 从 两 管 中 吸 出 1mL 加 入 相 应 标 号 的 平 皿 中, 选 用 高 氏 1 号 培 养 基, 用 与 细 菌 相 同 的 方 法 倒 入 平 皿 中, 便 可 制 成 放 线 菌 平 板 (3) 霉 菌 : 取 两 管 稀 释 各 1mL, 分 别 接 入 相 应 标 号 的 平 皿 中, 每 个 稀 释 度 接 两 个 平 皿 在 融 化 的 土 豆 蔗 糖 培 养 基 中, 每 100mL 加 入 灭 菌 的 乳 酸 1mL, 轻 轻 摇 匀, 然 后 用 与 细 菌 相 同 的 方 法 倒 入 平 皿 中, 便 可 制 成 霉 菌 的 平 板 4. 培 养 将 接 种 好 的 细 菌 放 线 菌 霉 菌 平 板 倒 置, 即 皿 盖 朝 下 放 置, 于 28~30 中 恒 温 培 养, 细 菌 培 养 1~2d, 放 线 菌 培 养 5~7d, 霉 菌 培 养 3~5d 观 察 生 长 的 菌 落, 用 于 进 一 步 纯 化 分 离 或 直 接 转 接 斜 面 ( 二 ) 平 板 制 作 及 划 线 分 离 方 法 1. 倒 平 板 按 无 菌 操 作 要 求, 在 火 焰 旁 操 作 ( 图 3 2), 做 法 如 3(1) 2. 划 线 分 离 使 用 接 种 环, 从 待 纯 化 的 菌 落 或 待 分 离 的 斜 面 菌 种 只 沾 取 少 量 菌 样, 在 相 应 培 养 基 平 板 中 划 线 分 离, 划 线 的 方 法 多 样, 目 的 是 获 得 单 个 菌 落, 主 要 方 法 参 见 图 3 3 图 3 3 平 板 划 线 方 法 示 意 图 A. 划 线 分 离 操 作 ; B. 用 于 稀 释 液 中, 可 连 接 划 线 ; C. 用 于 较 浓 的 菌 样, 分 数 次 划 线, 每 次 划 线 后 要 烧 接 种 环, 然 后 再 划 下 一 区 3. 培 养 方 法 同 土 壤 稀 释 分 离 ( 三 ) 斜 面 接 种 和 穿 刺 接 种 1. 斜 面 接 种 (1) 取 新 鲜 固 体 斜 面 培 养 基, 分 别 做 好 标 记 ( 写 上 菌 名 接 种 日 期 接 种 人 等 ), 然 后 用 无 菌 操 作 方 法, 把 待 接 菌 种 接 入 以 上 新 鲜 培 养 基 斜 面 上 (2) 接 种 的 方 法 是, 用 接 种 环 沾 取 少 量 待 接 菌 种, 然 后 在 新 鲜 斜 面 上 之 字 形 划 线, 方 向 是 从 下 部 开 始, 一 直 划 至 上 部 ( 图 3 4A) 注 意 划 线 要 轻, 不 可 把 培 养 基 划 破 图 3 4 斜 面 接 种 (A) 及 穿 刺 接 种 (B) 示 意 图 (3) 接 种 后 30 恒 温 培 养, 细 菌 培 养 48h, 放 线 菌 霉 菌 培 养 至 孢 子 成 熟 方 可 取 出 保 存

10 2. 穿 刺 接 种 (1) 取 两 支 新 鲜 半 固 体 牛 肉 膏 蛋 白 胨 柱 状 培 养 基, 做 好 标 记 ( 写 上 菌 名 ) 接 种 日 期, 接 种 人 等 ) (2) 接 种 的 方 法 是, 用 接 种 针 沾 取 少 量 待 接 菌 种, 然 后 从 柱 状 培 养 基 的 中 心 穿 入 其 底 部 ( 但 不 要 穿 透 ), 然 后 沿 原 刺 入 路 线 抽 出 接 种 针, 注 意 接 种 针 不 要 移 动 (3) 接 种 后 30 恒 温 培 养, 24h 后 观 察, 比 较 两 种 菌 的 生 长 结 果 四 注 意 事 项 1. 一 般 土 壤 中, 细 菌 最 多, 放 线 菌 及 霉 菌 次 之, 而 酵 母 菌 主 要 见 于 果 园 及 菜 园 土 壤 中, 故 从 土 壤 中 分 离 细 菌 时, 要 取 较 高 的 稀 释 度, 否 则 菌 落 连 成 一 片 不 能 计 数 2. 在 土 壤 稀 释 分 离 操 作 中, 每 稀 释 10 倍, 最 好 更 换 一 次 移 液 管, 使 计 数 准 确 3. 放 线 菌 的 培 养 时 间 较 长, 故 制 平 板 的 培 养 基 用 量 可 适 当 增 多 五 实 验 报 告 1. 记 录 土 壤 稀 释 分 离 结 果, 并 计 算 出 每 克 土 壤 中 的 细 菌 放 线 菌 和 霉 菌 的 数 量 计 算 方 法 : 选 择 长 出 菌 落 数 30~300 之 间 的 培 养 皿 进 行 计 数, 按 以 下 公 式 : 总 菌 数 /g= 同 一 稀 释 度 几 次 重 复 的 菌 落 平 均 数 稀 释 倍 数 2. 分 别 记 录 平 板 划 线 斜 面 接 种 的 结 果, 并 自 我 评 价 3. 比 较 两 种 细 菌 穿 刺 接 种 的 结 果, 并 进 行 分 析 七 问 题 和 思 考 1. 在 测 定 土 壤 微 生 物 含 量 中, 除 混 菌 法 外 还 可 用 什 么 方 法? 2. 试 设 计 实 验, 从 土 壤 中 分 离 出 酵 母 菌, 并 进 行 计 数 实 验 4 微 生 物 菌 落 的 观 察 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 识 别 细 菌 酵 母 菌 放 线 菌 和 霉 菌 四 大 类 微 生 物 的 菌 落 特 征 内 容 : 1. 观 察 已 知 菌 的 菌 落 的 形 态 大 小 色 泽 透 明 度 致 密 度 和 边 缘 等 特 征 2. 根 据 菌 落 的 形 态 特 征 判 断 未 知 菌 的 类 别 二 实 验 材 料 和 用 具 大 肠 杆 菌 (E.coli) 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus) 枯 草 芽 孢 杆 菌 (Bacillus subtilis) 酿 酒 酵 母 (Saccharomyces cerevisiae) 粘 红 酵 母 (Rhodotorula gracitis) 热 带 假 丝 酵 母 (Candida tropicalis) 细 黄 链 霉 菌 (Streptomyces microflavus, 又 称 5406 抗 生 菌 ) 灰 色 链 霉 菌 (Streptomyces griseus ) 黑 曲 霉 (Aspergillus niger ) 产 黄 青 霉 (Penicillium chrysogenum) 球 孢 白 伍 菌 (Beauveria bassiana) 等 细 菌 的 斜 面 菌 种 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 马 铃 薯 培 养 基 高 氏 1 号 培 养 基 无 菌 水 接 种 环 接 种 针 酒 精 灯 无 菌 培 养 皿 多 套 电 热 恒 温 箱 三 操 作 步 骤 ( 一 ) 制 备 已 知 菌 的 单 菌 落 1. 制 备 平 板 将 已 融 化 的 无 菌 培 养 基 待 冷 却 至 50 左 右, 分 别 制 备 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 平 板 马 铃 薯 蔗 糖 培 养 基 平 板 和 高 氏 1 号 培 养 基 平 板 各 一 皿 2. 制 备 菌 悬 液 或 孢 子 悬 液 在 培 养 好 的 斜 面 菌 种 管 内 加 入 5mL 无 菌 水, 制 成 菌 悬 液 后 备 用 3. 制 备 单 菌 落 通 过 平 板 划 线 法 获 得 细 菌 酵 母 菌 和 放 线 菌 的 单 菌 落 用 三 点 接 种 法 获 得 霉 菌 的 单 菌 落 细 菌 于 37 恒 温 培 养 24~48h, 酵 母 菌 于 28 培 养 2~3d, 霉 菌 和 放 线 菌 置 28 培 养 5~7d, 待 长 成 菌 落 后, 仔 细 观 察 四 大 类 微 生 物 菌 落 的 形 态 特 征, 并 将 观 察 结 果 记 录 于 表 4-1 中 ( 二 ) 制 备 未 知 菌 落 l. 倒 平 板 2. 接 种 可 用 弹 土 法 接 种, 其 要 点 为 : 采 集 校 园 土 壤, 待 风 干 磨 碎 后, 可 将 细 土 撒 在 无 菌 的 硬 板 纸 表 面, 先 弹 去 纸 面 浮 土, 然 后 打 开 皿 盖, 便 含 土 的 纸 面 对 着 平 板 培 养 基 的 表

11 面, 用 手 指 在 硬 板 纸 背 面 轻 轻 一 弹 即 可 接 种 上 各 种 微 生 物 3. 培 养 将 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 平 板 倒 置 于 37 培 养 箱 中 恒 温 培 养 2~3d, 将 马 铃 薯 蔗 糖 培 养 基 倒 置 于 28 培 养 箱 中 恒 温 培 养 3~5d, 即 可 获 得 未 知 菌 的 单 菌 落 4. 编 号 从 培 养 好 的 未 知 平 板 中, 挑 选 8 个 不 同 的 单 菌 落, 逐 个 编 号, 根 据 菌 落 识 别 要 点 区 分 未 知 菌 落 类 群, 并 将 判 断 结 果 填 入 表 4~2 中 ( 三 ) 直 接 观 察 菌 落 直 接 用 实 验 3 中 的 土 壤 稀 释 分 离 获 得 的 单 菌 落 进 行 观 察 识 别, 并 将 结 果 填 入 表 4-2 中 四 注 意 事 项 观 察 菌 落 特 点 时, 要 选 择 分 离 得 很 开 的 单 个 较 大 菌 落 ; 已 知 菌 落 和 未 知 菌 落 要 编 好 号, 请 勿 随 意 移 动 开 盖, 以 免 搞 混 菌 号 五 实 验 报 告 1. 已 知 菌 落 的 形 态 特 征 记 录 于 表 4~1 中 2. 将 未 知 菌 落 的 辨 别 结 果 记 录 于 表 4~2 中 七 问 题 和 思 考 1. 试 比 较 细 菌 放 线 菌 酵 母 菌 和 霉 菌 菌 落 形 态 的 差 异? 2. 设 计 一 个 实 验, 检 测 实 验 室 空 气 环 境 中 的 微 生 物 类 别? 表 4 1 已 知 菌 菌 落 的 形 态 微 类 生 物 数 细 菌 酵 母 菌 放 线 菌 霉 菌 菌 名 大 肠 杆 菌 金 黄 色 葡 萄 球 菌 枯 草 杆 菌 酿 酒 酵 母 粘 红 酵 母 热 带 假 丝 酵 母 细 黄 链 霉 菌 灰 色 链 霉 菌 产 黄 青 霉 黑 曲 霉 球 孢 白 僵 菌 辩 别 要 点 菌 落 描 述 湿 干 表 边 隆 起 颜 色 厚 大 松 大 面 缘 形 状 正 反 水 溶 薄 小 密 小 面 面 性 色 素 表 4 2 未 知 菌 菌 落 的 形 态 透 明 度

12 菌 湿 干 菌 落 描 述 判 断 结 落 厚 大 松 大 表 边 隆 起 颜 色 果 号 薄 小 密 小 面 缘 形 状 正 反 水 溶 透 1 2 面 面 性 色 明 素 度 注 : 四 大 类 微 生 物 菌 落 的 识 别 要 点 如 下 : 湿 润 : 正 反 面 颜 色 一 致 小 大 大 而 扁 平 小 而 扁 平 大 而 扁 平 大 而 隆 起 酵 母 菌 细 菌 菌 落 干 燥, 正 反 面, 中 央 与 边 缘 颜 色 不 一 致 小 大 小 而 致 密 大 而 致 密 大 而 疏 松 霉 菌

13 实 验 5 显 微 镜 油 浸 系 物 镜 的 使 用 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 复 习 显 微 镜 低 倍 镜 和 高 倍 镜 的 使 用 技 术, 了 解 油 浸 系 物 镜 的 基 本 原 理, 掌 握 油 浸 系 物 镜 的 使 用 方 法 内 容 :1. 学 习 油 浸 系 物 镜 的 使 用 方 法 2. 用 油 镜 观 察 枯 草 芽 孢 杆 菌 和 金 黄 色 葡 萄 球 菌 染 色 装 片 二 实 验 材 料 和 用 具 枯 草 芽 孢 杆 菌 (Bacillus subitilis) 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus) 的 染 色 装 片 香 柏 油 二 甲 苯 显 微 镜 擦 镜 纸 三 操 作 步 骤 ( 一 ) 观 察 前 的 准 备 1. 将 显 微 镜 置 于 平 稳 的 实 验 台 上, 镜 座 距 实 验 台 边 沿 约 为 4cm 坐 正, 练 习 用 左 眼 观 察 2. 调 节 光 源 : 将 低 倍 物 镜 转 到 工 作 位 置, 把 光 圈 完 全 打 开, 聚 光 器 升 至 与 载 物 台 相 距 约 1mm 左 右 转 动 反 光 镜 采 集 光 源, 光 线 较 强 的 天 然 光 源 宜 用 平 面 镜, 光 线 较 弱 的 天 然 光 源 或 人 工 光 源 宜 用 凹 面 镜, 对 光 至 视 野 内 均 匀 明 亮 为 止 观 察 染 色 装 片 时, 光 线 宜 强 ; 观 察 末 染 色 装 片 时, 光 线 不 宜 太 强 ( 二 ) 低 倍 镜 观 察 染 色 装 片 首 先 上 升 镜 简, 将 枯 草 芽 孢 杆 菌 染 色 装 片 置 于 载 物 台 上, 用 标 本 夹 夹 住, 将 观 察 位 置 移 至 物 镜 正 下 方, 物 镜 降 至 距 装 片 0.5cm 处, 适 当 缩 小 光 圈 然 后 两 眼 从 目 镜 观 察, 转 动 粗 调 节 器 使 物 镜 逐 渐 上 升 ( 或 使 镜 台 下 降 ) 至 发 现 物 像 时, 改 用 细 调 节 器 调 节 到 物 像 清 楚 为 止 移 动 装 片, 把 合 适 的 观 察 部 位 移 至 视 野 中 心 ( 三 ) 高 倍 镜 观 察 眼 睛 离 开 目 镜 从 侧 面 观 察, 旋 转 转 换 器, 将 高 倍 镜 转 至 正 下 方, 注 意 避 免 镜 头 与 玻 片 相 懂 再 由 目 镜 观 察, 仔 细 调 节 光 圈, 使 光 线 的 明 亮 度 适 宜 用 细 调 节 器 校 正 焦 距 使 物 镜 清 晰 为 止 将 最 适 宜 观 察 部 位 移 至 视 野 中 心, 绘 图 不 要 移 动 装 片 位 置, 准 备 用 油 镜 观 察 ( 四 ) 油 镜 观 察 1. 提 起 镜 筒 约 2cm, 将 油 镜 转 至 正 下 方 在 玻 片 标 本 的 镜 检 部 位 ( 镜 头 的 正 下 方 ) 滴 一 滴 香 柏 油 2. 从 侧 面 注 视, 小 心 慢 慢 降 下 镜 筒, 使 油 镜 浸 在 油 中 至 油 圈 不 扩 大 为 止, 镜 头 几 乎 与 装 片 接 触, 但 不 可 压 及 装 片, 以 免 压 碎 玻 片, 损 坏 镜 头 3. 将 光 线 调 亮, 左 眼 从 目 镜 观 察, 用 粗 调 节 器 将 镜 筒 徐 徐 上 升 ( 切 忌 反 方 向 旋 转 ), 当 视 野 中 有 物 像 出 现 时, 再 用 细 调 节 器 校 正 焦 距 如 因 镜 头 下 降 未 到 位 或 镜 头 上 升 太 快 末 找 到 物 像, 必 须 再 从 侧 面 观 察, 将 油 镜 降 下, 重 复 操 作 直 至 物 像 看 清 为 止 仔 细 观 察 并 绘 图 4. 再 次 观 察 提 起 镜 筒, 换 上 金 黄 色 葡 萄 球 菌 染 色 装 片, 依 次 用 低 倍 镜 高 倍 镜 和 油 镜 观 察, 绘 图 重 复 观 察 时 可 比 第 一 次 少 加 香 柏 油 ( 五 ) 镜 检 完 毕 后 的 工 作 1. 移 开 物 镜 镜 头 2. 取 出 装 片 3. 清 洁 油 镜, 油 镜 使 用 完 毕 后, 须 用 擦 镜 纸 擦 去 镜 头 上 的 香 柏 油, 再 用 擦 镜 纸 沾 少 许 二 甲 苯 擦 掉 残 留 的 香 柏 油, 最 后 再 用 干 净 的 擦 镜 纸 擦 干 残 留 的 二 甲 苯 4. 擦 净 显 微 镜, 将 各 部 分 还 原 将 接 物 镜 呈 八 字 形 降 下, 不 可 使 其 正 对 聚 光 器, 同 时 降 下 聚 光 器, 转 动 反 光 镜 使 其 镜 面 垂 直 于 镜 座 最 后 套 上 镜 罩, 对 号 放 入 镜 箱 中, 置 阴 凉 干 燥 处 存 放 四 注 意 事 项 1. 使 用 油 镜 必 须 按 先 用 低 倍 镜 和 高 倍 镜 观 察, 再 用 油 镜 观 察 2. 下 降 镜 头 时, 一 定 要 从 侧 面 注 视, 切 忌 用 眼 睛 对 着 目 镜, 边 观 察 边 下 降 镜 头 的 错 误 操 作, 以 免 压 碎 玻 片 而 损 坏 镜 头 3. 使 用 二 甲 苯 擦 镜 头 时, 注 意 二 甲 苯 不 能 过 多, 以 防 溶 解 固 定 透 镜 的 树 脂

14 4. 注 意 保 持 显 微 镜 的 洁 净, 对 金 属 部 分 要 用 软 布 擦 拭, 擦 镜 头 必 须 用 擦 镜 纸, 切 勿 用 手 或 用 普 通 布 纸 等, 以 免 损 坏 镜 头 五 实 验 报 告 分 别 绘 出 在 高 倍 镜 和 油 镜 下 观 察 到 的 枯 草 芽 孢 杆 菌 及 金 黄 色 葡 萄 球 菌 的 形 态, 注 明 物 镜 放 大 倍 数 和 总 放 大 率 六 问 题 和 思 考 1. 用 油 镜 便 于 观 察 细 菌 的 依 据 是 什 么? 2. 使 用 油 镜 应 特 别 注 意 哪 些 问 题? 3. 当 物 镜 从 低 倍 镜 转 到 高 倍 镜 和 油 镜 时, 对 照 明 度 有 何 要 求? 应 如 何 调 节? 油 镜 的 基 本 原 理 ( 一 ) 油 镜 头 的 辨 认 油 镜 头 上 常 刻 有 OI(oil immersion) 或 HI(homogeneneous immersion) 字 样, 有 的 还 刻 有 一 圈 红 线 或 黑 线 标 记, 在 低 倍 物 镜 高 倍 物 镜 和 油 镜 3 物 镜 中, 油 镜 的 放 大 倍 数 和 数 值 孔 径 (numerical aperture) 最 大, 而 工 作 距 离 最 短 ( 图 5 1) 图 5 1 显 微 镜 物 镜 参 数 示 意 图 ( 二 ) 显 微 镜 的 分 辨 率 显 微 镜 性 能 的 优 劣 不 单 是 看 它 的 总 放 大 倍 数, 更 重 要 的 是 看 它 分 辩 率 的 大 小 分 辨 率 是 指 显 微 镜 能 分 辨 出 物 体 两 点 间 最 小 距 离 (D) 的 能 力 D 值 愈 小 表 明 分 辨 率 愈 高 D 值 与 光 线 的 波 长 (λ) 成 正 比, 与 物 镜 的 数 值 孔 径 (NA) 成 反 比 λ D = 2 NA 从 上 式 可 看 出, 缩 短 光 波 长 和 增 大 数 值 孔 径 都 可 提 高 分 辨 率 数 值 孔 径 指 光 线 投 射 到 物 镜 上 的 最 大 角 度 ( 称 镜 口 角,α) 的 一 半 正 弦 与 介 质 折 射 率 (n) 的 乘 积 ; NA = n sin α 2 影 响 数 值 孔 径 大 小 的 因 数, 一 是 镜 口 角, 二 是 介 质 的 折 射 率 当 镜 与 装 片 之 间 的 介 质 为 空 气 时, 由 于 空 气 (n= 1.52) 的 折 射 率 不 同, 光 线 会 发 生 折 射, 不 仅 使 进 入 物 镜 的 光 线 减 少, 降 低 了 视 野 的 照 明 度, 而 且 会 减 少 镜 口 角 ( 图 5 2A) 当 以 香 柏 油 (n=1.515) 为 介 质 时, 由 于 它 的 折 射 率 与 玻 璃 相 近, 光 线 经 过 载 玻 片 后 可 直 接 通 过 香 柏 油 进 入 物 镜 而 不 发 生 折 射 ( 图 5 2B), 不 仅 增 加 了 视 野 的 照 明 度, 更 重 要 的 是 通 过 增 加 数 值 孔 径 达 到 提 高 分 辨 率 的 目 的 可 见 光 的 波 长 平 均 为 0.55μm 当 使 用 数 值 孔 径 为 0.65 的 高 倍 镜 时, 它 能 辨 别 两 点 之 间 的 距 离 为 0.42μm; 而 使 用 数 值 孔 径 为 1.25 的 油 镜 时, 能 辨 别 两 点 之 间 的 距 离 则 为 0.22μm

15 图 5 2 介 质 为 空 气 (A) 与 介 质 为 香 柏 油 (B) 时 光 线 通 过 的 比 较 实 验 6 细 菌 形 态 的 观 察 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 巩 固 油 镜 的 使 用 ; 掌 握 细 菌 形 态 观 察 的 基 本 方 法, 了 解 细 菌 的 基 本 形 态 内 容 :1. 观 察 细 菌 的 基 本 形 态 染 色 装 片 2. 观 察 枯 草 芽 孢 杆 菌 活 菌 3. 观 察 细 菌 细 胞 结 构 的 染 色 装 片 二 实 验 材 料 和 用 具 溶 血 链 球 菌 (Streptococcus haemolyticus ) 棒 杆 菌 (Corymebacterium) 螺 菌 (Spirillum) 浮 游 球 衣 菌 (Sphaerotilus natans) 巨 大 芽 孢 杆 菌 (Bacillus megaterium ) 苏 云 金 芽 孢 杆 菌 (Bacillus thuringiensis ) 普 通 变 形 菌 (Proteus vulgaris) 丙 酮 丁 醇 梭 菌 (Clostridum acetotylicum) 褐 球 固 氮 菌 (Azotobacter chroococcum ) 等 细 菌 的 染 色 装 片, 枯 草 芽 泡 杆 菌 (Bacillus subis) 的 斜 面 菌 种 香 柏 油 二 甲 苯 无 菌 水 ; 显 微 镜 擦 镜 纸 接 种 环 酒 精 灯 载 玻 片 盖 玻 片 吸 水 纸 小 滴 管 三 操 作 步 骤 ( 一 ) 观 察 细 菌 的 基 本 形 态 用 低 倍 镜 高 倍 镜 和 油 镜 观 察 溶 血 链 球 菌 棒 杆 菌 螺 菌 浮 游 球 衣 菌 的 染 色 装 片, 并 分 别 在 油 镜 下 绘 图 ( 二 ) 观 察 细 菌 的 细 胞 结 构 用 低 倍 镜 高 倍 镜 和 油 镜 观 察 巨 大 芽 孢 杆 菌 ( 示 细 胞 壁 ) 巨 大 芽 孢 杆 菌 ( 示 异 染 粒 ) 苏 云 金 芽 孢 杆 菌 ( 示 伴 胞 晶 体 ) 普 通 变 形 菌 ( 示 鞭 毛 ) 丙 酮 丁 醇 梭 菌 ( 示 芽 孢 ) 褐 球 固 氮 菌 ( 示 荚 膜 ) 等 细 菌 的 染 色 装 片, 并 分 别 在 油 镜 下 绘 图 ( 三 ) 观 察 枯 草 杆 菌 活 菌, 常 用 压 滴 法 观 察 1. 将 洁 净 无 油 腻 的 载 片 放 于 自 己 右 边 前 方, 在 中 央 放 一 小 滴 无 菌 水 2. 将 酒 精 灯 放 于 自 己 正 前 方, 点 燃 3. 用 无 菌 操 作 方 法 从 枯 草 芽 孢 杆 菌 斜 面 中 沾 取 少 量 菌 体, 与 载 片 上 的 水 滴 充 分 混 匀, 把 接 种 环 上 残 留 的 菌 体 杀 灭 后, 放 回 试 管 架 4. 用 镊 子 夹 一 洁 净 的 盖 玻 片, 使 其 一 边 先 接 触 菌 液, 然 后 将 整 个 盖 玻 片 慢 慢 放 下, 注 意 不 要 产 生 气 泡 如 菌 液 过 多, 可 用 吸 水 纸 适 当 吸 去 一 部 分 5. 先 用 低 倍 镜 然 后 转 用 高 倍 镜 观 察, 观 察 时 光 线 要 适 当 调 暗 些 四 注 意 事 项 1. 注 意 擦 镜 头 时, 只 能 用 擦 镜 纸

16 2, 观 察 完 毕, 必 须 将 镜 筒 上 升, 才 能 取 下 装 片, 放 入 另 一 装 片 后, 要 按 使 用 油 镜 要 求, 重 新 操 作, 不 能 在 油 镜 下 直 接 取 下 和 替 换 装 片, 切 记! 3. 无 菌 操 作 过 程 中, 接 种 环 灭 菌 后 不 能 触 及 其 他 物 品, 挑 菌 不 能 过 多 五 实 验 报 告 ( 一 ) 绘 图 l. 给 出 你 所 观 察 到 的 几 种 细 菌 的 个 体 形 态 视 野 图 2. 给 出 你 所 观 察 到 的 细 菌 细 胞 结 构 视 野 图, 并 注 明 各 部 分 ( 二 ) 试 指 出 在 制 备 活 菌 装 片 时, 应 注 意 什 么 问 题? 七 问 题 和 思 考 1. 用 明 视 野 显 微 镜 观 察 细 菌 的 形 态 时, 你 认 为 用 染 色 装 片 好, 还 是 用 非 染 色 的 活 体 装 片 好, 为 什 么? 观 察 活 体 装 片 与 染 色 装 片, 光 线 调 节 各 有 什 么 不 同? 2. 无 菌 操 作 过 程 中, 可 否 将 棉 塞 放 在 桌 面 上? 为 什 么? 3 试 设 计 一 个 准 备 本 实 验 的 工 作 方 案 实 验 7 细 菌 单 染 色 法 及 口 腔 微 生 物 的 观 察 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 巩 固 无 菌 操 作 技 术, 掌 握 细 菌 的 涂 片 和 单 染 色 技 术, 了 解 口 腔 中 的 微 生 物 及 其 观 察 方 法 内 容 :1. 学 习 细 菌 单 染 色 操 作 技 术 2. 用 单 染 色 法 或 负 染 色 法 观 察 口 腔 中 的 微 生 物 二 实 验 材 料 和 用 具 大 肠 杆 菌 (E.coli) 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (Staphylocosccus aureus) 的 斜 面 菌 种 吕 氏 美 蓝 染 色 液 石 炭 酸 复 红 染 色 液 黑 色 素 液 或 碳 素 墨 水 香 柏 油 二 甲 苯 无 菌 水 ; 显 微 镜 擦 镜 纸 接 种 环 酒 精 灯 载 玻 片 吸 水 纸 无 菌 牙 签 三 操 作 步 骤 ( 一 ) 单 染 色 法 1. 涂 片 在 洁 净 无 脂 的 载 玻 片 中 央 滴 一 小 滴 无 菌 水, 用 无 菌 操 作 方 法 从 菌 种 斜 面 挑 取 少 量 菌 体 与 水 滴 充 分 混 匀, 涂 成 薄 膜, 涂 布 面 积 约 1~1.5cm 2 ( 图 7 1A B) 2. 干 燥 将 涂 片 于 室 温 中 自 然 干 燥 3. 固 定 手 扶 载 片 一 端, 使 涂 菌 的 一 面 向 上, 将 载 片 通 过 微 火 2~3 次 在 火 上 固 定 时, 用 手 摸 涂 片 反 面, 以 不 烫 手 为 宜 不 能 将 载 片 在 火 上 烤, 否 则 细 菌 形 态 毁 坏 ( 图 7 1C) 4. 染 色 将 涂 片 置 于 水 平 位 置, 滴 加 染 色 液 覆 盖 于 涂 菌 处, 染 色 约 2min( 图 7 1D) 5. 水 洗 倾 去 染 色 液, 斜 置 载 片, 用 自 来 水 的 细 水 流 由 载 片 上 端 流 下, 不 得 直 接 冲 在 涂 菌 处, 直 洗 至 从 载 片 上 流 下 的 水 中 无 染 色 液 的 颜 色 为 止 ( 图 7 1E) 6. 干 燥 自 然 晾 干 或 用 吸 水 纸 轻 轻 地 吸 干, 注 意 不 要 擦 掉 菌 体 ( 图 7 1F) 7. 待 标 本 完 全 干 燥 后, 先 用 低 倍 镜 和 高 倍 镜 观 察, 将 典 型 部 位 移 至 视 野 中 央, 再 用 油 镜 观 察

17 图 7 1 单 染 色 的 方 法 ( 二 ) 口 腔 微 生 物 的 观 察 1. 单 染 色 法 (1) 在 洁 净 无 油 腻 的 载 片 中 央 滴 一 小 滴 无 菌 水, 用 牙 签 取 牙 垢 少 许 与 水 滴 充 分 混 匀, 涂 成 薄 膜 (2) 将 涂 片 于 室 温 中 自 然 干 燥 后, 按 上 面 单 染 色 法 的 步 骤, 进 行 固 定 染 色 水 洗, 干 燥 后 镜 检 2. 负 染 色 法 (1) 在 洁 净 无 油 腻 的 载 片 的 一 端 滴 一 小 滴 无 菌 水, 用 牙 签 取 牙 垢 少 许 与 水 滴 充 分 混 匀, 然 后 加 少 许 黑 色 素 溶 液, 充 分 混 匀 (2) 另 取 一 载 片 将 其 边 缘 放 在 含 菌 载 片 的 一 端, 然 后 推 向 另 一 端, 则 含 菌 载 片 上 的 混 合 液 被 推 成 薄 膜 (3) 于 室 温 中 自 然 干 燥 (4) 镜 检 : 将 光 线 调 亮, 先 用 低 倍 镜 观 察, 再 用 高 倍 镜 观 察 四 注 意 事 项 载 玻 片 要 洁 净 无 脂, 否 则 菌 液 涂 不 开 涂 片 时, 滴 水 不 要 过 多, 挑 菌 量 宜 少, 菌 膜 宜 薄 五 实 验 报 告 ( 一 ) 绘 图 1. 单 染 色 后 观 察 到 的 大 肠 杆 菌 和 金 黄 色 葡 萄 球 菌 的 形 态 图 2. 你 所 观 察 到 的 口 腔 微 生 物 的 形 态 图, 并 注 明 使 用 的 染 色 方 法, 菌 体 和 背 景 的 颜 色 ( 二 ) 单 染 色 法 和 负 染 色 法 操 作 要 点 七 问 题 和 思 考 1. 涂 片 在 染 色 前 为 什 么 要 先 进 行 固 定? 固 定 时 应 注 意 什 么 问 题? 2. 制 备 染 色 装 片 时 应 注 意 哪 些 事 项, 为 什 么? 制 片 为 什 么 要 完 全 干 燥 后 才 能 用 油 镜 观 察? 3. 你 知 道 口 腔 中 通 常 存 在 哪 些 微 生 物 吗? 如 何 进 行 区 分? 实 验 8 细 菌 的 革 兰 氏 染 色 目 的 : 初 步 掌 握 细 菌 涂 片 方 法 及 革 兰 氏 染 色 法 步 骤 内 容 :1. 制 作 细 菌 染 色 装 片 2. 进 行 革 兰 氏 染 色 法 操 作 二 实 验 材 料 和 用 具 苏 云 金 杆 菌 或 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus) 大 肠 杆 菌 (E.coli) 菌 液, 待 测 菌 菌 液 1~2 种 革 兰 氏 染 色 液 ( 结 晶 紫 染 液 卢 戈 氏 碘 液 95% 乙 醇 石 炭 酸 复 红 液 等 ) 香 柏 油 二 甲 苯 ; 显 微 镜 擦 镜 纸 接 种 环 载 玻 片 吸 水 纸 试 管 小 滴 管 酒 精 灯 三 操 作 步 骤 ( 一 ) 制 片 1. 涂 菌 用 无 菌 操 作 方 法 从 试 管 中 沾 取 菌 液 一 环, 用 接 种 环 在 洁 净 无 脂 的 载 玻 片 上 做 一 薄 而 均 匀 直 径 约 lcm 的 菌 膜 涂 菌 后 将 接 种 环 火 焰 灭 菌 2. 干 燥 于 空 气 中 自 然 干 燥 亦 可 把 玻 片 置 于 火 焰 上 部 略 加 温 加 速 干 燥 ( 温 度 不 宜 过 高 ) 3. 固 定 目 的 是 杀 死 细 菌 并 使 细 菌 粘 附 在 玻 片 上, 便 于 染 料 着 色, 常 用 加 热 法, 即 将 细 菌 涂 片 膜 向 上, 通 过 火 焰 3 次, 以 热 而 不 烫 为 宜, 防 止 菌 体 烧 焦 变 形 此 制 片 可 用 于 染 色 ( 二 ) 染 色

18 l. 初 染 于 制 片 上 滴 加 结 晶 紫 染 液, 染 lmin 后, 用 水 洗 去 剩 余 染 料 2. 媒 染 滴 加 卢 戈 氏 碘 液,lmin 后 水 洗 3. 脱 色 滴 加 95% 乙 醇 脱 色, 摇 动 玻 片 至 紫 色 不 再 为 乙 醇 脱 退 为 止 ( 根 据 涂 片 之 厚 薄 需 时 30s 至 lmin), 水 洗 4. 复 染 滴 加 石 炭 酸 复 红 液 复 染 lmin, 水 洗 5. 滤 纸 吸 干, 油 镜 镜 检 ( 三 ) 结 果 革 兰 氏 阳 性 菌 染 成 蓝 紫 色, 革 兰 氏 阴 性 菌 染 成 淡 红 色 ( 四 ) 检 测 未 知 菌 用 以 上 方 法 对 未 知 菌 进 行 革 兰 氏 染 色, 并 绘 图 记 录 染 色 结 果 四 注 意 事 项 1. 涂 片 务 求 均 匀, 切 忌 过 厚 2. 在 染 色 过 程 中, 不 可 使 染 液 干 涸 3. 脱 色 时 间 十 分 重 要, 过 长, 则 脱 色 过 度, 会 使 阳 性 菌 被 染 成 阴 性 菌 ; 脱 色 不 够, 则 会 使 阴 性 菌 被 染 成 阳 性 菌 4. 老 龄 菌 因 体 内 核 酸 减 少, 会 便 阳 性 菌 被 染 成 阴 性 菌, 故 不 能 选 用 五 实 验 报 吉 ( 一 ) 绘 图 1. 大 肠 杆 菌 革 兰 氏 染 色 视 野 图 2. 金 黄 色 葡 萄 球 菌 或 苏 云 金 杆 菌 革 兰 氏 染 色 视 野 图 ( 二 ) 记 录 革 兰 氏 染 色 法 法 步 骤, 并 进 行 结 果 分 析 ( 三 ) 未 知 菌 的 检 测 结 果 六 问 题 和 思 考 1. 涂 片 后 为 什 么 要 进 行 固 定? 固 定 时 应 注 意 什 么? 2. 什 么 是 革 兰 氏 染 色 法? 染 色 过 程 应 注 意 什 么? 3. 试 分 析 革 兰 氏 染 色 法 在 细 菌 分 类 中 的 意 义 实 验 9 细 菌 鞭 毛 染 色 及 其 运 动 的 观 察 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 了 解 细 菌 鞭 毛 染 色 的 原 理, 掌 握 鞭 毛 染 色 法 ; 学 习 观 察 细 菌 运 动 的 方 法 内 容 :1. 细 菌 的 鞭 毛 染 色 法 2. 用 压 滴 法 观 察 细 菌 的 运 动 3. 用 悬 滴 法 观 察 细 菌 的 运 动 二 实 验 材 料 和 用 具 普 通 变 形 菌 (Proteus vulgaris) 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus) 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 斜 面 鞭 毛 染 色 液 0.01% 美 蓝 水 溶 液 香 柏 油 二 甲 苯 无 菌 水 凡 士 林 ; 显 微 镜 擦 镜 纸 接 种 环 酒 精 灯 载 玻 片 凹 载 玻 片 盖 玻 片 镊 子 细 玻 棒 吸 水 纸 三 操 作 步 骤 ( 一 ) 细 菌 鞭 毛 染 色 1. 活 化 菌 种 将 保 存 的 变 形 菌 在 新 制 备 的 普 通 牛 肉 膏 蛋 白 胨 斜 面 培 养 基 上 连 续 移 种 2~3 次, 每 次 于 30 培 养 10~15h 活 化 后 菌 种 备 用 2. 制 片 在 干 净 载 玻 片 的 一 端 滴 一 滴 蒸 馏 水, 用 无 菌 操 作 法, 以 接 种 环 从 活 化 菌 种 中 取 少 许 菌 苔 ( 注 意 不 要 带 培 养 基 ), 在 载 玻 片 的 水 滴 中 轻 沾 几 下 将 载 玻 片 稍 倾 斜, 使 菌 液 随 水 滴 缓 缓 流 到 另 一 端, 然 后 平 放, 于 空 气 中 干 燥 3. 染 色 (1) 滴 加 鞭 毛 染 色 液 A 液, 染 3~5min (2) 用 蒸 馏 水 充 分 洗 净 A 液, 使 背 景 清 洁 (3) 将 残 水 沥 干 或 用 B 液 冲 去 残 水

19 (4) 滴 加 B 液, 在 微 火 上 加 热 使 微 冒 蒸 汽, 并 随 时 补 充 染 料 以 免 干 涸, 染 30~60S (5) 待 冷 却 后, 用 蒸 馏 水 轻 轻 冲 洗 干 净, 自 然 干 燥 或 滤 纸 吸 干 4. 镜 检 先 用 低 倍 镜 和 高 倍 镜 找 到 典 型 区 域, 然 后 用 油 镜 观 察 菌 体 为 深 褐 色, 鞭 毛 为 褐 色 注 意 观 察 鞭 毛 着 生 位 置 ( 镜 检 时 应 多 找 几 个 视 野, 有 时 只 在 部 分 涂 片 上 染 出 鞭 毛 ) ( 二 ) 细 菌 运 动 的 观 察 1. 压 滴 法 (1) 制 备 菌 液 : 从 幼 龄 菌 斜 面 上, 挑 数 环 菌 放 在 装 有 1~2mL 无 菌 水 的 试 管 中, 制 成 轻 度 混 浊 的 菌 悬 液 (2) 取 2~3 环 稀 释 菌 液 于 洁 净 载 玻 片 中 央, 再 加 入 一 环 0.01% 的 美 蓝 水 溶 液, 混 匀 (3) 用 镊 子 夹 一 洁 净 的 盖 玻 片, 先 使 其 一 边 接 触 菌 液, 然 后 慢 慢 地 放 下 盖 玻 片, 这 样 可 防 止 产 生 气 泡 (4) 镜 检 : 将 光 线 适 当 调 暗, 先 用 低 倍 镜 找 到 观 察 部 位, 再 用 高 倍 镜 观 察 要 区 分 细 菌 鞭 毛 运 动 和 布 朗 运 动, 后 者 只 是 在 原 处 左 右 摆 动, 细 菌 细 胞 间 有 明 显 位 移 者, 才 能 判 定 为 有 运 动 性 2. 悬 滴 法 (1) 取 洁 净 盖 玻 片, 在 四 周 涂 少 许 凡 士 林 (2) 在 盖 玻 片 中 央 滴 一 小 滴 菌 液 ( 图 9 1A) (3) 将 凹 玻 片 的 凹 窝 向 下, 使 凹 窝 中 心 对 准 盖 玻 片 中 央 的 菌 液 ( 图 9-1B), 轻 轻 地 盖 在 盖 玻 片 上, 便 凹 玻 片 与 盖 玻 片 粘 在 一 起 ( 注 意 液 滴 不 得 与 凹 玻 片 接 触 ) (4) 小 心 将 玻 片 翻 转 过 来, 使 菌 液 正 好 悬 在 窝 的 中 央 再 用 火 柴 棒 轻 压 盖 玻 片 四 周 使 封 闭, 以 防 菌 液 干 燥 (5) 镜 检 : 将 光 线 适 当 调 暗, 先 用 低 倍 镜 找 到 悬 滴 的 边 缘 后 ( 图 9 1D), 再 将 菌 液 移 至 视 野 中 央, 换 用 高 倍 镜 观 察, 注 意 细 菌 是 如 何 运 动 的, 它 与 分 子 布 朗 运 动 的 不 同 图 9 1 悬 滴 标 本 的 制 备 四 注 意 事 项 1. 鞭 毛 染 色 液 最 好 当 日 配 置 当 日 用, 次 日 使 用 则 鞭 毛 染 色 浅, 观 察 效 果 差 染 色 时 一 定 要 充 分 洗 净 A 液 后 再 加 B 液, 否 则 背 景 不 清 晰 2. 观 察 细 菌 的 运 动, 载 玻 片 和 盖 玻 片 都 要 洁 净 无 油, 否 则 会 影 响 细 菌 的 运 动 有 些 细 菌, 温 度 太 低 时 不 能 运 动 五 实 验 报 告 1. 绘 出 你 所 观 察 到 的 细 菌 的 形 态 及 鞭 毛 着 生 情 况 2. 试 描 述 你 所 观 察 的 细 菌 有 无 运 动 性, 是 如 何 运 动 的?

20 六 问 题 和 思 考 1. 鞭 毛 染 色 的 菌 种 为 什 么 要 先 连 续 传 几 代, 并 且 要 采 用 幼 龄 菌 种? 2. 根 据 你 的 实 验 体 会, 哪 些 因 素 影 响 鞭 毛 染 色 的 效 果? 如 何 控 制? 3. 试 设 计 一 实 验, 如 何 鉴 别 某 种 细 菌 是 否 能 运 动, 是 否 有 鞭 毛, 其 鞭 毛 的 着 生 位 置 实 验 10 细 菌 芽 孢 荚 膜 的 染 色 及 观 察 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 掌 握 细 菌 的 芽 孢 及 荚 膜 染 色 方 法 内 容 :1. 细 菌 的 芽 泡 染 色 2. 细 菌 的 荚 膜 染 色 二 实 验 材 料 和 用 具 枯 草 芽 孢 杆 菌 褐 球 固 氮 菌 的 斜 面 菌 种 二 甲 苯 香 柏 油 蒸 馏 水 5% 孔 雀 绿 水 溶 液 0.5% 沙 黄 水 溶 液 ( 或 0.05% 碱 性 复 红 ) 绘 图 墨 水 ( 用 滤 纸 过 滤 后 备 用 ) 95% 乙 醇 石 炭 酸 复 红 染 液 ; 显 微 镜 接 种 环 酒 精 灯 载 玻 片 盖 玻 片 小 试 管 (l 6.5cm) 烧 杯 (300mL) 滴 管 试 管 夹 擦 镜 纸 吸 水 纸 三 操 作 步 骤 ( 一 ) 芽 孢 染 色 法 1. 方 法 1 (1) 取 37 培 养 18~24h 的 枯 草 芽 孢 杆 菌 作 涂 片, 并 干 燥, 固 定 ( 参 见 细 胞 单 染 色 法 ) (2) 于 涂 片 上 滴 人 3~5 滴 5% 孔 雀 绿 水 溶 液 (3) 用 试 管 夹 夹 住 载 玻 片 在 火 焰 上 用 微 火 加 热, 自 载 玻 片 上 出 现 蒸 汽 时, 开 始 计 算 时 间 约 4~5min 加 热 过 程 中 切 勿 使 染 料 蒸 干, 必 要 时 可 添 加 少 许 染 料 (4) 倾 去 染 液, 待 玻 片 冷 却 后, 用 自 来 水 冲 洗 至 孔 雀 绿 不 再 褪 色 为 止 (5) 用 0.5% 沙 黄 水 溶 液 ( 或 0.05% 碱 性 复 红 ) 复 染 lmin, 水 洗 (6) 制 片 干 燥 后 用 油 镜 观 察 芽 孢 呈 绿 色, 菌 体 红 色 2. 方 法 2 (1) 加 1~2 滴 自 来 水 于 小 试 管 中, 用 接 种 环 从 斜 面 上 挑 取 2~3 环 培 养 18~24h 的 枯 草 芽 孢 杆 菌 菌 苔 于 试 管 中, 并 充 分 混 匀 打 散, 制 成 浓 稠 的 菌 液 (2) 加 5% 孔 雀 绿 水 溶 液 2~3 滴 于 小 试 管 中, 用 接 种 环 搅 拌 使 染 料 与 菌 液 充 分 混 合 (3) 将 此 试 管 浸 于 沸 水 浴 ( 烧 杯 ) 中, 加 热 15~20min (4) 用 接 种 环 从 试 管 底 部 挑 数 环 菌 于 洁 净 的 载 玻 片 上, 并 涂 成 薄 膜, 将 涂 片 通 过 微 火 3 次 固 定 (5) 水 洗, 至 流 出 的 水 中 无 孔 雀 绿 颜 色 为 止 (6) 加 沙 黄 水 溶 液, 染 2~3min 后, 倾 去 染 液, 不 用 水 洗, 直 接 用 吸 水 纸 吸 干 (7) 干 燥 后 用 油 镜 观 察 芽 孢 绿 色, 菌 体 红 色 ( 二 ) 荚 膜 染 色 法 1. 石 炭 酸 复 红 染 色 (1) 取 培 养 了 72h 的 褐 球 固 氮 菌 制 成 涂 片, 自 然 干 燥 ( 不 可 用 火 焰 烘 干 ) (2) 滴 入 1~2 滴 95% 乙 醇 固 定 ( 不 可 加 热 固 定 ) (3) 加 石 炭 酸 复 红 染 液 染 色 1~2min, 水 洗, 自 然 干 燥 (4) 在 载 玻 片 一 端 加 一 滴 墨 汁, 另 取 一 块 边 缘 光 滑 的 载 玻 片 与 墨 汁 接 触, 再 以 匀 速 推 向 另 一 端, 涂 成 均 匀 的 一 薄 层, 自 然 干 燥 (5) 干 燥 后 用 油 镜 观 察 菌 体 红 色, 荚 膜 无 色, 背 景 黑 色 2. 背 景 染 色 (1) 先 加 1 滴 墨 水 于 洁 净 的 玻 片 上, 并 挑 少 量 褐 球 固 氮 菌 与 之 充 分 混 合 均 匀 (2) 放 一 清 洁 盖 玻 片 于 混 合 液 上, 然 后 在 盖 玻 片 上 放 一 张 滤 纸, 向 下 轻 压, 吸 收 多 余 的 菌 液 (3) 干 燥 后 用 油 镜 观 察 背 景 灰 色, 菌 体 较 暗, 在 其 周 围 呈 现 一 明 亮 的 透 明 圈 即 荚 膜

21 四 注 意 事 项 1. 荚 膜 染 色 涂 片 不 要 用 加 热 固 定, 以 免 荚 膜 皱 缩 变 形 2. 供 芽 孢 染 色 用 的 菌 种 应 控 制 菌 龄, 使 大 部 分 芽 孢 仍 保 留 在 菌 体 上 为 宜 五 实 验 报 告 ( 一 ) 绘 图 1. 枯 草 芽 孢 杆 菌 及 巨 大 芽 孢 杆 菌 的 菌 体 及 芽 孢 形 态, 芽 孢 的 着 生 位 置 2. 褐 球 固 氮 菌 菌 体 及 荚 膜 的 形 态 ( 二 ) 试 制 片, 但 不 进 行 染 色, 观 察 是 否 能 看 到 芽 孢 和 荚 膜? 七 问 题 和 思 考 1. 为 什 么 芽 孢 染 色 要 加 热? 为 什 么 芽 孢 及 营 养 体 能 染 成 不 同 的 颜 色? 2. 组 成 荚 膜 的 成 分 是 什 么? 涂 片 一 般 用 什 么 固 定 方 法, 为 什 么? 3. 试 设 计 实 验 如 何 鉴 定 某 一 产 芽 孢 菌 株 的 芽 孢 形 态 着 生 位 置 及 所 属 分 类 地 位 实 验 11 放 线 菌 的 形 态 观 察 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 辨 认 放 线 菌 的 营 养 菌 丝 气 生 菌 丝 孢 子 丝 孢 子 的 形 态 ; 学 习 放 线 菌 的 观 察 方 法 内 容 : 用 水 封 计 法 玻 璃 纸 法 印 片 法 观 察 放 线 菌 的 形 态 特 征 二 实 验 材 料 和 用 具 细 黄 链 霉 菌 (streptomycs micuoflavus) 又 称 5406 的 培 养 平 皿, 棘 孢 小 单 孢 菌 (Micromonospora echinospora) 的 玻 璃 纸 培 养 平 皿 0.1% 美 蓝 染 色 液 石 炭 酸 复 红 染 色 液 ; 盖 玻 片 载 玻 片 镊 子 接 种 环 显 微 镜 涂 布 器 玻 璃 纸 打 孔 器 三 操 作 步 骤 ( 一 ) 观 察 自 然 生 长 状 态 的 放 线 菌 用 镊 子 小 心 取 出 用 插 片 法 培 养 的 5406 菌 培 养 皿 中 的 一 张 盖 玻 片, 将 其 背 面 附 着 的 菌 丝 体 擦 净 然 后 将 长 有 菌 的 一 面 向 上 放 在 洁 净 的 载 玻 片 上, 用 低 倍 镜 高 倍 镜 观 察 找 出 3 类 菌 丝 及 其 分 生 孢 子, 并 绘 图 注 意 放 线 菌 的 基 内 菌 丝 气 生 菌 丝 的 粗 细 和 色 泽 差 异 ( 二 ) 水 封 片 观 察 取 一 滴 美 蓝 染 色 液 置 于 载 玻 片 中 央, 将 用 搭 片 法 培 养 棘 孢 小 单 孢 菌 培 养 皿 中 的 盖 玻 片 取 出, 并 将 有 菌 面 朝 下, 放 在 载 玻 片 上, 浸 在 染 色 液 中, 制 成 水 封 片, 用 高 倍 镜 观 察 其 单 个 分 生 孢 子 及 其 基 内 菌 丝, 并 绘 图 ( 三 ) 玻 璃 纸 法 的 镜 检 观 察 l. 直 接 玻 璃 纸 观 察 分 别 用 5406 和 棘 孢 小 单 孢 菌 的 玻 璃 纸 制 片 观 察 制 片 时, 于 载 玻 片 上 放 一 小 滴 蒸 馏 水, 将 含 菌 玻 璃 纸 片 小 心 剪 下 一 小 块, 移 至 载 玻 片 上, 并 使 有 菌 面 向 上 在 玻 璃 纸 与 载 玻 片 间 不 能 有 气 泡, 以 免 影 响 观 察 将 制 片 于 显 微 镜 下 观 察, 先 用 低 倍 镜 观 察 菌 的 立 体 生 长 状 况, 再 用 高 倍 镜 仔 细 观 察 注 意 区 分 5406 菌 的 基 内 菌 丝 气 生 菌 丝 和 弯 曲 状 或 螺 旋 状 的 孢 子 丝 观 察 棘 孢 小 单 孢 菌 时 注 意 把 视 野 调 暗, 其 基 内 菌 丝 纤 细 发 亮, 其 单 个 分 生 孢 子 发 暗, 直 接 生 长 在 基 内 菌 丝 长 出 的 小 梗 上 绘 图 2. 印 片 染 色 法 观 察 用 镊 子 取 洁 净 载 玻 片 并 微 微 加 热, 然 后 用 这 微 热 载 玻 片 盖 在 长 有 5406 或 棘 孢 小 单 孢 菌 的 平 皿 上, 轻 轻 压 一 下, 注 意 将 载 玻 片 垂 直 放 下 和 取 出, 以 防 载 玻 片 水 平 移 动 而 破 坏 放 线 菌 的 自 然 形 态 反 转 有 印 痕 的 载 玻 片 微 微 加 热 固 定. 用 石 炭 酸 复 红 染 色 l min, 水 洗, 晾 干 用 油 镜 观 察 绘 图 注 意 比 较 两 种 菌 的 形 态 特 征 有 何 不 同 四 注 意 事 项 1. 培 养 放 线 菌 中 要 注 意, 放 线 菌 的 生 长 速 度 较 慢, 培 养 期 较 长, 在 操 作 中 应 特 别 注 意 无 菌 操 作, 严 防 杂 菌 污 染 2. 玻 璃 纸 法 培 养 接 种 时 注 意 玻 璃 纸 与 平 板 琼 脂 培 养 基 间 不 宜 有 气 泡, 以 免 影 响 其 表 面 放 线 菌 的 生 长, 3. 不 同 观 察 方 法 中 严 格 按 要 求 进 行, 注 意 菌 体 的 上 下 位 置

22 五 实 验 报 告 1. 绘 图 玻 璃 纸 法 水 封 片 法 印 片 法 及 自 然 生 长 状 态 下 观 察 的 放 线 菌 形 态 2. 试 比 较 5406 菌 与 棘 孢 小 单 孢 菌 特 征 的 异 同 六 问 题 和 思 考 1. 在 高 倍 镜 或 油 镜 下 如 何 区 分 放 线 菌 的 基 内 菌 丝 和 气 生 菌 丝? 2. 用 插 片 法 和 搭 片 法 如 何 制 备 放 线 菌 标 本, 其 主 要 优 点 是 什 么? 可 否 用 此 法 观 察 其 他 微 生 物? 为 什 么? 3. 以 玻 璃 纸 覆 盖 法 培 养 和 观 察 放 线 菌 有 何 优 点? 试 用 此 法 设 计 一 个 观 察 青 霉 菌 形 态 的 实 验 注 : ( 一 ) 插 片 法 和 搭 片 法 培 养 放 线 菌 1. 插 片 法 (1) 制 平 板 接 种 : 用 冷 却 至 约 50 的 高 氏 1 号 琼 脂 培 养 基 倒 平 板 ( 每 皿 约 20mL), 可 用 两 种 方 法 接 菌 :1 先 接 种 后 插 片 : 冷 凝 后 用 接 种 环 挑 取 少 量 斜 面 上 的 5406 菌 孢 子, 用 平 板 培 养 基 的 一 半 面 积 作 来 回 划 线 接 种 ( 接 种 量 可 适 当 加 大 );2 先 插 片 后 接 种 : 用 平 板 培 养 基 的 另 一 半 面 积 进 行 (2) 插 片 及 培 养 : 用 无 菌 镊 子 取 无 菌 盖 玻 片, 在 已 接 种 平 板 上 以 45 角 斜 插 入 培 养 基 内, 插 人 深 度 约 占 盖 玻 片 1/2 长 度 ( 图 11-1A) 同 时, 在 另 一 半 未 经 接 种 的 部 位 以 同 样 方 式 插 入 数 块 盖 玻 片, 然 后 接 种 少 量 5406 菌 孢 子 至 盖 玻 片 一 侧 的 基 部, 且 仅 接 种 于 其 中 央 位 置 约 占 盖 玻 片 长 度 的 一 半 左 右, 以 免 菌 丝 蔓 延 至 盖 玻 片 的 另 一 侧 将 插 片 平 板 倒 置 于 28, 培 养 3~ 7d 2. 搭 片 法 (1) 开 槽 及 接 种 : 用 无 菌 打 孔 器 在 凝 固 后 的 平 板 培 养 基 上 打 洞 数 个, 并 将 棘 孢 小 单 孢 菌 孢 子 划 线 接 种 至 洞 内 边 缘 (2) 搭 片 及 培 养 : 在 接 种 后 的 洞 面 上 放 一 无 菌 盖 玻 片, 平 板 倒 置 于 28, 培 养 3~7d( 图 11 1B) ( 二 ) 玻 璃 纸 法 固 体 培 养 5406 菌 和 棘 孢 小 单 孢 菌 1. 玻 璃 纸 灭 菌 将 玻 璃 纸 剪 成 比 培 养 皿 直 径 略 小 的 片 状, 将 滤 纸 剪 成 培 养 皿 大 小 的 圆 形 纸 片 并 稍 润 湿, 然 后 把 滤 纸 和 玻 璃 纸 交 互 重 叠 地 放 在 培 养 皿 中, 借 滤 纸 将 玻 璃 纸 隔 开 然 后 进 行 湿 热 灭 菌, 备 用 图 11 1 放 线 菌 的 插 片 与 搭 片 培 养 示 意 图 A. 插 片 法 ; B. 搭 片 法 2. 制 平 板 及 铺 玻 璃 纸 取 冷 凝 后 的 高 氏 1 号 琼 脂 培 养 基, 用 无 菌 镊 子 将 预 先 灭 菌 的 块 状 玻 璃 纸 平 铺 至 平 板 培 养 表 面, 铺 玻 璃 纸 时 可 用 无 菌 涂 布 器 将 玻 璃 纸 与 培 养 基 之 间 的 气 泡 除 去 3. 涂 布 菌 液 及 培 养 取 0.l ml 的 孢 子 悬 液 涂 布 在 铺 有 玻 璃 纸 的 平 板 培 养 基 表 面 接 种 平 板 倒 置 于 28, 培 养 5~7d

23 实 验 12 酵 母 菌 的 形 态 观 察 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 了 解 自 然 存 在 的 酵 母 菌 及 其 形 态 结 构 了 解 酵 母 菌 产 生 子 囊 孢 子 的 条 件 及 其 形 态 内 容 : 1. 观 察 酵 母 菌 个 体 形 态 2. 观 察 酵 母 菌 的 假 菌 丝 和 繁 殖 过 程 3. 观 察 自 然 状 态 的 酵 母 菌 二 实 验 材 料 和 用 具 酿 酒 酵 母 (Saccharomyes cerevisiae) 热 带 假 丝 酵 母 (Candida tropicalis) 斜 面 菌 种 PDA 培 养 基 麦 氏 (McCLary) 培 养 基 ( 醋 酸 钠 培 养 基 ) 0.05% 美 蓝 染 色 液 ( 以 ph6.0 的 0.02mol/L 磷 酸 缓 冲 液 配 制 ) 碘 液 0.04% 的 中 性 红 染 色 液 % 孔 雀 绿,0.5% 沙 黄 液 95% 乙 醇 ; 显 微 镜 载 玻 片 擦 镜 纸 盖 玻 片 接 种 环 V 形 玻 璃 棒 放 置 一 个 三 角 形 玻 璃 棒 支 架 的 培 养 皿 三 操 作 步 骤 ( 一 ) 酵 母 菌 形 态 观 察 1. 酵 母 菌 的 话 体 染 色 观 察 及 死 亡 率 的 测 定 (1) 以 无 菌 水 洗 下 PDA 斜 面 培 养 的 酿 酒 酵 母 菌 苔, 制 成 菌 悬 液 (2) 取 0.05% 美 蓝 染 色 液 1 滴, 置 载 玻 片 中 央, 并 用 接 种 环 取 酵 母 菌 悬 液 与 染 色 液 混 匀, 染 色 2~3min, 加 盖 玻 片, 在 高 倍 镜 下 观 察 酵 母 菌 个 体 形 态, 区 分 其 母 细 胞 与 芽 体, 区 分 死 细 胞 ( 蓝 色 ) 与 活 细 胞 ( 不 着 色 ) (3) 在 一 个 视 野 里 计 数 死 细 胞 和 活 细 胞, 共 计 数 5~6 个 视 野 酵 母 菌 死 亡 率 一 般 用 百 分 数 来 表 示, 以 下 式 来 计 算 : 死 亡 率 = 死 细 胞 总 数 死 活 细 胞 总 数 100% 2. 酵 母 菌 液 泡 系 的 话 体 观 察 于 洁 净 载 玻 片 中 央 加 一 滴 中 性 红 染 色 液, 取 少 许 上 述 酵 母 菌 悬 液 与 之 混 合, 染 色 5min, 加 盖 玻 片 在 显 微 镜 下 观 察 细 胞 无 色, 液 泡 呈 红 色 3. 酵 母 菌 细 胞 中 肝 糖 粒 的 观 察 将 1 滴 碘 液 置 于 载 玻 片 中 央, 接 人 上 述 酵 母 菌 悬 液, 混 匀, 盖 上 盖 玻 片, 显 微 镜 观 察, 细 胞 内 的 贮 藏 物 质 肝 糖 颗 粒 呈 深 红 色 4. 酵 母 菌 子 囊 孢 子 的 观 察 (1) 活 化 酿 酒 酵 母 : 将 酿 酒 酵 母 接 种 至 新 鲜 的 麦 芽 汁 培 养 基 上, 置 28C 培 养 2~3d, 然 后 再 移 植 2~3 次 (2) 转 接 产 孢 培 养 基 : 将 活 化 的 酿 酒 酵 母 转 接 至 醋 酸 钠 培 养 基 上, 置 30 恒 温 培 养 14d (3) 观 察 : 挑 取 少 许 产 孢 菌 苔 于 载 玻 片 的 水 滴 上, 经 涂 片 热 固 定 后, 加 数 滴 孔 雀 绿,lmin 后 水 洗, 加 95% 乙 醇 30S, 水 洗, 最 后 用 0.5% 沙 黄 液 复 染 30S, 水 洗 去 染 色 液, 最 后 用 吸 水 纸 吸 干 制 片 干 燥 后, 镜 检, 子 囊 孢 子 呈 绿 色, 子 囊 为 粉 红 色 注 意 观 察 子 囊 孢 子 的 数 目 形 状 和 子 囊 的 形 成 率 (4) 计 算 子 囊 形 成 的 百 分 率 : 计 数 时 随 机 取 3 个 视 野, 分 别 计 数 产 子 囊 孢 子 的 子 囊 数 和 不 产 孢 子 的 细 胞, 然 后 按 下 列 公 式 计 算 : 子 囊 形 成 率 (%)=3 个 视 野 中 形 成 子 囊 的 总 数 3 个 视 野 中 ( 形 成 子 囊 的 总 数 + 不 产 孢 子 细 胞 总 数 ) 100% 5. 酵 母 菌 假 菌 丝 的 观 察 取 一 无 菌 载 玻 片 浸 于 溶 化 的 PDA 培 养 基 中, 取 出 放 在 温 室 培 养 的 支 架 上, 待 培 养 基 凝 固 后, 进 行 酵 母 菌 划 线 接 种, 然 后 将 无 菌 盖 玻 片 盖 在 接 菌 线 上 ( 图 12 1),28 培 养 2~3d 后, 取 出 载 玻 片, 擦 去 载 玻 片 下 面 的 培 养 基, 在 显 微 镜 下 直 接 观 察 可 见 到 芽 殖 酵 母 形 成 的 藕 节 状 假 菌 丝, 裂 殖 酵 母 则 形 成 竹 节 状 假 菌 丝 ( 图 12 2)

24 图 12 1 酵 母 菌 假 菌 丝 的 培 养 图 12 2 酵 母 菌 的 假 菌 丝 形 态 A. 藕 节 状 假 菌 丝 ; B. 竹 节 状 假 菌 丝 6. 自 然 状 态 下 的 酵 母 菌 观 察 取 一 滴 美 蓝 染 色 液 于 载 玻 片 中 央, 春 夏 秋 季 取 酱 油 或 淹 菜 上 的 白 膜, 冬 季 取 腌 酸 菜 汤 上 的 白 膜, 将 其 置 于 载 玻 片 染 色 液 中, 盖 上 盖 玻 片, 显 微 镜 下 仔 细 观 察 酵 母 菌 形 态, 出 芽 生 殖, 假 菌 丝 等 四 注 意 事 项 1. 用 于 活 化 酵 母 菌 的 麦 芽 汁 培 养 基 要 新 鲜 表 面 湿 润 2. 在 产 孢 培 养 基 上 加 大 移 种 量, 可 提 高 子 囊 形 成 率 3. 通 过 微 加 热 增 加 酵 母 的 死 亡 率, 易 于 观 察 死 亡 细 胞 五 实 验 报 告 ( 一 ) 绘 图 1. 数 个 酵 母 菌 细 胞, 示 观 察 到 的 结 构 2. 数 个 子 囊 及 子 囊 孢 子 形 态 图 ( 二 ) 记 录 并 计 数 酵 母 菌 的 死 亡 率 及 子 囊 形 成 率 ( 原 始 记 录 及 计 算 结 果 ) 六 问 题 和 思 考 1. 酵 母 菌 的 假 菌 丝 是 怎 样 形 成 的? 与 霉 菌 的 真 菌 丝 有 何 区 别? 2. 如 何 区 别 营 养 细 胞 和 释 放 出 的 子 囊 孢 子? 3. 试 设 计 一 个 从 子 囊 中 分 离 子 囊 孢 子 的 试 验 方 案 注 : 酵 母 菌 的 简 易 培 养 配 2% 葡 萄 糖 水 ( 或 自 糖 水 ), 煮 沸, 装 入 三 角 瓶 中 ( 液 面 高 度 2~2cm ), 加 HCl 调 至 ph3~5 放 入 几 块 葡 萄 皮 ( 或 其 他 糖 分 较 高 的 果 皮 ), 置 5~28 温 箱 中 培 养 2~3d, 闻 到 酒 香 味 后, 即 可 取 培 养 液 镜 检

25 实 验 13 霉 菌 的 形 态 观 察 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 了 解 霉 菌 形 态, 掌 握 微 生 物 载 玻 片 湿 室 培 养 方 法 内 容 :1. 霉 菌 载 玻 片 湿 室 培 养 2. 曲 霉 青 霉 根 霉 毛 霉 形 态 观 察 3. 根 霉 假 根 的 观 察 二 实 验 材 料 和 用 具 产 黄 青 霉 (Penicfillium chrysogenum) 黑 曲 霉 (Aspergillus niger) 黑 根 霉 (Rhizopus nigrians) 总 状 毛 霉 (Mucor racemosus) 等 斜 面 菌 种 半 固 体 PDA 培 养 基 乳 酸 苯 酚 固 定 液 棉 蓝 染 色 液 20% 甘 油 ; 透 明 胶 带 剪 刀 培 养 皿 载 玻 片 口 形 玻 棒 搁 架 盖 玻 片 圆 形 滤 纸 片 细 口 滴 管 镊 子 显 微 镜 接 种 环 三 操 作 步 骤 ( 一 ) 霉 菌 的 载 玻 片 湿 室 培 养 可 4 人 合 作, 每 人 制 作 一 霉 菌 的 载 玻 片 1. 准 备 湿 室 在 培 养 皿 底 铺 一 张 圆 形 滤 纸 片, 其 上 放 一 冂 形 载 玻 片 搁 架, 在 搁 梁 上 放 一 块 载 玻 片 和 两 块 盖 玻 片, 盖 上 皿 盖, 外 用 纸 包 扎, 经 12lC 湿 热 灭 菌 30min 后, 置 60 烘 箱 中 烘 干, 备 用 2. 接 种 用 接 种 环 挑 取 少 量 待 观 察 的 霉 菌 孢 子 至 湿 室 内 的 载 玻 片 上, 每 张 载 玻 片 可 接 同 一 菌 种 的 孢 子 两 处 接 种 时 只 要 将 带 菌 的 接 种 环 在 载 玻 片 上 轻 轻 碰 几 下 即 可 ( 务 必 记 住 接 种 的 位 置 ) 3. 加 培 养 基 用 无 菌 细 口 滴 管 吸 取 少 量 融 化 约 60 的 培 养 基, 滴 加 到 载 玻 片 的 接 种 处, 培 养 基 应 滴 得 圆 而 薄, 其 直 径 约 为 0.5cm( 滴 加 量 一 般 以 l/2 小 滴 为 宜 ) 4. 加 盖 玻 片 在 培 养 基 未 彻 底 凝 固 前. 用 无 菌 镊 子 将 皿 内 盖 玻 片 盖 在 琼 脂 块 薄 层 上, 用 镊 子 轻 压, 使 盖 玻 片 和 载 玻 片 间 的 距 离 相 当 接 近, 但 不 能 压 扁, 否 则 不 透 气 5. 倒 保 湿 剂 每 皿 倒 大 约 3mL 20% 的 无 菌 甘 油, 使 皿 内 的 滤 纸 完 全 润 湿, 以 保 持 皿 内 湿 度, 皿 盖 上 注 明 菌 名 组 别 和 接 种 日 期 此 为 制 成 的 载 玻 片 湿 室, 置 28 恒 温 培 养 3~ 5d ( 二 ) 黑 根 霉 假 根 的 培 养 将 融 化 的 PDA 培 养 基, 冷 却 至 50 倒 入 无 菌 平 皿, 其 量 约 为 平 皿 高 度 的 l/2 冷 凝 后, 用 接 种 环 沾 取 根 霉 孢 子, 在 平 板 表 面 划 线 接 种 然 后 将 平 皿 倒 置, 在 皿 盖 内 放 一 无 菌 载 玻 片, 于 28 培 养 2~3d 后, 可 见 根 霉 的 气 生 菌 丝 倒 挂 成 胡 须 状, 有 许 多 菌 丝 与 载 玻 片 接 触, 并 在 载 玻 片 上 分 化 出 假 根 和 匍 匐 菌 丝 等 结 构 ( 图 13 1) 图 13 1 根 霉 假 根 的 培 养 ( 三 ) 镜 检 观 察 1. 湿 室 培 养 霉 菌 镜 检 载 玻 片 从 培 养 16~20h 开 始, 通 过 连 续 观 察, 可 了 解 孢 子 的 萌 发 菌 丝 体 的 生 长 分 化 和 子 实 体 的 形 成 过 程 将 湿 室 内 的 载 玻 片 取 出, 直 接 置 于 低 倍 镜 和 高 倍 镜 下 观 察 曲 霉 青 霉 毛 霉 根 霉 等 霉 菌 的 形 态, 重 点 观 察 菌 丝 是 否 分 隔, 曲 霉 和 青 霉 的 分 生 孢 子 形 成 特 点, 曲 霉 的 足 细 胞, 根 霉 和 毛 霉 的 孢 子 囊 和 孢 囊 孢 子 绘 图 2. 粘 片 观 察 取 一 滴 棉 蓝 染 色 液 置 于 载 玻 片 中 央, 取 一 段 透 明 胶 带, 打 开 霉 菌 平 板 培 养 物, 粘 取 菌 体, 粘 面 朝 下, 放 在 染 液 上 镜 检 3. 假 根 观 察 将 培 养 根 霉 假 根 的 平 皿 打 开, 取 出 皿 盖 内 的 载 玻 片 标 本, 在 附 着 菌 丝

26 体 的 一 面 盖 上 盖 玻 片, 置 显 微 镜 下 观 察 只 要 用 低 倍 镜 就 能 观 察 到 假 根 及 从 根 节 上 分 化 出 的 孢 子 囊 梗 孢 子 囊 孢 囊 孢 子 和 两 个 假 根 间 的 匍 匐 菌 丝, 观 察 时 注 意 调 节 焦 距 以 看 清 各 种 构 造 4. 制 成 永 久 装 片 把 观 察 到 霉 菌 形 态 较 清 晰, 完 整 的 片 子, 制 成 标 本 作 较 长 期 保 存 制 备 方 法 是, 轻 轻 揭 去 盖 玻 片, 如 果 载 玻 片 上 有 琼 脂, 仔 细 挑 去, 然 后 滴 加 少 量 乳 酸 苯 酚 固 定 液, 盖 上 清 洁 盖 玻 片, 在 盖 玻 片 四 周 滴 加 树 胶 封 固 四 注 意 事 项 载 玻 片 湿 室 培 养 时, 盖 玻 片 不 能 紧 贴 载 玻 片, 要 彼 此 有 极 小 缝 隙, 一 是 为 了 通 气 ; 二 是 使 各 部 分 结 构 平 行 排 列, 易 于 观 察 五 实 验 报 告 ( 一 ) 绘 制 镜 检 形 态 图 1. 毛 霉 和 根 霉 形 态 图, 示 各 部 2. 青 霉 和 曲 霉 形 态 图, 示 各 部 ( 二 ) 载 玻 片 观 察 记 录 各 菌 种 的 载 玻 片 标 本 观 察 结 果 : 菌 种 菌 丝 体 ( 气 生 菌 丝 营 养 菌 丝 的 粗 细 色 泽 菌 丝 有 隔 或 无 隔 等 ) 无 性 孢 子 特 征 ( 孢 子 梗 的 分 化 特 征, 孢 子 着 生 特 征 等 ) 其 他 特 征 结 构 ( 有 无 假 根 足 细 胞 匍 匐 菌 丝 囊 轴 等 ) 六 问 题 和 思 考 1. 什 么 叫 载 玻 片 湿 室 培 养? 它 适 用 于 观 察 怎 样 的 微 生 物, 有 何 优 点? 2. 湿 室 培 养 时 为 何 用 20% 甘 油 作 保 湿 剂? 3. 本 实 验 中 观 察 假 根 的 设 计 原 理 是 什 么? 此 设 计 还 适 合 于 培 养 哪 类 菌 实 验 14 细 菌 大 小 的 测 定 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 学 会 测 微 尺 的 使 用 和 计 算 方 法 及 对 球 菌 和 杆 菌 的 测 量 内 容 :1. 认 识 测 微 尺, 学 习 目 镜 测 微 尺 的 标 定 2. 测 定 金 黄 色 葡 萄 球 菌 和 大 肠 杆 菌 菌 体 的 大 小 二 实 验 材 料 和 用 具 金 黄 色 葡 萄 球 菌 大 肠 杆 菌 的 玻 片 标 本 香 柏 油 二 甲 苯 ; 显 微 镜 目 镜 测 微 尺 镜 台 测 微 尺 擦 镜 纸 三 操 作 步 骤 l. 测 微 尺 的 构 造 显 微 镜 测 微 尺 是 由 目 镜 测 微 尺 和 镜 台 接 物 测 微 尺 组 成, 目 镜 测 微 尺 是 一 块 圆 形 玻 璃 片, 其 中 有 精 确 的 等 分 刻 度, 在 5mm 刻 尺 上 分 50 份 ( 图 14 一 lc) 目 镜 测 微 尺 每 格 实 际 代 表 的 长 度 随 使 用 接 目 镜 和 接 物 镜 的 放 大 倍 数 而 改 变, 因 此 在 使 用 前 必 须 用 镜 台 测 微 尺 进 行 标 定 镜 台 测 微 尺 为 一 专 用 中 央 有 精 确 等 分 线 的 载 玻 片 ( 图 14 1A), 一 般 将 长 为 1mm 的 直 线 等 分 成 100 个 小 格, 每 格 长 0.0lmm 即 10μm, 是 专 用 于 校 正 目 镜 测 微 尺 每 格 长 度 的 2. 目 镜 测 微 尺 的 标 定 把 目 镜 的 上 透 镜 旋 开, 将 目 镜 测 微 尺 轻 轻 放 在 目 镜 的 隔 板 上, 使 有 刻 度 的 一 面 朝 下 将 镜 台 测 微 尺 放 在 显 微 镜 的 载 物 台 上, 使 有 刻 度 的 一 面 朝 上 先 用 低 倍 镜 观 察, 调 焦 距, 待 看 清 镜 台 测 微 尺 的 刻 度 后, 转 动 目 镜, 使 目 镜 测 微 尺 的 刻 度 与 镜 台 测 微 尺 的 刻 度 相 平 行, 并 使 两 尺 左 边 的 一 条 线 重 合, 向 右 寻 找 另 外 一 条 两 尺 相 重 合 的 直 线 ( 图 15 lb) 3. 计 算 方 法 标 定 公 式 :

27 目 镜 测 微 尺 每 格 长 度 (μm)= 两 条 重 合 线 间 镜 台 测 微 尺 的 格 数 10 两 条 重 合 线 间 目 镜 测 微 尺 的 格 数 例 如, 目 镜 测 微 尺 20 个 小 格 等 于 镜 台 测 微 尺 3 小 格, 已 知 镜 台 测 微 尺 每 格 为 10μm, 则 3 小 格 的 长 度 为 3 10=30μm, 那 么 相 应 地 在 目 镜 测 微 尺 上 每 小 格 长 度 为 =1.5 μm 用 以 上 计 算 方 法 分 别 校 正 低 倍 镜 高 倍 镜 及 油 镜 下 目 镜 测 微 尺 每 格 实 际 长 度 4. 菌 体 大 小 的 测 定 将 镜 台 测 微 尺 取 下, 分 别 换 上 大 肠 杆 菌 及 金 黄 色 葡 萄 球 菌 玻 片 标 本, 先 在 低 倍 镜 和 高 倍 镜 下 找 到 目 的 物, 然 后 在 油 镜 下 用 目 镜 测 微 尺 测 量 菌 体 的 大 小 先 量 出 菌 体 的 长 和 宽 占 目 镜 测 微 尺 的 格 数, 再 以 目 镜 测 微 尺 每 格 的 长 度 计 算 出 菌 体 的 长 和 宽 并 详 细 记 录 于 表 15 1 中 例 如, 目 镜 测 微 尺 在 这 架 显 微 镜 下, 每 格 相 当 于 1.5μm, 测 量 的 结 果, 若 菌 体 的 平 均 长 度 相 当 于 目 镜 测 微 尺 的 2 格, 则 菌 体 长 应 为 3 1.5μm=3.0μm 一 般 测 量 菌 体 的 大 小, 应 测 定 10~20 个 菌 体, 求 出 平 均 值, 才 能 代 表 该 菌 的 大 小 四 注 意 事 项 1. 镜 台 测 微 尺 的 玻 片 很 薄, 在 标 定 油 镜 头 时, 要 格 外 注 意, 以 免 压 碎 镜 台 测 微 尺 或 损 坏 镜 头 2. 标 定 目 镜 测 微 尺 时 要 注 意 准 确 对 正 目 镜 测 微 尺 与 镜 台 测 微 尺 的 重 合 线 五 演 示 1. 目 镜 测 微 尺 镜 台 测 微 尺 的 显 微 镜 下 示 教 2. 标 定 及 测 量 方 法 示 范 六 实 验 报 告 1. 目 镜 测 微 尺 标 定 结 果 : 低 倍 镜 下 倍 目 镜 测 微 尺 每 格 长 度 是 μm 高 倍 镜 下 倍 目 镜 测 微 尺 每 格 长 度 是 μm 油 镜 下 倍 目 镜 测 微 尺 每 格 长 度 是 μm 2. 菌 体 大 小 测 定 结 果 : 菌 号 大 肠 杆 菌 测 定 结 果 目 镜 测 微 尺 格 数 实 际 长 度 宽 长 宽 长 金 黄 色 葡 萄 球 菌 的 直 径 大 小 测 定 结 果 目 镜 测 微 尺 格 数 实 际 直 径 /µm 均 值 试 与 己 知 的 大 肠 杆 菌 和 金 黄 色 葡 萄 球 菌 的 大 小 作 一 比 较 是 否 一 致? 为 何? 七 问 题 和 思 考 1. 为 什 么 更 换 不 同 放 大 倍 数 的 目 镜 和 物 镜 时 必 须 重 新 用 镜 台 测 微 尺 对 目 镜 微 尺 进 行 标 定? 2. 若 目 镜 不 变, 目 镜 测 微 尺 也 不 变, 只 改 变 物 镜, 那 么 目 镜 测 微 尺 每 格 所 测 量 的 镜 台 上 的 菌 体 细 胞 的 实 际 长 度 ( 或 宽 度 ) 是 否 相 同? 为 什 么?

28 实 验 15 微 生 物 数 量 的 测 定 细 菌 群 体 生 长 表 现 为 细 胞 数 目 的 增 加 或 细 胞 物 质 的 增 加 测 定 细 胞 数 目 的 方 法 有 显 微 镜 直 接 计 数 法 (direct microscopic count) 平 板 菌 落 计 数 法 (plate count) 光 电 比 油 法 (turbidity estimation by spectrophotometer) 最 大 或 然 数 法 (most probable number MPN) 以 及 膜 过 滤 法 (membrane filtration) 等 测 定 细 胞 物 质 的 方 法 有 细 胞 干 重 的 测 定, 细 胞 某 种 成 分 如 氮 的 含 量 RNA 和 DNA 的 含 量 测 定, 代 谢 产 物 的 测 定 等 总 之, 测 定 微 生 物 生 长 量 的 方 法 很 多, 各 有 优 缺 点, 工 作 中 应 根 据 具 体 情 况 要 求 加 以 选 择 本 实 验 主 要 介 绍 生 产 科 研 工 作 中 比 较 常 用 的 显 微 镜 直 接 计 数 法 平 板 菌 落 计 数 法 和 光 电 比 浊 计 数 法 一 显 微 镜 直 接 计 数 法 ( 一 ) 目 的 要 求 1. 明 确 血 细 胞 计 数 板 计 数 的 原 理 2. 掌 握 使 用 血 细 胞 计 数 板 进 行 微 生 物 计 数 的 方 法 ( 二 ) 基 本 原 理 显 微 镜 直 接 计 数 法 是 将 小 量 待 测 样 品 的 悬 浮 液 置 于 一 种 特 别 的 具 有 确 定 面 积 和 容 积 的 载 玻 片 上 ( 又 称 计 菌 器 ), 于 显 微 镜 下 直 接 计 数 的 一 种 简 便 快 速 直 观 的 方 法 目 前 国 内 外 常 用 的 计 菌 器 有 : 血 细 胞 计 数 板 Peteroff-Hauser 计 菌 器 以 及 Hawksley 计 菌 器 等, 它 们 都 可 用 于 酵 母 细 菌 霉 菌 孢 子 等 悬 液 的 计 数, 基 本 原 理 相 同 后 两 种 计 菌 器 由 于 盖 上 盖 玻 片 后, 总 容 积 为 0.02mm 3, 而 且 盖 玻 片 和 载 波 片 之 间 的 距 离 只 有 0.02mm, 因 此 可 用 油 浸 物 镜 对 细 菌 等 较 小 的 细 胞 进 行 观 察 和 计 数 除 了 用 这 些 计 菌 器 外, 还 有 在 显 微 镜 下 直 接 观 察 涂 片 面 积 与 视 野 面 积 之 比 的 估 算 法, 此 法 一 般 用 于 牛 乳 的 细 菌 学 检 查 显 微 镜 直 接 计 数 法 的 优 点 是 直 观 快 速 操 作 简 单 但 此 法 的 缺 点 是 所 测 得 的 结 果 通 常 是 死 菌 体 和 活 菌 体 的 总 和 目 前 已 有 一 些 方 法 可 以 克 服 这 一 缺 点, 如 结 合 活 菌 染 色 微 室 培 养 ( 短 时 间 ) 以 及 加 细 胞 分 裂 抑 制 剂 等 方 法 来 达 到 只 计 数 活 菌 体 的 目 的 本 实 验 以 血 球 计 数 板 为 例 进 行 显 微 镜 直 接 计 数 另 外 两 种 计 菌 器 的 使 用 方 法 可 参 看 各 厂 商 的 说 明 书 用 血 细 胞 计 数 板 在 显 微 镜 下 直 接 计 数 是 一 种 常 用 的 微 生 物 计 数 方 法 该 计 数 板 是 一 块 特 制 的 载 玻 片, 其 上 由 四 条 槽 构 成 三 个 平 台 ; 中 间 较 宽 的 平 台 又 被 一 短 横 槽 隔 成 两 半, 每 一 边 的 平 台 上 各 列 有 一 个 方 格 网, 每 个 方 格 网 共 分 为 九 个 大 方 格, 中 间 的 大 方 格 即 为 计 数 室 血 细 胞 计 数 板 构 造 如 图 l5-1 计 数 室 的 刻 度 一 般 有 两 种 规 格, 一 种 是 一 个 大 方 格 分 成 25 个 中 方 格, 而 每 个 中 方 格 又 分 成 16 个 小 方 格 ( 图 15 2); 另 一 种 是 一 个 大 方 格 分 成 16 个 中 方 格, 而 每 个 中 方 格 又 分 成 25 个 小 方 格, 但 无 论 是 哪 一 种 规 格 的 计 数 板, 每 一 个 大 方 格 中 的 小 方 格 都 是 400 个 每 一 个 大 方 格 边 长 为 lmm, 则 每 一 个 大 方 格 的 面 积 为 lmm 2, 盖 上 盖 玻 片 后, 盖 玻 片 与 载 玻 片 之 间 的 高 度 为 0.lmm, 所 以 计 数 室 的 容 积 为 0.lmm 3 ( 万 分 之 一 毫 升 ) 图 15 1 血 细 胞 计 数 板 构 造 ( 一 ) 图 15 2 血 细 胞 计 数 板 构 造 ( 二 ) A. 正 面 图 ;B. 纵 切 面 图 ; 放 大 后 的 方 格 网, 中 间 大 方 格 为 计 数 室 1. 血 细 胞 计 数 板 ;2. 盖 玻 片 ;3. 计 数 室 计 数 时, 通 常 数 五 个 中 方 格 的 总 菌 数, 然 后 求 得 每 个 中 方 格 的 平 均 值, 再 乘 上 25 或 16,

29 就 得 出 一 个 大 方 格 中 的 总 菌 数, 然 后 再 换 算 成 lml 菌 液 中 的 总 菌 数 设 五 个 中 方 格 中 的 总 菌 数 为 A, 菌 液 稀 释 倍 数 为 B, 如 果 是 25 个 中 方 格 的 计 数 板, 则 1mL 菌 液 中 的 总 菌 数 =A/ B=50000A B( 个 ) 同 理, 如 果 是 16 个 中 方 格 的 计 数 板, 1mL 菌 液 中 的 总 菌 数 =A/ B=32000A B( 个 ) ( 三 ) 器 材 1. 菌 种 酿 酒 酵 母 2. 仪 器 或 其 他 用 具 血 细 胞 计 数 板, 显 微 镜, 盖 玻 片, 无 菌 毛 细 滴 管 ( 四 ) 操 作 步 骤 l. 菌 悬 液 制 备 以 无 菌 生 理 盐 水 将 酿 酒 酵 母 制 成 浓 度 适 当 的 菌 悬 液 2. 镜 检 计 数 室 在 加 样 前, 先 对 计 数 板 的 计 数 室 进 行 镜 检 若 有 污 物, 则 需 清 洗, 吹 干 后 才 能 进 行 计 数 3. 加 样 品 将 清 洁 干 燥 的 血 细 胞 计 数 板 盖 上 盖 玻 片, 再 用 无 菌 的 毛 细 滴 管 将 摇 匀 的 酿 酒 酵 母 菌 悬 液 由 盖 玻 片 边 缘 滴 一 小 滴, 让 菌 液 沿 缝 隙 靠 毛 细 渗 透 作 用 自 动 进 入 计 数 室, 一 般 计 数 室 均 能 充 满 菌 液 取 样 时 先 要 摇 匀 菌 液 ; 加 样 时 计 数 室 不 可 有 气 泡 产 生 4. 显 微 镜 计 数 加 样 后 静 止 5min, 然 后 将 血 细 胞 计 数 板 置 于 显 微 镜 载 物 台 上, 先 用 低 倍 镜 找 到 计 数 室 所 在 位 置, 然 后 换 成 高 倍 镜 进 行 计 数 调 节 显 微 镜 光 线 的 强 弱 适 当, 对 于 用 反 光 镜 采 光 的 显 微 镜 还 要 注 意 光 线 不 要 偏 向 一 边, 否 则 视 野 中 不 易 舌 清 楚 计 数 室 方 格 线, 或 只 见 竖 线 或 只 见 横 线 在 计 数 前 若 发 现 菌 液 太 浓 或 太 稀, 需 重 新 调 节 稀 释 度 后 再 计 数 一 般 样 品 稀 释 度 要 求 每 小 格 内 约 有 5~10 个 菌 体 为 宜 每 个 计 数 室 选 5 个 中 格 ( 可 选 4 个 角 和 中 央 的 一 个 中 格 ) 中 的 菌 体 进 行 计 数 位 于 格 线 上 的 菌 体 一 般 只 数 上 方 和 右 边 线 上 的 如 遇 酵 母 出 芽, 芽 体 大 小 达 到 母 细 胞 的 一 半 时, 即 作 为 两 个 菌 体 计 数 计 数 一 个 样 品 要 从 两 个 计 数 室 中 计 得 的 平 均 数 值 来 计 算 样 品 的 含 菌 量 5. 清 洗 血 细 胞 计 数 板 使 用 完 毕 后, 将 血 细 胞 计 数 板 在 水 龙 头 用 水 冲 洗 干 净, 切 勿 用 硬 物 洗 刷, 洗 完 后 自 行 晾 干 或 用 吹 风 机 吹 干 镜 检, 观 察 每 小 格 内 是 否 有 残 留 菌 体 或 其 他 沉 淀 物 若 不 干 净, 则 必 须 重 复 洗 涤 至 干 净 为 止 ( 五 ) 实 验 报 告 l. 结 果 将 结 果 记 录 于 下 表 中 A 表 示 五 个 中 方 格 中 的 总 菌 数 ;B 表 示 菌 液 稀 释 倍 数 第 一 室 第 二 室 各 中 格 中 菌 数 A B 二 室 平 均 值 菌 数 /ml 2. 思 考 题 (1) 根 据 你 的 体 会, 说 明 用 血 细 胞 计 数 板 计 数 的 误 差 主 要 来 自 哪 些 方 面? 应 如 何 尽 量 减 少 误 差. 力 求 准 确? (2) 某 单 位 要 求 知 道 一 种 干 酵 母 粉 中 的 活 菌 存 活 率, 请 设 计 1~2 种 可 行 的 检 测 方 法 二 平 板 菌 落 计 数 法 ( 一 ) 目 的 要 求 学 习 平 板 菌 落 计 数 的 基 本 原 理 和 方 法 ( 二 ) 基 本 原 理 平 板 菌 落 计 数 法 是 将 待 测 样 品 经 适 当 稀 释 之 后, 其 中 的 微 生 物 充 分 分 散 成 单 个 细 胞, 取 一 定 量 的 稀 释 样 液 接 种 到 平 板 上, 经 过 培 养, 由 每 个 单 细 胞 生 长 繁 殖 而 形 成 肉 眼 可 见 的 菌

30 落, 即 一 个 单 菌 落 应 代 表 原 样 品 中 的 一 个 单 细 胞 统 计 菌 落 数, 根 据 其 稀 释 倍 数 和 取 样 接 种 量 即 可 换 算 出 样 品 中 的 含 菌 数 但 是, 由 于 待 测 样 品 往 往 不 易 完 全 分 散 成 单 个 细 胞, 所 以, 长 成 的 一 个 单 菌 落 也 可 来 自 样 品 中 的 2~3 或 更 多 个 细 胞 因 此 平 板 菌 落 计 数 的 结 果 往 往 偏 低 为 了 清 楚 地 阐 述 平 板 菌 落 计 数 的 结 果, 现 在 已 倾 向 使 用 菌 落 形 成 单 位 (colony-forming units,cfu) 而 不 以 绝 对 菌 落 数 来 表 示 样 品 的 活 菌 含 量 平 板 菌 落 计 数 法 虽 然 操 作 较 繁, 结 果 需 要 培 养 一 段 时 间 才 能 取 得, 而 且 测 定 结 果 易 受 多 种 因 素 的 影 响, 但 是, 由 于 该 计 数 方 法 的 最 大 优 点 是 可 以 获 得 活 菌 的 信 息, 所 以 被 广 泛 用 于 生 物 制 品 检 验 ( 如 活 菌 制 剂 ), 以 及 食 品 饮 料 和 水 ( 包 括 水 源 水 ) 等 的 含 菌 指 数 或 污 染 程 度 的 检 测 ( 三 ) 器 材 1. 菌 种 大 肠 杆 菌 菌 悬 液 2. 培 养 基 牛 肉 膏 蛋 白 陈 培 养 基 3. 仪 器 或 其 他 用 具 lm1 无 菌 吸 管, 无 菌 平 皿, 盛 有 4.5ml 无 菌 水 的 试 管, 试 管 架, 恒 温 培 养 箱 等 ( 四 ) 操 作 步 骤 l. 编 号 取 无 菌 平 皿 9 套, 分 别 用 记 号 笔 标 明 ( 稀 释 度 ) 各 3 套 另 取 6 支 盛 有 4.5mL 无 菌 水 的 试 管, 依 次 标 是 稀 释 用 lml 无 菌 吸 管 吸 取 lml 已 充 分 混 匀 的 大 肠 杆 菌 菌 县 液 ( 待 测 样 品 ), 精 确 地 放 0.5ml 至 10-1 的 试 管 中, 此 即 为 10 倍 稀 释 将 多 余 的 菌 液 放 回 原 菌 液 中 将 10-1 试 管 置 试 管 振 荡 器 上 振 荡, 使 菌 液 充 分 混 匀 另 取 一 支 lml 吸 管 插 入 10-1 试 管 中 来 回 吹 吸 菌 悬 液 三 次, 进 一 步 将 菌 体 分 散 混 匀 吹 吸 菌 液 时 不 要 太 猛 太 快, 吸 时 吸 管 伸 人 管 底, 吹 时 离 开 液 面, 以 免 将 吸 管 中 的 过 滤 棉 花 浸 湿 或 使 试 管 内 液 体 外 溢 用 此 吸 管 吸 取 10-1 菌 液 lml, 精 确 地 放 0.5mL 至 10-2 试 管 中, 此 即 为 100 倍 稀 释 其 余 依 次 类 推, 整 个 过 程 如 图 15-3 所 示 放 菌 液 时 吸 管 尖 不 要 碰 到 液 面, 即 每 一 支 吸 管 只 能 接 触 一 个 稀 释 度 的 菌 悬 液, 否 则 稀 释 不 精 确, 结 果 误 差 较 大 3, 取 样 用 三 支 1mL 无 菌 吸 管 分 别 吸 取 和 10-6 的 稀 释 菌 悬 液 各 lml, 对 号 放 入 编 好 号 的 无 菌 平 皿 中, 每 个 平 皿 放 0.2mL 不 要 用 lml 吸 管 每 次 只 靠 吸 管 尖 部 吸 0.2mL 稀 释 菌 液 放 入 平 皿 臼, 这 样 容 易 加 大 同 一 稀 释 度 几 个 重 复 平 板 间 的 操 作 误 差 4. 倒 平 板. 图 15 3 平 板 菌 落 计 数 操 作 步 骤

31 尽 快 向 上 述 盛 有 不 同 稀 释 度 菌 液 的 平 皿 中 倒 入 融 化 后 冷 却 至 45 左 右 的 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 约 15 毫 升 / 平 皿, 置 水 平 位 置 迅 速 旋 动 平 皿, 使 培 养 基 与 菌 液 混 合 均 匀, 而 又 不 使 培 养 基 荡 出 平 皿 或 溅 到 平 皿 盖 上 由 于 细 菌 易 吸 附 到 玻 璃 器 皿 表 面, 所 以 菌 液 加 入 到 培 养 皿 后, 应 尽 快 倒 入 融 化 并 于 已 冷 却 至 45 左 右 的 培 养 基, 立 即 摇 匀, 否 则 细 菌 将 不 易 分 散 或 长 成 的 菌 落 连 在 一 起, 影 响 计 数 待 培 养 基 凝 固 后, 将 平 板 倒 置 于 37 恒 温 培 养 箱 中 培 养 5. 计 数 培 养 48h 后, 取 出 培 养 平 板, 算 出 同 一 稀 释 度 三 个 平 板 上 的 菌 落 平 均 数, 并 按 下 列 公 式 进 行 计 算, 每 毫 升 中 菌 落 形 成 单 位 (cfu)= 同 一 稀 释 度 三 次 重 复 的 平 均 菌 落 数 稀 释 倍 数 5 一 般 选 择 每 个 平 板 上 长 有 30~300 个 菌 落 的 稀 释 度 计 算 每 毫 升 的 含 菌 量 较 为 合 适 同 一 稀 释 度 的 三 个 重 复 对 照 的 菌 落 数 不 应 相 差 很 大, 否 则 表 示 试 验 不 精 确 实 际 工 作 中 同 一 稀 释 度 重 复 对 照 平 板 不 能 少 于 三 个, 这 样 便 于 数 据 统 计, 减 少 误 差 由 三 个 稀 释 度 计 算 出 的 每 毫 升 菌 液 中 菌 落 形 成 单 位 数 也 不 应 相 差 太 大 平 板 菌 落 计 数 法, 所 选 择 倒 平 板 的 稀 释 度 是 很 重 要 的 一 般 以 三 个 连 续 稀 释 度 中 的 第 二 个 稀 释 度 倒 平 板 培 养 后 所 出 现 的 平 均 菌 落 数 在 50 个 左 右 为 好, 否 则 要 适 当 增 加 或 减 少 稀 释 度 加 以 调 整 平 板 菌 落 计 数 法 的 操 作 除 上 述 倾 注 倒 平 板 的 方 式 以 外, 还 可 以 用 涂 布 平 板 的 方 式 进 行 二 者 操 作 基 本 相 同, 所 不 同 的 是 后 者 先 将 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 融 化 后 倒 平 板, 待 凝 固 后 编 号, 并 于 37 左 右 的 温 箱 中 烘 烤 30min, 或 在 超 静 工 作 台 上 适 当 吹 干, 然 后 用 无 菌 吸 管 吸 取 稀 释 好 的 菌 液 对 号 接 种 于 不 同 稀 释 度 编 号 的 平 板 上, 并 尽 快 用 无 菌 玻 璃 涂 棒 将 菌 液 在 平 板 上 涂 布 均 匀, 平 放 于 实 验 台 上 20~30min, 使 菌 液 渗 入 培 养 基 表 层 内, 然 后 倒 置 37 的 恒 温 箱 中 培 养 24~48h 涂 布 平 板 用 的 菌 悬 液 量 一 般 以 0.1ml 较 为 适 宜, 如 果 过 少 菌 液 不 易 涂 布 开, 过 多 则 在 涂 布 完 后 或 在 培 养 时 菌 液 仍 会 在 平 板 表 面 流 动, 不 易 形 成 单 菌 落 五 实 验 报 告 1. 结 果 2. 将 培 养 后 菌 落 计 数 结 果 填 入 下 表 稀 释 度 Cfu 数 / 平 板 平 均 平 均 平 均 每 毫 升 中 的 cfu 2. 思 考 题 (1) 为 什 么 融 化 后 的 培 养 基 要 冷 却 至 45 左 右 才 能 倒 平 板? (2) 要 使 平 板 菌 落 计 数 准 确, 需 要 掌 握 哪 几 个 关 键? 为 什 么? (3) 试 比 较 平 板 菌 落 计 数 法 和 显 微 镜 下 直 接 计 数 法 的 优 缺 点 及 应 用 (4) 当 你 的 平 板 上 长 出 的 菌 落 不 是 均 匀 分 散 的 而 是 集 中 在 一 起 时, 你 认 为 问 题 出 在 哪 里? (5) 用 倒 平 板 法 和 涂 布 法 计 数, 其 平 板 上 长 出 的 菌 落 有 何 不 同? 为 什 么 要 培 养 较 长 时 间 (48h) 后 观 察 结 果? 三 光 电 比 浊 计 数 法 一 目 的 要 求 1. 了 解 光 电 比 浊 计 数 法 的 原 理 2. 学 习 掌 握 光 电 比 浊 计 数 法 的 操 作 方 法 二 基 本 原 理 当 光 线 通 过 微 生 物 菌 悬 液 时, 由 于 菌 体 的 散 射 及 吸 收 作 用 使 光 线 的 透 过 量 降 低 在 一 定 的 范 围 内, 微 生 物 细 胞 浓 度 与 透 光 度 成 反 比, 与 光 密 度 成 正 比, 而 光 密 度 或 透 光 度 可 以 由

32 光 电 池 精 确 测 出 ( 图 15-4) 因 此, 可 用 一 系 列 已 知 菌 数 的 菌 悬 液 测 定 光 密 度, 作 出 光 密 度 菌 数 标 准 曲 线 然 后, 以 样 品 液 所 测 得 的 光 密 度, 从 标 准 曲 线 中 查 出 对 应 的 菌 数 制 作 标 准 曲 线 时, 菌 体 计 数 可 采 用 血 细 胞 计 数 板 计 数, 平 板 菌 落 计 数 或 细 胞 干 重 测 定 等 方 法 本 实 验 采 用 血 细 胞 计 数 板 计 数 光 电 比 浊 计 数 法 的 优 点 是 简 便 迅 速, 可 以 连 续 测 定, 适 合 于 自 动 控 制 但 是, 由 于 光 密 度 或 透 光 度 除 了 受 菌 体 浓 度 影 响 之 外, 还 受 细 胞 大 小 形 态 培 养 液 成 分 以 及 所 采 用 的 光 波 长 等 因 素 的 影 响 因 此, 对 于 不 同 微 生 物 的 菌 悬 液 进 行 光 电 比 浊 计 数 应 采 用 相 同 的 菌 株 和 培 养 条 件 制 作 标 准 曲 线 光 波 的 选 择 通 常 在 400~700nm 之 间, 具 体 到 某 种 微 生 物 采 用 多 少 还 需 要 经 过 最 大 吸 收 波 长 以 及 稳 定 性 试 验 来 确 定 另 外, 对 于 颜 色 太 深 的 样 品 或 在 样 品 中 还 含 有 其 他 干 扰 物 质 的 悬 液 不 适 合 用 此 法 进 行 测 定 图 15 4 比 浊 法 测 定 细 胞 浓 度 的 原 理 ( 三 ) 器 材 1. 菌 种 酿 酒 酵 母 培 养 液 2. 仪 器 或 其 他 用 具 721 型 分 光 光 度 计, 血 细 胞 计 数 板, 显 微 镜, 试 管, 吸 水 纸, 无 菌 吸 管, 无 菌 生 理 盐 水 等 ( 四 ) 操 作 步 骤 1. 标 准 曲 线 制 作 (1) 编 号 取 无 菌 试 管 7 支, 分 别 用 记 号 笔 将 试 管 编 号 为 (2) 调 整 菌 液 浓 度 用 血 细 胞 计 数 板 计 数 培 养 24 小 时 的 酿 酒 酵 母 菌 悬 液, 并 用 无 菌 生 理 盐 水 分 别 稀 释 调 整 为 每 毫 升 含 菌 数 的 细 胞 悬 液 再 分 别 装 入 已 编 好 号 的 1 至 7 号 无 菌 试 管 中 (3) 测 OD 值 将 1 至 7 号 不 同 浓 度 的 菌 悬 液 摇 均 匀 后 于 560nm 波 长 1cm 比 色 皿 中 测 定 OD 值 比 色 测 定 时, 用 无 菌 生 理 盐 水 作 空 白 对 照, 并 将 OD 值 填 入 下 表 管 号 细 胞 数 10 6 /ml 光 密 度 (OD) 每 管 菌 悬 液 在 测 定 OD 值 时 均 必 须 先 摇 匀 后 再 倒 入 比 色 皿 中 测 定 (4) 以 光 密 度 (OD) 值 为 纵 坐 标, 以 每 毫 升 细 胞 数 为 横 坐 标, 绘 制 标 准 曲 线 2. 样 品 测 定 将 待 测 样 品 用 无 菌 生 理 盐 水 适 当 稀 释, 摇 均 匀 后, 用 560nm 波 长 lcm 比 色 皿 测 定 光 密 度 测 定 时 用 无 菌 生 理 盐 水 作 空 白 对 照 各 种 操 作 条 件 必 须 与 制 作 标 准 曲 线 时 的 相 同, 否 则, 测 得 值 所 换 算 的 含 菌 数 就 不 准 确 3. 根 据 所 测 得 的 光 密 度 值, 从 标 准 曲 线 查 得 每 毫 升 的 含 菌 数 ( 五 ) 实 验 报 告 l. 结 果 每 毫 升 样 品 原 液 菌 数 = 从 标 准 曲 线 查 得 每 毫 升 的 菌 数 稀 释 倍 数

33 2. 思 考 题 (1) 光 电 比 浊 计 数 的 原 理 是 什 么? 这 种 计 数 法 有 何 优 缺 点? (2) 光 电 比 浊 计 数 在 生 产 实 践 中 有 何 应 用 价 值? (3) 本 实 验 为 什 么 采 用 560nm 波 长 测 定 酵 母 菌 悬 液 的 光 密 度? 如 果 你 在 实 验 中 需 要 测 定 大 肠 杆 菌 生 长 的 OD 值, 你 将 如 何 选 择 波 长? 四 大 肠 杆 菌 生 长 曲 线 的 测 定 ( 一 ) 目 的 要 求 1. 通 过 细 菌 数 量 的 测 量 了 解 大 肠 杆 菌 的 生 物 特 征 和 规 律, 绘 制 生 长 线 2. 复 习 光 电 比 浊 法 测 量 细 菌 数 量 的 方 法 ( 二 ) 基 本 原 理 大 多 数 细 菌 的 繁 殖 速 率 很 快, 在 合 适 的 条 件 下, 一 定 时 期 的 大 肠 杆 菌 细 胞 每 20min 分 裂 一 次 将 一 定 量 的 细 菌 转 入 新 鲜 液 体 培 养 基 中, 在 适 宜 的 条 件 下 培 养 细 胞 要 经 历 延 迟 期, 对 数 期 稳 定 期 和 衰 亡 期 四 个 阶 段 以 培 养 时 间 为 横 坐 标, 以 细 菌 数 目 的 对 数 或 生 长 速 率 为 纵 坐 标 作 图 所 绘 制 的 曲 线 称 为 该 细 菌 的 生 长 曲 线 不 同 的 细 菌 在 相 同 的 培 养 条 件 下 其 生 长 曲 线 不 同, 同 样 的 细 菌 在 不 同 的 培 养 条 件 下 所 绘 制 的 生 长 曲 线 也 不 相 同 测 定 细 菌 的 生 长 曲 线, 了 解 其 生 长 繁 殖 规 律, 这 对 人 们 根 据 不 同 的 需 要, 有 效 地 利 用 和 控 制 细 菌 的 生 长 具 有 重 要 意 义 用 于 测 定 细 菌 细 胞 数 量 的 方 法 已 在 上 述 实 验 作 了 介 绍 本 实 验 用 分 光 光 度 计 (spectrophotometer) 进 行 光 电 比 浊 测 定 不 同 培 养 时 间 细 菌 悬 浮 液 的 OD 值, 绘 制 生 长 曲 线 也 可 以 直 接 用 试 管 或 带 有 测 定 管 的 三 角 瓶 ( 图 15-5) 测 定 klett units 值 的 光 度 计 如 图 15 6 所 示, 只 要 接 种 1 支 试 管 或 1 个 带 测 定 管 的 三 角 瓶, 在 不 同 的 培 养 时 间 ( 横 坐 标 ) 取 样 测 定, 以 测 得 的 klett units 为 纵 坐 标, 便 可 很 方 便 地 绘 制 出 细 菌 的 生 长 曲 线 如 果 需 要, 可 根 据 公 式 1 klett units=od/0.002 换 算 出 所 测 菌 悬 液 的 OD 值 图 15 5 带 侧 臂 试 管 的 三 角 烧 瓶 ( 三 ) 器 材 1. 菌 种 大 肠 杆 菌 2. 培 养 基 LB 液 体 培 养 基 70ml, 分 装 2 支 大 试 管 (5ml/ 支 ), 剩 余 60ml 装 入 250ml 的 三 角 瓶 3. 仪 器 或 其 他 用 具 722 型 分 光 光 度 计, 水 浴 振 荡 摇 床, 无 菌 试 管, 无 菌 吸 管 等

34 图 15 6 直 接 用 试 管 测 OD 值 ( 四 ) 操 作 步 骤 1. 标 记 取 11 支 无 菌 大 试 管, 用 记 号 笔 分 别 标 明 培 养 时 间, 即 和 20h 2. 接 种 分 别 用 5ml 无 菌 吸 管 吸 取 2.5ml 大 肠 杆 菌 过 夜 培 养 液 ( 培 养 10~12h) 转 入 盛 有 50ml LB 液 的 三 角 瓶 内, 混 合 均 匀 后 分 别 取 5ml 混 合 液 放 入 上 述 标 记 的 11 支 无 菌 大 试 管 中 3. 培 养 将 已 接 种 的 试 管 置 摇 床 37 振 荡 培 养 ( 振 荡 频 率 250r/min), 分 别 培 养 和 20h, 将 标 有 相 应 时 间 的 试 管 取 出, 立 即 放 冰 箱 中 贮 存, 最 后 一 同 比 浊 测 定 其 光 密 度 值 4. 比 浊 测 定 用 未 接 种 的 LB 液 体 培 养 基 作 空 白 对 照, 选 用 600nm 波 长 进 行 光 电 比 浊 测 定 从 早 取 出 的 培 养 液 开 始 依 次 测 定, 对 细 胞 密 度 大 的 培 养 液 用 LB 液 体 培 养 基 适 当 稀 释 后 测 定, 使 其 光 密 度 值 在 0.1~0.65 之 内 ( 测 定 OD 值 前, 将 待 测 定 的 培 养 液 振 荡, 使 细 胞 均 匀 分 布 ) 本 操 作 步 骤 也 可 用 简 便 的 方 法 代 替 : 1. 用 1ml 无 菌 吸 管 取 0.25ml 大 肠 杆 菌 过 夜 培 养 液 转 入 盛 有 3~5ml LB 液 的 试 管 中 混 匀 后 将 试 管 直 接 插 入 分 光 光 度 计 的 比 色 糟 中, 比 色 糟 上 方 用 自 制 的 暗 盒 将 试 管 及 比 色 暗 室 全 部 罩 上, 形 成 一 个 大 的 暗 环 境, 另 以 1 支 盛 有 LB 液 但 没 有 接 种 的 试 管 调 零 点, 测 定 样 品 中 培 养 0h 的 OD 值 测 定 完 毕 后, 取 出 试 管 置 37 继 续 振 荡 培 养 2. 分 别 在 培 养 和 20h, 取 出 培 养 物 试 管 按 上 述 方 法 测 定 OD 值 该 方 法 准 确 度 高 操 作 简 便 但 须 注 意 的 是 使 用 的 2 支 试 管 要 很 干 净, 其 透 光 程 度 愈 接 近, 测 定 的 准 确 度 愈 高 ( 五 ) 实 验 报 告 1. 结 果 (1) 将 测 定 的 OD 600 值 填 入 下 表 : 培 养 时 间 (h) 对 照 光 密 度 值 OD 600 (2) 绘 制 大 肠 杆 菌 的 生 长 曲 线 OD 600 值 培 养 时 间 /h 2. 思 考 题 (1) 如 果 用 活 菌 计 数 法 制 作 生 长 曲 线, 你 认 为 会 有 什 么 不 同? 两 者 各 有 什 么 优 缺 点?

35 (2) 细 菌 生 长 繁 殖 所 经 历 的 四 个 时 期 中, 哪 个 时 期 其 代 时 最 短? 若 细 胞 密 度 为 10 3 /ml, 培 养 4.5h 后, 其 密 度 高 达 /ml, 计 计 算 出 其 代 时 (3) 次 生 代 谢 产 物 的 大 量 积 累 在 哪 个 时 期? 根 据 细 菌 生 长 繁 殖 的 规 律, 采 用 哪 些 措 施 可 使 次 生 代 谢 产 物 积 累 更 多? 实 验 16 微 生 物 的 生 理 生 化 反 应 微 生 物 生 理 生 化 反 应 的 多 样 性 在 自 然 界 产 生 了 两 种 结 果 : 第 一 是 使 自 然 界 的 有 机 分 子 都 有 可 能 得 到 分 解 ; 第 二 是 使 不 同 微 生 物 之 间 有 了 互 相 作 用 和 互 相 依 赖 的 基 础 例 如, 一 种 微 生 物 能 利 用 另 一 种 微 生 物 所 分 解 的 产 物, 或 者 一 种 微 生 物 的 产 物 可 抑 制 或 杀 死 另 一 种 微 生 物 所 以 微 生 物 的 生 理 生 化 反 应 也 被 作 为 细 菌 鉴 定 和 分 类 的 内 容 一 大 分 子 物 质 的 水 解 试 验 ( 一 ) 目 的 要 求 1. 证 明 不 同 微 生 物 对 各 种 有 机 大 分 子 的 水 解 能 力 不 同, 从 而 说 明 不 同 微 生 物 有 着 不 同 的 酶 系 统 2. 掌 握 进 行 微 生 物 大 分 子 水 解 试 验 的 原 理 和 方 法 ( 二 ) 基 本 原 理 微 生 物 对 大 分 子 的 淀 粉 蛋 白 质 和 脂 肪 不 能 直 接 利 用, 必 须 靠 产 生 的 胞 外 酶 将 大 分 子 物 质 分 解 才 能 被 微 生 物 吸 收 利 用 胞 外 酶 主 要 为 水 解 酶, 通 过 加 水 裂 解 大 的 物 质 为 较 小 的 化 合 物, 使 其 能 被 运 输 至 细 胞 内 如 淀 粉 酶 水 解 淀 粉 为 小 分 子 的 糊 精 双 糖 和 单 糖 ; 脂 肪 酶 水 解 脂 肪 为 甘 油 和 脂 肪 酸 ; 蛋 白 酶 水 解 蛋 白 质 为 氨 基 酸 等 这 些 过 程 均 可 通 过 观 察 细 菌 菌 落 周 围 的 物 质 变 化 来 证 实 : 淀 粉 遇 碘 液 会 产 生 蓝 色, 但 细 菌 水 解 淀 粉 的 区 域, 用 碘 测 定 不 再 产 生 蓝 色, 表 明 细 菌 产 生 淀 粉 酶 脂 肪 水 解 后 产 生 脂 肪 酸 可 改 变 培 养 基 的 ph, 使 ph 降 低, 加 入 培 养 基 的 中 性 红 指 示 剂 会 使 培 养 基 从 淡 红 色 变 为 深 红 色, 说 明 胞 外 存 在 着 脂 肪 酶 微 生 物 可 以 利 用 各 种 蛋 白 质 和 氨 基 酸 作 为 氮 源 外, 当 缺 乏 糖 类 物 质 时, 亦 可 用 它 们 作 为 碳 源 和 能 源 明 胶 是 由 胶 原 蛋 白 经 水 解 产 生 的 蛋 白 质, 在 25 以 下 可 维 持 凝 胶 状 态, 以 固 体 形 式 存 在 而 在 25 以 上 明 胶 就 会 液 化 有 些 微 生 物 可 产 生 一 种 称 作 明 胶 酶 的 胞 外 酶, 水 解 这 种 蛋 白 质, 而 使 明 胶 液 化, 甚 至 在 4 仍 能 保 持 液 化 状 态 还 有 些 微 生 物 能 水 解 牛 奶 中 的 蛋 白 质 酪 素, 酪 素 的 水 解 可 用 石 蕊 牛 奶 来 检 测 石 蕊 培 养 基 由 脱 脂 牛 奶 和 石 蕊 组 成, 是 昏 浊 的 蓝 色 酪 素 水 解 成 氨 基 酸 和 肽 后, 培 养 基 就 会 变 得 透 明 石 蕊 牛 奶 也 常 被 用 来 检 测 乳 糖 发 酵, 因 为 在 酸 存 在 下, 石 蕊 会 转 变 为 粉 红 色, 而 过 量 的 酸 可 引 起 牛 奶 的 固 化 ( 凝 乳 形 成 ) 氨 基 酸 的 分 解 会 引 起 碱 性 反 应, 使 石 蕊 变 为 紫 色 此 外, 某 些 细 菌 能 还 原 石 蕊, 使 试 管 底 部 变 为 白 色 尿 素 是 由 大 多 数 哺 乳 动 物 消 化 蛋 白 质 后 被 分 泌 在 尿 中 的 废 物 尿 素 酶 能 分 解 尿 素 释 放 出 氨, 这 是 一 个 分 辨 细 菌 很 有 用 的 诊 断 实 验 尽 管 许 多 微 生 物 都 可 以 产 生 尿 素 酶, 但 它 们 利 用 尿 素 的 速 度 比 变 形 杆 菌 属 (Proteus) 的 细 菌 要 慢, 因 此 尿 素 酶 试 验 被 用 来 从 其 他 非 发 酵 乳 糖 的 肠 道 微 生 物 中 快 速 区 分 这 个 属 的 成 员 尿 素 琼 脂 含 有 蛋 白 胨, 葡 萄 糖, 尿 素 和 酚 红 酚 红 在 ph6.8 时 为 黄 色, 而 在 培 养 过 程 中, 产 生 尿 素 酶 的 细 菌 将 分 解 尿 素 产 生 氨, 使 培 养 基 的 ph 升 高, 在 ph 升 至 8.4 时, 指 示 剂 就 转 变 为 深 粉 红 色 ( 三 ) 器 材 1. 菌 种 枯 草 芽 胞 杆 菌, 大 肠 杆 菌, 金 黄 色 葡 萄 球 菌, 铜 绿 假 单 胞 菌 (Pseudomonas aeruginosa), 普 通 变 形 杆 菌 2. 培 养 基 固 体 油 脂 培 养 基, 固 体 淀 粉 培 养 基, 明 胶 培 养 基 试 管, 石 蕊 牛 奶 试 管, 尿 素 琼 脂 试 管 3. 溶 液 或 试 剂 革 兰 氏 染 色 用 卢 戈 氏 碘 液 (Lugol s iodine solution) 4. 仪 器 或 其 他 用 具 无 菌 平 板, 无 菌 试 管, 接 种 环, 接 种 针, 试 管 架 ( 四 ) 操 作 步 骤 l. 淀 粉 水 解 试 验 (1) 将 固 体 淀 粉 培 养 基 溶 化 后 冷 却 至 50 左 右, 无 菌 操 作 制 成 平 板

36 (2) 用 记 号 笔 在 平 板 底 部 划 成 四 部 分 (3) 将 枯 草 芽 孢 杆 菌, 大 肠 杆 菌, 金 黄 色 葡 萄 球 菌, 铜 绿 假 单 胞 菌 分 别 在 不 同 的 部 分 划 线 接 种, 在 平 板 的 反 面 分 别 在 四 部 分 写 上 菌 名 (4) 将 平 板 倒 置 在 37 温 箱 中 培 养 24h (5) 观 察 各 种 细 菌 的 生 长 情 况, 将 平 板 打 开 盖 子, 滴 入 少 量 Lugol s 碘 液 于 平 皿 中, 轻 轻 旋 转 平 板, 使 碘 液 均 匀 铺 满 整 个 平 板 如 菌 苔 周 围 出 现 无 色 透 明 圈, 说 明 淀 粉 己 被 水 解, 为 阳 性 透 明 圈 的 大 小 可 初 步 判 断 该 菌 水 解 淀 粉 能 力 的 强 弱, 即 产 生 胞 外 淀 粉 酶 活 力 的 高 低 2. 油 脂 水 解 试 验 (1) 将 溶 化 的 固 体 油 脂 培 养 基 冷 却 至 50 左 右 时, 充 分 摇 荡, 使 油 脂 均 匀 分 布 无 菌 操 作 倒 入 平 板, 待 凝 (2) 用 记 号 笔 在 平 板 底 部 划 成 四 部 分, 分 别 标 上 菌 名 (3) 将 上 述 四 种 菌 分 别 用 无 菌 操 作 划 + 字 接 种 于 平 板 的 相 对 应 部 分 的 中 心 (4) 将 平 板 倒 置, 于 37 温 箱 中 培 养 24h (5) 取 出 平 板, 观 察 菌 苔 颜 色, 如 出 现 红 色 斑 点 说 明 脂 肪 水 解, 为 阳 性 反 应 3. 明 胶 水 解 试 验 (1) 取 三 支 明 胶 培 养 基 试 管, 用 记 号 笔 标 明 各 管 欲 接 种 的 菌 名 (2) 用 接 种 针 分 别 穿 刺 接 种 ( 见 图 3 4B) 枯 草 芽 抱 杆 菌, 大 肠 杆 菌, 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (3) 将 接 种 后 的 试 管 置 20 中, 培 养 2~5d (4) 观 察 明 胶 液 化 情 况 ( 图 16-1) 图 16 1 明 胶 穿 刺 液 化 的 形 态 4. 石 蕊 牛 奶 试 验 (1) 取 两 支 石 蕊 牛 奶 培 养 基 试 管, 用 记 号 笔 标 明 各 管 欲 接 种 的 菌 名 (2) 分 别 接 种 普 通 变 形 杆 菌 和 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (3) 将 接 种 后 的 试 管 置 35 中, 培 养 24~48h (4) 观 察 培 养 基 颜 色 变 化 石 蕊 在 酸 性 条 件 下 为 粉 红 色, 碱 性 条 件 下 为 紫 色, 而 被 还 原 时 为 白 色 5. 尿 素 试 验 (1) 取 两 支 尿 素 培 养 基 斜 面 试 管, 用 记 号 笔 标 明 各 管 欲 接 种 的 菌 名 (2) 分 别 接 种 普 通 变 形 杆 菌 和 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (3) 将 接 种 后 的 试 管 置 35 中, 培 养 24~48h (4) 观 察 培 养 基 颜 色 变 化 尿 素 酶 存 在 时 为 红 色, 无 尿 素 酶 时 应 为 黄 色 ( 五 ) 实 验 报 告 1. 结 果 将 结 果 填 入 下 表, + 表 示 阳 性, - 表 示 阴 性 菌 名 枯 草 芽 孢 杆 菌 淀 粉 水 解 试 验 脂 肪 水 解 试 验 明 胶 液 化 试 验 石 蕊 牛 奶 试 验 尿 素 试 验

37 大 肠 杆 菌 金 黄 色 葡 萄 球 菌 铜 绿 假 单 胞 菌 普 通 变 形 杆 菌 2. 思 考 题 (1) 你 怎 样 解 释 淀 粉 酶 是 胞 外 酶 而 非 胞 内 酶? (2) 不 利 用 碘 液, 你 怎 样 证 明 淀 粉 水 解 的 存 在? (3) 接 种 后 的 明 胶 试 管 可 以 在 35 培 养, 在 培 养 后 你 必 须 做 什 么 才 能 证 明 水 解 的 存 在? (4) 解 释 在 石 蕊 牛 奶 中 的 石 蕊 为 什 么 能 起 到 氧 化 还 原 指 示 剂 的 作 用? (5) 为 什 么 尿 素 试 验 可 用 于 鉴 定 Proteus 细 菌? 二 糖 发 酵 试 验 ( 一 ) 目 的 要 求 1. 了 解 糖 发 酵 的 原 理 和 在 肠 道 细 菌 鉴 定 中 的 重 要 作 用 2. 掌 握 通 过 糖 发 酵 鉴 别 不 同 微 生 物 的 方 法 ( 二 ) 基 本 原 理 糖 发 酵 试 验 是 常 用 的 鉴 别 微 生 物 的 生 化 反 应, 在 肠 道 细 菌 的 鉴 定 上 尤 为 重 要 绝 大 多 数 细 菌 都 能 利 用 糖 类 作 为 碳 源 和 能 源, 但 是 它 们 在 分 解 糖 类 物 质 的 能 力 上 有 很 大 的 差 异 有 些 细 菌 能 分 解 某 种 糖 产 生 有 机 酸 ( 如 乳 酸 醋 酸 丙 酸 等 ) 和 气 体 ( 如 氢 气 甲 烷 二 氧 化 碳 等 ); 有 些 细 菌 只 产 酸 不 产 气 例 如 大 肠 杆 菌 能 分 解 乳 糖 和 葡 萄 糖 产 酸 并 产 气 ; 伤 寒 杆 菌 分 解 葡 萄 糖 产 酸 不 产 气, 不 能 分 解 乳 糖 ; 普 通 变 形 杆 菌 分 解 葡 萄 糖 产 酸 产 气, 不 能 分 解 乳 糖 发 酵 培 养 基 含 有 蛋 白 胨, 指 示 剂 ( 溴 甲 酚 紫 ), 倒 置 的 德 汉 氏 小 管 和 不 同 的 糖 类 当 发 酵 产 酸 时, 溴 甲 酚 紫 指 示 剂 可 由 紫 色 (ph6.8) 变 为 黄 色 (ph5.2) 气 体 的 产 生 可 由 倒 置 的 德 汉 氏 试 管 中 有 无 气 泡 来 证 明 如 图 16 2 图 16 2 糖 发 酵 试 验 A. 培 养 前 的 情 况 ;B. 培 养 后 产 酸 不 产 气 ; C. 培 养 后 产 酸 产 气 ( 三 ) 器 材 1. 菌 种 大 肠 杆 菌, 普 通 变 形 杆 菌 斜 面 各 一 支 2. 培 养 基 葡 萄 糖 发 酵 培 养 基 试 管 和 乳 糖 发 酵 培 养 基 试 管 各 3 支 ( 内 装 有 倒 置 的 德 汉 氏 小 试 管 ) 3. 仪 器 或 其 他 用 具 试 管 架, 接 种 环 等 ( 四 ) 操 作 步 骤 1. 用 记 号 笔 在 各 试 管 外 壁 上 分 别 标 明 发 酵 培 养 基 名 称 和 所 接 种 的 细 菌 菌 名 2. 取 葡 萄 糖 发 酵 培 养 基 试 管 3 支, 分 别 接 入 大 肠 杆 菌, 普 通 变 形 杆 菌, 第 三 支 不 接 种, 作 为 照 另 取 乳 糖 发 酵 培 养 基 试 管 3 支, 同 样 分 别 接 入 大 肠 杆 菌, 普 通 变 形 杆 菌, 第 三 支 不

38 接 种, 作 为 对 照 在 接 种 后, 轻 缓 摇 动 试 管, 使 其 均 匀, 防 止 倒 置 的 小 管 进 入 气 泡 3. 将 接 种 过 和 作 为 对 照 的 6 支 试 管 均 置 37 培 养 24~48h 4. 观 察 各 试 管 颜 色 变 化 及 德 汉 氏 小 管 中 有 无 气 泡 五 实 验 报 告 1. 结 果 将 结 果 填 入 下 表 + 表 示 产 酸 或 产 气, - 表 示 不 产 酸 或 不 产 气 糖 类 发 酵 大 肠 杆 菌 普 通 变 形 杆 菌 对 照 葡 萄 糖 发 酵 乳 糖 发 酵 2. 思 考 题 假 如 某 种 微 生 物 可 以 有 氧 代 谢 葡 萄 糖, 发 酵 试 验 应 该 出 现 什 么 结 果? 三 IMViC 与 硫 化 氢 试 验 ( 一 ) 目 的 要 求 了 解 IMViC 与 硫 化 氢 反 应 的 原 理 及 其 在 肠 道 菌 鉴 定 中 的 意 义 和 方 法 ( 二 ) 基 本 原 理 IMViC 是 吲 哚 (indol test) 甲 基 红 (methy1 red test) 伏 一 普 (Voges-Prokauer test) 和 柠 檬 酸 盐 (citrate test) 四 个 试 验 的 缩 写,I 是 在 英 文 中 为 了 发 音 方 便 而 加 上 的 这 四 个 试 验 主 要 是 用 来 快 速 鉴 别 大 肠 杆 菌 和 产 气 肠 杆 菌 (Enterobacter aerogenes), 多 用 于 水 的 细 菌 学 检 查 大 肠 杆 菌 虽 非 致 病 菌, 但 在 饮 用 水 中 若 超 过 一 定 数 量, 则 表 示 受 粪 便 污 染 产 气 肠 杆 菌 也 广 泛 存 在 于 自 然 界 中, 因 此 检 查 水 时 要 将 两 者 分 开 硫 化 氢 试 验 也 是 检 查 肠 道 杆 菌 的 生 化 试 验 吲 哚 试 验 是 用 来 检 测 吲 哚 的 产 生 有 些 细 菌 能 产 生 色 氨 酸 酶, 分 解 蛋 白 胨 中 的 色 氨 酸 产 生 吲 哚 和 丙 酮 酸 吲 哚 与 对 二 甲 基 氨 基 苯 甲 醛 结 合, 形 成 红 色 的 玫 瑰 吲 哚 但 并 非 所 有 微 生 物 都 具 有 分 解 色 氨 酸 产 生 吲 哚 的 能 力, 因 此 吲 哚 试 验 可 以 作 为 一 个 生 物 化 学 检 测 的 指 标 色 氨 酸 水 解 反 应 : 吲 哚 与 对 二 甲 基 氨 基 苯 甲 醛 反 应 : 大 肠 杆 菌 吲 哚 反 应 阳 性, 产 气 肠 杆 菌 为 阴 性 甲 基 红 试 验 是 用 来 检 测 由 葡 萄 糖 产 生 的 有 机 酸, 如 甲 酸 乙 酸 乳 酸 等 当 细 菌 代 谢 糖 产 生 酸 时, 培 养 基 就 会 变 酸, 使 加 入 培 养 基 的 甲 基 红 指 示 剂 由 橘 黄 色 (ph6.3) 变 为 红 色 (ph4.2), 即 甲 基 红 反 应 尽 管 所 有 的 肠 道 微 生 物 都 能 发 酵 葡 萄 糖 产 生 有 机 酸, 但 这 个 试 验 在 区 分 大 肠 杆 菌 和 产 气 肠 杆 菌 上 仍 然 是 有 价 值 的 这 两 个 细 菌 在 培 养 的 早 期 均 产 生 有 机 酸, 但 大 肠 杆 菌 在 培 养 后 期 仍 能 维 持 酸 性 ph4, 而 产 气 肠 杆 菌 则 转 化 有 机 酸 为 非 酸 性 末 端 产 物,

39 如 乙 醇 丙 酮 酸 等, 使 ph 升 至 大 约 6 因 此 大 肠 杆 菌 为 阳 性 反 应, 产 气 肠 杆 菌 为 阴 性 反 应 伏 - 普 试 验 是 用 来 测 定 某 些 细 菌 利 用 葡 萄 糖 产 生 非 酸 性 或 中 性 末 端 产 物 的 能 力, 如 丙 酮 酸 丙 酮 酸 进 行 缩 合 脱 羧 生 成 乙 酰 甲 基 甲 醇, 此 化 合 物 在 碱 性 条 件 下 能 被 空 气 中 的 氧 气 氧 化 成 二 乙 酰 二 乙 酰 与 蛋 白 胨 中 精 氨 酸 的 胍 基 作 用, 生 成 红 色 化 合 物, 即 伏 - 普 反 应 阳 性 ; 不 产 生 红 色 化 合 物 者 为 阴 性 反 应 有 时 为 了 使 反 应 更 为 明 显, 可 加 入 少 量 含 胍 基 的 化 合 物, 如 肌 酸 等 其 化 学 反 应 过 程 如 下 : 柠 檬 酸 盐 试 验 是 用 来 检 测 柠 檬 酸 盐 是 否 被 利 用 有 些 细 菌 能 够 利 用 柠 檬 酸 钠 作 为 碳 源, 如 产 气 肠 杆 菌 ; 而 另 一 些 细 菌 则 不 能 利 用 柠 檬 酸 盐, 如 大 肠 杆 菌 细 菌 在 分 解 柠 檬 酸 盐 及 培 养 基 中 的 磷 酸 铵 后, 产 生 碱 性 化 合 物, 使 培 养 基 的 ph 升 高, 当 加 入 1% 溴 麝 香 草 酚 蓝 指 示 剂 时, 培 养 基 就 会 由 绿 色 变 为 深 蓝 色 溴 麝 香 草 酚 蓝 的 指 示 范 围 为 :ph 小 于 6.0 时 呈 黄 色, ph 在 6.0~7.0 时 为 绿 色,pH 大 于 7.6 时 呈 蓝 色 硫 化 氢 试 验 是 检 测 硫 化 氢 的 产 生, 也 是 用 于 肠 道 细 菌 检 查 的 常 用 生 化 试 验 有 些 细 菌 能 分 解 含 硫 的 有 机 物, 如 胱 氨 酸 半 胱 氨 酸 甲 硫 氨 酸 等 产 生 硫 化 氢, 硫 化 氢 一 遇 培 养 基 中 的 铅 盐 或 铁 盐 等, 就 形 成 黑 色 的 硫 化 铅 或 硫 化 铁 沉 淀 物 以 半 胱 氨 酸 为 例, 其 化 学 反 应 过 程 如 下 : CH 2 SHCHNH 2 COOH+H 2 O CH 3 COCOOH+H 2 S +NH 3 H 2 S+Pb(CH 3 COO) 2 PbS +2CH 3 COOH ( 黑 色 ) 大 肠 杆 菌 为 阴 性, 产 气 肠 杆 菌 为 阳 性 ( 三 ) 器 材 l. 菌 种 大 肠 杆 菌, 产 气 肠 杆 菌 2. 培 养 基 蛋 白 胨 水 培 养 基, 葡 萄 糖 蛋 白 胨 水 培 养 基, 柠 檬 酸 盐 斜 面 培 养 基, 醋 酸 铅 培 养 基 在 配 制 柠 檬 酸 盐 斜 面 培 养 基 时, 其 ph 不 要 偏 高, 以 浅 绿 色 为 宜, 吲 哚 试 验 中 用 的 蛋 白 胨 水 培 养 基 中 宜 选 用 色 氨 酸 含 量 高 的 蛋 白 胨, 如 用 胰 蛋 白 酶 水 解 酪 素 得 到 的 蛋 白 胨 较 好 3. 溶 液 或 试 剂 甲 基 红 指 示 剂,40%KOH,5%α- 萘 蔡 酚, 乙 醚, 吲 哚 试 剂 等 ( 四 ) 操 作 步 骤 l. 接 种 与 培 养 (1) 用 接 种 针 将 大 肠 杆 菌 产 气 肠 杆 菌 分 别 穿 刺 接 入 2 支 醋 酸 铅 培 养 基 中 ( 硫 化 氢 试 验 ), 置 37C 培 养 48h

40 (2) 将 上 述 二 菌 分 别 接 种 于 2 支 蛋 白 胨 水 培 养 基 ( 吲 哚 试 验 ),2 支 葡 萄 糖 蛋 白 胨 水 培 养 基 ( 甲 基 红 试 验 和 伏 - 普 试 验 ),2 支 柠 檬 酸 盐 斜 面 培 养 基 和 2 支 醋 酸 铅 培 养 基 中, 置 37 培 养 2d 2. 结 果 观 察 (1) 硫 化 氢 试 验 培 养 48h 后 观 察 黑 色 硫 化 铅 的 产 生 (2) 吲 哚 试 验 于 培 养 2d 后 的 蛋 白 陈 水 培 养 基 内 加 3~4 滴 乙 醚, 摇 动 数 次, 静 置 1~3min, 待 乙 醚 上 升 后, 沿 试 管 壁 徐 徐 加 入 2 滴 吲 哚 试 剂, 在 乙 醚 和 培 养 物 之 间 产 生 红 色 环 状 物 为 阳 性 反 应 配 制 蛋 白 胨 水 培 养 基, 所 用 的 蛋 白 胨 最 好 用 含 色 氨 酸 高 的, 如 用 胰 蛋 白 酶 水 解 酪 素 得 到 的 蛋 白 胨 中 色 氨 酸 含 量 较 高 (3) 甲 基 红 试 验 培 养 2d 后, 将 l 支 葡 萄 糖 蛋 白 胨 水 培 养 物 内 加 入 甲 基 红 试 剂 2 滴, 培 养 基 变 为 红 色 者 为 阳 性, 变 黄 色 者 为 阴 性 注 意 甲 基 红 试 剂 不 要 加 得 太 多, 以 免 出 现 假 阳 性 反 应 (4) 伏 - 普 试 验 培 养 2d 后, 将 另 1 支 葡 萄 糖 蛋 白 胨 水 培 养 物 内 加 入 5~10 滴 40%KOH, 然 后 加 入 等 量 的 5%α- 萘 酚 溶 液, 用 力 振 荡, 再 放 入 37 温 箱 中 保 温 15~30min, 以 加 快 反 应 速 度 若 培 养 物 呈 红 色 者, 为 伏 - 普 反 应 阳 性 (5) 柠 檬 酸 盐 试 验 培 养 48h 后 观 察 柠 檬 酸 盐 叙 面 培 养 基 上 有 无 细 菌 生 长 和 是 否 变 色 蓝 色 为 阳 性, 绿 色 为 阴 性 五 实 验 报 告 1. 结 果 将 实 验 结 果 填 入 下 表 + 表 示 阳 性 反 应, - 表 示 阴 性 反 应 菌 名 IMViC 试 验 吲 哚 试 验 甲 基 红 试 验 伏 一 普 试 验 柠 檬 酸 盐 试 验 硫 化 氢 试 验 大 肠 杆 菌 产 气 肠 菌 对 照 2. 思 考 题 (1) 讨 论 IMViC 试 验 在 医 学 检 验 上 的 意 义 (2) 解 释 在 细 菌 培 养 中 吲 哚 检 测 的 化 学 原 理, 为 什 么 在 这 个 试 验 中 用 吲 哚 的 存 在 作 为 色 氨 酸 活 性 的 指 示 剂, 而 不 用 丙 酮 酸? (3) 为 什 么 大 肠 杆 菌 是 甲 基 红 反 应 阳 性, 而 产 气 肠 杆 菌 为 阴 性? 这 个 试 验 与 伏 一 普 试 验 最 初 底 物 与 最 终 产 物 有 何 异 同 处? 为 什 么 会 出 现 不 同? (4) 说 明 在 硫 化 氢 试 验 中, 醋 酸 铅 的 作 用, 可 以 用 哪 种 化 合 物 代 替 醋 酸 铅?

41 实 验 17 微 生 物 与 氧 关 系 的 检 测 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 学 会 检 测 微 生 物 与 氧 关 系 的 方 法, 了 解 微 生 物 与 氧 的 关 系 内 容 : 通 过 调 整 转 速 和 瓶 装 量 检 测 微 生 物 生 长 与 氧 气 的 关 系 二 实 验 材 料 和 用 具 大 肠 杆 菌 斜 面 菌 种 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 吸 量 管 三 角 瓶 恒 温 振 荡 器 721 分 光 光 度 计 比 色 杯 等 三 操 作 步 骤 ( 一 )LB 培 养 基 的 制 备 1. 配 制 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 2. 分 装 取 4 个 300mL 三 角 瓶, 每 瓶 装 入 50 ml 培 养 基, 编 号 为 ; 另 取 4 个 500mL 三 角 瓶, 每 瓶 分 别 装 入 50mL l00ml 150mL 和 200mL 培 养 基, 编 号 为 再 取 一 个 100mL 三 角 瓶, 装 入 20mL 培 养 基, 剩 余 的 培 养 基 装 入 到 两 个 500mL 三 角 瓶 中, 所 有 三 角 瓶 均 用 8 层 纱 布 和 线 绳 包 扎 3. 灭 菌 将 上 述 分 装 的 培 养 基 于 121C 湿 热 灭 菌 30min, 冷 却 后 备 用 ( 二 ) 供 试 菌 种 的 制 备 l. 菌 种 活 化 将 冰 箱 中 储 藏 的 大 肠 杆 菌 斜 面 菌 种 转 接 至 牛 肉 膏 蛋 白 胨 斜 面 培 养 基 上, 37 培 养 18~20h 备 用 2. 种 子 制 备 取 上 述 活 化 的 大 肠 杆 菌 一 环 接 人 盛 有 20mL 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 的 100mL 三 角 瓶 中,37,200r/min 摇 床 培 养 16~18h 作 为 供 试 种 子 ( 三 ) 不 同 转 速 对 大 肠 杆 菌 生 长 的 影 响 取 1~4 号 三 角 瓶, 每 瓶 接 入 lml 上 述 大 肠 杆 菌 种 子,1 号 静 置 于 温 箱 中,2 号 置 75r/min 摇 床,3 号 置 于 150r/min 摇 床,4 号 置 于 225r/min 摇 床, 在 37 下 培 养 12~16h 后 取 出, 摇 匀, 经 适 当 稀 释 后, 测 定 每 个 瓶 中 的 OD 值 (λ=600nm), 并 同 时 以 原 培 养 基 不 接 种 作 对 照 测 定 记 录 结 果 于 表 17-1 中 ( 四 ) 不 同 瓶 装 量 对 大 肠 杆 菌 生 长 的 影 响 取 上 述 5~8 号 三 角 瓶, 按 1% 的 接 种 量 接 人 上 述 大 肠 杆 菌 种 子,37C,200r/min 培 养 12~16h 后 一 并 取 出, 用 721 分 光 光 度 计 测 定 OD 值 (λ=600m), 如 密 度 太 大 可 作 适 当 稀 释 后 再 测 OD 值, 记 录 实 验 结 果 于 表 17-2 中 四 注 意 事 项 1. 接 种 前 要 将 种 子 充 分 摇 匀, 接 种 时 要 保 证 接 种 量 一 致 严 格 无 菌 操 作, 以 免 污 染 2. 测 定 OD 值 时 要 摇 匀 后 再 取 培 养 液 若 经 稀 释 后 测 定, 则 各 瓶 培 养 物 的 稀 释 倍 数 要 一 致 五 实 验 报 告 1. 将 测 定 结 果 列 于 表 17-1 和 表 17-2 中 : 表 17-1 不 同 转 数 对 大 肠 杆 菌 生 长 量 的 影 响 转 数 /r min -1 OD 值 (λ=600nm) 1 2 平 均 值 瓶 装 量 (ml/500ml 三 角 瓶 ) 50 表 17-2 不 同 瓶 装 量 对 大 肠 杆 菌 生 长 量 的 影 响 OD 值 (λ=600nm) 1 2 平 均 值

42 绘 制 曲 线 分 别 以 转 速 或 瓶 装 量 为 横 坐 标, 以 OD 值 为 纵 坐 标 绘 制 大 肠 杆 菌 生 长 与 氧 关 系 的 曲 线 3. 试 对 以 上 曲 线 进 行 分 析 六 问 题 和 思 考 1. 根 据 微 生 物 与 氧 的 关 系, 可 将 微 生 物 分 为 哪 几 大 类? 2. 专 性 厌 氧 微 生 物 为 什 么 在 有 氧 的 条 件 下 不 能 生 长? 3. 试 设 计 一 实 验, 如 何 测 定 酵 母 菌 或 放 红 菌 及 霉 菌 与 氧 的 关 系 实 验 18 厌 氧 微 生 物 的 培 养 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 学 习 培 养 厌 氧 微 生 物 的 方 法, 了 解 厌 氧 微 生 物 生 长 的 特 性 内 容 :1 深 层 穿 刺 法, 厌 氧 培 养 丙 酮 丁 醇 梭 菌 2 真 空 干 燥 器 厌 氧 培 养 丙 酮 丁 醇 梭 菌 及 产 气 荚 膜 梭 菌 3 针 筒 厌 氧 法 培 养 丙 酮 丁 醇 梭 菌 及 产 气 荚 膜 梭 菌 4 厌 氧 罐 培 养 法 示 范 5 厌 氧 袋 法 培 养 丙 酮 丁 醇 梭 菌 二 实 验 材 料 和 用 具 丙 酮 丁 醇 梭 菌 (Clostridium acetobutylicum) 产 气 荚 膜 梭 菌 (Clostridium perfringens) RCM 培 养 基 ( 即 强 化 梭 菌 培 养 基 ) TYA 培 养 基 玉 米 醪 培 养 基 中 性 红 培 养 基 明 胶 麦 芽 汁 培 养 基 CaCO 3, 焦 性 没 食 子 酸 ( 即 邻 苯 三 酚 ) Na 2 CO 3,10%NaOH 溶 液,0.5% 美 蓝 水 溶 液,6% 葡 萄 糖 水 溶 液, 钯 粒 (A 型 ),NaBH 4,KBH 4,NaHCO 3, 柠 檬 酸 带 塞 或 塑 料 帽 玻 璃 管 ( 直 径 18~20mm, 长 180~200mm),1mL 血 浆 瓶,250mL 血 浆 瓶, 2OmL 和 50mL 针 简,250mL 三 角 瓶, 试 管, 厌 氧 罐, 厌 氧 袋 ( 不 透 气 的 无 毒 复 合 透 明 薄 膜 塑 料 袋,14cm 32cm), 培 养 皿, 真 空 泵, 带 活 塞 干 燥 器, 氮 气 钢 瓶 三 操 作 步 骤 ( 一 ) 真 空 干 燥 器 厌 氧 培 养 法 此 法 不 适 用 于 培 养 需 要 CO 2 的 微 生 物 该 法 是 在 干 燥 器 内 使 焦 性 没 食 子 酸 与 氢 氧 化 钠 溶 液 发 生 反 应 而 吸 氧, 形 成 无 氧 的 小 环 境 而 使 厌 氧 菌 生 长 1. 培 养 基 准 备 与 接 种 将 3 支 装 有 玉 米 醪 培 养 基 或 RCM 培 养 基 的 大 试 管 放 在 水 浴 中 煮 沸 l0min, 以 赶 出 其 中 溶 解 的 氧 气, 迅 速 冷 却 后 ( 切 勿 摇 动 ) 将 其 中 2 支 试 管 分 别 接 种 丙 酮 丁 醇 梭 菌 和 产 气 荚 膜 梭 菌 2. 干 燥 器 准 备 与 抽 气 在 带 活 塞 的 干 燥 器 内 底 部, 预 先 放 入 焦 性 没 食 子 酸 粉 末 20g 和 斜 放 盛 有 200mL10% NaOH 溶 液 的 烧 杯 将 接 种 有 厌 氧 菌 的 培 养 管 放 入 干 燥 器 内 在 干 燥 器 口 上 涂 抹 凡 士 林, 密 封 后 接 通 真 空 泵, 抽 气 3~5min, 关 闭 活 塞 轻 轻 摇 动 干 燥 器, 促 使 烧 杯 中 的 NaOH 溶 液 倒 入 焦 性 没 食 子 酸 中, 两 种 物 质 混 合 发 生 吸 氧 反 应, 使 干 燥 器 中 形 成 无 氧 小 环 境 ( 图 18-lA) 3. 观 察 结 果 将 干 燥 器 置 于 37 恒 温 箱 中 培 养 约 7d, 取 出 培 养 管, 分 别 制 片 观 察 菌 体 特 征

43 图 18-1 厌 氧 培 养 示 意 图 A 干 燥 器 厌 氧 培 养 装 置 1 连 接 真 空 泵 ;2 干 燥 器 ;3 试 管 ;4 10%NaOH 溶 液 ;5 焦 性 没 食 子 酸 粉 末 B 深 层 穿 刺 分 离 培 养 法 1 塑 料 盖 ;2 营 养 琼 脂 ;3 无 菌 橡 皮 塞 ;4 接 种 针 穿 刺 至 底 部 ;5 培 养 后 长 出 菌 落 ( 二 ) 深 层 穿 刺 厌 氧 培 养 法 此 法 操 作 简 单, 适 用 于 一 般 厌 氧 微 生 物 的 活 化 和 分 离 培 养, 但 不 能 用 于 扩 大 培 养 1. 接 种 培 养 将 玻 璃 管 一 头 塞 上 橡 胶 塞, 装 入 培 养 基 (RCM 或 TYA 培 养 基 ) 的 高 度 为 管 长 的 2/3, 套 上 塑 料 帽 或 橡 皮 塞, 灭 菌 并 凝 固 后, 将 丙 酮 丁 醇 梭 菌 用 接 种 针 穿 刺 接 种 ( 图 18 lb), 置 37 恒 温 箱 中 培 养 6~7d 2. 观 察 结 果 观 察 菌 落 形 态 特 征 并 制 片 于 显 微 镜 下 观 察 菌 体 的 细 胞 形 态, 并 记 录 结 果 ( 三 ) 针 筒 厌 氧 培 养 法 此 法 适 于 活 化 厌 氧 菌 和 小 体 积 的 扩 大 培 养 1. 培 养 基 准 备 将 灭 菌 的 装 有 RCM 或 TYA 培 养 基 的 血 浆 瓶 放 在 沸 水 浴 中 加 热 10min, 在 瓶 口 胶 塞 上 插 上 2 枚 医 用 针 头 排 气, 以 赶 出 残 留 在 培 养 基 内 的 氧 气 随 后 将 血 浆 瓶 从 沸 水 浴 中 取 出, 再 用 氮 气 钢 瓶 中 的 高 纯 氮 气 (99.99%) 通 过 胶 塞 上 的 一 枚 针 头 引 人 血 浆 瓶 中, 使 血 浆 瓶 内 充 满 氮 气, 瓶 内 培 养 基 在 冷 却 过 程 中 保 持 无 氧 状 态 2. 针 筒 装 灌 培 养 基 将 灭 菌 的 针 筒 接 上 针 头 经 胶 塞 刺 人 血 浆 瓶 中, 先 利 用 瓶 内 氮 气 的 压 力 将 针 筒 的 推 杆 慢 慢 推 开, 待 吸 入 一 定 体 积 的 氮 气 后 取 下 针 筒, 排 尽 针 筒 内 的 气 体 按 此 重 复 操 作 3 次, 以 排 尽 针 筒 内 的 残 留 空 气 而 维 持 无 氧 状 态 使 血 浆 瓶 口 朝 下 倾 斜, 利 用 瓶 内 压 力 将 培 养 液 缓 慢 注 入 针 筒 内, 然 后 取 下 针 筒, 用 经 灭 菌 的 带 孔 橡 皮 塞 迅 速 把 针 筒 头 部 塞 住 ( 图 18-2) 图 18 2 针 筒 培 养 基 分 装 装 置 图 18 3 针 筒 间 对 接 法 接 种 3. 接 种 培 养 采 用 无 菌 操 作 以 菌 种 液 针 筒 将 菌 穿 刺 接 入 培 养 液 针 筒 中 ( 图 18-3), 置 37 恒 温 培 养, 用 于 菌 种 活 化 可 培 养 16~18h, 用 于 测 定 菌 体 生 长 可 培 养 6~7d 4. 观 察 结 果 取 菌 制 片 观 察 ( 四 ) 厌 氧 罐 培 养 法 此 法 利 用 透 明 的 聚 碳 酸 酯 硬 质 塑 料 制 成 的 一 种 小 型 罐 状 密 封 容 器, 采 用 抽 气 换 气 法 充 入

44 氢 气, 利 用 钯 作 催 化 剂 与 罐 内 氧 气 发 生 作 用 达 到 除 氧 的 目 的, 同 时 充 入 10%(V/V) 的 CO 2 以 促 进 某 些 革 兰 氏 阴 性 厌 氧 菌 的 生 长 ( 图 18-4) 图 18 4 厌 氧 罐 厌 氧 培 养 装 置 其 实 验 操 作 过 程 如 下 : 1. 制 备 厌 氧 度 指 示 剂 取 3mL0.5% 美 蓝 水 溶 液 用 蒸 馏 水 稀 释 至 100mL ; 6mL0.1mol/LNaOH 溶 液 用 蒸 馏 水 稀 释 至 l00ml;6g 葡 萄 糖 加 蒸 馏 水 至 l00ml 将 上 述 3 种 溶 液 等 体 积 混 合, 并 用 针 筒 注 入 安 瓿 管 内 lml, 沸 水 浴 加 热 至 无 色, 立 即 封 口 即 成 取 一 根 直 径 1cm 长 8cm 的 无 毒 透 明 塑 料 软 管, 将 装 有 美 蓝 指 示 剂 的 安 瓿 管 置 于 软 管 中, 制 成 美 蓝 厌 氧 度 指 示 管 2. 培 养 基 准 备 与 接 种 将 制 成 无 菌 无 氧 的 RCM 或 TYA 培 养 基 平 板, 在 无 菌 操 作 下 迅 速 划 线 接 种 丙 酮 丁 醇 梭 菌 或 产 气 荚 膜 梭 菌, 并 立 即 将 平 皿 倒 置 放 入 已 准 备 好 的 厌 氧 罐 中, 同 时 放 入 一 支 美 蓝 厌 氧 指 示 剂 管 随 后 及 时 旋 紧 罐 盖, 达 到 完 全 密 封 3. 抽 气 换 气 将 真 空 泵 接 通 厌 氧 罐 抽 气 接 口 ( 图 18-4), 抽 真 空 至 表 指 针 0.09~0.093MPa(680~700mmHg 柱 ) 时, 关 闭 抽 气 口 活 塞, 用 止 血 钳 夹 住 抽 气 橡 皮 管 打 开 氮 气 钢 瓶 气 阀 向 厌 氧 罐 内 充 入 氮 气, 当 真 空 表 指 针 返 回 到 零 位 终 止 充 氮 再 接 上 述 步 骤 抽 气 和 充 入 氮 气, 如 此 重 复 2~3 次, 使 罐 中 氧 的 含 量 达 最 低 度 最 后 充 入 的 氮 气 使 真 空 表 指 针 达 0.02MPa(l60mmHg) 时 停 止 充 氮 气 再 开 启 CO 2 钢 瓶 阀 门, 向 罐 内 充 入 CO 2 直 至 真 空 表 指 针 达 到 0.011MPa(80mmHg) 时 停 止 为 除 尽 罐 内 残 留 的 氧, 以 氢 气 袋 ( 用 医 用 氧 气 袋 灌 满 氢 气 ) 气 管 连 接 向 厌 氧 罐 内 充 入 氢 气 直 至 真 空 表 指 针 回 到 零 位 为 止 充 气 完 毕, 封 闭 厌 氧 罐 4. 恒 温 培 养 将 厌 氧 罐 置 于 37 恒 温 箱 中 培 养 6~7d, 注 意 罐 中 厌 氧 指 示 剂 的 颜 色 变 化 5. 观 察 结 果 和 镜 检 从 罐 内 取 出 平 皿, 观 察 菌 落 特 征 并 挑 取 菌 落 作 涂 片, 用 结 晶 紫 染 液 染 色, 镜 检, 比 较 不 同 菌 的 菌 体 细 胞 形 态 特 征, 并 作 记 录 ( 五 ) 厌 氧 袋 培 养 法 厌 氧 袋 除 氧 是 利 用 氢 硼 化 钠 与 水 反 应 产 生 氢, 在 催 化 剂 钯 的 作 用 下, 氢 与 袋 中 氧 结 合 生 成 水 达 到 除 氧 目 的, 除 氧 效 果 可 从 袋 中 厌 氧 度 指 示 剂 观 察 同 时, 利 用 柠 檬 酸 与 碳 酸 氢 钠 的 作 用 产 生 CO 2, 以 有 利 于 需 要 CO 2 的 厌 氧 菌 的 生 长 其 反 应 过 程 为 :

45 1. 厌 氧 袋 选 用 无 毒 复 合 透 明 薄 膜 塑 料, 采 用 塑 膜 封 口 机 或 电 热 法 烫 制 成 20 40cm 塑 料 袋 2. 产 气 管 取 一 根 无 毒 塑 料 软 管 ( 直 径 2.0cm, 长 20cm), 管 壁 制 成 小 孔, 一 端 封 实 天 平 称 取 0.4g NaBH 4 和 0.4g NaHCO 3, 用 擦 镜 纸 包 成 小 包, 塞 入 软 管 底 部, 其 上 基 入 3 层 擦 镜 纸, 将 装 有 5% 柠 檬 酸 溶 液 3mL 的 安 瓿 管 塞 入 塑 料 管 中, 管 口 塞 上 有 缺 口 的 泡 沫 塑 料 小 塞, 即 制 成 产 气 管 3. 厌 氧 度 指 示 管 取 一 根 无 毒 透 明 塑 料 软 管 ( 直 径 2cm, 长 10cm) 量 取 0.5% 美 蓝 水 溶 液 3mL, 用 蒸 馏 水 稀 释 至 100mL; 取 0.lmol/LNaOH 溶 液 6mL, 用 蒸 馏 水 稀 释 至 100mL; 称 取 6g 葡 萄 糖 加 蒸 馏 水 稀 释 成 100mL 将 上 述 3 种 溶 液 等 量 混 合 后 取 2mL 装 入 安 瓿 管, 经 沸 水 浴 加 热 至 无 色 后 立 即 封 口, 即 为 厌 氧 度 指 示 管 4. 催 化 剂 和 吸 湿 剂 催 化 剂 钯 粒 (A 型 )10~20 粒 加 热 活 化, 随 后 装 入 带 孔 的 小 塑 料 硬 管 内, 制 成 钯 粒 催 化 管 取 变 色 硅 胶 少 许, 用 滤 纸 包 好 塞 入 带 孔 塑 料 管 内, 为 吸 湿 剂 管 5. 培 养 基 准 备 和 接 种 将 灭 菌 的 中 性 红 培 养 基 和 CaCO 3 明 胶 培 养 基 分 别 在 沸 水 浴 中 煮 沸 10min, 以 赶 出 其 中 溶 解 的 氧, 冷 却 至 50C 左 右 倒 平 板, 冷 凝 后 接 种 丙 酮 丁 醇 梭 菌 随 后 立 即 将 平 皿 放 入 厌 氧 袋 中, 每 袋 可 倒 置 平 放 3 个 平 皿 6. 封 袋 除 氧 和 培 养 将 产 气 管 厌 氧 度 指 示 管 钯 粒 催 化 剂 管 和 吸 湿 剂 管 分 别 放 入 袋 中 平 皿 两 边, 尽 量 赶 出 袋 中 空 气, 用 宽 透 明 胶 带 将 袋 口 封 住, 用 一 根 lcm 宽 与 袋 口 宽 等 长 的 有 机 玻 璃 条 或 小 木 条 将 袋 口 卷 折 2~3 层, 用 夹 子 夹 紧, 严 防 漏 气 ( 图 18-5) 使 袋 口 倾 斜 向 上, 随 后 隔 袋 折 断 产 气 管 中 的 安 瓿 管 颈, 使 试 剂 反 应 产 生 H 2 和 CO 2,H 2 在 钯 粒 催 化 下 与 袋 内 O 2 化 合 生 成 水 经 5~l0min 左 右, 钯 粒 催 化 管 处 升 温 发 热, 生 成 少 量 水 蒸 汽 在 折 断 产 气 管 半 小 时 后, 隔 袋 折 断 厌 氧 度 指 示 管 中 的 安 瓶 管 颈, 观 察 指 示 剂 不 变 蓝, 表 明 袋 内 己 形 成 厌 氧 环 境 此 时 将 厌 氧 袋 转 入 37 恒 温 箱 中 培 养 6~7d 7. 观 察 结 果 和 镜 检 从 袋 中 取 出 平 皿 观 察 菌 落 特 征 丙 酮 丁 醇 梭 菌 在 中 性 红 平 板 上 显 示 黄 色 菌 落, 挑 取 典 型 单 菌 落 涂 片 染 色 后 进 行 镜 检, 观 察 菌 体 细 胞 形 态 特 征, 并 作 记 录 图 18 5 厌 氧 袋 厌 氧 培 养 装 置

46 四 注 意 事 项 1. 培 养 需 要 CO 2 的 厌 氧 菌 时, 须 在 厌 氧 小 环 境 中 供 应 CO 2 2. 氢 气 是 危 险 易 爆 气 体, 使 用 氢 气 钢 瓶 充 氢 时, 应 严 格 按 操 作 规 程 进 行, 切 勿 大 意, 严 防 事 故 3. 选 用 干 燥 器 针 筒 厌 氧 罐 或 厌 氧 袋 时, 应 事 先 仔 细 检 查 其 密 封 性 能, 以 防 漏 气 4. 已 制 备 灭 菌 的 培 养 基 在 接 种 前 应 在 沸 水 浴 中 煮 沸 10min, 以 消 除 溶 解 在 培 养 基 中 的 氧 气 5. 针 筒 培 养 液 刃 天 青 指 示 剂 出 现 红 色, 表 明 有 残 留 氧 气 厌 氧 袋 和 厌 氧 罐 中 美 蓝 厌 气 度 指 示 剂 变 成 蓝 色, 表 明 除 氧 不 够 6. 产 气 荚 膜 梭 菌 为 条 件 致 病 菌, 防 止 进 入 口 中 和 沾 上 伤 口 五 演 示 1. 显 示 深 层 穿 刺 厌 氧 培 养 的 厌 氧 菌 菌 落 特 征 及 生 长 情 况 2. 选 用 真 空 干 燥 器 针 筒 厌 氧 罐 或 厌 氧 袋 厌 氧 培 养 法, 演 示 该 方 法 的 操 作 过 程, 特 别 是 厌 氧 罐 的 抽 气 换 气 和 厌 氧 袋 的 封 袋 除 氧 操 作 过 程 六 实 验 报 告 1. 实 验 中 选 用 厌 氧 培 养 法 的 培 养 结 果 : 培 养 方 法 菌 种 名 称 菌 落 形 态 特 征 菌 落 大 小 形 状 颜 色 光 滑 度 透 明 度 气 味 菌 体 形 态 特 征 菌 体 形 态 有 无 芽 孢 芽 孢 形 状 碘 液 染 色 液 体 培 养 特 征 备 注 2. 试 比 较 以 上 厌 氧 培 养 方 法 的 优 缺 点, 并 分 析 其 成 功 的 关 键 七 问 题 和 思 考 1. 请 设 计 一 个 试 验 方 案, 如 何 从 土 壤 中 分 离 纯 化 和 培 养 出 厌 氧 菌 2. 试 举 例 说 明 研 究 厌 氧 菌 的 实 际 意 义

47 实 验 19 免 疫 血 清 的 制 备 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 学 习 和 掌 握 免 疫 血 清 的 制 备 方 法, 为 凝 集 反 应 和 沉 淀 反 应 准 备 凝 集 素 和 沉 淀 素 内 容 :1 抗 大 肠 杆 菌 血 清 ( 凝 集 素 ) 的 制 备 2 牛 血 清 白 蛋 白 抗 血 清 ( 沉 淀 素 ) 的 制 备 二 实 验 材 料 和 用 具 体 重 2~3kg 的 健 康 雄 家 兔 大 肠 杆 菌 (E. coli) 斜 面 菌 种 ; 牛 血 清 白 蛋 白 ( 蛋 白 含 量 1.5mg/mL) 牛 肉 膏 蛋 白 胨 斜 面 培 养 基 0.3% 甲 醛 液 ( 用 0.85% 生 理 盐 水 配 制 ) 75% 酒 精 棉 球 碘 酒 棉 球 消 毒 干 棉 球 ; 细 菌 比 浊 标 准 管 无 菌 吸 管 无 菌 注 射 器 (5mL 20mL) 注 射 针 头 (5 号,B19) 无 菌 试 管 装 有 玻 璃 珠 的 无 菌 血 清 瓶 解 剖 用 具 ( 解 剖 台 兔 头 夹 止 血 钳 解 剖 刀 眼 科 剪 刀 镊 子 动 脉 夹 等 ) 双 面 刀 片 丝 线 玻 璃 管 胶 管 离 心 机 及 无 菌 离 心 管 普 通 冰 箱 超 净 工 作 台 水 浴 箱 三 操 作 步 骤 ( 一 ) 凝 集 素 的 制 备 1. 凝 集 原 ( 颗 粒 性 抗 原 ) 的 制 备 (1) 取 37C 恒 温 培 养 24h 的 牛 肉 膏 蛋 白 胨 大 肠 杆 菌 斜 面 (2) 每 支 斜 面 菌 种 中 加 入 5mL0.3% 甲 醛 液, 小 心 地 把 菌 苔 洗 下 制 成 菌 液 (3) 用 无 菌 清 洁 吸 管, 吸 取 以 上 菌 液, 注 入 装 有 玻 璃 珠 的 无 菌 血 清 瓶 内, 振 荡 10~25min, 分 散 菌 块 制 成 菌 悬 液 (4) 将 含 菌 悬 液 的 血 清 瓶 置 于 60 的 水 浴 箱 中 水 浴 1h, 并 不 时 摇 动, 把 菌 杀 死 (5) 将 菌 悬 液 重 新 接 种 至 牛 肉 膏 蛋 白 胨 斜 面 培 养 基 中,37 培 养 24~48h, 如 有 菌 生 长, 则 要 在 60 水 温 中 再 处 理 若 无 菌 生 长 则 进 行 比 浊 测 定 其 含 菌 量 (6) 凝 集 素 的 制 备 (1) 免 疫 方 法 : 选 择 2~3kg 健 康 雄 免, 从 耳 缘 静 脉 采 血 2mL, 分 离 出 血 清 该 血 清 与 准 备 免 疫 用 的 抗 原 进 行 凝 集 反 应, 以 检 查 有 无 天 然 凝 集 素 如 没 有 或 只 有 极 微 量 时, 该 动 物 便 可 用 来 免 疫 最 常 用 的 免 疫 途 径 是 耳 缘 静 脉 注 射 将 家 兔 放 在 家 兔 固 定 箱 内, 一 手 轻 轻 拿 起 耳 朵, 用 碘 酒 棉 花 球 在 耳 外 侧 边 缘 静 脉 处 消 毒, 然 后 用 酒 精 棉 球 涂 擦, 并 用 手 指 轻 轻 弹 几 下 静 脉 血 管, 使 其 扩 张 消 毒 细 菌 悬 液 瓶 塞 后, 用 无 菌 注 射 器 及 5 号 针 头 吸 取 菌 液, 沿 着 静 脉 平 行 方 向 刺 入 静 脉 血 管, 并 慢 慢 注 入 菌 液, 注 射 完 毕, 用 干 棉 球 按 压 住 注 射 处, 然 后 拨 出 针 头, 并 压 迫 血 管 注 射 处 片 刻, 以 防 止 血 液 向 外 溢 出 注 射 时 发 现 注 射 处 隆 起, 不 易 推 进 时, 表 明 针 尖 不 在 血 管 中, 应 拨 出 针 头, 重 找 位 置 再 注 射 有 时 针 尖 口 被 堵 塞, 菌 液 推 不 进 去, 应 及 时 更 换 针 头 注 射 途 径 剂 量 和 日 程 安 排 等 视 抗 原 和 动 物 不 同 而 有 所 不 同 大 肠 杆 菌 免 疫 家 兔 的 抗 原 注 射 剂 量 和 日 程 安 排 如 下 表 : 日 期 第 1 日 第 2 日 第 3 日 第 4 日 第 5 日 注 射 剂 量 /ml (2) 试 血 : 通 常 于 最 后 一 次 注 射 后 7~11d, 从 兔 耳 缘 静 脉 抽 取 2mL 血, 分 离 析 出 血 清, 用 试 管 凝 集 反 应 测 定 抗 血 清 效 价 效 价 合 格 即 可 大 量 采 血, 如 效 价 不 高, 可 继 续 注 射 抗 原 免 疫, 提 高 效 价 (3) 采 血 : 采 血 分 为 心 脏 采 血 和 颈 动 脉 放 血 心 脏 采 血 : 使 免 疫 家 兔 仰 卧 于 台 上, 四 肢 固 定 用 左 手 探 明 心 脏 博 动 最 明 显 处, 用 碘 酒 棉 球 与 酒 精 棉 球 消 毒 后, 右 手 握 消 毒 过 的 20mL 注 射 器 和 B19 号 针 头, 在 上 述 部 位 的 肋 骨 间 隙 与 胸 部 呈 45 角 刺 入 心 脏, 微 微 抽 取 针 筒, 此 时 可 发 现 血 液 涌 入 注 射 器 中 便 可 徐 徐 抽 取 血 液 2.5kg 家 兔 一 次 可 取 血 20~30mL 取 血 完 毕 后, 用 消 毒 棉 球 按 压 进 针 处 迅 速 拨 出 针 头, 进 针 处 用 棉 球 继 续 压 住 并 马 上 将 所 采 的 血 液 注 入 无 菌 大 试 管 内, 斜 放, 待 血 液 凝 固 后, 置 于 37 恒 温 箱 中 30min, 使 血 清 充 分 析 出, 然 后 放 入 4~6C 冰 箱 中 颈 动 脉 采 血 : 将 免 疫 家 兔 固 定 于 兔 台 上, 用 少 量 乙 醚 麻 醉, 剪 去 颈 部 的 毛, 然 后 用 碘 酒

48 棉 球 和 酒 精 棉 球 消 毒 沿 正 中 线 将 颈 部 皮 肤 切 开 到 锁 骨 间, 拨 开 肌 膜, 暴 露 出 气 管, 在 气 管 深 侧 处 找 到 搏 动 的 颈 动 脉 小 心 地 将 颈 动 脉 和 迷 走 神 经 剥 离 分 开 4~5cm 用 镊 子 拉 出 颈 动 脉, 用 丝 线 扎 紧 血 管 的 离 心 端, 在 血 管 的 向 心 端 用 止 血 钳 夹 住 然 后 用 眼 科 剪 在 丝 线 与 止 血 钳 之 间 的 血 管 上 剪 一 个 V 型 小 切 口, 将 弯 咀 眼 科 镊 自 切 口 插 入, 使 其 张 开, 同 时 将 一 小 玻 管 插 入, 用 丝 线 扎 紧, 以 防 玻 管 脱 漏 玻 管 另 一 端 接 入 一 条 胶 管, 胶 管 通 入 大 试 管 ( 或 大 离 心 管 ) 内, 然 后 将 止 血 钳 慢 慢 松 开, 使 血 液 流 入 试 管, 直 至 动 物 死 亡, 无 血 液 流 出 为 止 (4) 抗 血 清 分 离 与 保 存 : 取 凝 固 血 液 于 4000r/min, 离 心 20min, 获 得 抗 血 清 ( 即 凝 集 素 ) 加 入 石 炭 酸 或 硫 柳 汞 使 其 浓 度 分 别 达 到 0.5% 或 0.01% 测 定 抗 血 清 的 效 价 后, 封 好 瓶 口, 贴 好 标 签, 注 明 抗 血 清 名 称 效 价 及 日 期, 置 冰 箱 保 存 备 用 ( 二 ) 沉 淀 素 的 制 备 抗 原 为 可 溶 性 抗 原 ( 如 脂 多 糖 类 毒 素 或 可 溶 性 蛋 白 等 ) 通 常 每 kg 兔 体 重 注 射 2mg 蛋 白, 牛 血 清 白 蛋 白 抗 原 浓 度 为 1.5mg/mL, 则 2.5kg 兔 应 注 射 5mg 蛋 白 免 疫 方 法 采 血 方 法 和 抗 血 清 ( 沉 淀 素 ) 的 分 离 可 参 照 凝 集 素 制 备 方 法, 但 效 价 测 定 则 用 沉 淀 反 应 来 测 定 四 注 意 事 项 由 于 每 个 动 物 对 免 疫 反 应 不 同, 产 生 的 抗 体 效 份 有 高 有 低, 所 以 在 制 备 抗 血 清 时 至 少 免 疫 两 只 家 兔 如 须 保 留 该 免 疫 动 物, 刚 采 取 心 脏 直 接 取 血, 取 血 后 应 从 静 脉 注 射 等 体 积 的 50% 葡 萄 糖 溶 液, 经 过 2~3 个 月 的 饲 养, 方 可 再 次 免 疫 若 不 保 留 动 物 须 一 次 取 大 量 血 时, 则 采 用 颈 动 脉 放 血 法 五 演 示 1. 耳 缘 静 脉 注 射 抗 原 的 方 法 2. 心 脏 取 血 的 操 作 过 程 六 实 验 报 告 1. 记 录 免 疫 家 兔 的 操 作 过 程 及 免 疫 过 程 中 兔 的 反 应 2. 实 验 操 作 过 程 的 体 会 七 问 题 和 思 考 1. 如 果 不 用 生 理 盐 水 来 配 制 抗 原, 以 这 样 的 抗 原 免 疫 兔 成 不 成? 为 什 么? 2. 现 有 一 支 苏 云 金 杆 菌 (Bacillus thuringinesis) 斜 面 菌 种, 你 能 否 制 备 出 相 应 的 凝 集 素? 阐 述 其 主 要 步 骤 实 验 20 凝 集 反 应 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 学 习 和 掌 握 用 试 管 凝 集 反 应 测 定 抗 血 清 效 价 的 方 法 内 容 :1 玻 片 凝 集 试 验 2 试 管 凝 集 试 验 二 实 验 材 料 和 用 具 含 10 亿 个 /ml 大 肠 杆 菌 (E. coli) 的 生 理 盐 水 菌 悬 液 大 肠 杆 菌 抗 血 清 生 理 盐 水 载 玻 片 小 试 管 (1cm 6.5cm) 试 管 架 移 液 管 吸 管 水 浴 箱 三 操 作 步 骤 ( 一 ) 玻 片 凝 集 试 验 1. 在 载 玻 片 两 端 各 滴 一 滴 大 肠 杆 菌 悬 液 2. 在 一 端 的 菌 悬 液 中 加 入 一 滴 1:10 稀 释 的 大 肠 杆 菌 抗 血 清, 另 一 端 悬 液 加 入 一 滴 生 理 盐 水 3. 将 载 玻 片 小 心 地 振 动 使 混 合 液 混 匀 后 静 置 室 温 中, 数 分 钟 后 便 可 观 察 到 抗 血 清 端 产 生 凝 集 块, 而 另 一 端 为 生 理 盐 水 对 照 若 反 应 不 明 显, 可 放 入 培 养 皿 中 ( 皿 内 放 入 湿 滤 纸, 以 保 持 一 定 湿 度 ),37 保 温 30min 后 观 察 结 果 亦 可 将 载 玻 片 放 置 显 微 镜 下, 凝 集 块 明 显 可 见 ( 二 ) 试 管 凝 集 试 验 1. 抗 血 清 的 稀 释 抗 血 清 稀 释 采 取 对 倍 稀 释 法 取 干 净 小 试 管 10 支, 排 列 在 试 管 架 上, 依 次 注 明 号 码, 每 支 试 管 用 移 液 管 加 入 0.5mL 生 理 盐 水

49 用 移 液 管 吸 取 1:10 稀 释 的 大 肠 杆 菌 抗 血 清 0.5mL 加 入 第 1 管, 在 管 内 连 续 吹 吸 3 次, 使 血 清 与 生 理 盐 水 充 分 混 合, 然 后 吸 取 0.5mL 加 入 第 2 管, 同 样 混 匀 后 吸 取 0.5mL 加 入 第 3 管, 依 次 类 推, 直 至 第 9 管, 混 匀 后 从 第 9 管 中 吸 取 0.5mL 弃 去 第 10 管 不 加 血 清 作 为 对 照 此 时 从 第 1 管 到 第 9 管 的 血 清 稀 释 倍 数 分 别 1:20,1:40,1:80,1:160,1:320, 1:640,1:1280,1:2560,1: 加 入 抗 原 从 第 10 支 管 开 始, 由 后 向 前 每 支 管 依 次 加 入 0.5mL 大 肠 杆 菌 菌 悬 液 此 时 血 清 稀 释 倍 数 相 应 加 大 一 倍 3. 抗 原 抗 体 反 应 把 各 管 混 合 液 振 摇 混 匀, 置 37 水 浴 箱 中 水 浴 4h 或 在 室 温 中 过 夜, 观 察 结 果 4. 结 果 观 察 与 效 价 判 断 (1) 生 理 盐 水 对 照 管 中 的 抗 原 ( 细 菌 ) 应 分 散, 无 凝 集 块 沉 淀 而 呈 混 浊 菌 悬 液 (2) 试 验 管 如 有 凝 集, 管 底 可 见 到 凝 集 块 液 体 上 部 澄 清 半 澄 清 或 混 浊 度 降 低, 管 底 凝 集 块 轻 摇 即 浮 起, 呈 片 块 状 (3) 凝 集 强 弱 的 判 断 ( 以 + 表 示 ) ++++ : 很 强, 表 示 细 菌 完 全 凝 集, 凝 集 块 完 全 沉 于 管 底, 菌 液 澄 清 +++ : 很 强, 表 示 细 菌 绝 大 部 分 凝 集, 凝 集 块 小 沉 于 管 底, 菌 液 有 轻 微 混 浊 ++ : 中 等 强 度, 表 示 细 菌 部 分 凝 集 沉 于 管 底, 凝 集 块 呈 颗 粒 状, 菌 液 半 澄 清 + : 弱, 表 示 细 菌 少 数 凝 集, 菌 液 混 浊 - : 不 凝 集, 菌 液 混 浊 与 生 理 盐 水 对 照 管 同 血 清 的 效 价 就 是 呈 现 50% 凝 集 ( 即 ++ 反 应 ) 的 最 高 血 清 稀 释 倍 数 四 注 意 事 项 1. 所 用 载 玻 片 试 管 移 液 管 等 用 具 均 应 干 净 2. 在 血 清 对 倍 稀 释 过 程 中, 力 求 准 确 一 是 防 止 液 体 溢 出 管 外, 二 是 在 连 续 吸 3 次 混 匀 液 体 时, 第 2 次 吸 人 移 液 管 中 的 液 体 高 度 不 能 低 于 第 1 次, 最 好 是 每 一 稀 释 度 换 一 支 洗 净 的 移 液 管 3. 试 管 水 浴 或 静 置 后, 观 察 前 不 宜 摇 动 振 荡, 以 免 影 响 实 验 结 果 的 准 确 性 五 演 示 1. 对 倍 稀 释 过 程 2. 玻 片 凝 集 的 显 微 示 范 镜, 观 察 凝 集 块 六 实 验 报 告 ( 一 ) 记 录 玻 片 凝 集 试 验 结 果, 试 比 较 血 清 端 与 生 理 盐 水 端 结 果 的 不 同, 并 解 释 其 原 因 ( 二 ) 抗 血 清 的 效 价 测 定 结 果 1. 抗 血 清 效 价 测 定 结 果 : 试 管 最 后 血 清 稀 释 倍 数 凝 集 强 弱 2. 确 定 抗 血 清 的 效 价 为 七 问 题 和 思 考 1. 为 什 么 取 ++ 的 抗 血 清 最 高 稀 释 倍 数 作 为 抗 血 清 的 效 价? 2. 在 试 管 凝 集 试 验 中, 有 否 出 现 不 正 常 现 象? 并 分 析 其 原 因 3. 现 有 枯 草 孢 杆 菌 斜 面 菌 种 及 未 知 效 价 的 相 应 抗 血 清, 你 能 否 测 定 出 其 血 清 效 价? 描 述 其 操 作 过 程

50 实 验 21 沉 淀 反 应 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 学 习 和 掌 握 环 状 沉 淀 反 应 及 双 向 琼 脂 扩 散 沉 淀 反 应 方 法 内 容 :1. 用 牛 血 清 白 蛋 白 及 兔 抗 牛 血 清 白 蛋 白, 进 行 环 状 沉 淀 反 应 2. 用 以 上 抗 原 和 抗 体 进 行 双 向 琼 脂 扩 散 沉 淀 反 应 试 验 二 实 验 材 料 和 用 具 可 溶 性 抗 原 ( 牛 血 清 白 蛋 白 ) 兔 抗 牛 血 清 白 蛋 白 抗 血 清 生 理 盐 水 (0.85%NaCl) 洗 净 载 玻 片 小 试 管 移 液 管 玻 璃 毛 细 吸 管 不 锈 钢 吸 管 三 操 作 步 骤 ( 一 ) 环 状 沉 淀 反 应 1. 取 1:25 的 牛 血 清 白 蛋 白 lml, 用 生 理 盐 水 以 对 倍 稀 释 法 稀 释 成 1:50,1:100,1: 200,1:400,1:800,1:1600,1:3200 的 抗 原 溶 液 2. 取 9 支 洁 净 干 燥 的 小 试 管, 每 支 小 试 管 如 入 1:2 的 兔 抗 牛 血 清 白 蛋 白 抗 血 清 0.5mL 3, 用 移 液 管 吸 取 上 面 已 稀 释 好 的 牛 血 清 白 蛋 白 ( 抗 原 ), 按 表 21 1 要 求, 从 最 大 稀 释 度 开 始, 沿 着 管 壁 徐 徐 加 入 各 小 试 管 中, 使 与 下 层 抗 体 之 间 形 成 交 界 面, 切 勿 摇 动 混 匀, 第 8 管 加 入 生 理 盐 水 及 第 9 管 加 入 兔 抗 血 清 以 作 对 照 4. 静 置 15~30min, 观 察 在 两 液 面 交 界 处 有 无 白 色 环 状 沉 淀 物 出 现 5. 结 果 记 录 凡 有 白 色 环 状 沉 淀 物 者 记 +, 没 有 沉 淀 者 记 - 最 大 稀 释 度 的 抗 原 与 抗 体 交 界 面 之 间 还 出 现 白 色 环 状 沉 淀 者, 此 管 的 抗 原 稀 释 倍 数 即 为 抗 体 ( 沉 淀 素 ) 的 效 价 表 21-1 环 状 沉 淀 反 应 记 录 表 试 管 抗 体 (1:2)/mL 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 盐 免 血 清 抗 原 稀 释 度 水 (1:50) 抗 原 用 量 /ml 结 果 ( 二 ) 双 向 琼 脂 扩 散 沉 淀 反 应 1. 称 取 1g 优 质 琼 脂 于 l00ml ph7.2 生 理 盐 水 中, 在 沸 水 中 水 浴 使 琼 脂 溶 化 后, 加 入 1% 的 硫 柳 汞 lml 防 腐 每 块 载 玻 片 (7.5cm 4.5cm) 滴 加 4mL 琼 脂 溶 液, 待 凝 固 后 用 不 锈 钢 吸 管 在 两 端 (A B 端 ) 打 梅 花 形 小 孔, 孔 径 和 孔 距 均 为 3mm 亦 可 直 接 用 不 锈 钢 管 打 孔, 再 用 接 种 针 挑 去 梅 花 形 孔 中 的 琼 脂 块 2. 在 A 端 梅 花 形 孔 中, 用 玻 璃 毛 细 吸 管 在 中 心 孔 中 加 入 适 当 稀 释 的 抗 血 清 ( 抗 体 ), 注 意 要 使 孔 加 满, 但 不 外 溢 ; 周 围 孔 加 入 不 同 稀 释 度 的 抗 原 ( 例 如 1:10,1:20,1:40,1:80,1:160, 1:320) 在 B 端 梅 花 形 孔 中, 同 样 在 中 央 孔 中 加 入 适 当 稀 释 度 的 抗 原, 周 围 的 孔 中 加 入 不 同 稀 释 度 的 抗 体 3. 把 以 上 载 玻 片 放 入 带 盖 的 铝 盒 中, 下 面 垫 上 3 一 4 层 湿 纱 布, 置 37 扩 散 24~48h, 可 看 见 抗 原 和 抗 体 反 应 处 呈 现 的 沉 淀 线 4. 记 录 结 果 注 意 沉 淀 线 数 目 及 偏 向 四 注 意 事 项 1. 在 进 行 环 状 沉 淀 反 应 试 验 时, 一 定 要 沿 着 管 壁 加 入 抗 原, 而 且 切 勿 摇 动, 否 则 影 响 沉 淀 环 的 形 成 2. 双 向 琼 脂 扩 散 试 验 时, 抗 原 或 抗 体 的 稀 释 度 多 少 才 合 适, 教 师 必 须 进 行 预 测, 否 则 由 于 抗 原 抗 体 比 例 不 合 适 而 造 成 假 阴 性 五 演 示

51 1. 沿 着 管 壁 徐 徐 加 入 抗 原 的 操 作 2. 在 琼 脂 板 上 打 梅 花 孔 的 操 作 六 实 验 报 告 记 录 环 状 沉 淀 反 应 的 结 果 并 确 定 抗 体 的 效 价 按 照 表 21-2 和 表 21-3 记 录 双 向 琼 脂 扩 散 结 果, 并 分 析 寻 找 其 规 律 性 表 21-2 载 玻 片 A 端 结 果 抗 原 稀 释 度 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 沉 淀 线 数 目 表 21-3 载 玻 片 B 端 结 果 抗 体 稀 释 度 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 沉 淀 线 数 目 七 问 题 和 思 考 1. 比 较 凝 集 反 应 与 沉 淀 反 应 有 何 异 同? 2. 双 向 琼 脂 扩 散 沉 淀 反 应 试 验 中, 抗 原 或 抗 体 浓 度 大 于 相 应 抗 体 或 抗 原 时, 沉 淀 线 会 出 现 何 种 现 象? 为 什 么 会 出 现 多 条 沉 淀 线? 3. 如 发 现 衣 服 上 有 一 血 迹, 怀 疑 是 人 血, 你 能 用 简 单 的 方 法 进 行 鉴 定 吗? 并 叙 述 其 方 法 步 骤 第 二 部 分 实 际 应 用 实 验 实 验 22 乳 酸 发 酵 与 乳 酸 菌 饮 料 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 学 习 乳 酸 发 酵 和 制 作 乳 酸 菌 饮 料 的 方 法, 了 解 乳 酸 菌 的 生 长 特 性 内 容 :1. 从 新 鲜 酸 乳 中 进 行 乳 酸 菌 的 分 离 纯 化 2. 乳 酸 发 酵 及 检 测 3. 乳 酸 菌 饮 料 制 作 4. 自 制 乳 酸 质 量 品 尝 二 实 验 材 料 和 用 具 嗜 热 乳 酸 链 球 菌 (Streptococcus thermophilus) 保 加 利 亚 乳 酸 杆 菌 (Lactobacillus bulgaricus), 乳 酸 菌 种 也 可 以 从 市 场 销 售 的 各 种 新 鲜 酸 乳 或 酸 乳 饮 料 中 分 离 ; BCG 牛 乳 培 养 基 乳 酸 菌 培 养 基 脱 脂 乳 试 管 ( 见 注 ) 脱 脂 乳 粉 或 全 脂 乳 粉 鲜 牛 奶 蔗 糖 碳 酸 钙 ; 恒 温 水 溶 锅 酸 度 计 高 压 蒸 汽 灭 菌 锅 超 净 工 作 台 培 养 箱 酸 乳 瓶 (200~280mL,) 培 养 皿 试 管 300mL 三 角 瓶 三 操 作 步 聚 ( 一 ) 乳 酸 菌 的 分 离 纯 化 1. 分 离 取 市 售 新 鲜 酸 乳 或 泡 制 酸 菜 的 酸 液 稀 释 至 10-5,, 取 其 中 的 个 稀 释 度 的 稀 释 液 各 0.1~0.2mL, 分 别 接 入 BCG 牛 乳 培 养 基 琼 脂 平 板 上, 用 无 菌 涂 布 器 依 次 涂 布 ; 或 者 直 接 用 接 种 环 蘸 取 原 液 平 板 划 线 分 离, 置 40 培 养 48h, 如 出 现 圆 形 稍 扁 平 的 黄 色 菌 落 及 其 周 围 培 养 基 变 为 黄 色 者 初 步 定 为 乳 酸 菌 2. 鉴 别 选 取 乳 酸 菌 典 型 菌 落 转 至 脱 脂 乳 试 管 中,40 培 养 8~24h 若 牛 乳 出 现 凝 固, 无 气 泡, 呈 酸 性, 涂 片 镜 检 细 胞 杆 状 或 链 球 状 ( 两 种 形 状 的 菌 种 均 分 别 选 入 ), 革 兰 氏 染 色 呈 阳 性, 则 可 将 其 连 续 传 代 4~6 次, 最 终 选 择 出 在 3~6h 能 凝 固 的 牛 乳 管, 作 菌 种 待 用 ( 二 ) 乳 酸 发 酵 及 检 测 1. 发 酵 在 无 菌 操 作 下 将 分 离 的 1 株 乳 酸 菌 接 种 于 装 有 300mL 乳 酸 菌 培 养 液 的 500mL 三 角 瓶 中,40~42 静 止 培 养 2. 检 测 为 了 便 于 测 定 乳 酸 发 酵 情 况, 实 验 分 2 组 一 组 在 接 种 培 养 后, 每 6~8h

52 取 样 分 析, 测 定 ph 值 另 一 组 在 接 种 培 养 24h 后 每 瓶 加 入 CaCO 3 3g( 以 防 止 发 酵 液 过 酸 使 菌 种 死 亡 ), 每 6~8h 取 样, 测 定 乳 酸 含 量 ( 方 法 见 注 ), 记 录 测 定 结 果 ( 三 ) 乳 酸 菌 饮 料 的 制 作 1. 将 脱 脂 乳 和 水 以 1:7~10(WW) 的 比 例, 同 时 加 入 5%--6% 蔗 糖, 充 分 混 合, 于 80~ 85 灭 菌 10~5min, 然 后 冷 却 至 35~40, 作 为 制 作 饮 料 的 培 养 基 质 2. 将 纯 种 嗜 热 乳 酸 链 球 菌 保 加 利 亚 乳 酸 杆 菌 及 两 种 菌 的 等 量 混 合 菌 液 作 为 发 酵 剂, 均 以 2%~5% 的 接 种 量 分 别 接 入 以 上 培 养 基 质 中 即 为 饮 料 发 酵 液, 亦 可 以 市 售 鲜 酸 乳 为 发 酵 剂 接 种 后 摇 匀, 分 装 到 已 灭 菌 的 酸 乳 瓶 中, 每 一 种 菌 的 饮 料 发 酵 液 重 复 分 装 3~5 瓶, 随 后 将 瓶 盖 拧 紧 密 封 3. 把 接 种 后 的 酸 乳 瓶 置 于 恒 温 箱 中 培 养 3~4h 培 养 时 注 意 观 察, 在 出 现 凝 乳 后 停 止 培 养 然 后 转 入 4~5 的 低 温 下 冷 藏 24h 以 上 经 此 后 熟 阶 段, 达 到 酸 乳 酸 度 适 中 (ph4~4.5), 凝 块 均 匀 致 密, 无 乳 清 析 出, 无 气 泡, 获 得 较 好 的 口 感 和 特 有 风 味 4. 以 品 尝 为 标 准 评 定 酸 乳 质 量 采 用 乳 酸 球 菌 和 乳 酸 杆 菌 等 量 混 合 发 酵 的 酸 乳 与 单 菌 株 发 酵 的 酸 乳 相 比 较, 前 者 的 香 味 和 口 感 更 佳 品 尝 时 若 出 现 异 味, 表 明 酸 乳 污 染 了 杂 菌 比 较 项 目 按 表 22-1 四 注 意 事 项 1. 采 用 BCG 牛 乳 培 养 基 琼 脂 平 板 筛 选 乳 酸 菌 时, 注 意 挑 取 典 型 特 征 的 黄 色 菌 落, 结 合 镜 检 观 察, 有 利 高 效 分 离 筛 选 乳 酸 菌 2. 制 作 乳 酸 菌 饮 料, 应 选 用 优 良 的 乳 酸 菌, 采 用 乳 酸 球 菌 与 乳 酸 杆 菌 等 量 混 合 发 酵, 使 其 具 有 独 特 风 味 和 良 好 口 感 3. 牛 乳 的 消 毒 应 掌 握 适 宜 温 度 和 时 间, 防 止 长 时 间 采 用 过 高 温 度 消 毒 而 破 坏 酸 乳 风 味 4. 作 为 卫 生 合 格 标 准 还 应 按 卫 生 部 规 定 进 行 检 测, 如 大 肠 菌 群 检 测 等 经 品 尝 和 检 验, 合 格 的 酸 乳 应 在 4 条 件 下 冷 藏, 可 保 存 6~7d 五 实 验 报 告 1. 乳 酸 发 酵 过 程 检 测 结 果 及 结 果 分 析 表 22 1 乳 酸 菌 单 菌 及 混 合 菌 发 酵 的 酸 乳 品 评 结 果 乳 酸 菌 类 球 菌 杆 菌 品 评 项 目 凝 乳 情 况 口 感 香 味 异 味 ph 值 球 菌 杆 菌 混 合 (1:1) 2. 将 发 酵 的 酸 乳 品 评 结 果 记 录 于 表 22 1 中 ; 六 问 题 和 思 考 1 发 酵 酸 乳 为 什 么 能 引 起 凝 乳? 2. 为 什 么 采 用 乳 酸 菌 混 合 发 酵 的 酸 乳 比 单 菌 发 酵 的 酸 乳 口 感 和 风 味 更 佳? 3. 试 设 计 一 个 从 市 售 鲜 酸 乳 中 分 离 纯 化 乳 酸 菌 的 制 作 乳 酸 菌 饮 料 的 程 序 注 : ( 一 ) 脱 脂 乳 试 管 直 接 选 用 脱 脂 乳 液 或 按 脱 脂 乳 粉 与 5% 蔗 糖 水 为 1:10 的 比 例 配 制, 装 量 以 试 管 的 1/3 为 宜,115 灭 菌 15min. ( 二 ) 乳 酸 检 测 方 法 1. 定 性 测 定 取 酸 乳 上 清 液 的 10mL 于 试 管 中, 加 入 10% H 2 SO 4 1mL, 再 加 2% KMnO 4 1mL, 此 时 乳 酸 转 化 为 乙 醛, 把 事 先 在 含 氨 的 硝 酸 溶 液 中 浸 泡 的 滤 纸 条 搭 在 试 管 口 上, 微 火 加 热 试 管 至 沸, 若 滤 纸 变 黑, 则 说 明 有 乳 酸 存 在, 这 里 因 为 加 热 使 乙 醛 挥 发 的 结 果 2. 定 量 测 定 : (1) 测 定 方 法 : 取 稀 释 10 倍 的 酸 乳 上 清 液 0.2mL, 加 至 3mL ph9.0 的 缓 冲 液 中, 再 加 入 0.2mL NAD 溶 液, 混 匀 后 测 定 OD 340nm 值 为 A1, 然 后 加 入 0.02mL L(+)LDH,0.02 D( 一 )LDH, 25 保 温 lh 后 测 定 OD 340nm 值 为 A2 同 时 用 蒸 馏 水 代 替 酸 乳 上 清 液 作 对 照, 测 定 步 骤 及 条 件 完 全 相 同, 测 出 的 相 应 值 为 Bl 和 B2 (2) 计 算 公 式 : 结 论

53 乳 酸 /g (100mL) -1 =(V M ε D) 1000 ε 1 Vs V: 比 色 液 最 终 体 积 (3.44mL) M: 乳 酸 的 克 分 子 重 量 (lmol/l=90g) ε:(a2-a1)-(b2-b1) D: 稀 释 倍 数 (10) ε:nadh 在 340nm 吸 光 系 数 ( l mol -1 cm -l ) 1: 比 色 皿 的 厚 度 (0.1cm) Vs: 取 样 体 积 (0.2mL) (3) 测 定 乳 酸 试 剂 的 配 制 ( 见 附 录 ) 3. 酸 乳 的 检 查 指 标 1 感 观 指 标 : 酸 乳 凝 块 均 匀 细 腻, 色 泽 均 匀 无 气 泡, 有 乳 酸 特 有 的 悦 味 ;2 合 格 的 理 化 指 标 : 如 脂 肪 3%, 乳 总 干 物 质 11.5%, 蔗 糖 5.00%, 酸 度 70~110T º,Hg< mg/ml 等 ;3 无 致 病 菌, 大 肠 菌 群 40 个 /100m L 实 验 23 酒 精 发 酵 及 糯 米 甜 酒 的 酿 制 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 学 习 和 掌 握 酵 母 菌 发 酵 糖 产 生 酒 精 和 酒 曲 发 酵 糯 米 配 制 糯 米 甜 酒 的 方 法 内 容 :1. 酵 母 菌 的 酒 精 发 酵 2. 糯 米 甜 酒 的 酿 制 二 实 验 材 料 和 用 具 培 养 的 酿 酒 酵 母 (Saccharomyces cerevisiae) 斜 面 菌 种 酒 精 发 酵 培 养 基 甜 酒 曲 蒸 馏 水 无 菌 水 糯 米 铝 锅 电 炉 三 角 瓶 牛 皮 纸 棉 绳 蒸 馏 装 置 水 浴 锅 振 荡 器 酒 精 比 重 计 三 操 作 步 骤 ( 一 ) 酵 母 菌 的 酒 精 发 酵 1. 培 养 基 配 制 好 的 发 酵 培 养 基 分 装 人 300min 三 角 瓶 中, 每 瓶 100mL,121 湿 热 灭 菌 20~30min 2. 接 种 和 培 养 于 培 养 24h 的 酿 酒 酵 母 斜 面 中 加 入 无 菌 水 5mL, 制 成 菌 悬 液 并 吸 取 lml, 接 种 于 装 有 100mL 培 养 基 的 三 角 瓶 中, 一 共 接 2 瓶, 其 中 1 瓶 于 30 恒 温 静 止 培 养, 另 1 瓶 置 30 恒 温 振 荡 培 养 3. 酵 母 菌 数 目 的 计 数 每 隔 24h 取 样, 经 10 倍 稀 释 后 进 行 细 胞 计 数 ( 方 法 参 阅 细 菌 数 量 测 定 ) 4. 酒 精 蒸 馏 及 酒 精 度 的 测 定 取 60mL 已 发 酵 培 养 3d 的 发 酵 液 加 至 蒸 馏 装 置 的 圆 底 烧 瓶 中, 在 水 浴 锅 中 85~95 下 蒸 馏 当 开 始 流 出 液 体 时, 准 确 收 集 40mL 于 量 筒 中, 用 酒 精 比 重 计 测 量 酒 精 度 5. 品 尝 取 少 量 一 定 浓 度 (30~40 度 ) 的 酒 品 尝, 体 会 口 感 ( 二 ) 糯 米 甜 酒 的 配 制 1. 甜 酒 培 养 基 制 作 称 取 一 定 量 优 质 糯 米 ( 糙 糯 米 更 好 ) 用 水 淘 洗 干 净 后, 加 水 量 为 米 水 比 1:1, 加 热 煮 熟 成 饭 或 者 糯 米 洗 净 后, 用 水 浸 透, 沥 干 水 后, 加 热 蒸 熟 成 饭, 即 为 甜 酒 培 养 基 2. 接 种 糯 米 冷 却 至 35 以 下, 加 入 适 量 的 甜 酒 曲 ( 用 量 按 产 品 说 明 书 ) 并 喷 洒 一 些 清 水 拌 匀, 然 后 装 入 到 干 净 的 三 角 瓶 中 或 装 入 聚 丙 烯 袋 中 装 饭 量 为 容 器 的 l/3~2/3, 中 央 挖 洞, 饭 面 上 : 再 撒 一 些 酒 曲, 塞 上 棉 塞 或 扎 好 袋 口, 置 25~30 下 培 养 发 酵 3. 培 养 发 酵 发 酵 2d 便 可 闻 到 酒 香 味, 开 始 渗 出 清 液,3~4d 渗 出 液 越 来 越 多, 此 时, 把 洞 填 平, 让 其 继 续 发 酵 4. 产 品 处 理 培 养 发 酵 至 第 7d 取 出, 把 酒 槽 滤 去, 汁 液 即 为 糯 米 甜 酒 原 液, 加 入 一 定 量 的 水 加 热 煮 沸 便 是 糯 米 甜 酒, 即 可 品 尝 四 注 意 事 项 酿 制 糯 米 甜 酒 时 糯 米 饭 一 定 要 煮 熟 煮 透, 不 能 太 硬 或 夹 生 ; 米 饭 一 定 要 凉 透 至 35 以 下 才 能 拌 酒 曲, 否 则 会 影 响 正 常 发 酵 五 演 示 酒 精 蒸 馏 过 程

54 六 实 验 报 告 记 录 酵 母 酒 精 发 酵 过 程, 比 较 两 种 培 养 方 法 结 果 的 不 同, 并 解 释 其 原 因 记 录 糯 米 配 制 糯 米 甜 酒 的 发 酵 过 程, 以 及 糯 米 甜 酒 的 外 观 色 香 味 和 口 感 七 问 题 和 思 考 1. 为 什 么 糯 米 饭 温 度 要 降 至 35 以 下 拌 酒 曲, 发 酵 才 能 正 常 进 行? 糯 米 饭 一 开 始 发 酵 时 要 挖 个 洞, 后 来 又 填 平, 这 有 什 么 作 用? 2. 酒 精 发 酵 培 养 基 配 方 中 如 去 掉 KH 2 PO 4, 同 样 接 人 酒 精 酵 母 菌 进 行 发 酵, 将 出 现 何 种 结 果? 为 什 么? 实 验 24 微 生 物 菌 种 保 藏 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 了 解 并 掌 握 菌 种 保 藏 的 常 用 方 法 及 其 优 缺 点 内 容 :1 学 习 斜 面 传 代 保 藏 方 法 2 学 习 液 体 石 蜡 保 藏 方 法 3 学 习 沙 土 管 保 藏 方 法 4 学 习 冷 冻 干 燥 保 藏 方 法 二 实 验 材 料 和 用 具 细 菌 酵 母 菌 放 线 菌 和 霉 菌 斜 面 菌 ; 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 斜 面 ( 培 养 细 菌 ), 麦 芽 汁 培 养 基 斜 面 ( 培 养 酵 母 菌 ), 高 氏 1 号 培 养 基 斜 面 ( 培 养 放 线 菌 ), 马 铃 薯 蔗 糖 培 养 基 斜 面 ( 培 养 丝 状 真 菌 ) 无 菌 水 液 体 石 蜡 P 2 O 5 脱 脂 奶 粉 10%HCl 干 冰 95% 乙 醇 食 盐 河 沙 瘦 黄 土 ( 有 机 物 含 量 少 的 黄 土 ); 无 菌 试 管 无 菌 吸 管 (1mL 及 5mL) 无 菌 滴 管 接 种 环 40 目 及 100 目 筛 子 干 燥 器 安 瓿 管 冰 箱 冷 冻 真 空 干 燥 装 置 酒 精 喷 灯 三 角 烧 瓶 (250mL) 三 操 作 步 骤 下 列 各 方 法 可 根 据 实 验 室 具 体 条 件 与 需 要 选 做 ( 一 ) 斜 面 传 代 保 藏 法 l. 贴 标 签 取 各 种 无 菌 斜 面 试 管 数 支, 将 注 有 菌 株 名 称 和 接 种 日 期 的 标 签 贴 上, 贴 在 试 管 斜 面 的 正 上 方, 距 试 管 口 2~3cm 处 2. 斜 面 接 种 将 待 保 藏 的 菌 种 用 接 种 环 以 无 菌 操 作 法 移 接 至 相 应 的 试 管 斜 面 上, 细 菌 和 酵 母 菌 宜 采 用 对 数 生 长 期 的 细 胞, 而 放 线 菌 和 丝 状 真 菌 宜 采 用 成 熟 的 袍 子 3. 培 养 细 菌 37 恒 温 培 养 18~24h, 酵 母 菌 于 28~30 培 养 36~60h, 放 线 菌 和 丝 状 真 菌 置 于 28 培 养 4~7d 4. 保 藏 斜 面 长 好 后, 可 直 接 放 入 4 冰 箱 保 藏 为 防 止 棉 塞 受 潮 长 杂 菌, 管 口 棉 花 应 用 牛 皮 纸 包 扎, 或 换 上 无 菌 胶 塞, 亦 可 用 熔 化 的 固 体 石 蜡 熔 封 棉 塞 或 胶 塞 保 藏 时 间 依 微 生 物 种 类 而 不 同, 酵 母 菌 霉 菌 放 线 菌 及 有 芽 抱 的 细 菌 可 保 存 2~6 个 月, 移 种 一 次 ; 而 不 产 芽 孢 的 细 菌 最 好 每 月 移 种 一 次 此 法 的 缺 点 是 容 易 变 异, 污 染 杂 菌 的 机 会 较 多 ( 二 ) 液 体 石 蜡 保 藏 法 l. 液 体 石 蜡 灭 菌 在 250mL 三 角 烧 瓶 中 装 入 100mL 液 体 石 蜡, 塞 上 棉 塞, 并 用 牛 皮 纸 包 扎,12l 湿 热 灭 菌 30min, 然 后 于 40 温 箱 中 放 置 l4d( 或 置 于 105~110 烘 箱 中 lh), 以 除 去 石 蜡 中 的 水 分, 备 用 2. 接 种 培 养 同 斜 面 传 代 保 藏 法 3. 加 液 体 石 蜡 用 无 菌 滴 管 吸 取 液 体 石 蜡 以 无 菌 操 作 加 到 已 长 好 的 菌 种 斜 面 上, 加 入 量 以 高 出 斜 面 顶 端 约 1cm 为 宜 4. 保 藏 棉 塞 外 包 牛 皮 纸, 将 试 管 直 立 放 置 于 4 冰 箱 中 保 存 利 用 这 种 保 藏 方 法, 霉 菌 放 线 菌 有 芽 孢 细 菌 可 保 藏 2 年 左 右, 酵 母 菌 可 保 藏 1~2 年, 一 般 无 芽 孢 细 菌 也 可 保 藏 1 年 左 右

55 5. 恢 复 培 养 用 接 种 环 从 液 体 石 蜡 下 挑 取 少 量 菌 种, 在 试 管 壁 上 轻 靠 几 下, 尽 量 使 油 滴 净, 再 接 种 于 新 鲜 培 养 基 中 培 养 由 于 菌 体 表 面 粘 有 液 体 石 蜡, 生 长 较 慢 且 有 粘 性, 故 一 般 须 转 接 2 次 才 能 获 得 良 好 菌 种 ( 三 ) 沙 土 管 保 藏 法 l. 沙 土 处 理 (1) 沙 处 理 : 取 河 沙 经 40 目 过 筛, 去 除 大 颗 粒, 加 10%HCl 浸 泡 ( 用 量 以 浸 没 沙 面 为 宜 )2~ 4h( 或 煮 沸 30min), 以 除 去 有 机 杂 质, 然 后 倒 去 盐 酸, 用 清 水 冲 洗 至 中 性, 烘 干 或 晒 干, 备 用 (2) 土 处 理 : 取 非 耕 作 层 瘦 黄 土 ( 不 含 有 机 质 ), 加 自 来 水 浸 泡 洗 涤 数 次, 直 至 中 性, 然 后 烘 干, 粉 碎, 用 100 目 过 筛, 去 除 粗 颗 粒 后 备 用 2. 装 沙 土 管 将 沙 与 土 按 2:1,3:1 或 4:1(W/W) 比 例 混 合 均 匀 装 入 试 管 中 (10mm 100mm, 装 置 约 7cm 高, 加 棉 塞, 并 外 包 牛 皮 纸,12l 湿 热 灭 菌 30min, 然 后 烘 干 3. 无 菌 试 验 每 10 支 沙 土 管 任 抽 一 支, 取 少 许 沙 土 接 入 牛 肉 膏 蛋 白 胨 或 麦 芽 汁 培 养 液 中, 在 最 适 的 温 度 下 培 养 2~4d, 确 定 无 菌 生 长 时 才 可 使 用 若 发 现 有 杂 菌, 经 重 新 灭 菌 后, 再 作 无 菌 试 验, 直 到 合 格 4. 制 备 菌 液 用 5mL 无 菌 吸 管 分 别 吸 取 3mL 无 菌 水 至 待 保 藏 的 菌 种 斜 面 上, 用 接 种 环 轻 轻 搅 动, 制 成 悬 液 5. 加 样 用 1mL 吸 管 吸 取 上 述 菌 悬 液 0.1~0.5mL 加 入 沙 土 管 中, 用 接 种 环 拌 匀 加 入 菌 液 量 以 湿 润 沙 土 达 2/3 高 度 为 宜 6. 干 燥 将 含 菌 的 沙 土 管 放 入 干 燥 器 中, 干 燥 器 内 用 培 养 皿 盛 P 2 O 5 作 为 干 燥 剂, 可 再 用 真 空 泵 连 续 抽 气 3~4h, 加 速 干 燥 将 沙 土 管 轻 轻 一 拍, 沙 土 呈 分 散 状 即 达 到 充 分 干 燥 7. 保 藏 沙 土 管 可 选 择 下 列 方 法 之 一 来 保 藏 : (1) 保 存 于 干 燥 器 中 ; (2) 用 石 蜡 封 住 棉 花 塞 后 放 入 冰 箱 保 存 ; (3) 将 沙 土 管 取 出, 管 口 用 火 焰 熔 封 后 放 入 冰 箱 保 存 ; (4) 将 沙 土 管 装 入 有 CaCl 2 等 干 燥 剂 的 大 试 管 中, 塞 上 橡 皮 塞 或 木 塞, 再 用 蜡 封 口, 放 入 冰 箱 中 或 室 温 下 保 存 8. 恢 复 培 养 使 用 时 挑 取 少 量 混 有 孢 子 的 沙 土, 接 种 于 斜 面 培 养 基 上, 或 液 体 培 养 基 内 培 养 即 可, 原 沙 土 管 仍 可 继 续 保 藏 此 法 适 用 于 保 藏 能 产 生 芽 孢 的 细 菌 及 形 成 孢 子 的 霉 菌 和 放 线 菌, 可 保 存 2 年 左 右 但 不 能 用 于 保 藏 营 养 细 胞 ( 四 ) 冷 冻 干 燥 保 藏 法 1. 准 备 安 瓿 管 选 用 内 径 5mm, 长 10.5cm 的 硬 质 玻 璃 试 管, 用 10%HCl 浸 泡 8~10h 后 用 自 来 水 冲 洗 多 次, 最 后 用 去 离 子 水 洗 1~2 次, 烘 干, 将 印 有 菌 名 和 接 种 日 期 的 标 签 放 人 安 瓿 管 内, 有 字 的 一 面 朝 向 管 壁 管 口 加 棉 塞,121 灭 菌 30min 2. 制 备 脱 脂 牛 奶 将 脱 脂 奶 粉 配 成 20% 乳 液, 然 后 分 装,121 灭 菌 30min, 并 作 无 菌 试 验 3. 准 备 菌 种 选 用 无 污 染 的 纯 菌 种, 培 养 时 间, 一 般 细 菌 为 24~48h, 酵 母 菌 为 3d, 放 线 菌 与 丝 状 真 菌 7~10d 4. 制 备 菌 液 及 分 装 吸 取 3mL 无 菌 牛 奶 直 接 加 入 斜 面 菌 种 管 中, 用 接 种 环 轻 轻 搅 动 菌 落, 再 用 手 摇 动 试 管, 制 成 均 匀 的 细 胞 或 孢 子 悬 液 用 无 菌 长 滴 管 将 菌 液 分 装 于 安 瓿 管 底 部, 每 管 装 0.2mL 5. 预 冻 将 安 瓿 管 外 的 棉 花 剪 去 并 将 棉 塞 向 里 推 至 离 管 口 约 15mm 处 ( 图 24 2A), 再 通 过 乳 胶 管 把 安 瓶 管 连 接 于 总 管 的 侧 管 上, 总 管 则 通 过 厚 壁 橡 皮 管 及 三 通 短 管 与 真 空 表 及 干 燥 瓶 真 空 泵 相 连 接 ( 图 24 1), 并 将 所 有 安 瓶 管 浸 入 装 有 干 冰 和 95% 乙 醇 的 预 冷 槽 中,( 此 时 槽 内 温 度 可 达 -40~-50 ), 只 需 冷 冻 1h 左 右, 即 可 使 悬 液 冻 结 成 固 体

56 图 24 1 真 空 冷 冻 干 燥 装 置 6. 真 空 干 燥 完 成 预 冻 后, 升 高 总 管 使 安 瓿 管 仅 底 部 与 冰 面 接 触,( 此 处 温 度 约 -10 ), 以 保 持 安 韶 管 内 的 悬 液 仍 呈 固 体 状 态 开 启 真 空 泵 后, 应 在 5~15min 内 使 真 空 度 达 66.7Pa 以 下, 使 被 冻 结 的 悬 液 开 始 升 华, 当 真 空 度 达 到 26.7~13.3Pa 时, 冻 结 样 品 逐 渐 被 干 燥 成 白 色 片 状, 此 时 使 安 瓿 管 脱 离 冰 浴, 在 室 温 下 (25~30 ) 继 续 干 燥 ( 管 内 温 度 不 超 过 30C), 升 温 可 加 速 样 品 中 残 余 水 分 的 蒸 发 总 干 燥 时 间 应 根 据 安 瓿 管 的 数 量, 悬 浮 液 装 量 及 保 持 剂 性 质 来 定, 一 般 3~4h 即 可 7. 封 口 样 品 干 燥 后 继 续 抽 真 空 达 1.33Pa 时, 在 安 瓿 管 棉 塞 的 稍 下 部 位 用 酒 精 喷 灯 火 焰 灼 烧, 拉 成 细 颈 并 熔 封 ( 图 24-2B C), 然 后 置 4 冰 箱 内 保 藏 8. 恢 复 培 养 用 75% 乙 醇 消 毒 安 瓿 管 外 壁 后, 在 火 焰 上 烧 热 安 瓿 管 上 部, 然 后 将 无 菌 水 滴 在 烧 热 处, 使 管 壁 出 现 裂 缝, 放 置 片 刻, 让 空 气 从 裂 缝 中 缓 慢 进 入 管 内 后, 将 裂 口 端 敲 断, 这 样 可 防 止 再 用 无 菌 的 长 颈 滴 管 吸 取 菌 液 至 合 适 培 养 基 中, 放 置 在 最 适 温 度 下 培 养 冷 冻 干 燥 保 藏 法 综 合 利 用 了 各 种 有 利 于 菌 种 保 藏 的 因 素 ( 低 温 干 燥 和 缺 氧 等 ), 是 目 前 最 有 效 的 菌 种 保 藏 方 法 之 一 保 存 时 间 可 长 达 10 年 以 上 图 24 2 安 瓿 管 的 处 理 A. 棉 塞 推 向 管 内 的 位 置 ;B. 拉 细 颈 ;C. 熔 封 四 注 意 事 项 1. 从 液 体 石 蜡 封 藏 的 菌 种 管 中 挑 菌 后, 接 种 环 上 带 有 油 和 菌, 故 接 种 环 在 火 焰 上 灭 菌 时 要 先 在 火 焰 边 烤 干 再 直 接 灼 烧, 以 免 菌 液 四 溅, 引 起 污 染 2. 在 真 空 干 燥 过 程 中 安 瓿 管 内 样 品 应 保 持 冻 结 状 态, 以 防 止 抽 真 空 时 样 品 产 生 泡 沫 而 外 溢 3. 熔 封 安 瓿 管 时 注 意 火 焰 大 小 要 适 中, 封 口 处 灼 烧 要 均 匀, 若 火 焰 过 大, 封 品 处 易 弯 斜, 冷 却 后 易 出 现 裂 缝 而 造 成 漏 气 五 演 示 1. 冷 冻 真 空 干 燥 装 置 的 连 接 及 使 用 2. 熔 封 安 瓿 管 操 作 六 实 验 报 告

57 1. 按 以 下 项 目 列 表 记 录 菌 种 保 藏 方 法 和 结 果 : 接 种 日 期 菌 种 名 称 培 养 条 件 保 藏 保 藏 中 文 名 学 名 培 养 基 培 养 温 度 方 法 温 度 操 作 要 点 2. 试 述 各 种 菌 种 保 藏 方 法 的 优 缺 点 七 问 题 和 思 考 1. 如 何 防 止 菌 种 管 棉 塞 受 潮 和 杂 菌 污 染? 2. 冷 冻 干 燥 装 置 包 括 哪 几 个 部 件? 各 个 部 件 起 什 么 作 用? 3. 现 有 一 个 纤 维 素 酶 的 高 产 霉 菌 菌 株, 你 选 用 什 么 方 法 保 存? 试 设 计 一 个 实 验 方 案 实 验 25 食 用 菌 培 养 I 食 用 菌 组 织 分 离 一 目 的 和 要 求 掌 握 了 解 食 用 菌 组 织 分 离 的 方 法 和 实 际 操 作 技 术, 明 确 食 用 菌 组 织 分 离 在 食 用 菌 生 产 中 的 重 要 性 二 材 料 和 用 具 培 养 皿 试 管 斜 面 培 养 基 平 菇, 金 针 菇 或 蘑 菇 较 成 熟 的 子 实 体 酒 精 灯 接 种 针 75% 酒 精, 火 柴 甲 醛 高 锰 酸 钾 新 洁 尔 灭 消 毒 液 以 及 温 箱 冰 箱 等 三 说 明 在 食 用 菌 生 产 中 采 用 组 织 分 离 的 方 法 繁 殖 母 种 是 大 多 数 菌 类 普 遍 采 用 的 方 法, 而 组 织 分 离 成 功 与 否 是 与 种 菇 子 实 体 的 选 择 分 离 过 程 中 的 操 作 方 法 等 分 不 开 的 这 直 接 关 系 到 所 繁 菌 种 的 优 劣 因 此 食 用 菌 组 织 分 离 是 食 用 菌 生 产 中 的 重 要 环 节 之 一 四 方 法 与 步 骤 每 班 同 学 分 为 二 大 组 4 小 组,( 以 每 大 组 为 单 位 进 行 培 养 基 制 备 工 作 ) 组 织 分 离 接 种 以 小 组 为 单 位 进 行, 每 个 同 学 接 种 8 支 试 管 母 种 ( 平 菇 4 支 金 针 菇 4 支 ) 在 未 感 染 病 虫 和 杂 菌 的 菇 瓶 或 菇 床 上 选 择 种 菇, 各 类 食 用 菌 种 菇 均 须 选 具 有 本 品 种 特 征 特 性 的 较 成 熟 的 第 一 二 批 菇 作 种 菇 平 菇 选 朵 大 肉 厚 的 作 种 菇 金 针 菇 则 选 择 朵 大, 菇 柄 长 的 且 黄 白 色 部 分 较 长 的 菇 作 种 菇 蘑 菇 选 择 菇 形 圆 整 洁 白 肉 厚 较 成 熟 未 开 伞 的 作 种 菇 将 选 好 的 种 菇 剪 去 过 长 的 菌 柄, 放 入 接 种 箱 内 进 行 消 毒, 种 菇 均 用 75% 的 酒 精 擦 洗 菌 盖 菌 柄 然 后 用 无 菌 小 刀 从 菌 柄 中 部 纵 向 切 开, 或 把 种 菇 撕 开, 在 菌 盖 与 菌 柄 交 界 处 或 菌 盖 带 菌 褶 部 分 挑 取 一 小 块 组 织, 移 接 到 试 管 培 养 基 上 平 菇 也 可 不 用 酒 精 擦 洗 直 接 将 种 菇 撕 开, 挑 取 一 小 块 组 织 移 接 到 培 养 基 上 置 于 22~26 左 右 温 度 下 培 养 3~5 天 就 可 看 到 组 织 上 产 生 白 色 绒 毛 状 菌 丝, 并 向 培 养 基 上 生 长 菌 丝 长 满 斜 面 后, 管 口 用 塑 料 薄 膜 或 防 潮 纸 包 扎, 即 可 放 入 5 电 冰 箱 中 保 藏 第 一 大 组 采 用 菌 盖 与 菌 柄 交 界 处 组 织 进 行 分 离, 第 二 大 组 采 用 菌 盖 带 菌 褶 部 分 进 行 组 织 分 离 五 作 业 认 真 按 操 作 规 程 进 行 工 作, 根 据 观 察 结 果 比 较 两 菌 种 间 菌 丝 生 长 情 况 和 同 一 菌 种 不 同 部 位 组 织 分 离 后 菌 丝 生 长 情 况, 评 价 何 种 部 位 更 适 宜 该 菌 种 的 组 织 分 离 繁 殖, 并 对 操 作 的 各 个 环 节 提 出 改 进 建 议 II 食 用 菌 孢 子 分 离 一 目 的 要 求 : 了 解 食 用 菌 孢 子 分 离 的 方 法, 操 作 技 术 以 及 应 用 二 材 料 和 用 具 孢 子 收 集 器 75% 酒 精 0.25% 的 新 洁 尔 灭 蘑 菇 平 菇 子 实 体 接 种 针 等 三 方 法 和 步 骤

58 在 无 菌 操 作 操 作 下 使 孢 子 在 适 宜 的 培 养 基 上 萌 发, 长 成 菌 丝 体 而 获 得 纯 菌 种 的 方 法 称 为 孢 子 分 离 法 其 特 点 是 : 菌 丝 菌 龄 短, 因 是 有 性 繁 殖 产 物, 其 菌 丝 生 命 力 强 侵 染 病 毒 的 菌 类 可 用 孢 子 分 离 法 脱 毒 在 一 般 菌 种 分 离 中, 为 了 避 免 异 宗 接 合 的 菌 类 如 香 菇 平 菇 产 生 单 孢 子 不 孕 现 象, 一 般 都 采 用 多 孢 分 离 法 单 孢 分 离 法 主 要 应 用 于 食 用 菌 的 杂 交 育 种 但 双 孢 蘑 菇 草 菇 等 同 宗 接 合 菌 类 可 采 用 单 孢 分 离 法 1. 种 菇 的 选 择 在 生 产 中 必 须 选 择 优 良 品 系 中 的 优 良 个 体 作 分 离 材 料 2. 孢 子 采 集 方 法 (1) 孢 子 弹 射 分 离 法 它 是 利 用 孢 子 能 自 动 弹 射 出 子 实 体 层 的 特 性 来 收 集 孢 子 收 集 有 几 种 不 同 的 装 置 1 整 菇 插 种 法, 需 用 一 套 孢 子 收 集 器 ( 图 25-1) 来 收 集 孢 子, 将 钟 罩 上 的 孔 加 上 棉 塞 或 包 上 6~8 层 纱 布, 放 在 垫 有 4~6 层 纱 布 ( 浸 过 0.1% 升 汞 液 ) 的 塘 瓷 盘 上, 纱 布 上 放 一 培 养 器, 内 放 一 个 不 锈 钢 支 架 把 收 集 器 包 装 好, 灭 菌 备 用 将 菌 幕 未 破 裂 的 成 熟 子 实 体 洗 干 净, 用 0.1% 升 汞 溶 液 或 0.25% 的 新 洁 尔 灭 浸 泡 2~3min, 以 杀 死 表 面 的 杂 菌 对 于 菌 幕 破 裂 子 实 层 已 外 露 的 子 实 体 或 无 菌 幕 包 裹 的 子 实 体, 可 用 棉 花 蘸 75% 酒 精 涂 擦 子 实 体 表 面 消 毒 按 无 菌 操 作 要 求 移 入 孢 子 收 集 器, 插 在 支 架 上, 在 适 宜 的 温 度 中 培 养 2~3 天 后 孢 散 落 在 培 养 皿 中, 加 入 无 菌 水, 用 针 筒 吸 取 孢 子 液, 接 种 在 斜 面 培 养 基 中 央, 置 于 22~26 恒 温 箱 中 培 养 即 可 2 钩 悬 法 ( 图 25 2), 在 生 产 上, 采 集 木 耳 银 耳 孢 子 常 用 此 法, 伞 菌 也 可 采 用 此 法 先 将 新 鲜 成 熟 的 耳 片 用 无 菌 水 冲 洗, 然 后 用 无 菌 纱 布 将 水 吸 干, 取 一 小 片 挂 在 灭 菌 的 钩 子 上 ( 伞 菌 则 消 毒 后 挂 上 ), 钩 子 的 另 一 端 挂 在 三 角 瓶 口, 瓶 内 装 有 培 养 基, 在 25 下 培 养 24h 孢 子 落 到 培 养 基 上 后, 取 出 耳 片, 塞 上 棉 塞 继 续 培 养, 然 后 再 转 入 试 管 中 培 养 3 贴 附 法, 取 一 小 块 成 熟 的 菌 褶 或 小 块 菌 盖, 用 溶 化 的 琼 脂 或 胶 水 浆 糊 ( 需 先 灭 菌 ) 贴 附 在 试 管 斜 面 的 上 方 或 培 养 皿 皿 盖 上, 经 6-12h, 待 孢 子 落 下 后, 立 即 将 试 管 或 培 养 皿 中 的 培 养 基 移 到 另 一 消 毒 过 的 空 试 管 或 培 养 皿 中 进 行 培 养 图 25 1 孢 子 收 集 器 图 25 2 钩 悬 法 采 集 孢 子 1- 消 毒 棉 塞 ;2- 玻 璃 钟 罩 ;3- 种 菇 1- 棉 花 塞 ;2- 铁 丝 钩 ;3- 种 菇 ;4- 培 养 基 4- 培 养 皿 ;5- 瓷 盘 ;6- 浸 过 升 汞 水 的 纱 布 (2) 菌 褶 上 涂 抹 法 将 伞 菌 手 实 体 用 75% 酒 精 表 面 消 毒, 按 无 菌 操 作 用 接 种 环 直 接 插 入 两 片 菌 褶 之 间, 轻 轻 地 抹 过 褶 片 表 面, 然 后 用 划 线 法 涂 抹 于 试 管 培 养 基 上 (3) 孢 子 印 分 离 法 取 成 熟 子 实 体 经 表 面 消 毒 后, 切 去 菌 柄, 将 菌 褶 向 下 放 置 于 灭 过 菌 的 有 色 纸 上, 在 20~ 24 静 置 一 天, 大 量 孢 子 落 下 形 成 孢 子 印, 然 后 移 少 量 孢 子 在 试 管 培 养 基 上 培 养 (4) 单 孢 子 分 离 法 进 行 单 孢 子 分 离 后, 在 人 工 控 制 的 条 件 下, 便 两 个 优 良 品 系 的 单 孢 子 进 行 杂 交, 从 而 培

59 育 出 新 品 种 1 平 板 稀 释 法, 挑 取 少 许 孢 子 在 无 菌 水 中 形 成 孢 子 悬 浮 液, 取 几 滴 涂 于 培 养 基 上, 用 无 菌 玻 璃 三 角 架 推 平 经 48~72h 后, 镜 检 孢 子 萌 发 情 况 在 单 个 孢 子 旁 做 好 标 记, 然 后 将 其 转 接 到 斜 面 培 养 基 上, 待 菌 落 长 到 1cm 左 右 时 进 行 镜 检, 观 察 有 无 锁 状 联 合, 初 步 确 定 是 否 是 单 核 菌 丝 2 连 续 稀 释 法, 挑 取 一 定 量 孢 子, 经 连 续 稀 释 后, 直 到 每 滴 稀 释 液 中 只 有 一 个 孢 子, 然 后 滴 入 试 管 中 保 温 培 养 当 发 现 单 个 菌 落 时, 转 到 新 试 管 中 继 续 培 养, 并 通 过 镜 检 以 确 定 是 否 为 单 孢 菌 落 III 食 用 菌 一 级 种 制 作 一 目 的 要 求 通 过 母 种 ( 一 级 种 ) 的 制 作, 掌 握 其 制 种 的 技 术 二 方 法 与 步 骤 母 种 培 养 基 制 作 流 程 : 设 计 培 养 基 配 方 材 料 煮 汁 或 药 品 溶 化 琼 脂 溶 化 混 合 定 容 调 节 ph 值 分 装 灭 菌 倒 斜 面 接 种 培 养 母 种 ( 一 级 种 ) l. 一 级 种 常 用 培 养 基 配 方 (1) 马 铃 薯 葡 萄 糖 琼 脂 培 养 基 (PDA 培 养 基 ) 马 铃 薯 ( 去 皮 )200mg, 葡 萄 糖 20.0g, 琼 脂 2.0g, 水 l000ml (2) 马 铃 薯 硫 酸 铵 培 养 基 马 铃 薯 200 g, 硫 酸 铵 2g, 蛋 白 胨 1g, 葡 萄 糖 20g, 磷 酸 二 氢 钾 1g, 硫 酸 镁 1g, 琼 脂 20g, 水 1000mL (3) 马 铃 薯 葡 萄 糖 蛋 白 胨 培 养 基 马 铃 薯 200g, 葡 萄 糖 20g, 蛋 白 胨 2g, 硫 酸 镁 0.5g, 磷 酸 氢 二 钾 1g, 维 生 素 B 1 0.5mg, 琼 脂 20g, 水 1000mL 2. 培 养 基 分 装 培 养 基 配 制 完 毕 应 即 时 分 装, 否 则 琼 脂 凝 固, 无 法 分 装, 一 级 种 最 常 用 玻 璃 试 管 ; 要 安 装 好 分 装 装 置, 常 用 玻 璃 漏 斗 套 接 乳 胶 管 和 尖 嘴 玻 璃 接 液 管, 乳 胶 管 上 配 以 止 流 夹 分 装 时 左 手 抓 握 2~3 支 试 管, 右 手 控 制 接 液 管 插 入 试 管, 注 入 培 养 基, 装 培 养 基 量 为 总 试 管 容 量 的 1/5 分 装 时 应 注 意 不 要 将 培 养 液 沾 到 试 管 管 口, 避 免 将 来 发 生 污 染 若 有 沾 粘, 则 应 用 干 净 纱 布 及 时 擦 净 分 装 的 试 管 直 接 加 棉 花 塞 封 口, 棉 花 应 用 普 通 棉 花, 不 能 用 脱 脂 棉, 棉 花 塞 起 到 过 滤 空 气 的 作 用, 不 宜 过 松 或 过 紧, 以 封 口 后 手 持 棉 塞 轻 轻 摇 动 试 管 不 脱 落, 且 旋 转 拨 出 顺 利 为 度 棉 塞 外 观 要 求 光 滑, 不 能 塞 过 浅 或 过 深, 否 则 造 成 操 作 困 难 3. 培 养 基 灭 菌 和 冷 却 成 斜 面 一 般 分 装 好 的 试 管 应 当 天 灭 菌, 使 之 呈 无 菌 状 态, 以 免 杂 菌 自 繁, 造 成 培 养 基 变 质 酸 败 灭 菌 时 将 试 管 扎 成 捆, 用 牛 皮 纸 或 其 它 防 潮 纸 将 整 捆 试 管 的 棉 塞 包 好, 直 接 放 入 底 部 盛 水 的 高 压 灭 菌 锅 内, 加 热 到 压 力 为 l.05kg/cm 2, 灭 菌 30min 然 后 趁 热 取 出 试 管, 斜 卧 放 置, 使 之 自 然 冷 却, 凝 固 成 斜 面, 斜 面 为 试 管 长 的 1/2, 冷 却 后 即 成 斜 面 培 养 基 4. 一 级 种 的 接 种 培 养 将 试 管 中 的 菌 种 移 接 至 另 外 的 试 管 培 养 基 上 称 为 转 管, 其 步 骤 为 : (1) 将 待 接 的 斜 面 试 管 以 及 一 级 种 接 种 针 等 放 入 已 消 毒 的 接 种 箱 内 (2) 用 75% 的 酒 精 溶 液 棉 球 擦 双 手 消 毒 (3) 左 手 持 住 空 白 斜 面 试 管 和 一 级 种, 右 手 夹 持 棉 塞, 火 焰 封 口 (4) 将 接 种 针 顶 端 烧 红, 并 将 整 支 接 种 棒 在 火 焰 上 过 火 (5) 挑 取 黄 豆 大 小 的 菌 丝 琼 脂 块, 迅 速 移 接 到 空 白 斜 面 中 央, 将 棉 塞 塞 回 试 管 (6) 将 已 接 种 好 的 试 管 放 入 恒 温 培 养 箱, 在 22~26 下 培 养, 长 满 试 管 即 可 作 为 一 级 种 ( 母 种 ) 使 用 IV 原 种 及 栽 培 种 的 制 作 一 目 的 要 求 通 过 原 种 和 栽 培 种 的 制 作, 熟 悉 掌 握 食 用 菌 生 产 用 种 的 制 备 过 程 和 操 作 技 术 二 方 法 与 步 骤 结 合 栽 培 季 节 和 平 菇 栽 培 的 内 容, 进 行 原 种 和 栽 培 种 的 制 作

60 ( 一 ) 原 种 ( 二 级 种 ) 制 作 原 种 选 用 玉 米 粒 作 培 养 基, 以 750 毫 升 玻 璃 瓶 或 250mL 三 角 瓶 作 容 器, 按 每 瓶 装 干 玉 米 0.1~0.3 公 斤 计 算 其 配 方 为 : 玉 米 粒 98% 石 膏 1%, 碳 酸 钙 1%; 将 玉 米 粒 浸 泡 数 小 时, 再 煮 软 但 不 能 过 软 ( 即 玉 米 粒 中 央 还 有 一 点 白 色 ), 然 后 捞 出 晾 干, 加 入 石 膏 和 碳 酸 钙, 装 瓶, 加 棉 塞, 用 牛 皮 纸 将 瓶 口 包 扎, 以 免 消 毒 时 将 棉 塞 弄 湿 消 毒 在 2 高 压 蒸 汽 消 毒 锅 内 进 行 当 压 力 达 0.5 公 斤 / 厘 米 时, 排 去 冷 空 气 压 力 升 至 1.5 公 斤 / 厘 米 2 时 开 始 计 时, 消 毒 50 分 钟 消 毒 结 束 后 让 压 力 自 然 降 至 零 后, 揭 盖 将 瓶 子 取 出, 贴 上 标 签, 写 明 所 接 品 种 名 称 接 种 日 期 接 种 人 姓 名 然 后 放 入 接 种 箱 内 进 行 接 种, 采 用 低 温 型 平 菇 菌 种, 一 支 试 管 母 种 ( 一 级 种 ) 接 四 瓶 原 种, 原 母 种 试 管 培 养 基 中 央 的 老 菌 块 除 去 不 用 ( 二 ) 栽 培 种 ( 三 种 种 ) 制 作 栽 培 种 以 棉 籽 壳 为 培 养 料, 聚 丙 烯 塑 料 袋 ( 厘 米 ) 为 容 器, 其 配 方 为 : 棉 籽 壳 99% 石 膏 1% 棉 籽 壳 按 1: 的 料 水 比 加 入 清 水, 使 之 用 手 捏 料 指 缝 间 见 水 但 不 滴 下 为 宜, 此 时 即 为 65% 的 含 水 量 塑 料 袋 装 料 以 每 袋 0.3 公 斤 干 棉 籽 壳 计 算 配 料 装 袋 后 将 袋 口 套 上 塑 料 环, 并 加 棉 塞, 环 口 用 牛 皮 纸 复 盖, 用 胶 圈 或 绳 子 将 牛 皮 纸 捆 紧 然 后 将 塑 料 袋 装 入 常 压 消 毒 锅 中 进 行 消 毒 消 费 时 间 为 上 汽 后 ( 即 灶 内 水 开 有 蒸 汽 冒 出 ) 小 时, 冷 却 后 在 塑 料 袋 上 贴 上 胶 布 作 为 标 签, 再 将 塑 料 袋 放 入 接 种 箱 内 消 毒 接 种 每 瓶 玉 米 原 种 接 种 30 袋 左 右 接 种 后 放 入 22~ 26 条 件 下 进 行 培 养 三 时 间 安 排 以 一 天 时 间 配 制 培 养 料 消 毒, 接 种 以 组 为 单 位 进 行 配 料 装 瓶 装 袋, 全 班 统 一 进 行 消 毒 灭 菌, 分 组 接 种 V 食 用 菌 加 工 技 术 一 目 的 要 求 了 解 食 用 菌 常 规 加 工 技 术 二 方 法 与 步 骤 食 用 菌 的 常 规 加 工 技 术 主 要 有 盐 渍 干 制 罐 头 等 ( 一 ) 干 制 技 术 食 用 菌 的 干 制 也 称 烘 干 干 燥 脱 水 等, 它 是 在 自 然 条 件 或 人 工 控 制 条 件 下, 促 使 新 鲜 食 用 菌 子 实 体 中 水 分 蒸 发 的 工 艺 过 程 经 过 干 制 的 食 用 菌 称 为 干 品 干 制 设 备 要 求 不 高, 技 术 不 复 杂, 易 掌 握 ; 干 制 品 耐 贮 藏, 不 易 腐 败 变 质, 可 长 期 保 藏 有 的 食 用 菌 ( 如 香 菇 ) 经 干 制 后 可 增 加 风 味, 改 善 色 泽, 提 高 了 商 品 价 值 但 干 制 过 程 会 引 起 营 养 成 分 及 品 质 的 变 化, 菇 体 中 了 些 生 理 活 性 物 质 以 及 一 些 维 生 素 类 物 质 ( 维 生 素 C) 往 往 不 耐 高 温, 在 烘 干 过 程 中 易 受 破 坏, 菇 体 中 的 可 溶 性 糖 在 较 高 的 烘 干 温 度 下 容 易 焦 化 而 损 失, 并 且 使 菇 体 颜 色 变 黑 l. 干 制 原 理 由 于 干 制 品 所 含 可 溶 性 固 形 物 浓 度 相 对 提 高, 因 而 具 有 很 高 的 渗 透 压, 能 使 附 在 其 上 的 腐 败 菌 产 生 生 理 干 旱, 无 法 活 动 菇 体 所 含 的 游 离 水 在 干 燥 过 程 中 容 易 排 除, 但 化 合 水 结 合 于 组 织 内 的 化 合 物 质 中, 干 燥 过 程 中 难 以 排 除 菇 体 脱 水 是 靠 菇 体 表 面 水 分 汽 化 和 菇 体 内 水 分 的 向 外 扩 散 而 实 现 的 由 于 水 分 下 降, 酶 的 活 性 也 受 到 抑 制, 这 就 是 食 用 菌 干 制 品 能 长 期 保 藏 的 原 理 2. 干 制 方 法 菌 类 的 干 制 分 为 晒 干 烘 干 和 冷 冻 干 燥 等 方 法 (1) 晒 干 是 一 种 自 然 干 制 的 方 式, 包 括 晾 干 和 晒 干 晒 干 后, 不 仅 有 利 于 保 存, 还 能 改 善 菌 类 品 质 和 提 高 营 养 价 值, 晒 制 还 能 促 使 香 菇 中 所 含 的 维 生 素 D 原 转 化 成 维 生 素 D 2 晒 干 过 程 一 般 为 2-3 天, 对 后 熟 作 用 强 的 菇 类 务 必 于 采 收 当 日 以 蒸 煮 方 式 作 灭 活 处 理 后 再 晒 (2) 烘 干 是 食 用 菌 干 制 的 主 要 方 法 它 是 将 鲜 菇 置 于 烘 房 烘 笼 烘 干 机 中 用 炭 火 电 热 或 远 红 外 线 等 作 热 源 进 行 干 燥 的 过 程 烘 干 不 受 气 候 条 件 影 响, 干 燥 快, 省 工, 省 时, 产 品 质 量 有 保 证

61 (3) 冷 冻 干 燥 先 将 菇 体 中 的 水 分 冻 成 冰 晶, 然 后 在 较 高 真 空 下 将 冰 直 接 汽 化 而 除 去 为 了 做 到 长 期 保 藏, 最 好 采 用 真 空 包 装 并 在 包 装 袋 内 充 氮 如 双 孢 蘑 菇 的 冷 冻 干 燥 工 艺 是 : 将 蘑 菇 放 入 密 闭 容 器 中, 在 -20 下 冷 冻, 然 后 在 较 高 真 空 条 件 下 缓 缓 升 温, 经 10 12h, 因 升 华 作 用 而 使 蘑 菇 脱 水 干 燥 经 过 这 种 处 理 的 蘑 菇 具 有 良 好 的 复 原 性, 只 要 在 热 水 中 浸 泡 数 分 钟 便 可 恢 复 原 有 形 状, 除 硬 度 略 逊 于 鲜 菇 外, 其 风 味 与 鲜 菇 几 乎 没 有 差 别 3. 烘 干 工 艺 : 适 宜 于 脱 水 干 燥 的 食 用 菌 如 口 蘑 香 菇 猴 头 菌 木 耳 银 耳 灵 芝 竹 荪 等, 干 燥 后 不 影 响 品 质, 有 的 还 能 增 加 风 味 与 适 口 性 但 是 有 些 菇 如 草 菇 金 针 菇 平 菇 等 干 制 后, 其 风 味 适 口 性 变 差 在 脱 水 前 可 对 菇 体 进 行 预 处 理, 其 方 法 之 一 为 杀 青, 就 是 把 菇 体 投 入 沸 水 中 煮 透, 一 般 为 2-8min, 然 后 迅 速 冷 却, 但 此 法 易 造 成 菇 体 软 化, 影 响 形 态 也 可 用 预 热 处 理 的 方 法, 如 草 菇 需 纵 剖, 然 后 切 口 向 上 摆 在 烤 筛 上, 勿 重 叠 ; 金 针 菇 扎 成 小 捆 整 捆 放 在 烤 筛 上 放 入 烘 箱 后, 使 温 度 升 高 到 (64±2), 处 理 20 30min, 然 后 再 进 行 常 规 烘 烤 烘 房 或 脱 水 机 的 烘 烤 温 度 控 制 较 为 关 键, 温 度 过 低 易 使 产 品 腐 烂 变 色, 过 高 又 会 将 产 品 烤 焦 烘 烤 温 度 从 35 开 始, 每 小 时 升 高 1~2, 经 7~8h 后 鲜 菇 水 分 散 发 30%,12~13h 后 散 发 50% 当 温 度 升 至 60~65 ( 勿 超 过 75 ) 时, 水 分 已 散 发 70%, 然 后 将 温 度 降 至 50~55, 继 续 烘 烤 2~3h 即 可 在 烘 烤 过 程 中, 要 调 整 好 通 风 口 和 排 风 口 的 开 启 程 度, 保 持 一 定 的 换 气 量, 加 速 鲜 菇 脱 水 干 制 的 菇 体 在 空 气 中 易 吸 湿 而 回 潮, 引 起 霉 变 和 生 虫, 因 此, 干 品 应 贮 藏 于 密 封 的 塑 料 袋 或 容 器 中, 放 到 清 洁 干 爽 低 温 的 房 间 贮 藏 ( 二 ) 盐 渍 技 术 1. 盐 渍 原 理 盐 渍 是 让 食 盐 渗 入 到 菇 体 组 织 内, 降 低 其 水 活 度, 提 高 菇 体 的 渗 透 压, 以 控 制 微 生 物 的 生 长 活 性, 抑 制 腐 败 菌 的 生 长, 从 而 防 止 食 用 菌 腐 败 变 质, 保 持 其 商 品 价 值 其 制 品 称 为 盐 水 菇 食 盐 属 高 渗 透 压 物 质, 质 量 浓 度 为 l0g/l 的 食 盐 溶 液 可 以 产 生 610kPa 的 渗 透 压 生 产 盐 水 菇 用 的 食 盐 溶 液 质 量 浓 度 可 达 350g/L, 能 产 生 20MPa 以 上 的 渗 透 压, 菇 体 组 织 中 的 水 分 和 可 溶 性 物 质 外 渗, 盐 水 渗 入, 最 后 达 到 平 衡, 使 菇 体 组 织 也 有 很 高 的 渗 透 压 一 般 微 生 物 细 胞 液 的 渗 透 压 在 350~1670kPa 之 间, 一 般 细 菌 则 为 300~600kPa 食 盐 溶 液 的 渗 透 压 则 高 得 多, 使 附 着 在 菇 体 表 面 的 有 害 微 生 物 细 胞 内 的 水 分 外 渗, 原 生 质 收 缩, 质 壁 分 离, 造 成 生 理 干 燥, 迫 使 微 生 物 处 于 假 死 状 态 或 休 眠 状 态, 甚 至 死 亡, 从 而 达 到 防 止 腐 烂 变 质 的 目 的 食 盐 溶 解 后 就 会 离 解, 并 在 每 一 离 子 的 周 围 聚 集 着 一 群 水 分 子, 也 就 是 离 子 水 化 水 化 离 子 周 围 的 水 分 聚 集 量 占 总 水 分 量 的 百 分 率 随 着 盐 分 浓 度 的 提 高 而 增 加, 水 分 活 度 则 随 之 降 低, 也 抑 制 了 微 生 物 的 生 长 ; 而 高 浓 度 食 盐 离 解 产 生 高 浓 度 的 钠 离 子 和 氯 离 子, 造 成 微 生 物 所 需 的 离 子 不 平 衡, 产 生 单 盐 毒 害, 同 样 也 抑 制 了 微 生 物 的 活 动 食 盐 对 微 生 物 分 泌 的 酶 活 力 也 有 破 坏 由 于 氧 很 难 溶 解 在 盐 水 中, 在 盐 液 中 形 成 了 缺 氧 环 境, 需 氧 菌 是 难 以 生 长 的 2. 盐 渍 工 艺 (1) 选 料 选 择 好 原 料 菇, 当 天 采 收, 当 天 加 工 (2) 漂 洗 用 质 量 浓 度 为 6g/L 的 盐 水 洗 去 菇 体 的 杂 质, 接 着 用 0.05mol/L 柠 檬 液 (ph 值 4.5) 漂 洗, 能 显 著 改 变 菇 色 因 为 菇 体 内 的 多 酚 氧 化 酶 能 利 用 酪 氨 酸 形 成 黑 色 素 的 前 体 物 质, 经 氧 化 作 用 形 成 黑 色 素 而 用 低 ph 值 的 柠 檬 酸 溶 液 可 有 效 地 抑 制 多 酚 氧 化 酶 的 活 性, 防 止 菇 色 变 深 和 变 黑 (3) 杀 青 指 在 稀 盐 水 中 煮 沸 杀 死 菇 体 细 胞 的 过 程 其 作 用 是 进 步 抑 制 酶 活 性 ; 防 止 子 实 体 开 伞, 防 止 褐 变, 破 坏 细 胞 膜 结 构, 增 加 细 胞 透 气 性, 排 出 菇 体 内 的 水 分, 以 便 盐 水 能 很 快 进 入 菇 体, 然 后 依 菌 盖 直 径 进 行 分 级 (4) 制 备 饱 和 食 盐 水 和 调 酸 剂 准 备 10:4 的 水 与 食 盐, 将 盐 溶 化, 直 到 盐 不 能 溶 解 为 止, 用 波 美 比 重 计 测 其 浓 度 为 23 Be 左 右, 再 放 大 少 量 明 矾 静 置, 冷 却 后 取 其 上 清 液 用 8 层 脱 脂 纱 布 过 滤, 使 盐 水 达

62 到 清 澈 透 明, 即 为 饱 和 食 盐 水, 备 用 配 制 调 酸 剂, 其 中 柠 檬 酸 占 50%, 偏 磷 酸 钠 占 42%, 明 矾 占 8%, 混 合 均 匀 后, 加 入 饱 和 食 盐 水 中, 用 柠 檬 酸 调 ph 值 至 3~3.5 即 可 (5) 盐 渍 将 杀 青 分 级 后 沥 去 水 分 的 菇 按 每 l00kg 加 25 30kg 食 盐 ( 精 盐 ) 的 比 例 逐 层 盐 渍 先 在 缸 底 放 一 层 盐, 接 着 放 一 层 菇 (8-9cm 厚 ), 依 次 一 层 盐 一 层 菇, 直 至 满 缸 缸 内 注 入 煮 沸 后 冷 却 的 饱 和 食 盐 水 表 面 加 盖 帘 ( 竹 片 或 木 条 制 成 ), 并 压 上 鹅 卵 石, 使 菇 浸 没 在 盐 水 内 3 天 需 倒 缸 一 次 以 后 5-7 天 倒 缸 一 次 盐 渍 过 程 中, 要 经 常 用 波 美 比 重 计 测 盐 水 浓 度, 使 其 保 持 在 23 Be 左 右, 低 了 就 应 及 时 倒 缸 (6) 装 桶 盐 渍 20 天 以 上 即 可 装 桶 装 桶 前 先 将 盐 渍 好 的 菇 捞 出 控 尽 盐 水 一 般 用 塑 料 桶 分 装, 加 入 新 配 制 的 调 酸 剂 至 菇 面, 用 精 盐 封 口, 排 除 桶 内 空 气, 盖 紧 内 外 盖 ( 三 ) 罐 头 加 工 将 新 鲜 食 用 菌 经 过 一 系 列 处 理 之 后, 装 入 特 制 的 容 器 内, 经 过 抽 气 密 封 隔 绝 外 界 空 气 和 微 生 物, 再 经 过 加 热 杀 菌, 便 能 在 较 长 时 间 内 保 藏 食 用 菌, 其 保 藏 的 产 品 称 为 食 用 菌 罐 头 按 罐 藏 内 容 物 的 组 成 和 制 造 目 的 的 不 同, 食 用 菌 罐 头 可 分 为 两 大 类 以 食 用 菌 整 菇 片 菇 或 碎 菇 为 主 要 原 料, 注 入 适 当 浓 度 的 盐 水 作 填 充 液, 称 为 清 水 罐 头, 主 要 用 于 菜 肴 的 烹 调 加 工, 是 当 前 食 用 菌 罐 头 生 产 的 主 要 类 型 将 菇 类 和 肉 鸡 鸭 等 原 料 配 制, 经 烹 调 加 工 制 成 的 罐 头, 如 蘑 菇 猪 肚 汤 等 复 合 式 食 用 菌 罐 头, 可 直 接 食 用 食 用 菌 罐 头 厂 一 般 采 用 马 口 铁 罐 和 玻 璃 瓶 罐, 也 有 采 用 复 合 塑 料 薄 膜 袋 包 装 我 国 食 用 菌 罐 头 生 产 大 约 从 本 世 纪 50 年 代 开 始, 一 直 发 展 至 今 目 前, 蘑 菇 罐 头 已 成 为 中 国 出 口 罐 头 的 拳 头 产 品, 除 此 之 外, 还 有 草 菇 罐 头 香 菇 罐 头 金 针 菇 罐 头 等 新 品 种, 并 已 批 量 出 口 l. 罐 头 加 工 原 理 食 用 菌 罐 藏 品 能 较 长 时 间 保 藏 的 主 要 原 理 是 : 罐 藏 容 器 是 密 封 的, 隔 绝 了 外 界 的 空 气 和 各 种 微 生 物 制 罐 过 程 中, 密 闭 在 容 器 里 的 食 用 菌 及 制 品 经 过 高 温 灭 菌, 罐 内 微 生 物 的 营 养 体 被 完 全 杀 死, 但 可 能 有 极 少 数 微 生 物 孢 子 体 没 有 被 杀 死 如 果 是 好 气 性 的, 由 于 罐 内 形 成 一 定 的 真 空 而 无 法 活 动 ; 如 果 是 厌 气 性 的, 罐 藏 品 仍 有 变 质 的 危 险, 所 以, 罐 藏 品 有 一 定 的 保 藏 期 限, 通 常 为 两 年 由 于 高 温 灭 菌 也 破 坏 了 菇 体 的 一 切 酶 系 统, 使 菇 体 内 的 一 切 生 理 生 化 反 应 不 能 进 行, 防 止 了 菇 体 变 质 2. 罐 头 生 产 工 艺 (1) 原 料 准 备 1 选 择 好 原 料 菇 它 必 须 符 合 制 罐 等 级 标 准 并 应 及 时 加 工 处 理 2 漂 白 护 色 将 菇 体 置 于 质 量 浓 度 为 0.3g/L 的 焦 亚 硫 酸 钠 溶 液 中 浸 2-3min, 再 倒 人 质 量 浓 度 为 lg/l 的 焦 亚 硫 酸 钠 溶 液 中 漂 白 为 止, 然 后 用 清 水 洗 净 3 预 煮 将 菇 体 放 入 已 烧 开 的 2% 食 盐 水 中 煮 熟 但 不 烂, 可 抑 制 酶 活 性, 防 止 酶 引 起 的 化 学 变 化 ; 排 除 菇 体 组 织 内 滞 留 的 气 体, 使 组 织 收 缩 软 化, 减 少 脆 性, 便 于 切 片 和 装 罐, 也 可 减 少 铁 皮 罐 的 腐 蚀 4 冷 却 将 煮 过 的 原 料 迅 速 放 人 流 水 中 冷 却 采 用 滚 筒 式 分 级 机 或 机 械 振 荡 式 分 级 机 进 行 分 级 (2) 装 罐 空 罐 使 用 前 用 80 热 水 消 毒 装 罐 用 手 工 或 罐 机 装 罐, 因 为 成 罐 后 内 容 物 重 量 减 少, 一 般 装 罐 时 应 增 加 规 定 量 的 10%~15% (3) 注 液 注 入 汤 液 可 增 加 风 味, 排 除 空 气, 有 利 于 在 灭 菌 冷 却 时 加 快 热 的 传 递 速 度 汤 液 一 般 含 2%--3% 的 食 盐 或 0.12% 的 柠 檬 酸, 有 的 还 加 0.1% 的 抗 坏 血 酸 (4) 排 气 抽 真 空 排 气 最 重 要 的 目 的 是 除 去 罐 头 内 所 有 空 气 空 气 中 氧 气 会 加 速 铁 皮 腐 蚀 排 气 后 可 以 使 罐 头 的 底 盖 维 持 一 种 平 坦 或 略 向 内 凹 陷 的 状 态 ; 这 是 正 常 良 好 罐 头 食 品 的 标 志 排 气 有 两 种 方 法 : 一 种 是 原 料 装 罐 注 液 后 不 封 盖, 通 过 加 热 排 气 后 封 盖, 另 一 种 是 在 真 空 室 内 抽 气 后, 再 封 盖 (5) 封 罐 主 要 防 止 腐 败 性 细 菌 侵 入 较 早 是 手 工 焊 合 封 盖 现 在 普 遍 使 用 双 滚 压 缝 线 封 罐 机 ; 有

63 手 摇 半 自 动 全 自 动 和 真 空 封 罐 机 (6) 灭 菌 其 目 的 是 使 罐 头 内 容 物 不 致 受 微 生 物 的 破 坏, 一 般 采 用 高 压 蒸 汽 灭 菌 采 用 高 温 短 时 间 灭 菌 对 保 持 产 品 的 质 量 有 好 处 蘑 菇 罐 头 灭 菌 温 度 为 , 灭 菌 时 间 为 15-60min (7) 冷 却 灭 菌 后 的 罐 头 应 立 即 放 入 冷 水 中 迅 速 冷 却, 以 免 色 泽 风 味 和 组 织 结 构 遭 受 大 的 破 坏 玻 璃 罐 冷 却 时, 水 温 要 逐 步 降 低, 以 免 玻 璃 罐 破 裂 冷 却 到 时, 则 可 取 出 罐 头 擦 干 ; 抽 样 检 验, 打 印 标 识 并 包 装 贮 藏 VI 平 菇 的 栽 培 一 目 的 要 求 熟 悉 平 菇 栽 培 的 技 术 二 方 法 与 步 骤 ( 一 ) 室 内 栽 培 栽 培 平 菇 的 房 间 要 有 一 定 的 散 射 光, 能 保 温 保 湿, 可 通 风 换 气, 地 面 平 整 光 滑, 周 围 环 境 清 洁 卫 生 ; 门 窗 装 有 防 虫 的 尼 龙 纱 1. 品 种 选 择 应 根 据 接 种 季 节 栽 培 场 所 培 养 料 种 类 栽 培 方 式 及 市 场 要 求 等 选 择 适 宜 品 种 秋 冬 宜 用 中 低 温 型 品 种, 早 春 宜 用 中 温 型 品 种, 春 末 夏 初 宜 周 中 高 温 型 品 种, 夏 秋 宜 用 高 温 型 品 种 2. 生 产 季 节 利 用 自 然 气 温 生 产 平 菇, 一 般 中 低 温 型 品 种 在 7 月 下 旬 至 8 月 上 中 旬 制 原 种,8 月 中 下 旬 至 9 月 上 中 旬 制 生 产 种 ; 中 温 型 品 种 在 11~l2 月 制 原 种, 次 年 1~2 月 制 生 产 种 ; 高 温 型 品 种 在 3~4 月 制 原 种,4~5 月 制 生 产 种 平 菇 可 利 用 不 同 温 型 的 品 种, 实 现 周 年 生 产 3. 培 养 料 的 选 择 配 方 与 处 理 1) 培 养 料 的 选 择 培 养 料 可 以 就 地 取 材, 采 用 棉 籽 壳 玉 米 芯 豆 秆 粉 锯 木 屑 稻 草 麦 秆 等, 其 中 以 棉 籽 壳 最 好 使 用 前, 棉 籽 壳 应 在 日 光 下 晒 1-2 天, 不 能 使 用 霉 烂 变 质 的 生 料 栽 培 拌 料 时, 可 加 入 多 菌 灵 或 高 锰 酸 钾 等 药 剂 防 污 染, 但 加 入 的 药 剂 浓 度 过 高, 可 能 会 对 平 菇 菌 丝 造 成 药 害 实 验 表 明, 在 平 菇 生 料 中 加 入 0.1% 的 多 菌 灵 0.1% 的 托 布 津 或 0.1%-5% 的 高 锰 酸 钾 溶 液 可 较 好 地 防 治 杂 菌 污 染, 而 且 对 菌 丝 无 不 良 的 影 响, 但 在 培 养 料 中 加 入 过 氧 乙 酸 和 甲 醛 溶 液 防 污 染 效 果 差, 且 对 平 菇 菌 丝 生 长 有 抑 制 作 用 2) 培 养 料 的 配 方 由 于 平 菇 培 养 料 的 来 源 很 广, 因 此, 主 料 与 辅 料 的 配 法 也 多 种 多 样 (1) 棉 籽 壳 培 养 料 1 棉 籽 壳 100%;2 棉 籽 壳 95%, 豆 饼 粉 ( 菜 饼 粉 )5%;3 棉 籽 壳 95%, 过 磷 酸 钙 2%, 石 膏 3%;4 棉 籽 壳 80%, 麸 皮 或 米 糠 20% 培 养 料 含 水 量 为 65%--70% (2) 废 棉 培 养 料 废 棉 营 养 含 量 丰 富 且 较 全 面, 一 般 不 必 添 加 其 它 材 料 废 棉 ph 值 为 5.5 左 右, 应 加 消 石 灰 调 节 废 棉 因 附 着 的 棉 纤 维 较 多, 吸 水 困 难, 需 先 将 废 棉 放 在 清 水 中 浸 泡 6-12h, 浸 透 后 用 手 捏 干, 或 用 压 榨 机 压 干, 其 含 水 量 为 65%-70% (3) 稻 草 培 养 料 1 稻 草 粉 80%-90%, 米 糠 或 麦 麸 10%-20%;2 稻 草 粉 98%, 糖 1%, 石 膏 1%;3 稻 草 95%, 豆 饼 粉 ( 菜 籽 饼 )5% 稻 草 中 含 有 很 多 鬼 伞 菌 等 杂 菌, 可 用 开 水 煮 20-30min, 也 可 用 1%-3% 石 灰 水 浸 泡 1-2 天, 然 后 用 清 水 冲 洗 便 其 ph 值 为 8, 沥 干, 加 大 其 它 材 料 (4) 玉 米 芯 培 养 料 玉 米 芯 碎 块 60%, 米 糠 或 麦 麸 36%, 石 膏 1%, 尿 素 0.2%, 过 磷 酸 钙 2% (5) 锯 木 屑 培 养 料 锯 木 屑 78%, 麦 麸 或 米 糠 20%, 蔗 糖 1%, 石 膏 1% (6) 甘 蔗 渣 培 养 料 甘 蔗 渣 70%, 麦 麸 或 米 糖 28%, 石 膏 2% (7) 其 它 稿 杆 培 养 料 可 采 用 小 麦 秆 玉 米 秆 麦 壳 向 日 葵 秆 花 生 壳 及 山 茅 草 等 稿

64 秆 中 的 一 种 或 两 种, 甚 至 多 种 材 料 组 成, 并 制 成 糠 粉 或 切 成 4~8cm 长 的 材 料 其 中 稿 秆 糠 75%~85%, 麦 麸 或 米 糠 10%~20%, 蔗 糖 1%, 尿 素 0.5%, 过 磷 酸 钙 2%, 石 膏 1% (8) 废 纸 培 养 料 废 纸 ( 印 刷 厂 切 边 纸 等 )90%, 麦 麸 9%, 碳 酸 钙 或 石 灰 粉 1% 将 废 纸 切 碎, 用 水 浸 泡 6~ l2h, 捞 出 沥 干, 加 入 麦 麸 等 材 料 4. 上 料 播 种 : 1) 床 栽 一 般 床 架 式 栽 培 可 采 用 生 料 栽 培, 将 配 制 好 的 培 养 料 铺 上 菇 床, 逐 层 铺 料, 料 厚 10~ 15cm, 可 采 用 穴 播, 穴 距 为 8~12cm, 在 料 表 面 层 应 撒 一 层 菌 种, 然 后 弄 平 料 面, 加 盖 薄 膜 2) 块 栽 菌 砖 用 长 方 形 的 木 模 制 成, 砖 大 小 为 90cm 50cm l2cm 具 体 操 作 方 法 为 : 在 模 子 下 铺 塑 料 薄 膜, 在 模 子 内 铺 人 培 养 料 和 菌 种, 可 采 用 层 播 法, 一 层 料 再 铺 上 一 层 菌 种, 可 铺 多 层 也 可 混 播, 将 料 与 菌 种 混 合 后 铺 入 模 子 通 常 用 种 量 常 为 干 料 质 量 的 10%~15% 每 个 菌 砖 之 间 应 留 有 5~8cm 的 距 离, 以 利 于 通 风 透 气, 使 菌 丝 易 萌 发 并 吃 料 生 长 3) 塑 料 袋 栽 适 于 熟 料 栽 培 若 采 用 高 压 灭 菌 刚 采 用 聚 丙 烯 塑 料 袋, 常 压 灭 菌 可 用 聚 乙 烯 薄 膜 塑 料 袋 长 49cm, 宽 15~16cm, 装 料 可 采 用 装 袋 机 袋 两 头 开 口 的, 应 套 塑 料 环, 用 棉 花 塞 封 口, 然 后 用 牛 皮 纸 防 水 纸 或 塑 料 薄 膜 包 扎 系 紧, 灭 菌 后 接 种, 在 菌 丝 培 养 室 培 养 用 塑 料 袋 进 行 生 料 栽 培, 以 两 头 开 口 为 好, 便 于 通 风 透 气, 定 点 出 菇 装 袋 先 从 一 端 开 始, 封 口 后 先 放 一 层 菌 种, 再 放 一 层 培 养 料 并 压 实 装 料 达 袋 的 一 半 时, 又 放 一 层 菌 种, 再 装 满 培 养 料, 再 播 一 层 菌 种 压 实, 用 木 棒 在 料 中 央 插 一 空 洞, 袋 口 用 塑 料 环 套 好, 封 口 气 温 高 时, 则 松 散 直 立 放 置, 切 勿 堆 积, 以 防 发 热 高 温 烧 坏 菌 种 待 袋 温 稳 定 后, 再 多 层 叠 放 呈 墙 形 平 菇 袋 栽 可 采 用 覆 土 栽 培, 覆 土 可 减 少 虫 害, 提 高 产 量 和 品 质 土 质 可 选 择 微 酸 性 的 砂 壤 土, 土 壤 要 求 疏 松 肥 沃 通 气, 使 用 前 可 用 甲 醛 消 毒, 闷 一 天 后 再 用 当 菌 丝 长 满 菌 袋, 培 养 料 变 紧 实 后 脱 袋 覆 土, 或 在 菌 袋 出 2-3 批 菇 后 脱 袋 覆 土 4) 箱 栽 可 采 用 清 洁 的 塑 料 箱 旧 木 箱 包 装 纸 箱 竹 箱 或 其 它 材 料 编 制 的 筐 子 来 栽 培 先 在 箱 内 铺 塑 料 薄 膜, 再 装 入 调 配 好 的 培 养 料 并 播 种, 采 用 穴 播 或 分 层 播 种, 播 后 用 薄 膜 保 湿 采 用 此 法 栽 培, 便 于 搬 动, 可 放 到 菌 丝 体 或 子 实 体 生 长 适 宜 的 温 湿 度 场 所 工 厂 化 生 产 宜 用 箱 式 栽 培, 可 先 将 箱 子 放 入 温 度 适 宜 的 房 间 进 行 菌 丝 培 养, 然 后 再 移 入 湿 度 较 高 温 度 较 低 的 人 防 地 道 或 岩 洞 中, 让 子 实 体 发 育 箱 筐 在 菌 丝 生 长 阶 段 可 在 地 面 上 重 叠 放 置, 也 可 放 在 床 架 上, 以 充 分 利 用 空 间 5) 瓶 栽 可 采 用 750mL 的 玻 璃 菌 种 瓶 或 500mL 的 玻 璃 罐 头 瓶 栽 培 采 用 此 法 出 菇 快, 出 菇 前 可 拔 去 棉 塞, 子 实 体 从 瓶 口 长 出 ; 但 此 法 所 用 玻 璃 瓶 的 成 本 高, 生 产 工 艺 比 较 繁 琐, 适 用 于 菌 种 场 的 少 量 生 产 试 验 或 家 庭 小 规 模 栽 培 5. 发 菌 管 理 播 种 后 如 料 温 持 续 上 升, 超 过 30, 应 加 强 通 风 降 温, 同 时, 要 抖 动 盖 在 菌 床 和 菌 砖 上 的 薄 膜 散 热 或 将 菌 袋 翻 堆 降 温 还 要 经 常 检 查 培 养 料 有 无 杂 菌 虫 害 若 发 现 有 杂 菌 虫 害, 要 及 时 处 理 ; 严 重 者, 应 将 其 移 出 培 养 室, 喷 施 药 剂, 隔 离 培 养 发 菌 后 期, 若 温 度 过 低, 还 应 保 温 升 温, 以 保 证 菌 丝 的 正 常 生 长 经 过 天 培 养 后, 菌 丝 长 满 培 养 料, 提 供 适 宜 的 外 界 环 境 条 件, 以 刺 激 菌 丝 体 扭 结 形 成 子 实 体 原 基 6. 出 菇 管 理 平 菇 现 蕾 后, 应 注 意 通 风 换 气 和 增 加 湿 度 采 用 菌 砖 菌 床 等 栽 培 的 要 掀 开 薄 膜, 采 用 菌 袋 的 则 要 敞 开 两 头, 以 利 通 风 换 气 ; 可 向 地 面 墙 壁 空 间 喷 水 或 采 用 增 湿 机 以 增 加 湿 度, 保 持 相 对 湿 度 80%-90%, 切 勿 直 接 向 幼 小 菌 蕾 喷 水 随 着 子 实 体 的 长 大, 应 增 加 菇 房 湿 度, 喷 水 应 勤 喷 轻 喷 并 加 强 通 风 换 气, 保 持 空 气 新 鲜 湿 润 7. 采 收 当 平 菇 菌 盖 充 分 展 开, 颜 色 由 深 逐 渐 变 浅, 但 孢 子 尚 未 弹 射 时, 即 可 采 收 适 时 采 收, 则 菇 体 柔 嫩, 品 质 好, 味 道 佳, 产 量 也 高 ; 采 收 过 早, 菇 体 发 育 不 足, 产 量 低 ; 采 收 过 迟,

65 菌 盖 干 缩, 菇 柄 坚 硬, 质 量 下 降 采 收 后 的 平 菇 要 去 除 菌 柄 基 部 的 草 屑 或 棉 渣, 分 装 运 往 市 场 销 售 ( 二 ) 室 外 阳 畦 栽 培 室 外 阳 畦 栽 培 只 要 少 量 薄 膜 棚 席 等 即 可 栽 培, 成 本 低, 而 产 量 不 低 该 法 因 受 外 界 气 候 影 响 较 大, 一 般 适 于 冬 春 季 栽 培 在 室 外 做 成 宽 70~100cm 深 10~20cm 的 畦, 长 度 可 根 据 需 要 而 定, 畦 底 夯 实, 平 整 成 龟 背 形 先 沿 畦 壁 16cm 处 垫 一 圈 薄 膜, 再 装 料 分 层 播 种 为 使 培 养 料 通 气 好, 避 免 畦 中 央 部 位 因 通 气 不 良, 菌 丝 生 长 差, 特 别 是 当 培 养 料 过 湿 时, 应 每 隔 33cm 留 出 3cm 空 位 ; 这 样 过 多 水 分 也 可 流 入 小 沟 中 播 种 后 将 所 垫 薄 膜 向 畦 内 将 培 养 料 包 住, 并 覆 盖 稻 草, 这 样 气 温 低 时 可 起 到 保 温 的 作 用, 过 20 天 左 右, 菌 丝 长 满 后 快 现 蕾 时, 将 稻 草 和 薄 膜 去 掉, 畦 上 用 竹 支 架 薄 膜 小 拱 棚, 并 盖 草 帘 以 阻 挡 阳 光 的 直 接 照 射, 畦 上 还 可 搭 一 荫 棚 其 它 管 理 方 法 与 室 内 栽 培 相 似 也 可 用 大 田 畦 式 覆 土 栽 培, 其 方 法 为 : 将 畦 土 揭 去 一 层, 堆 放 在 畦 两 旁, 即 成 畦 坑, 然 后 将 菌 简 脱 袋, 紧 密 排 放 于 畦 坑 中, 再 将 畦 两 边 的 细 土 覆 盖 在 菌 筒 上, 以 盖 没 为 度 在 覆 土 上 洒 一 次 水, 使 土 湿 润 ; 再 撒 一 层 0.5 1cm 厚 的 细 土, 使 菌 筒 盖 严, 加 盖 农 用 薄 膜, 以 保 温 保 湿 菌 筒 覆 土 7-10 天 后, 菌 蕾 开 始 拱 土 现 蕾 后 注 意 通 风 换 气, 干 燥 时 喷 水, 每 采 收 一 批 菇 后, 要 喷 一 次 水, 一 般 可 出 菇 3-4 批 平 菇 露 地 栽 培 与 阳 畦 栽 培 相 似, 只 是 不 用 搭 荫 棚 而 利 用 果 园 竹 林 遮 荫, 也 可 与 蔬 菜 高 秆 作 物 隔 畦 间 作, 如 凤 尾 菇 与 白 花 豆 间 作 效 果 好 由 于 露 地 栽 培 保 湿 困 难, 培 养 料 上 宜 覆 盖 厚 度 为 1cm 左 右 的 细 土 VII 灵 芝 的 栽 培 一 目 的 要 求 熟 悉 灵 芝 的 栽 培 二 方 法 与 步 骤 ( 一 ) 瓶 栽 和 袋 栽 1. 栽 培 季 节 灵 芝 在 自 然 气 候 条 件 下, 一 般 春 秋 两 季 栽 培, 春 季 栽 培 在 3--4 月 接 种 ; 秋 季 栽 培 在 月 接 种, 如 果 有 空 调 等 设 备, 一 年 四 季 均 可 栽 培 2. 菌 种 的 制 作 灵 芝 菌 丝 在 黄 豆 芽 黄 豆 粉 培 养 基 中 生 长 最 好, 而 在 PDA 培 养 基 中 生 长 最 慢 紫 芝 菌 丝 在 胡 萝 卜 蛋 白 胨 培 养 基 中 生 长 最 好 而 作 为 原 种 或 栽 培 种, 要 求 纯 净 无 杂 菌, 品 种 优 良, 生 命 力 强, 菌 龄 适 当 3. 栽 培 材 料 配 方 (1) 棉 籽 壳 麦 麸 培 养 料 棉 籽 壳 77%, 麦 麸 20%, 糖 1%, 石 膏 1%, 过 磷 酸 钙 1% (2) 棉 籽 壳 木 屑 培 养 料 棉 籽 壳 50%, 木 屑 32%, 麦 麸 15%, 石 膏 1%, 过 磷 酸 钙 1%, 糖 1% (3) 木 屑 培 养 料 木 屑 77%, 麦 载 20%, 石 膏 1%, 过 磷 酸 钙 1%, 糖 1% (4) 甘 蔗 渣 培 养 料 甘 蔗 渣 75%, 麦 麸 22%, 糖 1%, 石 膏 1%, 过 磷 酸 钙 1% (5) 花 生 壳 豆 秸 棉 秆 培 养 料 花 生 壳 ( 豆 秸, 棉 秆 等 )77%, 麸 皮 20%, 糖 1%, 石 膏 1%, 过 磷 酸 钙 1% (6) 玉 米 芯 培 养 料 玉 米 芯 74%, 麸 皮 25%, 石 膏 粉 10%, 草 木 灰 0.5% 据 1993 年 我 们 的 栽 培 试 验 表 明, 采 用 (1) 号 配 方 培 养 灵 芝, 其 产 量 较 高 可 达 74.45g/ 瓶 4. 栽 培 管 理 将 已 接 种 的 瓶 子 或 袋 子 搬 人 培 养 室, 在 条 件 适 宜 时, 菌 丝 3-4 天 即 萌 发 ;1 星 期 左 右 开 始 吃 料 并 迅 速 生 长 当 菌 丝 已 全 部 长 满 斜 面, 向 料 内 深 入 2-3cm 时, 即 可 松 动 棉 塞 但 不 拉 出, 以 便 增 加 瓶 ( 袋 ) 内 的 空 气 l 个 月 左 右 子 实 体 原 基 开 始 形 成 并 逐 渐 发 育 为 菌 蕾 菌 蕾 形 成 后, 及 时 拔 去 棉 塞, 瓶 栽 的 应 将 瓶 倒 放 成 卧 式 横 排 培 养, 也 可 转 至 另 一 间 专 用

66 栽 培 室 培 养 卧 排 的 瓶 子 每 排 可 重 叠 10~12 瓶, 以 充 分 利 用 培 养 室 空 间, 便 于 管 理 室 内 温 度 控 制 在 25~28, 空 气 相 对 湿 度 90%~95%, 每 天 向 空 中 喷 雾 4~5 次, 经 常 使 地 面 保 持 湿 润, 地 面 若 积 一 层 水 更 好 但 喷 水 不 可 直 接 喷 到 子 实 体 上 和 瓶 ( 袋 ) 内, 以 免 菌 体 霉 变 腐 烂 此 时 应 加 强 通 风 换 气, 给 菇 体 充 足 的 氧 气, 每 天 早 中 晚 开 窗 通 风 1~2h 若 CO 2 积 累 过 多, 子 实 体 就 不 能 很 好 地 生 长, 菌 柄 长, 菌 盖 小, 甚 至 完 全 不 分 化 菌 盖, 呈 鹿 角 状 或 棍 棒 状 同 时 要 做 到 室 内 有 较 充 足 的 光 线 在 正 常 情 况 下, 从 菌 蕾 形 成 到 拔 塞 卧 放 约 需 25 天, 即 可 开 始 采 收 ( 二 ) 阳 畦 栽 培 1. 建 阳 畦 选 择 坐 北 朝 南, 东 西 作 畦, 畦 宽 1.5m, 长 4~5m, 深 30~35cm, 畦 周 围 设 置 水 沟, 畦 上 搭 棚 架, 覆 盖 塑 料 薄 膜 和 草 帘 遮 荫 2. 菌 丝 培 养 采 用 聚 丙 烯 塑 料 袋, 按 前 述 培 养 料 配 方 装 袋 灭 菌 接 入 灵 芝 原 种, 于 25~28 培 养, 经 25~30 天 菌 丝 长 满 全 袋 3. 出 芝 管 理 将 长 满 菌 丝 脱 去 塑 料 袋 的 菌 筒 平 铺 于 阳 畦 内, 每 个 菌 筒 之 间 相 距 6 10cm, 中 间 填 入 菜 园 土, 然 后 向 畦 内 喷 水 自 5 月 中 旬 入 阳 畦, 经 5-10 天 左 右 出 现 原 基, 每 天 需 打 开 阳 畦 两 头 的 塑 料 薄 膜 通 风, 时 常 喷 水, 以 保 持 畦 土 湿 润 于 6 月 中 旬 采 头 潮 灵 芝, 再 过 20 天 可 采 第 二 潮 经 试 验 表 明, 阳 畦 栽 培 灵 芝 不 仅 管 理 方 便, 产 量 较 高, 且 菌 盖 大, 柄 短, 形 状 近 似 野 生 灵 芝, 商 品 性 状 好, 经 济 效 益 高 ( 三 ) 应 用 1. 药 用 灵 芝 菌 体 内 含 有 多 种 有 效 成 分, 如 灵 芝 多 糖 灵 芝 酸 ( 灵 芝 三 萜 类 化 合 物 ) 皂 甙 麦 角 甾 醇 腺 苷 嘌 呤 嘧 啶 生 物 碱 内 酯 等, 具 有 很 高 的 药 用 价 值 这 几 种 成 分 大 多 数 能 溶 解 于 热 水, 但 是 灵 芝 酸 皂 甙 麦 角 甾 醇 等 成 分 在 热 水 中 的 溶 解 度 较 低, 在 乙 醇 中 的 溶 解 度 较 高, 可 用 乙 醇 提 取, 灵 芝 的 其 它 有 效 成 分 都 可 用 热 水 提 取 下 面 介 绍 灵 芝 有 效 成 分 的 提 取 方 法 (1) 灵 芝 的 热 水 提 取 将 灵 芝 子 实 体 用 破 碎 机 破 碎 成 块, 投 入 提 取 锅, 加 入 去 离 子 水 加 热 使 水 沸 腾 并 保 温 2h, 流 出 煎 液 残 渣 用 同 法 再 提 取, 放 出 第 二 次 煎 液 将 两 次 煎 液 合 并, 输 入 贮 液 槽, 静 置 l0h, 吸 取 清 液, 弃 去 槽 底 泥 浆 状 物, 将 清 液 浓 缩, 制 成 灵 芝 制 品 (2) 灵 芝 的 乙 醇 提 取 将 灵 芝 子 实 体 破 碎, 投 入 提 取 锅, 加 入 95% 食 用 乙 醇,78 下 回 流 lh, 放 出 提 取 液, 残 渣 留 在 锅 中 再 用 95% 食 用 乙 醇 用 同 法 提 取 3 次, 将 3 次 乙 醇 提 取 液 合 并, 在 贮 液 槽 中 静 置 10h, 取 出 上 清 液, 弃 去 底 部 沉 淀 物, 将 上 清 液 中 的 乙 醇 回 收, 去 乙 醇 后 的 浓 缩 物 可 制 成 灵 芝 制 品 现 在, 灵 芝 制 品 剂 型 很 多, 有 糖 浆 片 剂 胶 囊 冲 剂 粉 剂 丸 剂 酒 剂 注 射 剂 水 煎 剂 酊 剂 等 剂 型, 对 多 种 疾 病 具 有 良 好 的 疗 效 今 后 随 着 研 究 的 不 断 深 入, 其 药 用 价 值 的 迸 一 步 认 定, 将 生 产 出 更 多 的 疗 效 显 著 的 灵 芝 制 品 供 应 市 场 2. 食 用 由 于 灵 芝 具 有 丰 富 的 营 养, 含 有 人 体 必 需 氨 基 酸 维 生 素 矿 物 质 多 糖 等 多 种 成 分, 是 理 想 的 保 健 食 品 可 以 直 接 食 用 灵 芝 菌 体, 也 可 制 成 多 种 类 型 的 加 工 食 品, 如 灵 芝 口 服 液 灵 芝 乳 酸 浓 缩 液 灵 芝 茶 灵 芝 可 乐 灵 芝 猴 头 膏 灵 芝 糖 灵 芝 蜂 王 浆 等 3. 美 容 据 研 究, 灵 芝 具 有 抗 衰 老 作 用, 有 抗 皱 消 炎 清 除 色 斑 保 护 皮 肤 增 加 头 发 光 泽 的 美 容 效 果 灵 芝 的 护 肤 养 发 沫 浴 制 品 也 已 面 市, 如 灵 芝 特 效 营 养 增 白 露 灵 芝 润 肤 露 灵 芝 爽 肤 沐 浴 露 灵 芝 防 皱 露 等 4. 盆 景 灵 芝 子 实 体 形 态 奇 特, 富 有 光 泽, 坚 硬 不 腐, 可 作 为 造 型 材 料 制 成 可 供 观 赏 的 艺 术 品, 即 灵 芝 盆 景 灵 芝 盆 景 的 制 作, 首 先 要 根 据 灵 芝 生 长 发 育 的 规 律, 采 用 生 物 技 术, 调 控 光 温 水

67 氧 气 二 氧 化 碳 等 条 件, 也 可 采 用 接 合 药 物 刺 激 等 手 段, 人 工 培 养 出 形 态 各 异 的 子 实 体 如 在 高 温 或 缺 氧 下, 可 培 育 出 菌 柄 细 长 或 分 校 呈 珊 瑚 状 的 灵 芝 ; 控 制 通 气 状 态, 可 培 育 出 双 层 菌 盖 的 子 实 体 ; 根 据 其 向 光 性, 可 改 变 菌 柄 菌 盖 生 长 的 方 向 ; 选 用 不 同 口 径 的 容 器, 可 控 制 朵 型 的 大 小 ; 用 紫 外 线 照 射, 可 使 子 实 体 变 形 培 育 个 体 较 大 的 树 舌 可 用 来 绘 制 山 水 风 景 人 物 或 雕 刻 各 种 图 案, 然 后 进 行 造 型 设 计, 通 过 修 剪 晒 干 防 腐 对 子 实 体 进 行 处 理, 防 腐 可 采 用 3:1 的 75% 酒 精 甲 醛 溶 液 擦 拭 子 实 体, 晾 干 后, 连 续 涂 两 次 光 油, 使 之 有 光 泽, 并 有 防 腐 防 虫 作 用 将 处 理 后 的 子 实 体 打 磨 粘 合, 用 石 米 或 塑 料 泡 沫 作 填 充 材 料, 煮 熔 石 蜡 固 定 在 花 盆 花 盘 或 玻 璃 框 内, 并 配 以 花 石 假 山 树 根 人 物 小 型 动 物 以 及 绒 毛 制 成 的 小 草 等, 便 制 作 出 寓 意 深 远 的 灵 芝 盆 景 VIII 金 针 菇 的 栽 培 一 目 的 要 求 : 了 解 金 针 菇 的 栽 培 二 方 法 与 步 骤 古 代, 人 们 常 采 用 段 木 栽 培 生 产 金 针 菇, 但 段 木 栽 培 的 金 针 菇 产 量 低, 形 状 不 好, 色 泽 深, 常 为 黑 褐 色, 商 品 价 值 低, 不 受 消 费 者 喜 爱, 因 此, 现 在 几 乎 不 再 采 用 段 木 栽 培 方 式 随 着 代 料 栽 培 技 术 的 发 展, 目 前 金 针 菇 主 要 有 瓶 栽 袋 栽 大 麻 栽 培 等 方 式 ( 一 ) 瓶 栽 l. 栽 培 容 器 可 采 用 750mL 800mL 或 l000ml 的 无 色 玻 璃 瓶 或 塑 料 瓶, 瓶 口 径 约 7cm 为 宜, 可 使 菇 蕾 大 量 发 生, 同 时, 瓶 口 较 大, 通 气 较 好, 菇 质 量 也 高 目 前 国 内 也 常 采 用 750mL 的 菌 种 瓶 或 500mL 的 罐 头 瓶 作 为 栽 培 容 器, 菌 种 瓶 口 径 太 小, 菇 蕾 发 生 个 数 少, 菇 体 较 密, 通 气 差, 所 以 近 瓶 口 一 段 菌 柄 色 泽 特 别 深, 影 响 菇 体 质 量 而 罐 头 瓶 装 料 有 限, 水 分 容 易 蒸 发 且 易 污 染 杂 菌, 长 出 的 菌 蕾 细 弱, 产 量 不 高 2. 工 厂 化 瓶 栽 设 施 工 厂 化 周 年 瓶 栽 金 针 菇 需 有 如 下 设 施 : (1) 接 种 室 要 求 为 无 菌 状 态 由 于 灭 菌 后 培 养 料 温 度 高, 需 降 温, 因 此 要 设 置 翅 片 冷 却 器, 将 培 养 温 度 降 到 15--l8 (2) 菌 丝 培 养 室 利 用 控 温 设 备, 保 持 温 度 20 左 右, 并 安 装 定 时 换 气 阀 或 全 热 交 换 器, 每 2--3h 强 制 通 风 15min, 排 除 呼 吸 产 生 的 过 多 的 二 氧 化 碳 (3) 催 蕾 室 要 求 控 温 , 空 气 相 对 湿 度 85%--90%, 黑 暗 在 催 蕾 室 两 侧 壁 的 墙 脚 处 设 吸 气 孔, 在 两 墙 上 方 设 排 气 孔, 用 于 通 风 换 气 室 内 有 不 排 风 的 翅 片 冷 却 器 和 加 湿 器 菌 蕾 培 养 成 整 齐 圆 整 而 结 实 的 金 针 菇 菇 房 的 室 温 要 求 4 左 右, 空 气 湿 度 80%--85% 安 装 由 上 往 下 吹 风 的 冷 风 机 组 换 气 阀 或 全 热 交 换 器 (5) 套 纸 筒 生 育 室 为 便 金 针 菇 菌 柄 伸 长, 子 实 体 需 干 燥 发 白, 套 上 纸 筒, 同 时 室 温 要 求 在 6~7, 室 内 安 装 横 向 吹 风 的 冷 风 机 组 工 厂 化 生 产 金 针 菇 可 采 用 mL 口 径 7cm 的 聚 丙 烯 塑 料 瓶, 瓶 盖 采 用 无 棉 盖 体 3. 培 养 料 可 选 用 阔 叶 树 或 针 叶 树 的 木 屑, 需 在 室 外 堆 积, 让 木 屑 中 的 树 脂 挥 发 油 及 水 溶 性 有 害 物 散 失 棉 籽 壳 废 棉 甘 蔗 渣 稻 草 粉 均 可 作 为 原 料 常 用 的 配 方 有 : (1) 棉 籽 壳 95%, 玉 米 粉 3%, 糖 1%, 石 灰 1% (2) 废 棉 99%, 石 膏 1% (3) 甘 蔗 渣 73%, 米 糠 25%, 糖 1%, 碳 酸 钙 1% (4) 木 屑 73%, 米 糠 25%, 糖 1%, 碳 酸 钙 1% (5) 稻 草 粉 73%, 米 糠 25%, 糖 1%, 碳 酸 钙 1% 4. 配 料 装 瓶

68 将 主 料 棉 籽 壳 甘 蔗 渣 废 棉 等 浸 水 6--12h 后 捞 起 沥 干, 木 屑 过 筛, 与 其 它 辅 料 混 合, 调 节 含 水 量 为 65%-70% 装 瓶 时 下 部 可 装 松 些, 以 缩 短 发 菌 时 间 ; 上 部 要 装 紧 些, 否 则 易 干 燥 装 料 应 至 瓶 肩 装 完 用 木 棒 在 瓶 中 部 插 一 个 直 通 瓶 底 的 接 种 孔, 使 菌 丝 在 上 中 下 部 同 时 生 长, 塞 入 棉 花, 外 包 防 水 纸 或 报 纸 或 聚 丙 烯 薄 膜 封 口 5. 灭 菌 接 种 与 培 养 采 用 高 压 蒸 汽 灭 菌, 在 147kPa 压 力 下 灭 菌 1~1.5h, 常 压 灭 菌 是 在 100 下 灭 菌 8~10h 接 种 需 按 无 菌 操 作 进 行, 接 种 量 以 塞 满 接 种 孔 为 宜 接 种 后 立 即 将 接 种 瓶 移 入 培 养 室, 在 20 左 右 培 养 因 菌 丝 生 长 进 行 呼 吸 作 用, 会 发 热, 瓶 内 温 度 一 般 比 室 温 高 2~4 气 温 低 时, 关 闭 门 窗, 每 隔 5-6h 通 风 换 气 一 次 一 般 菌 丝 经 20~30 天 可 长 满 全 瓶 6. 出 菇 管 理 (1) 催 蕾 将 长 满 菌 丝 的 瓶 子 移 到 出 菇 室, 去 掉 瓶 口 上 的 棉 塞, 进 行 搔 菌 所 谓 搔 菌 就 是 用 镊 子 等 工 具 将 老 菌 种 扒 掉, 去 掉 白 色 菌 膜, 并 刮 平 按 平 培 养 料 表 面, 使 其 平 整 也 有 不 搔 菌 的, 但 搔 菌 后 效 果 好 然 后 用 报 纸 覆 盖 瓶 口, 每 日 在 报 纸 上 喷 水 2--3 次 几 天 后 培 养 基 上 部 就 会 形 成 琥 珀 色 的 水 珠, 有 时 还 会 形 成 一 层 白 色 棉 状 物, 这 是 现 蕾 的 前 兆, 再 过 天 就 会 出 现 菇 蕾 喷 水 过 程 中, 不 能 把 水 喷 在 菇 蕾 上, 否 则 菌 柄 基 部 就 会 变 成 黄 棕 色 至 咖 啡 色, 影 响 出 菇 的 质 量, 同 时 会 产 生 根 腐 病 催 蕾 期 温 度 控 制 在 12~13, 湿 度 85%~90%, 每 天 通 风.3~4 次, 每 次 15min 左 右 (2) 抑 制 现 蕾 后 2-3 天, 菌 柄 伸 长 到 3-5mm, 菌 盖 呈 米 粒 大 时, 应 抑 制 生 长 快 的, 促 使 生 长 慢 的 菇 体 生 长, 使 菇 体 整 齐 一 致 在 5-7 天 内, 减 少 喷 水 或 停 水, 湿 度 控 制 在 75%, 温 度 控 制 在 5 左 右 (3) 套 筒 为 了 防 止 金 针 菇 下 垂 散 乱, 减 少 氧 气 供 应, 防 止 强 光 加 深 颜 色, 抑 制 菌 盖 生 长, 促 进 菌 柄 伸 长, 常 采 用 套 筒 措 施 可 用 牛 皮 纸 塑 料 薄 膜, 蜡 纸 作 高 度 10~15cm 的 筒, 呈 喇 叭 形 当 金 针 菇 伸 出 瓶 口 2~3cm 时 套 筒 ; 若 套 筒 过 早, 只 有 瓶 中 间 的 菇 生 长 且 不 容 易 形 成 菌 盖 ; 若 套 筒 过 迟, 子 实 体 矮 小, 没 有 商 品 价 值 为 使 空 气 能 从 筒 下 部 进 入, 常 在 筒 下 部 打 数 个 少 圆 孔 ; 套 筒 后 每 天 在 纸 简 上 喷 少 量 水, 保 持 湿 度 90% 左 右, 早 晚 通 风 15~20min, 温 度 保 持 在 6~8 在 金 针 菇 生 产 中, 常 选 用 浅 色 或 白 色 品 系, 采 用 套 筒 遮 光 吹 风 等 技 术 手 段, 以 抑 制 金 针 菇 色 素 的 形 成 和 菌 盖 的 展 开, 并 促 进 菌 柄 的 伸 长, 得 到 质 地 柔 软 白 色 或 浅 白 色 的 金 针 菇 子 实 体, 这 一 栽 培 方 法 称 为 金 针 菇 白 色 软 化 栽 培 7. 采 收 鲜 销 的 菇 体 在 菌 盖 六 七 分 开 伞 时 采 收, 不 宜 太 迟, 以 免 菌 柄 基 部 呈 褐 色, 绒 毛 增 加 而 影 响 外 观 和 质 量 采 收 时 一 手 拿 住 瓶, 另 一 手 轻 轻 把 菇 丛 拔 下, 采 收 一 批 后 进 行 搔 菌, 重 新 盖 报 纸 保 湿 培 养, 以 便 第 二 次 出 菇 一 般 金 针 菇 可 采 收 2-3 批, 但 产 量 主 要 集 中 在 第 一 二 批, 其 中 第 一 批 产 量 占 总 产 量 的 60% 左 右 从 出 菇 到 收 获 完 毕 需 40~60 天 ( 二 ) 袋 栽 袋 栽 由 于 袋 口 直 径 大, 菌 蕾 可 大 量 发 生, 通 气 好, 菇 的 色 泽 较 好 用 于 栽 培 的 塑 料 袋 的 上 端 可 用 来 遮 光 保 湿, 从 装 料 到 采 收 等 栽 培 管 理 过 程, 操 作 简 便, 原 基 形 成 后 只 需 拉 直 袋 口, 免 去 了 套 筒 的 手 续 我 们 的 研 究 发 现, 袋 栽 金 针 菇 的 子 实 体 个 数 比 用 750mL 菌 种 瓶 500mL 罐 头 瓶 栽 多 出 60% 和 48%, 而 袋 栽 的 菌 柄 长 度 可 增 加 9mm 和 33mm 一 般 来 说, 袋 栽 比 用 3.5cm 口 径 的 瓶 栽 产 量 高 出 30% 左 右 但 因 塑 料 袋 口 大, 培 养 基 水 分 易 蒸 发 干 燥, 同 时 塑 料 袋 破 裂 时 易 引 发 杂 菌 污 染, 造 成 损 失 1. 塑 料 袋 规 格 可 采 用 聚 丙 烯 塑 料 袋, 长 40cm, 宽 17cm 或 长 38cm, 宽 l6cm, 厚 度 mm 塑 料 袋 宽 度 不 宜 过 大, 否 则 易 感 染 杂 菌, 且 菌 柄 易 倒 伏 2. 配 料 装 袋 培 养 料 配 方 和 配 制 与 瓶 栽 相 同, 但 因 袋 口 较 大, 水 分 会 有 散 失, 培 养 料 含 水 量 可 调 高 些, 为 70%~75% 为 了 使 原 料 充 分 混 合 均 匀, 可 采 用 原 料 搅 拌 机 混 合 搅 拌 装 袋 时, 注 意 袋 底 两 个 角 压 人 袋 内, 袋 内 放 一 圆 形 木 棒, 边 装 边 压 紧, 袋 上 端 留 15cm 以 上 的 长 度, 装 入 塑 料

69 环, 用 棉 塞 塞 入, 外 包 牛 皮 纸 或 防 水 纸 封 口 也 可 采 用 装 瓶 装 袋 机, 以 提 高 工 效 3. 灭 菌 接 种 与 培 养 由 于 塑 料 袋 装 量 多, 灭 菌 时 间 比 瓶 栽 要 长 一 些, 高 压 灭 菌 l.5-2h, 常 压 l00 灭 菌 8-l0h 接 种 培 养 与 瓶 栽 相 同, 但 需 注 意 用 玉 米 菌 种 接 种 栽 培 的, 需 防 老 鼠 咬 穿 塑 料 袋 4. 出 菇 管 理 当 菌 丝 长 满 袋 后, 将 棉 塞 或 套 环 去 掉, 拉 直 袋 口, 在 上 面 覆 盖 一 层 报 纸, 每 日 喷 水 于 报 纸 上, 可 保 持 较 高 的 湿 度 (85%-90%), 防 止 水 分 蒸 发 同 时 增 加 CO 2 的 浓 度, 抑 制 菌 盖 生 长, 待 其 菌 柄 变 长 时, 取 掉 报 纸 其 它 管 理 与 瓶 栽 相 同 IX 双 孢 蘑 菇 的 栽 培 一 目 的 : 熟 悉 双 孢 蘑 菇 的 栽 培 技 术 二 方 法 及 步 骤 A. 床 式 栽 培 ( 一 ) 培 养 料 配 制 培 养 料 的 好 坏 直 关 系 到 蘑 菇 栽 培 的 成 败 和 产 量 高 低 蘑 菇 培 养 料 目 前 有 粪 草 培 养 料 和 合 成 培 养 料 两 大 类 l. 培 养 料 的 基 本 材 料 稻 草 和 麦 秆 富 含 半 纤 维 素 纤 维 素 及 木 质 素 等 有 机 碳, 且 质 地 疏 松, 具 有 弹 性, 通 气 良 好, 是 堆 制 培 养 料 的 好 材 料 稻 草 的 茎 秆 易 吸 水, 腐 熟 快, 堆 积 两 用 后 就 会 腐 熟, 但 粘 性 较 大 ; 小 麦 的 茎 秆 硬, 外 被 腊 质, 不 易 吸 水, 腐 熟 慢, 堆 积 3~4 周 才 能 腐 熟, 但 质 地 疏 松 生 产 上 常 将 稻 麦 草 混 合 使 用 堆 制 对 应 将 麦 秆 及 稻 草 先 后 加 大, 或 将 麦 草 充 分 浸 透 后 和 干 稻 淋 一 起 堆 制 总 之, 要 减 少 稻 草 的 堆 制 时 间, 特 别 是 早 稻 草 的 堆 制 时 间 要 减 少, 以 免 过 分 腐 熟 其 它 如 粉 碎 的 玉 米 秆 玉 米 芯 及 甘 蔗 渣 等 也 能 用 来 配 制 培 养 料 畜 禽 粪 是 蘑 菇 需 要 的 营 养 物 质, 都 可 用 来 配 制 培 养 料 猪 粪 的 有 机 物 含 最 较 少, 氮 磷 钾 含 量 高, 用 作 堆 料 出 菇 快, 菇 较 小 而 密, 前 期 产 量 高, 后 期 产 量 低 牛 粪 中 有 机 物 及 氮 磷 钾 的 含 量 稍 低, 若 将 牛 粪 晒 干 弄 碎 后 堆 料, 则 发 酵 快, 堆 温 高 用 牛 粪 堆 料 种 植 的 蘑 菇 粗 壮, 出 菇 期 较 长, 但 出 菇 较 稀 马 粪 含 丰 富 的 有 机 物, 氮 磷 钾 的 含 量 也 较 高, 质 地 疏 松, 具 有 较 高 的 发 酵 能 力, 其 出 菇 产 量 和 质 量 与 牛 猪 粪 栽 培 相 似 几 种 畜 粪 可 混 合 使 用 鸡 鸭 粪 养 分 充 足, 发 热 快, 温 度 高, 但 碱 性 重, 粘 性 大, 可 与 畜 粪 混 合 堆 制 2. 培 养 料 配 方 (1) 粪 草 培 养 料 我 国 目 前 栽 培 的 蘑 菇 多 数 采 用 粪 草 培 养 料, 铺 料 厚 度 以 15cm 计, 则 每 l00m 2 的 栽 培 面 积 需 要 4500kg 培 养 料, 可 采 用 粪 草 比 例 1.5:1 或 1:1 两 种 配 方 1 干 牛 粪 58%, 干 稻 麦 草 39%, 过 磷 酸 钙 1%, 尿 素 0.5%, 硫 酸 铵 0.5%, 石 膏 1% 按 此 配 方 约 需 干 牛 粪 2600kg, 稻 麦 草 各 半 共 l800kg, 过 磷 酸 钙 45kg, 尿 素 23kg, 硫 酸 铵 23kg, 石 膏 45kg,C/N 约 为 31.6:1 2 干 牛 粪 47.5%, 干 稻 麦 草 47.5%, 菜 籽 饼 4.5%, 尿 素 0.5%; 石 膏 1% 按 此 配 方 需 干 牛 粪 约 2l00kg, 干 稻 麦 草 各 半 共 2100kg, 菜 籽 饼 200kg, 尿 素 25kg,100 石 膏 45kg,C/N 为 33:l 下 面 介 绍 几 种 国 外 的 粪 草 培 养 料 配 方 1 美 国 马 厩 肥 堆 料 配 方 : 马 厩 肥 80kg, 鸡 粪 7.5kg, 啤 酒 糟 2.5kg, 石 膏 1.25kg 2 荷 兰 马 厩 肥 堆 料 配 方 : 马 厩 肥 l000kg, 鸡 粪 l00kg, 石 膏 25kg (2) 合 成 培 养 料 合 成 培 养 料 是 不 用 粪 肥 或 少 用 粪 肥 配 制 的 培 养 料 目 前, 合 成 培 养 料 在 日 本 美 国 南 韩 英 国 及 我 国 台 湾 已 相 当 普 及, 成 为 蘑 菇 生 产 的 主 要 培 养 料 合 成 培 养 料 以 稻 草 或 麦 秆 为 主 要 材 料, 配 以 含 氮 量 高 的 尿 素 硫 酸 铵 或 饼 肥 等 在 配 制 合 成 培 养 料 时, 不 宜 只 采 用 一 种 氮 肥, 因 为 堆 肥 的 腐 熟 是 多 种 微 生 物 共 同 发 酵 的 结 果, 不 同 种 微 生 物 需 要 不 同 的 氮 源 在 配 制 培 养 料 时 还 需 添 加 一 定 量 的 磷 钾 钙 等 营 养 元 素 由 于 合 成 培 养 料 的 腐 熟 比 粪 草 培 养 料 慢, 尤 其 是 小 麦 秆 玉 米 芯 等 不 易 腐 熟, 还 需 添 加 微 量 元 素 加 速 麦 秆 等 的 腐 熟, 也 为 培 养 料 增 加 营 养 成 分 我 国 采 用 合 成 培 养 料 的 配 方 较 多, 下 面 举 例 说 明 1 上 海 农 科 院 的 配 方 : 每 l00m 2 栽 培 面 积 用 稻 草 2250kg, 尿 素 18.5kg, 过 磷 酸 钙 22.5kg,

70 石 膏 粉 45kg, 碳 酸 钙 22.5kg,C/N 为 33:1, 经 二 次 发 酵 后, 播 种 前 C/N 为 18:1,pH 值 由 8.3 左 右 降 至 7.3 左 右 2 我 国 台 湾 配 方 : 稻 草 l00kg, 尿 素 1kg, 硫 酸 铵 2kg, 过 磷 酸 钙 3kg, 碳 酸 钙 2.5kg 国 外 的 合 成 培 养 料 配 方 也 很 多, 现 举 例 如 下 1 日 本 配 方 : 稻 草 l000kg, 石 灰 氮 10kg, 尿 素 5kg, 硫 酸 铵 13kg, 硫 酸 钙 30kg, 过 磷 酸 钙 30kg 2 美 国 兰 伯 特 式 合 成 培 养 料 的 配 方 : 小 麦 秆 或 黑 麦 秆 1000kg, 血 粉 40 kg, 马 粪 l00kg, 尿 素 l0kg, 过 磷 酸 钙 40kg, 碳 酸 钙 20kg, 细 土 500kg, 水 2500kg 3 美 国 辛 登 式 配 方 : 麦 秆 l000kg, 豆 稿 l000kg, 干 啤 酒 槽 75kg, 石 膏 50kg, 硝 酸 铵 30kg, 氯 化 钾 25kg 4 南 韩 配 方 : 稻 草 1000kg, 鸡 粪 l00kg, 尿 素 kg, 石 膏 10 20kg ( 二 ) 培 养 料 堆 积 发 酵 堆 积 发 酵 将 配 方 中 的 各 种 材 料 混 合 在 一 起, 让 其 腐 熟 发 酵 的 过 程 其 目 的 为 : 使 各 种 好 热 性 微 生 物 在 堆 料 中 繁 殖, 把 培 养 材 料 中 的 纤 维 素 半 纤 维 素 木 质 素 分 解 为 蘑 菇 菌 丝 可 以 利 用 的 化 合 物 ; 所 加 人 的 氮 素 营 养 物 质 被 各 种 微 生 物 利 用 后, 变 成 微 生 物 的 蛋 白 质, 当 微 生 物 死 亡 后, 菌 体 也 就 成 了 蘑 菇 可 利 用 的 有 机 氮 ; 发 酵 过 程 中 释 放 的 热 可 以 杀 死 料 中 的 病 虫 杂 菌 ; 经 过 发 酵, 堆 料 变 得 柔 软 疏 松 通 气, 具 有 优 良 的 物 理 状 态 l. 堆 料 前 的 准 备 粪 肥 应 晒 干, 不 要 淋 雨, 若 来 不 及 晒 干, 则 可 挖 坑 倒 入, 拍 紧, 密 封 用 干 粪 堆 积 效 果 好, 牛 粪 最 好 晒 干 至 半 干 时 粉 碎 成 粉 状, 再 晒 干 透 稻 草 麦 秆 等 材 料 需 选 用 新 鲜 无 霉 烂 的, 使 用 前 须 切 割 成 cm 长 的 小 段, 以 便 其 吸 水, 也 便 于 翻 堆 2. 培 养 料 的 二 次 发 酵 蘑 菇 培 养 料 堆 积 腐 熟 发 酵 一 般 分 两 个 阶 段 进 行, 前 发 酵, 又 称 一 次 发 酵 或 室 外 发 酵 ; 后 发 酵, 或 称 第 二 次 发 酵, 因 其 通 常 在 室 内 进 行, 又 称 为 室 内 发 酵 (1) 前 发 酵 采 用 粪 草 培 养 料 的, 前 发 酵 时 间 较 长, 需 15~20 天 ; 采 用 以 稻 草 为 主 的 合 成 培 养 料 的, 前 发 酵 时 间 需 10~15 天 : 以 麦 秆 为 主 的 发 酵 时 间 较 长 麦 草 吸 水 力 差, 应 浸 泡 2~3 天, 稻 草 吸 水 快, 只 浸 泡 l 天 即 可 干 粪 在 堆 制 时 用 水 调 湿 润 使 用 的 粪 和 草 均 需 先 预 湿 堆 料 时, 先 铺 一 层 厚 20cm 的 草 料, 草 上 铺 5 6cm 厚 的 粪 肥, 其 上 再 铺 20cm 厚 的 草, 再 铺 5~6cm 厚 的 粪 这 样 一 层 草 一 层 粪 层 层 相 间 地 堆 积 起 来 第 一 层 粪 草 不 需 浇 水, 以 后 每 铺 一 层 粪 一 层 草 后, 补 浇 清 水 或 人 畜 粪 尿 下 层 少 浇, 上 层 多 浇 料 堆 不 要 过 宽, 否 则 操 作 不 便, 且 透 气 性 差, 料 温 难 以 提 高 ; 料 堆 过 窄, 则 可 能 使 料 温 过 高, 将 一 些 微 生 物 杀 死, 对 发 酵 不 利 堆 料 最 好 在 阴 棚 下, 免 受 日 晒 雨 淋 培 养 料 堆 积 后 也 应 覆 盖 草 帘, 以 利 于 保 温 保 湿 但 一 般 不 宜 用 塑 料 薄 膜 紧 贴 培 养 料 覆 盖, 否 则, 料 堆 通 气 不 良, 会 造 成 厌 氧 状 态, 使 堆 内 材 料 变 粘, 在 露 天 堆 料, 下 雨 前 需 用 薄 膜 作 为 临 时 避 雨 棚 培 养 料 堆 积 发 酵 后, 需 经 几 次 翻 堆 翻 堆 是 定 时 将 堆 积 的 粪 草 抖 松 拌 和, 把 位 于 料 上 面 的 和 周 围 的 粪 草 翻 到 下 面 或 中 间 去, 而 把 下 面 或 中 间 的 材 料 翻 到 上 面 或 外 围 来, 使 堆 积 的 培 养 料 发 酵 均 匀 一 致 有 条 件 的 地 方 也 可 采 用 翻 堆 机 翻 堆 在 不 同 部 位 的 粪 草 发 酵 很 不 均 匀, 料 堆 最 外 层 氧 气 虽 然 充 足, 但 水 分 散 失 多, 培 养 料 分 解 较 差 ; 在 料 堆 中 心 部 位, 由 于 缺 氧, 培 养 料 不 能 很 好 地 分 解 ; 在 料 堆 底 层 的 培 养 料 积 有 较 多 的 CO 2, 培 养 料 呈 酸 性, 会 发 粘 发 臭 只 有 外 层 至 中 心 部 分 发 酵 最 好 因 此, 通 常 应 进 行 3 次 以 上 的 翻 堆 翻 堆 的 作 用 是 : 改 善 料 堆 各 部 位 的 发 酵 条 件, 防 止 料 堆 中 央 部 位 特 别 是 中 央 底 层 长 期 处 于 厌 氧 状 态 ; 排 除 堆 内 废 气, 增 加 新 鲜 氧 气, 缩 短 发 酵 时 间 ; 调 节 水 分 ; 检 查 发 酵 状 况 ; 便 于 分 次 加 入 添 加 材 料 堆 料 后, 次 日 堆 温 便 开 始 上 升, 开 始 40~50, 是 一 些 嗜 温 性 微 生 物 ( 主 要 是 一 些 细 菌 ) 活 动 ;4~5 天 后 温 度 上 升 到 65~75 时, 此 时 是 一 些 嗜 热 性 微 生 物 ( 主 要 是 嗜 热 性 放 线 菌 ) 活 动 一 般 当 堆 温 上 升 到 最 高 点 并 开 始 下 降 时, 即 应 进 行 一 次 翻 堆 堆 温 由 微 生 物 分 解 物 质 时 释 放 出 来 的 热 能 维 持, 如 果 堆 温 开 始 下 降, 说 明 堆 内 物 质 的 分 解 作 用 已 减 弱, 此 时 翻 堆 能 及 时 补 充 堆 内 的 氧 气 和 水 分, 使 微 生 物 的 分 解 作 用 在 新 的 条 件 下 继 续 进 行, 加 速 培 养 料 分 解

71 和 腐 熟 高 温 能 杀 死 粪 草 料 中 的 病 菌 孢 子 和 虫 卵, 但 长 时 间 高 温, 一 些 嗜 热 性 放 线 菌 也 会 旺 盛 地 繁 殖 起 来, 就 会 耗 损 大 量 可 溶 性 养 分 每 次 翻 堆 的 时 间 随 着 材 料 的 发 酵 腐 熟 逐 渐 递 减, 通 常 进 行 第 一 次 翻 堆 时 间 是 上 堆 后 的 6~8 天, 进 行 第 二 次 翻 堆 时 间 是 第 一 次 翻 堆 后 的 5~7 天, 第 三 次 翻 堆 是 第 二 次 翻 堆 后 的 4~5 天 第 一 次 翻 堆 加 足 水 分 ; 并 加 尿 素 和 石 膏 粉 ; 第 二 次 翻 堆 只 对 料 干 部 分 适 当 加 水, 不 宜 加 水 太 多, 此 次 加 入 硫 酸 铵 及 过 磷 酸 钙 ; 第 三 次 翻 堆 调 节 水 分 及 酸 碱 度 (2) 后 发 酵 国 内 目 前 后 发 酵 方 法 有 两 种, 即 固 定 床 架 式 后 发 酵 和 就 地 式 后 发 酵, 后 者 就 是 将 前 发 酵 的 料 就 地 建 堆 后 发 酵, 但 以 前 者 为 主, 将 培 养 料 移 人 菇 房 后 再 一 次 发 酵 通 常 前 发 酵 以 化 学 反 应 为 主, 要 求 高 温 快 速 ; 后 发 酵 则 是 生 物 活 动 过 程 占 优 势, 要 求 控 温 控 湿 通 气 后 发 酵 过 程 分 两 个 步 骤 进 行, 将 经 前 发 酵 好 的 培 养 料 搬 人 菇 房 床 架 上, 关 闭 门 窗, 升 温 至 58~60, 维 持 6-8h, 即 巴 斯 德 消 毒, 以 进 一 步 杀 死 料 中 的 虫 卵 和 病 害 杂 菌 然 后 通 风 降 温, 在 12h 内 逐 步 将 料 温 降 至 48~53C, 维 持 3~5 天, 促 使 一 些 有 益 微 生 物 生 长, 将 培 养 料 转 化 为 易 被 蘑 菇 菌 丝 吸 收 和 利 用 的 物 质 ; 同 时 便 能 刺 激 竞 争 性 杂 菌 生 长 而 抑 制 蘑 菇 菌 丝 生 长 的 氨 气 挥 发 因 为 氨 气 在 50 以 上 或 40 以 下 挥 发 速 度 明 显 减 慢 控 温 发 酵 还 可 减 缓 易 被 细 菌 和 真 菌 利 用 的 碳 水 化 合 物 的 降 解, 而 不 至 于 降 低 培 养 料 的 活 性 后 发 酵 过 程 中 的 有 益 微 生 物 大 体 可 分 为 嗜 热 细 菌 ( 最 适 生 长 温 度 50~60 ) 嗜 热 放 线 菌 ( 最 适 生 长 温 度 50~55 ) 和 嗜 热 霉 菌 ( 最 适 生 长 温 度 45~53 ) 三 类 它 们 在 料 内 繁 殖 的 顺 序 为 : 细 菌 放 线 菌 真 菌 首 先 是 细 菌 大 量 繁 殖, 利 用 培 养 料 中 易 降 解 的 碳 水 化 合 物, 产 生 粘 滑 的 物 质 即 多 糖 类, 这 是 蘑 菇 生 长 所 需 要 的 重 要 碳 源 接 着 放 线 菌 繁 殖, 降 解 纤 维 素 和 半 纤 维 素, 并 利 用 氨 胺 和 酞 胺 作 为 合 成 细 胞 物 质 的 营 养, 同 时 释 放 出 蘑 菇 菌 丝 生 长 所 需 的 生 长 因 子 如 维 生 素 等 最 后 是 一 些 非 分 解 纤 维 素 的 霉 菌 协 同 放 线 菌 进 行 氨 的 转 化, 有 些 还 利 用 细 菌 作 养 料, 合 成 自 身 物 质 其 中 以 放 线 菌 最 具 活 性 通 过 后 发 酵, 培 养 料 由 棕 色 变 成 深 褐 色, 料 松 软, 不 粘 稠, 含 水 量 65%~68%, 含 氮 量 1.8%~2%,C/N 为 18~20;pH 值 7-7.5, 含 氨 量 为 0.04% 或 更 少 影 响 后 发 酵 的 主 要 因 素 是 温 度 培 养 料 含 水 量 氧 气 等 温 度 是 后 发 酵 过 程 中 的 首 要 因 子, 必 须 设 法 达 到 所 要 求 的 温 度, 以 培 养 料 的 温 度 为 标 准 由 于 后 发 酵 需 消 耗 和 散 失 较 多 的 水 分, 故 培 养 料 含 水 量 应 较 高, 为 70% 左 右, 在 前 发 酵 最 后 一 次 翻 堆 时 调 节 用 蒸 汽 加 热, 培 养 料 含 水 量 为 71%~73%, 后 发 酵 结 束 时 其 含 水 量 为 67%~71% 采 用 室 内 炭 火 直 接 加 温 法, 后 发 酵 时 培 养 料 含 水 量 应 为 70%~72%; 采 用 炭 火 及 蒸 汽 加 温 法, 则 料 含 水 量 宜 为 65%~68%; 采 用 塑 料 棚 保 温 法, 培 养 料 含 水 量 以 65% 为 宜 后 发 酵 中 料 内 的 有 益 微 生 物 一 般 好 氧, 室 内 应 有 空 气, 因 此 后 发 酵 时 期 应 适 当 开 启 门 窗 或 敞 开 薄 膜 通 风, 以 促 进 有 益 微 生 物 活 动, 抑 制 厌 氧 细 菌 繁 殖, 制 成 有 选 择 性 的 培 养 料 后 发 酵 的 关 键 措 施 是 加 温 和 控 温 将 经 过 前 发 酵 的 培 养 料 调 节 到 一 定 温 度 后, 搬 入 室 内, 然 后 通 入 蒸 汽, 进 行 加 温 和 控 温 我 国 目 前 许 多 地 区 在 生 产 上 进 行 后 发 酵 的 加 温 方 法, 大 体 可 有 : 室 内 炭 火 加 温 式 控 温 ; 室 外 薄 膜 覆 盖 升 温, 对 于 室 内 炭 火 直 热 式 的 后 发 酵, 菇 房 应 密 闭 不 漏 风, 菇 房 大 小 以 111m 2 一 间 为 宜, 在 室 内 设 置 10~20 个 无 烟 煤 炉 加 热 升 温, 菇 房 过 大 不 易 升 温 炉 火 烧 旺 后 将 门 窗 紧 闭 密 封, 使 温 度 逐 渐 上 升 达 到 60 时 维 持 6~8h, 然 后 拿 掉 部 分 炉 子 并 适 当 开 窗, 将 温 度 降 到 48~53, 保 持 4~6 天 每 天 在 高 温 时 进 行 2~ 3 次 通 风 换 气, 每 次 10~15min 通 风 换 气 避 免 了 二 氧 化 碳 以 及 其 它 有 害 气 体 过 多, 影 响 发 酵 采 用 这 种 方 法 进 行 后 发 酵, 成 本 低, 效 果 好 露 天 式 后 发 酵 是 利 用 堆 肥 在 完 成 前 发 酵 后, 再 建 后 发 酵 堆 建 堆 时, 在 料 堆 底 部 中 心 建 一 道 通 气 小 道, 料 堆 上 面 用 草 片 覆 盖, 夜 间 雨 天 再 在 料 堆 顶 部 加 盖 塑 料 薄 膜, 其 内 用 竹 片 支 撑, 使 其 与 料 面 有 15-20cm 的 距 离 在 建 堆 的 第 二 天, 料 的 中 心 温 度 达 的 60~65, 保 持 2h, 揭 开 覆 被 草 片, 并 在 料 上 按 15cm 15cm 距 离, 打 一 个 直 径 5cm 的 小 孔, 用 来 掌 握 通 气 量, 以 便 调 节 温 度, 使 温 度 维 持 在 5 左 右 蘑 菇 培 养 料 后 发 酵 的 优 点 是 : 提 高 了 蘑 菇 产 量 和 质 量, 一 般 可 增 产 20%~40%, 有 时 可 增 产 l 倍 以 上 生 产 的 子 实 体 品 质 好, 菇 形 正, 肉 厚, 柄 粗, 不 易 开 伞, 一 级 菇 比 例 大 采 用 培 养 料 后 发 酵, 由 于 高 温 放 线 菌 等 有 益 微 生 物 的 活 动, 可 形 成 多 种 可 供 蘑 菇 菌 丝 直 接 吸 收 利 用 的 维 生 素 和 氨 基 酸 ; 后 发 酵 将 培 养 料 在 60 下 处 理 2h, 可 以 把 料 中 的 虫 卵 幼 虫 等 害 虫 杀 死, 使 病 虫 来 源 大 大 减 少, 可 不 用 或 少 用 农 药 防 治, 减 轻 了 农 药 污 染 ; 用 后 发 酵 技 术 可

72 推 迟 堆 料 期 7~10 天, 这 样 缓 和 了 双 夏 劳 力 矛 盾 ; 后 发 酵 堆 料 比 一 次 发 酵 少 两 次 翻 堆, 可 减 少 用 工, 也 可 减 少 费 用, 降 低 生 产 成 本 ( 三 ) 菇 房 的 消 毒 灭 菌 将 适 度 腐 熟 的 培 养 料 尽 快 搬 入 菇 房, 先 填 入 最 上 层 床 架, 从 上 到 下, 逐 床 填 入, 填 料 的 厚 度 为 16~20cm 填 料 完 毕, 即 关 闭 门 窗, 用 甲 醛 敌 敌 畏 各 lkg 熏 蒸 消 毒 24h, 操 作 方 法 与 空 菇 房 消 毒 相 同 ( 四 ) 培 养 料 的 翻 料 当 培 养 料 经 后 发 酵 消 毒 或 用 农 药 熏 蒸 消 毒 后, 要 进 行 一 次 翻 料, 即 将 铺 在 菇 床 上 的 培 养 料 上 下 翻 动 一 次, 把 料 抖 松, 同 时 将 料 中 发 黄 绿 色 的 生 粪 块 及 杂 物 等 均 除 去, 并 打 开 门 窗, 进 行 大 通 风 一 次 通 风 及 抖 松 料 的 目 的 是 为 了 将 料 在 消 毒 发 酵 过 程 中 产 生 的 二 氧 化 碳 乙 醛 乙 烯 等 各 种 有 害 气 体 彻 底 排 除, 使 料 内 进 人 较 多 的 新 鲜 空 气, 有 利 于 接 种 后 菌 丝 在 料 中 迅 速 生 长, 同 时 翻 匀 后 可 使 料 层 厚 薄 一 致, 保 持 cm 厚, 这 样 料 面 平 整, 床 面 喷 水 时 受 水 量 也 均 匀, 避 免 床 面 凹 陷 处 积 水 ( 五 ) 播 种 1. 播 种 前 的 准 备 菇 房 熏 蒸 消 毒 或 经 室 内 发 酵 后, 打 开 门 窗 及 排 风 筒, 排 除 药 液 气 味 或 热 气, 及 时 进 行 翻 料 若 培 养 料 偏 湿 或 料 内 氨 气 过 浓 时, 在 料 面 喷 2%~3% 的 甲 醛 溶 液, 随 后 密 闭 一 夜, 次 日 打 开 门 窗 通 风 后 再 翻 料 一 次 加 以 清 除 播 种 前 需 先 测 量 料 温, 温 度 超 过 30, 可 再 翻 料 一 次 降 温, 待 培 养 料 温 度 下 降 至 28 以 下 时 才 可 播 种 播 种 前 要 对 菌 种 质 量 进 行 检 查, 选 用 优 质 菌 种 优 质 菌 种 的 标 准 是 纯 度 高, 菌 丝 浓 密 旺 盛, 生 命 力 强, 粪 草 种 的 培 养 基 里 红 棕 色, 有 浓 厚 的 蘑 菇 香 味, 不 吐 黄 水, 无 杂 菌 虫 害 2. 播 种 时 间 目 前, 我 国 蘑 菇 栽 培 主 要 是 利 用 自 然 气 温 进 行 生 产, 因 此 播 种 时 间 的 选 择 十 分 重 要 由 于 蘑 菇 菌 丝 生 长 阶 段 要 求 较 高 温 度, 子 实 体 发 生 要 求 较 低 温 度, 因 此 我 国 各 地 一 般 都 进 行 秋 播 或 深 秋 播, 长 江 流 域 各 省 多 数 在 9 月 上 中 旬 温 度 在 28 以 下 时 播 种,10 月 中 下 旬 开 始 采 收,12 月 秋 菇 采 收 结 束, 至 次 年 3 月 气 温 回 升, 又 可 出 菇, 至 5 月 春 菇 结 束 珠 江 流 域 各 省 秋 季 气 温 较 高, 冬 季 不 冷, 一 般 在 秋 末 播 种, 初 冬 开 始 采 菇, 冬 春 季 连 续 出 菇, 没 有 间 歇 如 福 建 在 10 月 下 旬 播 种,11 月 中 下 旬 开 始 采 菇,4 月 至 5 月 上 旬 采 菇 结 束 华 北 地 区 一 般 在 8 月 下 旬 播 种 3. 播 种 规 格 播 种 量 因 菌 种 培 养 料 不 同 而 有 较 大 差 异 每 瓶 (750mL 蘑 菇 菌 种 瓶 ) 粪 草 菌 种 播 m 2 ; 麦 粒 菌 种 播 m 2 为 了 使 菌 种 尽 量 全 面 萌 发, 菌 丝 在 培 养 料 表 面 应 占 有 优 势, 减 少 杂 菌 污 染 一 般 穴 播 采 取 小 株 密 植 方 式, 行 株 距 由 l0cm 见 方 改 为 8cm 梅 花 形, 深 度 5cm 目 前 新 法 播 种 采 用 混 播 加 撒 播 方 式, 即 先 以 三 分 之 二 的 菌 种 撒 在 培 养 料 表 面 后, 将 菌 种 翻 入 料 中 5cm 与 培 养 料 混 合, 再 将 剩 下 的 三 分 之 一 菌 种 撒 在 料 面 上 无 论 选 用 哪 种 方 法 播 种, 为 防 止 杂 菌 污 染, 所 用 工 具 及 操 作 人 员 的 手 都 要 严 格 消 毒, 菌 种 瓶 表 面 及 瓶 口 均 用 0.1% 高 锰 酸 钾 溶 液 消 毒, 近 瓶 口 一 层 菌 种 不 用 4. 播 种 后 的 管 理 播 种 3 天 后, 为 使 菌 种 与 湿 料 接 触, 易 于 萌 发, 一 般 情 况 下 关 闭 门 窗, 仅 有 背 风 地 窗 少 量 通 风, 潮 湿 天 气 可 打 开 门 窗 通 风 3 天 以 后, 当 菌 丝 已 经 萌 发, 并 开 始 长 出 培 养 料 时, 菇 房 通 风 应 逐 渐 加 大 如 气 温 在 28 以 上 为 防 止 高 温 影 响 室 内 温 度, 可 在 中 午 关 闭 门 窗, 只 开 北 面 地 窗, 同 时 注 意 夜 间 通 风, 雨 天 多 开 门 窗 通 风 播 种 5--7 天 后, 菌 丝 已 经 长 大 培 养 料 ; 为 了 促 进 菌 丝 向 料 内 生 长, 抑 制 杂 菌 发 生, 需 加 强 通 风, 降 低 空 气 湿 度 在 无 风 情 况 下 ; 多 开 窗, 南 北 地 窗 昼 夜 全 部 打 开 ; 有 风 时 只 开 背 风 门 窗 在 气 候 干 燥 而 培 养 料 又 偏 干 时, 可 在 料 面 覆 盖 一 层 报 纸, 保 持 料 面 湿 润 培 养 料 过 干 时, 可 在 报 纸 上 喷 水, 增 加 料 面 湿 度, 使 菌 丝 长 入 料 内 播 种 7 天 后 要 进 行 检 查, 如 发 现 杂 菌 及 病 虫 害, 应 及 时 处 理 如 发 现 培 养 料 过 湿 或 料 内 有 氨 气, 为 了 使 菌 丝 长 入 料 内, 可 在 床 架 反 面 打 洞, 加 强 通 风, 散 发 水 分 和 氨 荷 兰 菇 农 是 从 合 作 社 购 买 菌 种 和 原 料, 进 行 混 合 播 种, 这 可 由 一 种 小 型 的 铺 料 机 完 成 播 种 后 用 空 调 调 节 温 度, 保 持

73 ( 六 ) 覆 土 蘑 菇 培 养 料 经 过 发 菌, 床 而 有 时 高 低 不 平, 覆 土 前 要 把 料 面 抹 匀 拍 平 覆 土 对 蘑 菇 的 发 育 有 重 要 的 作 用 首 先, 覆 土 能 改 变 培 养 料 中 二 氧 化 碳 的 浓 度, 便 蘑 菇 的 菌 丝 从 营 养 生 长 期 转 入 到 生 殖 生 长 期, 形 成 子 实 体, 并 保 持 培 养 料 的 水 分, 有 利 于 子 实 体 的 发 育 ; 其 次, 覆 土 层 中 含 有 许 多 有 益 的 微 生 物 如 臭 味 假 单 孢 杆 菌 等, 它 们 的 代 谢 产 物 含 有 多 种 激 素, 能 促 进 蘑 菇 子 实 体 的 形 成 ; 第 三, 覆 土 层 对 子 实 体 有 支 撑 作 用, 能 防 止 培 养 料 温 湿 度 的 急 剧 变 化, 保 护 料 层 中 菌 丝 的 生 长 发 育, 并 有 机 械 刺 激 作 用, 能 促 进 结 菇 及 时 覆 土 是 夺 取 蘑 菇 高 产 的 重 要 措 施 由 于 菇 房 的 覆 土 量 大, 且 对 覆 土 的 质 量 要 求 较 高, 如 在 覆 土 期 遇 到 长 期 下 雨 等 不 良 天 气, 往 往 延 误 覆 土, 影 响 产 量 因 此, 蘑 菇 菌 床 所 需 要 的 覆 土 必 须 在 覆 土 前 及 早 准 备, 并 晒 干 贮 藏 备 用 l. 覆 土 的 选 择 覆 土 的 性 质 往 往 影 响 到 出 菇 的 迟 早 与 产 量 的 高 低 澳 大 利 亚 的 蘑 菇 农 场 目 前 多 采 用 泥 炭 土 作 覆 土 材 料 泥 炭 苔 藓 是 最 理 想 的 覆 土 材 料, 与 土 壤 河 泥 等 材 料 相 比, 泥 炭 苔 藓 的 吸 水 量 要 高 得 多 目 前, 我 国 蘑 菇 栽 培 上 所 用 的 覆 土, 根 据 土 粒 的 大 小, 分 为 粗 土 与 细 土 粗 土 直 径 2cm 左 右, 其 质 地 以 壤 土 为 好, 要 选 毛 细 孔 多 有 机 质 含 量 高 团 粒 结 构 好 持 水 量 大 且 含 有 一 定 的 营 养 成 分 的 土 壤 作 覆 土 材 料, 以 利 于 蘑 菇 菌 丝 穿 透 泥 层 生 长 菇 房 每 平 方 米 床 面 约 需 粗 土 35kg 细 土 直 径 约 为 0.5cm, 如 黄 豆 大 小, 每 平 方 米 床 面 需 细 土 20kg 左 右, 其 质 地 以 稍 带 粘 性 的 壤 土 为 宜, 因 床 面 的 泥 层 上 经 常 喷 水, 稍 带 粘 性 的 土 粒 喷 水 后 不 会 松 散, 也 不 会 造 成 床 面 板 结 的 现 象, 如 细 土 选 用 砂 性 土, 床 面 喷 水 后 泥 粒 变 得 松 散, 造 成 床 面 泥 层 板 结, 直 接 影 响 到 土 层 的 通 气 性, 不 利 于 菌 丝 的 生 长, 也 不 利 于 子 实 体 的 形 成 2, 覆 土 的 时 期 与 方 法 适 宜 的 覆 土 时 期 是 根 据 料 层 菌 丝 的 深 度 来 决 定 的, 当 菌 丝 大 部 分 都 已 伸 展 到 床 底 时, 便 是 覆 土 的 适 期 先 覆 粗 土, 隔 7-10 天 再 覆 细 土 根 据 一 般 高 产 菇 房 的 经 验, 覆 粗 土 7 天 左 右 便 应 及 时 覆 细 土 覆 细 土 后 10 天 左 右, 便 能 见 到 菌 蕾, 所 以 覆 粗 土 后 约 经 20 天 便 可 出 菇 覆 土 的 厚 度, 如 采 用 粗 土 加 细 土 的 方 法, 则 粗 土 覆 2.5~3cm 厚, 细 土 覆 lcm 厚 ; 如 采 用 全 部 覆 细 土 的 方 法, 则 覆 土 厚 度 在 3.3cm 左 右 覆 土 的 具 体 方 法 是 : 先 覆 粗 土 一 层, 铺 满 料 面, 以 不 见 料 为 标 准, 并 用 中 土 ( 介 乎 粗 土 与 细 土 之 间 的 土 粒 ) 填 满 粗 土 的 缝 隙, 以 防 止 调 水 时 水 分 渗 入 培 养 料 内, 造 成 料 内 菌 丝 萎 缩, 最 后 铺 上 一 层 薄 细 土 3. 覆 土 的 杀 虫 灭 菌 处 理 为 了 防 止 覆 土 中 带 入 病 虫, 可 采 用 下 列 处 理 方 法 1 用 10% 甲 醛 溶 液 及 1% 的 敌 敌 畏 溶 液 洒 在 土 粒 上,1000kg 土 用 以 上 两 种 农 药 各 2--4kg, 喷 洒 后 拌 匀, 用 塑 料 薄 膜 严 密 覆 盖 两 天, 利 用 农 药 挥 发 出 的 气 体 杀 死 病 菌 与 虫 卵 2 用 泥 土 质 量 1%--2% 的 石 灰 拌 人 泥 中, 杀 死 线 虫 等 害 虫 4. 覆 土 层 的 调 水 用 干 的 粗 土, 覆 土 3 天 内 调 足 粗 土 水 分, 但 在 杭 州 地 区 多 采 用 先 将 粗 土 预 湿, 然 后 在 2-3 天 内 调 粗 土 水 分 方 法 是 将 干 粗 土 盛 入 竹 制 的 土 箕 内, 将 竹 土 箕 连 同 粗 土 浸 没 水 中, 并 立 即 取 出, 等 待 5~10min, 让 水 分 吸 入 土 粒 中, 再 将 土 粒 撒 在 床 上, 此 时 土 粒 不 会 粘 结 成 团 因 此, 一 般 覆 粗 土 1~2 天 内 开 始 调 水, 连 续 调 水 3 天 在 用 水 量 上 掌 握 两 头 轻 中 间 重 的 原 则, 即 第 一 天 调 水 2.5~3.5kg/m 2, 第 二 天 调 水 4.5kg/m 2, 第 三 天 调 水 2.5~3kg/m 2,3 天 内 共 调 水 l0 11kg/m 2 如 土 料 干 的 调 水 量 还 可 增 加 到 13.5k/m 2 喷 水 的 方 法 采 用 轻 喷 勤 喷 循 环 喷 水 的 方 法, 不 可 一 次 喷 水 过 多, 防 止 水 分 流 大 料 中, 妨 碍 菌 丝 生 长 调 水 的 具 体 标 准 是 粗 土 已 无 白 心, 质 地 疏 松, 手 能 捏 扁 土 粒, 手 捏 粘 手, 此 时 粗 土 的 含 水 量 在 20% 左 右 ( 七 ) 出 菇 管 理 蘑 菇 从 播 种 到 开 始 采 收, 一 般 需 要 35~40 天 长 江 流 域 各 省 于 9 月 上 旬 播 种 后, 从 10 月 中 下 旬 开 始 采 收 到 12 月 下 旬 秋 菇 期 间 一 般 可 收 5 批 ( 潮 ), 第 一 二 三 批 出 菇 集 中, 两 批 菇 间 隔 期 为 7 天 左 右, 第 四 五 批 及 春 菇 出 菇 不 集 中, 产 量 减 少 秋 菇 产 量 占 总 产 量 的

74 70% 左 右 出 菇 期 间 的 管 理 工 作 主 要 有 水 分 管 理 通 风 换 干 挑 根 补 上 及 追 肥 等 l. 水 分 管 理 (1) 床 面 喷 水 覆 细 土 后 10 天 左 右, 扒 开 上 层 细 土, 看 到 许 多 绿 豆 大 小 白 色 小 菌 蕾 时, 就 要 及 时 喷 一 次 重 水, 称 为 结 菇 水, 每 天 喷 水 1 次, 每 次 喷 用 1kg/m 2, 连 续 2~3 天, 总 的 用 水 量 2.5~3.2kg 喷 水 增 加 细 土 湿 度, 同 时 也 使 粗 土 上 半 部 得 到 水 分, 促 使 菌 蕾 迅 速 形 成 和 长 大, 并 使 粗 土 层 的 菌 丝 粗 壮 有 力 当 菌 蕾 普 遍 形 成 并 已 长 到 黄 豆 大 小 时, 需 及 时 喷 第 二 次 重 水, 称 为 出 菇 水, 方 法 与 第 一 次 重 水 相 同, 用 量 较 第 一 次 稍 重, 总 的 用 水 量 2.7~3.6kg/m 2 再 次 加 大 细 土 的 湿 度 并 使 粗 土 得 到 水 分, 促 使 子 实 体 迅 速 长 大 出 上, 这 样 出 菇 多 均 匀, 转 潮 ( 批 ) 快, 除 了 喷 重 水 期 间 外, 其 余 时 间 喷 水 每 天 1 次, 气 候 干 燥 时 可 喷 两 次, 每 次 0.25~0.36kg/m 2 前 三 批 菇 出 菇 间 隔 期 间, 一 般 称 为 落 潮, 此 时 应 减 少 喷 水, 每 天 喷 水 l 次, 每 次 喷 0.2kg/m 2 前 三 批 菇 生 育 期 间 气 温 较 高, 喷 水 时 间 最 好 在 早 晚 进 行 秋 菇 后 期 即 第 三 批 采 收 后, 蘑 菇 不 再 明 显 地 成 批 生 长, 春 菇 出 菇 也 不 集 中, 喷 水 要 轻 喷 勤 喷, 减 少 喷 水 量, 每 天 喷 水 0.15~0.45kg/m 2 喷 水 力 求 均 匀, 雾 点 要 小, 喷 头 要 提 高 一 些, 并 稍 有 倾 斜, 以 减 少 对 小 菇 的 冲 击 喷 水 后 尽 量 多 开 门 窗, 不 喷 关 门 水, 避 免 菇 房 闷 热, 使 菌 丝 老 化 或 者 孽 生 杂 菌 采 菇 前 喷 水, 防 止 手 捏 处 菌 丝 发 红, 影 响 质 量 生 产 上 欲 采 收 春 菇, 在 冬 季 停 产 期 间, 仍 需 加 以 管 理, 保 护 菌 丝 生 长 由 于 冬 季 气 温 低, 蒸 发 量 小, 可 适 当 减 少 喷 水, 一 般 5-7 天 喷 水 l 次, 每 次 喷 水 0.5kg/m 2 要 防 止 土 面 过 于 过 湿, 以 免 菌 丝 萎 缩 春 季 3 月 上 中 旬 气 温 回 升 后, 适 当 增 加 喷 水, 一 般 每 天 或 隔 天 喷 l 次, 每 次 0.15~ 0.36kg/m 2, 以 促 进 菌 丝 萌 发 生 长 3 月 下 旬 至 4 月 出 菇 期 间 增 加 喷 水 量, 每 天 喷 水 1~2 次, 每 次 喷 水 0.36~0.5 kg/m 2,4~5 月 份 温 度 较 高, 气 候 干 爆, 适 当 增 加 喷 水 次 数, 霉 天 2~3 次 (2) 空 气 湿 度 的 调 节 秋 菇 前 期 温 度 较 高, 出 菇 多, 空 气 相 对 湿 度 应 达 到 90~95% 如 气 候 干 燥, 除 床 面 适 当 多 喷 水 外, 需 要 在 走 道 空 间 墙 壁 和 地 面 喷 水, 以 增 加 空 气 相 对 湿 度 菇 房 内 空 气 相 对 湿 度 过 低, 子 实 体 生 长 缓 慢 并 容 易 产 生 鳞 片 和 空 根 白 心 现 象 但 也 不 宜 超 过 95%; 否 则 影 响 菌 丝 生 长, 并 容 易 产 生 杂 菌 锈 斑 等 病 害 采 菇 高 峰 过 后, 气 温 渐 低, 空 气 相 对 湿 度 可 低 一 些, 达 85%~90%, 空 中 地 面 不 再 喷 水 春 菇 后 期 温 度 较 高, 蒸 发 量 大, 应 增 加 菇 房 内 相 对 湿 度 如 气 候 干 燥, 仍 需 在 走 道 空 间 墙 壁 和 地 面 喷 水, 并 加 强 通 风, 降 低 室 内 温 度 也 可 采 用 喷 水 机 来 完 成 喷 水 2. 通 风 换 气 秋 菇 前 期 菌 丝 生 长 旺 盛, 出 菇 多, 放 出 大 量 的 二 氧 化 碳, 需 要 加 强 通 风, 保 持 菇 房 内 空 气 新 鲜 ; 但 此 时 期 气 温 较 高, 又 需 保 持 较 高 的 空 气 湿 度 因 此 ; 菇 房 主 要 在 早 晚 或 夜 间 通 风 春 季 气 温 尚 低 时, 通 风 在 中 午 气 温 较 高 时 进 行, 以 利 提 高 菇 房 温 度 4~5 月 份 气 温 上 升, 宜 早 晚 和 夜 间 通 风, 以 免 热 空 气 进 人 室 内, 增 加 菇 房 温 度 3. 清 除 老 根 死 菇, 及 时 补 土 每 次 采 收 以 后, 菌 床 上 遗 留 下 的 老 根 死 菇, 要 及 时 清 除 干 净, 因 老 根 已 失 去 吸 收 养 分 和 出 菇 的 能 力, 且 占 据 位 置, 使 下 面 的 菌 丝 生 长 受 到 影 响, 有 碍 出 菇 如 果 时 间 长 腐 烂 后, 容 易 引 起 病 虫 危 害 同 时 要 把 采 菇 时 带 走 的 泥 土 用 较 湿 润 的 细 土 重 新 补 平, 保 持 原 来 的 厚 度 4. 追 肥 在 出 菇 旺 盛 期 需 肥 最 大, 一 时 供 应 不 上 时 容 易 出 现 柄 细 长 薄 皮 开 伞 菇 ; 发 育 后 期 营 养 不 足 时 产 菇 减 少, 小 菇 薄 皮 菇 多, 显 著 地 影 响 蘑 菇 的 产 量 和 质 量 适 当 地 分 次 追 肥 是 提 高 产 量 和 质 量 的 一 项 措 施 常 用 的 种 类 和 浓 度 如 下 : (1) 葡 萄 糖 常 用 的 葡 萄 糖 液 浓 度 为 10-20g/L, 必 要 时 可 用 30g/L, 也 可 用 200g./L 蔗 糖 液 (2) 胡 萝 卜 汁 先 将 胡 萝 卜 切 成 小 薄 片, 加 水 2 倍, 煮 烂 后 过 滤, 取 出 原 液, 再 稀 释 3 倍 使 用

75 (3) 黄 豆 浆 用 黄 豆 1kg 浸 水 后 磨 成 浆 汁, 过 滤 后 加 清 水 50kg 使 用 (4) 化 学 肥 料 尿 素 用 2-4g/L, 硫 酸 铵 用 5g/L, 磷 酸 二 氢 钾 用 2-3g/L, 过 磷 酸 钙 用 5g/L( 取 澄 清 液 ) 的 液 肥 (5) 蘑 菇 健 壮 素 l 号 比 久 0.5g, 硫 酸 镁 40g, 硼 酸 10g, 硫 酸 锌 20g, 尿 素 l00g, 维 生 素 B 1 40mg, 加 水 l00kg 可 供 300m 2 面 积 上 喷 2~3 次, 对 菌 丝 复 壮 有 效 (6) 蘑 菇 健 壮 素 II 号 比 久 1g, 硫 酸 镁 50g, 磷 酸 二 氢 钾 100g, 维 生 素 B l 100mg, 加 水 l00kg 对 促 进 子 实 体 形 成 和 肥 大 有 效, 用 量 与 I 号 相 同 蘑 菇 追 肥 对 增 加 产 量 和 提 高 质 量 有 一 定 的 效 果, 但 只 能 作 为 一 项 辅 助 措 施 蘑 菇 只 有 在 配 制 质 量 好 的 培 养 料 的 基 础 上, 适 当 追 肥, 才 能 获 得 更 好 的 收 成 ( 八 ) 采 收 当 蘑 菇 长 到 符 合 标 准 大 小 时, 应 及 时 采 收 如 果 采 收 过 晚, 影 响 质 量, 同 时 会 影 响 下 面 小 菇 的 生 长 蘑 菇 旺 盛 期, 应 该 采 取 菇 多 采 小 温 高 采 小 质 差 采 小 的 方 法, 才 能 保 证 蘑 菇 质 量 作 鲜 销 的 蘑 菇, 可 以 采 得 稍 大 些, 但 也 不 能 开 伞, 否 则 降 低 其 商 品 价 值 旺 产 期 一 般 每 天 采 收 两 次, 以 保 证 质 量 采 菇 前 不 能 喷 水, 否 则 采 时 手 捏 菇 盖 造 成 发 红 采 收 方 法 不 当 也 会 影 响 蘑 菇 的 产 量 和 质 量 菇 密 时, 采 菇 要 用 拇 指 食 指 中 指 捏 住 菇 盖, 轻 轻 旋 转 采 下, 以 免 带 动 周 围 的 小 菇 多 个 菇 丛 生 在 一 起 的 球 菇, 采 收 时 要 用 刀 小 心 地 切 下 大 菇 留 小 菇, 不 能 整 个 搬 动, 否 则 其 它 小 菇 都 会 死 掉 秋 菇 采 收 第 二 批 后, 床 面 菇 稀 时, 采 菇 可 以 直 接 将 菇 拔 起, 这 样 能 同 时 带 出 一 部 分 老 根 采 菇 时 经 常 用 湿 手 巾 将 手 指 上 的 泥 土 擦 掉, 来 下 的 蘑 菇 应 整 齐 地 放 人 篮 中, 以 免 损 伤 蘑 菇 采 收 后, 随 即 用 小 刀 把 菇 柄 下 端 带 有 泥 土 的 部 分 削 去, 加 工 蘑 菇 菇 柄 长 短, 按 收 购 标 准 要 求 切 削 在 削 菇 时, 动 作 要 轻, 避 免 机 械 损 伤, 刀 要 锋 利, 这 样 菇 柄 平 整, 质 量 好 削 菇 后 进 行 分 级, 将 不 同 等 级 的 蘑 菇 分 别 放 置 于 垫 有 纱 布 棉 垫 或 薄 膜 的 筛 或 篮 中, 上 面 盖 上 纱 布, 及 时 送 到 收 购 站 交 售 B. 箱 式 栽 培 箱 栽 培 适 合 于 机 械 化 的 三 区 制 周 年 栽 培 培 养 料 的 配 方 堆 制 发 酵 工 艺 均 与 床 架 式 栽 培 法 相 同 栽 培 箱 的 规 格 要 根 据 机 械 化 的 程 度 菇 房 大 小 及 便 于 操 作 进 行 设 计, 常 用 的 有 40cm 60cm 20cm 和 50cm 80cm 20cm 两 种 规 格 栽 培 箱 可 用 木 铝 合 金 或 硬 质 塑 料 等 制 作, 为 便 于 贮 藏 运 输 和 消 毒 灭 菌, 一 般 都 制 成 统 一 规 格 的 活 动 箱 把 发 酵 并 经 处 理 的 培 养 料 装 入 栽 培 箱, 料 厚 15cm, 播 上 蘑 菇 菌 种, 移 人 发 菌 培 养 室 培 养 天 后, 覆 上 消 毒 处 理 过 的 土 粒, 调 水 后 再 培 养 15~17 天, 此 时 蘑 菇 菌 丝 已 基 本 发 满 培 养 料, 移 进 出 菇 室 出 菇 室 温 度 控 制 在 (14±2), 空 气 相 对 湿 度 90%~95% 5~8 天 后 蘑 菇 菌 丝 开 始 扭 结 出 菇, 采 收 约 60 天 结 束 采 收 结 束 后 将 箱 子 移 到 室 外, 倒 掉 废 料, 消 毒 菇 室, 再 从 发 菌 室 移 进 一 批 已 经 培 养 好 菌 丝 的 栽 培 箱, 降 温 使 其 出 菇, 周 而 复 始 地 连 续 生 产 这 种 箱 式 栽 培 的 三 区 制 菇 房, 一 间 发 菌 室 配 两 间 出 菇 室, 还 需 要 装 空 调 等 制 冷 设 备, 一 般 每 年 可 种 5 期 蘑 菇 C. 畦 式 栽 培 畦 式 栽 培 一 般 多 利 用 冬 闲 田 进 行 在 干 稻 田 中, 整 地 作 畦, 畦 宽 1.5m, 高 cm, 长 则 根 据 地 形 而 定, 在 畦 面 上 撒 一 层 生 石 灰 粉 进 行 消 毒 把 堆 制 发 酵 成 熟 的 培 养 料 铺 放 于 畦 上, 料 厚 约 l0cm, 整 平 后 稍 压 实 即 可 播 蘑 菇 菌 种 播 种 后 用 竹 木 材 料 做 成 框 架, 罩 在 菇 畦 上, 覆 盖 黑 色 或 深 蓝 色 塑 料 薄 膜 为 了 保 湿 和 遮 光, 薄 膜 上 再 覆 盖 一 层 用 稻 草 茅 草 蔗 叶 编 织 成 的 草 帘 在 栽 培 管 理 过 程 中, 要 定 期 掀 开 部 分 薄 膜 进 行 通 风 换 气, 并 根 据 天 气 情 况 而 定, 可 选 在 中 午 或 下 午, 清 晨 或 夜 间 换 气 时 间 的 长 短 应 根 据 菌 丝 的 生 长 量 或 畦 上 蘑 菇 子 实 体 的 多 少, 以 及 当 天 的 天 气 情 况 灵 活 掌 握 X 草 菇 的 栽 培 一 目 的 : 掌 握 草 菇 的 栽 培 技 术 二 方 法 和 步 骤

76 ( 一 ) 栽 培 季 节 当 气 温 在 25 以 上 空 气 相 对 湿 度 在 80% 以 上 时, 即 可 栽 培 草 菇 如 北 京 河 北 可 从 6 月 下 旬 至 8 月 上 旬, 广 西 福 建 4~9 月 气 温 高, 适 合 草 菇 的 生 长 发 育 广 东 栽 培 草 菇 的 季 节 比 其 它 省 长, 如 在 珠 江 三 角 洲, 从 3 月 下 旬 开 始 栽 培, 一 直 到 11 月 上 旬 止, 其 平 均 气 温 在 23 以 上, 因 此 一 般 从 4~10 月 均 可 在 自 然 条 件 下 连 续 生 产, 但 有 春 菇 夏 菇 秋 菇 之 分 近 年 来, 由 于 栽 培 技 术 的 进 步, 可 人 工 调 节 温 度, 即 使 在 冬 季 低 温 季 节 也 能 生 产, 草 菇 已 实 现 周 年 栽 培 ( 二 ) 培 养 料 配 制 适 合 草 菇 生 长 的 培 养 料 很 多, 各 地 可 因 地 制 宜, 就 地 取 材 l. 培 养 料 配 方 (1) 废 棉 培 养 料 废 棉 96%, 石 灰 4% (2) 甘 蔗 渣 培 养 料 甘 蔗 渣 86%, 麦 敖 9%, 石 灰 3%, 石 膏 2% (3) 稻 草 培 养 料 稻 草 81%, 肥 泥 16%, 石 灰 3% (4) 稻 草 与 棉 籽 屑 培 养 料 稻 草 48%, 棉 籽 屑 48%, 石 灰 4% (5) 棉 籽 屑 培 养 料 棉 籽 屑 71%, 干 牛 粪 9%, 稻 草 粉 11%, 麦 秩 7%, 磷 肥 1%, 石 灰 1% (6) 棉 纺 屑 培 养 料 棉 纺 屑 75%, 火 土 灰 15%, 麦 麸 8%, 石 灰 1%, 石 膏 1% 2. 培 养 料 处 理 有 两 种 培 养 料 处 理 法 : 1 塑 料 薄 膜 堆 制, 培 养 草 菇 的 棉 籽 屑 稻 草 或 废 棉 等 需 先 用 水 浸 透, 浸 制 时 间 一 般 为 6~ l2h, 然 后 捞 出 沥 干, 将 辅 料 拌 和 均 匀, 使 含 水 量 为 60%~65% 然 后 建 堆, 堆 宽 1.2m, 高 60~70cm, 长 依 用 料 数 量 而 定, 在 料 推 上 覆 盖 薄 膜 保 温 经 2~3 天, 待 堆 温 升 高 到 60 时 翻 堆, 翻 堆 后 2~3 天, 堆 温 再 升 高 到 60 时, 维 持 l 天, 第 二 天 可 拆 堆, 准 备 运 入 菇 房 2 前 后 发 酵 堆 制, 前 发 酵 : 将 稻 草 切 成 5~l0cm 的 小 段, 浸 水 后 加 大 辅 料 拌 匀, 含 水 量 60%~70%, 堆 成 宽 lm 高 lm 长 度 不 限 的 发 酵 堆 发 酵 2~3 天 后, 翻 堆 检 查 干 湿 度, 再 堆 1~2 天, 调 好 水 分 和 ph 值, 然 后 进 人 栽 培 室, 进 行 室 内 后 发 酵 后 发 酵 : 完 成 前 发 酵 后 趁 料 温 在 40~50 时 将 料 搬 人 菇 房, 关 闭 菇 房 门 窗, 当 菇 床 上 的 培 养 料 因 发 酵 而 温 度 逐 渐 上 升 时, 通 入 蒸 汽 或 加 热, 将 料 温 升 到 60 保 持 2h, 然 后 微 微 通 风, 逐 步 降 温 到 50 左 右 保 持 1~2 天 待 床 内 料 温 降 至 30~35 时, 立 即 轻 压 实 拍 平 播 种 ( 三 ) 栽 培 场 所 l. 室 内 栽 培 室 内 栽 培 需 要 有 菇 房, 要 求 菇 房 能 保 温 保 湿, 通 气 透 光 草 菇 房 内 的 床 架 与 蘑 菇 栽 培 的 床 架 相 同, 通 常 为 4~5 层, 床 架 宽 1.2m, 床 架 间 走 道 宽 60cm 有 条 件 的 情 况 下, 可 在 菇 房 内 安 装 温 湿 度 自 动 调 节 器 以 及 通 风 系 统 草 菇 的 室 内 栽 培 能 人 工 控 制 其 生 长 发 育 所 需 的 温 度 湿 度 通 气 光 照 及 营 养 等 条 件, 避 免 低 温 干 旱 大 风 暴 雨 等 自 然 条 件 的 影 响, 全 年 均 可 栽 培, 一 年 四 季 均 有 鲜 菇 供 应 市 场, 可 向 工 业 化 专 业 化 自 动 化 生 产 的 方 向 发 展 2. 室 外 栽 培 华 南 地 区 由 于 温 差 较 小 气 温 较 高, 可 在 室 外 稻 田 中 栽 培 ; 河 北 地 区 可 采 用 冷 床 ( 阳 畦 ) 上 盖 薄 膜 栽 培 夏 初 气 温 低 时, 畦 地 应 选 择 向 阳 的 地 方 ; 夏 季 气 温 较 高 时, 应 选 择 较 阴 凉 的 地 方 但 是 室 外 栽 培 草 菇 除 了 华 南 地 区 外, 只 能 在 高 温 的 夏 秋 季 节 进 行 由 于 是 在 室 外 栽 培, 受 气 候 影 响 较 大, 产 量 不 稳 定 况 且 室 外 栽 培 用 草 量 多, 生 产 成 本 高, 有 的 占 用 耕 地, 其 生 产 技 术 也 复 杂, 不 容 易 掌 握 ( 四 ) 栽 培 方 式 (1) 床 式 栽 培

77 l. 波 浪 式 将 经 过 发 酵 的 培 养 料 移 到 菇 床 上, 按 照 菇 床 排 列 的 纵 向 方 向, 做 成 波 浪 式 短 小 的 小 埂 菌 床 小 埂 高 15cm, 两 小 埂 之 间 为 5--7cm 该 方 式 可 增 加 出 菇 面 积, 通 风 较 好, 菌 丝 生 长 快, 出 菇 早, 菇 体 整 齐 但 是 如 果 管 理 不 好, 喷 水 不 当, 小 埂 中 部 常 被 水 渍, 会 影 响 菌 丝 生 长 和 出 菇 2. 平 铺 式 把 发 酵 好 的 培 养 料 搬 人 菇 床, 均 匀 铺 在 床 架 上, 除 中 间 略 呈 龟 背 式 外, 其 余 部 分 平 整 培 养 料 的 厚 度 依 气 温 高 低 而 有 所 区 别, 如 气 温 30 时, 棉 籽 屑 培 养 料 厚 l0cm, 稻 草 培 养 料 厚 l7cm; 气 温 升 高 达 33C 时, 棉 籽 屑 厚 7cm, 稻 草 厚 l3cm; 气 温 降 至 25 时, 棉 籽 屑 厚 l3cm, 稻 草 厚 20cm 培 养 料 在 菌 床 上 整 理 好 后 即 可 播 种, 播 种 方 法 可 用 穴 播 或 撒 播, 接 种 量 为 4%--6% 草 菇 菌 种 满 瓶 后 15 天 以 内 的 菌 种, 其 生 命 力 强, 易 萌 发 吃 料, 产 量 较 高 (2) 堆 式 栽 培 一 般 指 在 大 田 以 稻 草 为 培 养 料 的 栽 培 方 式 l. 选 地 作 畦 在 旱 地 水 田 均 可 栽 培, 其 土 质 应 为 疏 松 的 砂 壤 土, 可 保 湿 保 肥, 又 通 气, 有 利 于 草 菇 生 长 如 土 质 粘 性 太 重 或 沙 石 太 多, 应 添 加 一 层 砂 壤 土 畦 应 于 种 菇 前 5~7 天 做 成, 先 用 杀 虫 药 消 灭 蚯 蚓 及 其 它 害 虫 水 田 应 犁 翻 浸 水 4 天, 然 后 犁 耙, 再 浸 水 4 天, 之 后 排 水 晒 干 旱 或 水 田 晒 干 后, 即 可 做 成 畦 一 般 畦 宽 l00~120cm, 南 北 向, 东 西 延 长, 畦 高 20~33cm, 畦 面 呈 龟 背 形, 每 畦 相 距 50~60cm 2. 备 料 稻 草 要 求 无 霉 烂, 金 黄 色 若 用 已 潮 湿 发 霉 的 稻 草, 则 堆 温 低, 发 热 期 短, 而 且 容 易 感 染 病 虫 杂 菌, 产 量 也 低 新 鲜 稻 草 含 水 多, 发 热 较 低, 须 经 充 分 曝 晒 干 燥 后, 才 能 使 用 早 中 晚 稻 草 均 可 采 用, 其 中 以 中 稻 草 较 好 种 植 l 公 顷 地 草 菇 需 500~667kg 稻 草 低 温 季 节, 用 草 量 及 用 种 量 可 适 当 增 加 3. 浸 草 将 稻 草 扎 成 把, 每 把 0.5~1kg 2.5~5kg 捆 成 一 捆, 于 堆 草 前 一 天 放 入 水 中 浸 10~14h, 使 稻 草 充 分 浸 湿, 早 稻 草 浸 水 时 间 可 短 些 也 有 人 采 取 将 稻 草 放 入 水 中, 边 浸 边 踩, 可 使 稻 草 充 分 吸 水, 缩 短 浸 水 时 间, 待 稻 草 变 软 时 即 可 使 用 浸 草 完 毕 即 捞 起 运 到 栽 培 场 备 用 4. 踩 草 堆 (1) 轧 草 式 将 湿 草 从 中 间 用 轧 刀 切 成 两 段, 齐 头 放 在 畦 的 两 边, 草 头 草 尾 在 畦 中 间, 两 边 对 放, 一 把 紧 靠 一 把, 用 脚 踩 紧 堆 中 间 空 低 处 填 入 稻 草, 即 填 心 草 一 般 堆 4 层, 每 层 周 围 均 比 第 一 层 缩 进 3cm 左 右, 菌 堆 呈 梯 形 播 种 后, 菌 堆 顶 上 层 盖 一 层 薄 稻 草 并 踩 紧 (2) 折 尾 式 长 稻 草 用 此 法 将 干 稻 草 齐 好, 重 0.5kg 蛙 左 右, 在 近 草 头 1/3 处 折 转 扎 把 踩 堆 时, 把 已 浸 湿 的 稻 草 把 一 把 紧 靠 一 把, 横 放 在 畦 上 踩 第 二 层 时, 草 头 的 方 向 压 在 第 一 层 草 尾 之 上, 如 此 一 层 层 堆 好 (3) 扭 把 式 将 稻 草 扭 成 8 字 形, 依 序 紧 密 地 横 放 在 畦 上, 草 头 和 草 尾 朝 内 两 边 同 时 进 行, 叠 草 的 宽 度 比 畦 窄 7--10cm 叠 完 第 一 层 后, 普 遍 踩 一 次, 边 踩 边 淋 水, 这 样 菌 堆 易 于 发 热 叠 第 二 层 草 时 向 内 收 缩 7--10cm, 叠 法 与 第 一 层 相 同 层 层 相 叠, 直 到 第 四 层 菌 堆 做 完 后, 还 要 踩 一 次, 也 要 淋 水, 直 至 菌 堆 四 边 有 黄 水 流 出 为 止 菌 堆 踩 好 后, 用 薄 膜 覆 盖, 以 保 温 保 湿, 有 利 于 草 菇 菌 丝 的 生 长 发 育 室 内 栽 培 的, 因 为 温 湿 度 较 稳 定,3-4 天 后 可 不 再 覆 盖 露 地 栽 培 还 须 在 雨 季 来 临 前 用 薄 膜 覆 盖 防 雨 通 常 踩 菌 堆 与 播 种 是 交 错 进 行 的, 菌 堆 第 一 层 踩 完 后, 在 四 周 7-l0cm 范 围 内 播 一 层 草 菇 纯 种, 然 后 踩 第 二 层, 草 把 刚 好 压 住 菌 种 第 二 三 层 播 种 方 法 同 第 一 层, 在 第 四 层 草 上 全 面 播 种 5. 复 踩 与 盖 土 复 踩 是 菌 堆 原 来 踩 得 不 紧 或 水 分 不 足 的 辅 助 措 施 菌 堆 顶 部 盖 土, 能 保 温 保 湿, 为 出

78 菇 创 造 条 件 一 般 这 两 项 措 施 在 踩 堆 后 第 三 天 进 行 如 果 堆 内 稻 草 过 干, 则 应 在 复 踩 时 淋 水 以 补 足 水 分, 用 水 量 以 菌 堆 流 出 黄 水 为 度 需 淋 水 的 草 堆 只 适 宜 在 建 堆 后 第 三 天 进 行, 过 迟 淋 水 引 起 堆 温 骤 然 降 低, 易 损 伤 菌 丝, 影 响 产 量 如 果 草 堆 中 稻 草 含 水 量 己 足, 仅 在 菌 堆 顶 部 反 复 踩 紧 一 次, 然 后 用 火 烧 土 或 较 肥 沃 的 菜 园 土 薄 盖 一 层 ( 五 ) 栽 培 管 理 (1) 控 制 菌 堆 温 度 菌 堆 内 温 度 经 历 由 低 到 高, 再 由 高 到 低 的 变 化 过 程 踩 菌 堆 后, 堆 内 温 度 逐 渐 升 高,4~ 6 天 后 达 到 最 高 温 度, 再 过 1~2 天 后 开 始 缓 慢 下 降 一 般 播 种 后 6~7 天, 即 可 出 现 幼 菇 菌 堆 内 水 分 不 足, 稻 草 较 干, 易 引 起 高 温, 可 采 用 踩 紧 菌 堆 和 淋 水 的 方 法 降 低 堆 温 温 度 过 高 时, 应 掀 开 草 被 或 全 部 撤 掉 草 被, 加 强 室 内 通 风, 并 用 竹 棍 在 堆 内 打 洞, 散 发 堆 温 当 温 度 下 降 到 45 左 右 时, 再 用 稻 草 将 洞 塞 好 保 温 (2) 调 节 水 分 在 踩 菌 堆 4 天 后 要 定 时 掀 开 薄 膜 通 风 换 气 若 气 温 较 高, 菌 床 外 表 干 燥, 可 直 接 向 菌 堆 喷 水, 以 后 每 天 可 以 喷 水 1--2 次, 喷 后 盖 薄 膜 如 果 气 候 特 别 干 燥, 还 要 在 草 堆 覆 盖 物 上 浇 水, 经 常 保 持 草 被 有 适 当 的 湿 度 当 堆 上 出 现 白 色 原 基 时, 宜 轻 喷 少 喷, 以 保 湿 为 主 随 着 菌 蕾 长 大, 逐 渐 加 大 喷 水 量 每 采 完 一 批 草 菇 后, 应 踩 堆 或 压 实 一 次, 草 堆 两 侧 也 需 压 实, 使 保 温 保 湿 良 好, 以 利 再 次 出 菇 (3) 通 风 换 气 草 菇 为 好 气 性 真 菌, 应 注 意 通 风 换 气, 通 常 每 天 开 窗 多 次, 以 排 除 室 内 的 二 氧 化 碳, 增 加 新 鲜 空 气, 这 样 有 利 于 菌 蕾 的 形 成 ( 六 ) 采 收 室 外 种 菇 一 般 播 种 后 6~10 天 即 可 见 菌 蕾,11~15 天 可 以 开 始 采 菇 商 品 草 菇 采 收 适 期 是 菇 体 由 基 部 较 宽 顶 部 稍 尖 的 宝 塔 形 变 为 卵 形, 质 地 由 硬 变 软, 颜 色 由 深 变 浅, 在 外 菌 幕 未 被 突 破 之 前 采 收, 这 时 的 菇 体 味 道 鲜 美, 蛋 白 质 含 量 较 高, 质 量 最 佳 菌 幕 将 破 末 破, 菌 柄 还 未 露 出 的 质 量 次 之, 开 伞 的 菇 质 量 较 差 草 菇 生 长 迅 速, 有 时 往 往 一 夜 之 间 全 部 开 伞, 因 此, 采 收 必 须 及 时, 最 好 早 晚 各 采 收 一 次 室 内 栽 培 草 菇 6~7 天 可 见 菌 蕾,10 天 左 右 收 菇 当 第 一 潮 草 菇 采 完 后, 隔 1~2 天 第 二 潮 菇 蕾 便 出 现, 约 5-6 天 后 又 可 采 收 每 个 草 堆 可 收 草 菇 4~5 次, 采 收 期 30~40 天 室 内 栽 培 的 草 菇 第 一 潮 菇 产 量 可 占 整 个 收 菇 期 产 量 的 70%~80% 采 收 草 菇 的 方 法 为 : 一 手 按 住 菇 体 周 围 的 培 养 料, 另 一 手 握 住 菇 体 左 右 旋 转, 轻 轻 摘 下, 切 忌 用 力 拔 起, 以 免 牵 动 菌 丝, 弄 乱 草 堆, 影 响 以 后 出 菇 如 遇 密 集 丛 的 草 菇, 应 在 大 部 分 适 合 采 收 时, 一 齐 采 摘, 以 免 因 采 收 个 别 草 菇 的 翻 动 而 造 成 大 量 未 成 熟 的 草 菇 死 亡

79 第 三 部 分 专 题 实 验 实 验 26 水 中 细 菌 学 检 查 I 水 中 细 菌 总 数 的 测 定 一 目 的 要 求 l. 学 习 水 样 的 采 取 方 法 和 水 样 细 菌 总 数 测 定 的 方 法 2. 了 解 水 源 水 的 平 板 菌 落 计 数 的 原 则 二 基 本 原 理 本 实 验 应 用 平 板 菌 落 计 数 技 术 测 定 水 中 细 菌 总 数 由 于 水 中 细 菌 种 类 繁 多, 它 们 对 营 养 和 其 他 生 长 条 件 的 要 求 差 别 很 大, 不 可 能 找 到 一 种 培 养 基 在 一 种 条 件 下, 使 水 中 所 有 的 细 菌 均 能 生 长 繁 殖, 因 此, 以 一 定 的 培 养 基 平 板 上 生 长 出 来 的 菌 落, 计 算 出 来 的 水 中 细 菌 总 数 仅 是 一 种 近 似 值 目 前 一 般 是 采 用 普 通 肉 膏 蛋 白 胨 琼 脂 培 养 基 三 器 材 l. 培 养 基 肉 膏 蛋 白 胨 琼 脂 培 养 基, 无 菌 水 2. 仪 器 或 其 他 用 具 灭 菌 三 角 烧 瓶, 灭 菌 的 带 玻 璃 塞 瓶, 灭 菌 培 养 皿, 灭 菌 吸 管, 灭 菌 试 管 等 四 操 作 步 骤 l. 水 样 的 采 取 (1) 自 来 水 先 将 自 来 水 龙 头 用 火 焰 烧 灼 3min 灭 菌, 再 开 放 水 龙 头 使 水 流 5min 后, 以 灭 菌 三 角 烧 瓶 接 取 水 样, 以 待 分 析 (2) 池 水 河 水 或 湖 水 应 取 距 水 面 l0~15cm 的 深 层 水 样, 先 将 灭 菌 的 带 玻 璃 塞 瓶, 瓶 口 向 下 浸 入 水 中, 然 后 翻 转 过 来, 除 去 玻 璃 塞, 水 即 流 入 瓶 中, 盛 满 后, 将 瓶 塞 盖 好, 再 从 水 中 取 出, 最 好 立 即 检 查, 否 则 需 放 入 冰 箱 中 保 存 2. 细 菌 总 数 测 定 (1) 自 来 水 1 用 灭 菌 吸 管 吸 取 lml 水 样, 注 入 灭 菌 培 养 皿 中 共 做 两 个 平 皿 2 分 别 倾 注 约 15mL 己 溶 化 并 冷 却 到 45 左 右 的 肉 膏 蛋 白 胨 琼 脂 培 养 基, 并 立 即 在 桌 上 作 平 面 旋 摇, 使 水 样 与 培 养 基 充 分 混 匀 3 另 取 一 空 的 灭 菌 培 养 皿, 倾 注 肉 膏 蛋 白 胨 琼 脂 培 养 基 15mL 作 空 自 对 照 4 培 养 基 凝 固 后, 倒 置 于 37 温 箱 中, 培 养 24h, 进 行 菌 落 计 数 5 两 个 平 板 的 平 均 菌 落 数 即 为 lml 水 样 的 细 菌 总 数 (2) 池 水 河 水 或 湖 水 等 1 稀 释 水 样 取 3 个 灭 菌 空 试 管, 分 别 加 入 9ml 灭 菌 水 取 lml 水 样 注 入 第 一 管 9ml 灭 菌 水 内 摇 匀, 再 自 第 一 管 取 1ml 至 下 一 管 灭 菌 水 内, 如 此 稀 释 到 第 三 管, 稀 释 度 分 别 为 与 10-3 稀 释 倍 数 看 水 样 污 浊 程 度 而 定, 以 培 养 后 平 板 的 菌 落 数 在 30~300 个 之 间 的 稀 释 度 最 为 合 适, 若 三 个 稀 释 度 的 菌 数 均 多 到 无 法 计 数 或 少 到 无 法 计 数, 则 需 继 续 稀 释 或 减 小 稀 释 倍 数 一 般 中 等 污 秽 水 样, 取 三 个 连 续 稀 释 度, 污 秽 严 重 的 取 三 个 连 续 稀 释 度 2 自 最 后 三 个 稀 释 度 的 试 管 中 各 取 lml 稀 释 水 加 入 空 的 灭 菌 培 养 皿 中, 每 一 稀 释 度 做 两 个 培 养 皿 3 各 倾 注 15ml 已 溶 化 并 冷 却 至 45 左 右 的 肉 膏 蛋 白 胨 琼 脂 培 养 基, 立 即 放 在 桌 上 摇 匀 4 凝 固 后 倒 置 于 37 培 养 箱 中 培 养 24h 3. 菌 落 计 数 方 法 (1) 先 计 算 相 同 稀 释 度 的 平 均 菌 落 数 若 其 中 一 个 平 板 有 较 大 片 状 菌 苔 生 长 时, 则 不 应 采 用, 而 应 以 无 片 状 菌 苔 生 长 的 平 板 作 为 该 稀 释 度 的 平 均 菌 落 数 若 片 状 菌 苔 的 大 小 不 到 平 板 的 一 半, 而 其 余 的 一 半 菌 落 分 布 又 很 均 匀 时, 则 可 将 此 一 半 的 菌 落 数 乘 2 以 代 表 全 平 板 的 菌 落 数, 然 后 再 计 算 该 稀 释 度 的 平 均 菌 落 数

80 (2) 首 先 选 择 平 均 菌 落 数 在 30~300 之 间 的, 当 只 有 一 个 稀 释 度 的 平 均 菌 落 数 符 合 此 范 围 时, 则 以 该 平 均 菌 落 数 乘 其 稀 释 倍 数 即 为 该 水 样 的 细 菌 总 数 ( 见 表 26-1, 例 1) (3) 若 有 两 个 稀 释 度 的 平 均 菌 落 数 均 在 30~300 之 间, 则 按 两 者 菌 落 总 数 之 比 值 来 决 定 若 其 比 值 小 于 2, 应 采 取 两 者 的 平 均 数 ; 若 大 于 2, 则 取 其 中 较 小 的 菌 落 总 数 ( 见 表 26-l, 例 2 及 例 3) (4) 若 所 有 稀 释 度 的 平 均 菌 落 数 均 大 于 300, 则 应 按 稀 释 度 最 高 的 平 均 菌 落 数 乘 以 稀 释 倍 数 ( 见 表 26-l, 例 4) (5) 若 所 有 稀 释 度 的 平 均 菌 落 数 均 小 于 30, 则 应 按 稀 释 度 最 低 的 平 均 菌 落 数 乘 以 稀 释 倍 数 ( 见 表 26-l, 例 5) (6) 若 所 有 稀 释 度 的 平 均 菌 落 数 均 不 在 30~300 之 间, 则 以 最 近 300 或 30 的 平 均 菌 落 数 乘 以 稀 释 倍 数 ( 见 表 26-1, 例 6) 例 次 不 同 稀 释 的 平 均 菌 落 数 表 26 1 计 算 菌 数 落 总 数 方 法 举 例 两 个 稀 释 度 菌 落 数 之 比 菌 落 总 烽 ( 个 /ml) 或 或 或 无 法 计 数 或 或 无 法 计 数 或 五 实 验 报 告 1. 结 果 (1) 自 来 水 备 注 两 位 以 后 的 数 字 采 取 四 舍 五 入 的 方 法 去 掉 平 板 菌 落 数 1ml 自 来 水 中 细 菌 总 数 1 2 (2) 池 水 河 水 或 湖 水 等 稀 释 度 平 板 菌 落 数 平 均 菌 落 数 计 算 方 法 细 菌 总 数 /ml 2. 思 考 题 (1) 从 自 来 水 的 细 菌 总 数 结 果 来 看, 是 否 合 乎 饮 用 水 的 标 准? (2) 你 所 测 的 水 源 水 的 污 秽 程 度 如 何? (3) 国 家 对 自 来 水 的 细 菌 总 数 有 一 标 准, 那 么 各 地 能 否 自 行 设 计 其 测 定 条 件 ( 诸 如 培 养 温 度, 培 养 时 间 等 ) 来 测 定 水 样 总 数 呢? 为 什 么? II 水 中 大 肠 菌 群 的 检 测 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 学 习 检 测 水 中 大 肠 菌 群 的 方 法, 了 解 大 肠 菌 群 数 量 与 水 质 状 况 的 关 系 内 容 :1. 用 滤 膜 法 检 测 大 肠 菌 群 2. 用 多 管 发 酵 法 检 测 大 肠 菌 群 二 实 验 材 料 和 用 具

81 复 红 亚 硫 酸 钠 培 养 基 ( 远 藤 氏 培 养 基 ) 乳 糖 蛋 白 胨 半 固 体 培 养 基 乳 糖 蛋 白 胨 培 养 液 三 倍 浓 乳 糖 蛋 白 胨 培 养 液 伊 红 美 蓝 培 养 基 (EMB 培 养 基 ) 微 孔 滤 膜 ( 孔 径 0.45µm) 滤 器 ( 容 量 500mL) 抽 气 设 备 镊 子 发 酵 用 试 管 杜 氏 小 管 培 养 皿 刻 度 吸 管 或 移 液 管 接 种 环 酒 精 灯 三 操 作 步 骤 ( 一 ) 水 样 的 采 集 1. 自 来 水 将 自 来 水 龙 头 用 火 焰 烧 灼 3min 灭 菌, 再 拧 开 水 龙 头 流 水 5min, 以 排 除 管 道 内 积 存 的 死 水, 随 后 用 已 灭 菌 的 三 角 瓶 接 取 水 样, 以 供 检 测 2. 池 水 河 水 或 湖 水 将 无 菌 的 带 玻 塞 的 小 口 瓶 浸 入 距 水 面 10~15cm 深 的 水 层 中, 瓶 口 朝 上, 除 去 瓶 塞, 待 水 流 入 瓶 中 装 满 后, 盖 好 瓶 塞, 取 出 后 立 即 进 行 检 测, 或 临 时 存 于 冰 箱, 但 不 能 超 过 24h ( 二 ) 滤 膜 法 检 测 大 肠 菌 群 l. 用 无 菌 镊 子 将 一 无 菌 滤 膜 置 于 滤 器 的 承 受 器 当 中, 将 过 滤 杯 装 于 滤 膜 承 受 器 上, 旋 紧, 使 接 口 处 能 密 封, 将 真 空 泵 与 滤 器 下 部 的 抽 气 口 连 接 ( 图 26-1) 图 26 1 微 孔 滤 膜 滤 器 1. 滤 杯 ;2. 滤 杯 和 接 瓶 接 合 处 ( 内 装 有 滤 膜 );3. 接 瓶 ;4. 抽 滤 系 统 ( 可 接 针 筒 );5. 硅 树 脂 垫 圈 ;6. 微 孔 滤 膜 (0.45µm);7. 膜 承 受 部 分 2. 加 水 样 100mL 于 滤 杯 中, 启 动 抽 真 空 系 统, 使 水 通 过 滤 膜 流 到 下 部, 水 中 的 菌 细 胞 被 截 留 在 滤 膜 上 水 样 用 量 可 适 当 增 减 使 获 得 菌 落 适 量 3. 用 无 菌 镊 子 小 心 将 截 留 有 细 菌 的 滤 膜 取 出, 平 移 贴 于 复 红 亚 硫 酸 钠 固 体 培 养 基 上 ( 注 意 无 菌 操 作, 滤 膜 与 培 养 基 间 贴 紧, 无 气 泡 ),37 培 养 16~l8h 挑 选 深 红 色 或 紫 红 色 带 有 或 不 带 金 属 光 泽 的 菌 落, 或 淡 红 色 中 心 色 较 深 的 菌 落 进 行 涂 片 和 革 兰 氏 染 色 观 察 4. 经 染 色 证 实 为 革 兰 氏 阴 性 无 芽 孢 杆 菌 者, 再 接 种 在 乳 糖 蛋 白 胨 半 固 体 培 养 基 上,37 培 养 6~8h 后 观 察, 产 气 者 证 实 为 大 肠 菌 群 阳 性 培 养 中 应 及 时 观 察, 时 间 过 长 则 气 泡 可 能 消 失 5. 结 果 计 算 水 样 中 总 大 肠 菌 群 数 / 个 L -1 =( 滤 膜 生 长 的 菌 落 数 / 过 滤 水 样 量 /ml) 100 ( 滤 膜 上 菌 落 数 以 20~60 个 / 片 较 为 适 宜 ) ( 三 ) 多 管 发 酵 法 检 测 大 肠 菌 群 1. 取 5 支 装 有 3 倍 浓 乳 糖 蛋 白 胨 培 养 基 的 初 发 酵 管, 每 管 分 别 加 入 水 样 10mL 另 取 5 支 装 有 乳 糖 蛋 白 胨 培 养 基 的 初 发 酵 管, 每 管 分 别 加 入 水 样 lml 再 取 5 支 装 有 乳 糖 蛋 白 胨 培 养 基 的 初 发 酵 管, 每 管 分 别 加 入 按 1:10 稀 释 的 水 样 lml( 即 相 当 于 原 水 样 0.1mL), 均 贴 好 标 签 此 即 为 15 管 法, 接 种 待 测 水 样 量 共 计 55.5mL 各 管 摇 匀 后 在 37 恒 温 箱 中 培 养 24h 若 待 测 水 样 污 染 严 重, 可 按 上 述 3 种 梯 度 将 水 样 稀 释 10 倍 ( 即 分 别 接 种 原 水 样 1mL 0.lmL 0.01mL) 甚 至 100 倍 ( 即 分 别 接 种 原 水 样 0.lmL 0.01mL 0.001mL), 以 提 高 检 测 的 准 确 度 此 时, 不 必 用 3 倍 浓 乳 糖 蛋 白 胨 培 养 基, 全 用 乳 糖 蛋 白 胨 培 养 基

82 2. 取 出 培 养 后 的 发 酵 管, 观 察 管 内 发 酵 液 颜 色 变 为 黄 色 者 记 录 为 产 酸, 杜 氏 小 管 内 有 气 泡 者 记 录 为 产 气 将 产 酸 产 气 和 只 产 酸 的 两 类 发 酵 管 分 别 划 线 接 种 于 伊 红 美 蓝 培 养 基 上, 在 37 恒 温 箱 中 培 养 18~24h 挑 选 深 紫 黑 色 和 紫 黑 色 带 有 或 不 带 有 金 属 光 泽 的 菌 落 或 淡 紫 红 色 和 中 心 色 较 深 的 菌 落, 将 其 一 部 分 分 别 取 样 进 行 涂 片 和 革 兰 氏 染 色 观 察 3. 经 镜 检 证 实 为 革 兰 氏 阴 性 无 芽 孢 杆 菌, 则 将 此 菌 落 的 另 一 部 分 接 种 于 装 有 倒 置 杜 氏 小 管 的 乳 糖 蛋 白 胨 培 养 液 的 复 发 酵 管 中, 每 管 可 接 种 同 一 发 酵 管 的 典 型 菌 落 1~3 个,37 培 养 24h 若 为 产 酸 产 气 者 表 明 试 管 内 有 大 肠 菌 群 菌 存 在, 记 录 为 阳 性 管 4. 根 据 3 个 梯 度 (10mL 1ml 0.1mL) 每 5 支 管 中 出 现 的 阳 性 管 教 ( 即 为 数 量 指 标 ), 查 附 注 的 15 管 发 酵 法 水 中 大 肠 菌 群 5 次 重 复 测 数 统 计 表 ( 表 26-2) 的 细 菌 最 可 能 数, 再 乘 以 100 即 换 算 成 1 升 水 样 中 的 总 大 肠 菌 群 数 四 注 意 事 项 认 真 配 制 不 同 类 型 培 养 基 检 测 中 应 合 理 控 制 所 加 的 水 样 量 在 滤 膜 法 中 每 片 滤 膜 的 菌 落 数 以 20~60 个 为 宜 多 管 发 酵 法 中 水 样 稀 释 比 例 要 适 宜 挑 选 菌 落 时 认 真 选 择 大 肠 菌 群 典 型 菌 落 五 演 示 1. 具 有 大 肠 菌 群 的 发 酵 管 中 产 酸 与 产 气 特 征 的 观 察 2. 在 复 红 亚 硫 酸 钠 培 养 基 和 伊 红 美 蓝 培 养 基 上 大 肠 菌 群 典 型 菌 落 的 色 泽 及 特 征 的 识 别 六 实 验 报 告 ( 一 ) 实 验 结 果 记 录 1. 微 孔 滤 膜 法 过 滤 水 样 量 (ml):,37 培 养 后 特 征 菌 落 数 :, 接 种 乳 糖 培 养 基 后 的 阳 性 管 数 : 总 大 肠 菌 群 数 ( 个 /L): 2. 多 管 发 酵 法 检 测 结 果 (1) 根 据 实 验 数 据 查 表 26 2: 表 管 发 酵 法 水 中 大 肠 菌 群 5 次 重 复 测 数 统 计 表 数 量 指 标 * 细 菌 最 可 能 数 数 量 指 标 细 菌 最 可 能 数 数 量 指 标 细 菌 最 可 能 数 数 量 指 数 细 菌 最 可 能 数

83 * 数 量 指 标 示 意 : 如 203, 表 示 5 个 10mL 初 发 酵 管 中 有 阳 性 管 2 个 ;5 个 1mL 初 发 酵 管 中 有 阳 性 管 0 个 ;5 个 0.1mL 初 发 酵 管 中 有 阳 性 管 3 个 ; 又 如 555, 则 表 示 15 个 初 发 酵 管 均 为 阳 性 管 (2) 多 管 发 酵 法 结 果 填 于 下 表 中 : 初 发 酵 管 初 发 酵 管 数 每 管 取 样 数 /ml 产 酸 产 气 管 数 复 发 酵 管 数 阳 性 管 数 (3) 多 管 发 酵 法 检 测 结 果 : 查 表 结 果 及 总 大 肠 菌 群 数 ( 个 /L) ( 二 ) 试 图 解 说 明 检 测 水 样 中 大 肠 菌 群 的 操 作 过 程 七 问 题 和 思 考 1. 检 查 饮 用 水 的 中 大 肠 菌 群 有 何 意 义? 比 较 本 实 验 中 两 种 检 测 方 法 的 优 缺 点 2. 试 设 计 一 个 监 测 某 自 来 水 厂 水 质 卫 生 状 况 的 方 案 实 验 27 实 验 室 环 境 和 人 体 表 面 微 生 物 的 检 查 一 目 的 要 求 1. 证 明 实 验 室 环 境 与 体 表 存 在 微 生 物 2. 比 较 来 自 不 同 场 所 与 不 同 条 件 下 细 菌 的 数 量 和 类 型 3. 观 察 不 同 类 群 微 生 物 的 菌 落 形 态 特 征 4. 体 会 无 菌 操 作 的 重 要 性 二 基 本 原 理 平 板 培 养 基 含 有 细 菌 生 长 所 需 要 的 营 养 成 分, 当 取 自 不 同 来 源 的 样 品 接 种 于 培 养 基 上, 在 适 宜 温 度 下 培 养 1~2d 内 每 一 菌 体 即 能 通 过 很 多 次 细 胞 分 裂 而 进 行 繁 殖, 形 成 一 个 可 见 的 细 胞 群 体 集 落, 称 为 菌 落 每 一 种 细 菌 所 形 成 的 菌 落 都 有 它 自 己 的 特 点, 例 如 菌 落 的 大 小, 表 面 干 燥 或 湿 润 隆 起 或 扁 平 粗 糙 或 光 滑, 边 缘 整 齐 或 不 整 齐, 菌 落 透 明 或 半 透 明 或 不 透 明, 颜 色 以 及 质 地 疏 松 或 紧 密 等 因 此, 可 通 过 平 板 培 养 来 检 查 环 境 中 细 菌 的 数 量 和 类 型 三 器 材 l. 培 养 基 肉 膏 蛋 白 胨 琼 脂 平 板 2. 仪 器 或 其 他 用 具 无 菌 水, 灭 菌 棉 签 ( 装 在 试 管 内 ), 接 种 环, 试 管 架, 酒 精 灯 或 煤 气 灯, 记 号 笔, 废 物 缸 四 操 作 步 骤 每 组 在 实 验 室 和 人 体 两 大 部 分 中 各 选 择 一 个 内 容 做 实 验, 或 由 教 师 指 定 分 配, 最 后 结 果 供 全 班 讨 论 l. 写 标 签 任 何 一 个 实 验, 在 动 手 操 作 前 均 需 首 先 将 器 皿 用 记 号 笔 做 上 记 号, 写 上 班 级 姓 名 日 期, 本 次 实 验 还 要 写 上 样 品 来 源 ( 如 实 验 室 空 气 或 无 菌 室 空 气 或 头 发 等 ), 字 尽 量 小 些, 写 在 皿 底 的 一 边, 不 要 写 在 当 中, 以 免 影 响 观 察 结 果

84 培 养 皿 的 记 号 一 般 写 在 皿 底 上 如 果 写 在 皿 盖 上, 同 时 观 察 两 个 以 上 培 养 皿 的 结 果, 打 开 皿 盖 时, 容 易 混 淆 2. 实 验 室 细 菌 检 查 (1) 空 气 将 一 个 肉 膏 蛋 白 胨 琼 脂 平 板 放 在 当 时 做 实 验 的 实 验 室, 移 去 皿 盖, 使 琼 脂 培 养 基 表 面 暴 露 在 空 气 中 ; 将 另 一 肉 膏 蛋 白 胨 琼 脂 平 板 放 在 无 菌 室 或 无 人 走 动 的 其 他 实 验 室, 移 去 皿 盖 lh 后 盖 上 两 个 皿 盖 (2) 实 验 台 和 门 的 旋 钮 1 用 记 号 笔 在 皿 底 外 面 中 央 画 一 直 线, 再 在 此 线 中 间 处 画 一 垂 直 线, 如 图 27-l 图 27 1 培 养 皿 底 外 面 画 记 号 图 形 2 取 棉 签 左 手 拿 装 有 棉 签 的 试 管, 在 火 焰 旁 用 右 手 的 手 掌 边 缘 和 小 指 无 名 指 夹 持 棉 塞 ( 或 试 管 帽 ), 将 其 取 出 ( 图 27-2,B), 将 管 口 很 快 地 通 过 煤 气 灯 ( 或 酒 精 灯 ) 的 火 焰, 烧 灼 管 口 ; 轻 轻 地 倾 斜 试 管, 用 右 手 的 拇 指 和 食 指 将 棉 签 小 心 地 取 出 ( 图 27-2,C) 塞 回 棉 塞 ( 或 试 管 帽 )(27-2,D), 并 将 空 试 管 放 在 试 管 梁 上 图 27 2 灭 菌 棉 签 的 取 出 与 放 入 试 管 A. 盛 灭 菌 棉 签 的 灭 菌 试 管 ;B. 取 出 管 帽 与 烧 灼 管 口 ;C. 取 出 棉 签 ;D. 放 回 管 帽 ;E. 棉 签 接 种 后 放 回 试 管 前, 拔 出 管 帽, 烧 灼 管 口 ;F. 用 过 的 棉 签 插 入 试 管 后, 放 回 至 试 管 架 3 弄 湿 棉 签 左 手 取 灭 菌 水 试 管, 如 上 法 拨 出 棉 塞 ( 或 试 管 帽 ) 并 烧 灼 管 口, 将 棉 签 插 入 水 中, 再 提 出 水 面, 在 管 壁 上 挤 压 一 下 以 除 去 过 多 的 水 分, 小 心 将 棉 签 取 出, 烧 灼 管 口, 塞 回 棉 塞 ( 或 试 管 帽 ), 并 将 灭 菌 水 试 管 放 在 试 管 梁 上 4 取 样 将 湿 棉 签 在 实 验 台 面 或 门 旋 钮 上 擦 拭 约 2cm 2 的 范 围. 5 接 种 在 火 焰 旁 用 左 手 拇 指 和 食 指 或 中 指 使 平 皿 开 启 成 一 缝. 再 将 棉 签 伸 人, 在 琼 脂 表 面 顶 端 接 种, 即 滚 动 一 下, 立 即 闭 合 皿 盖 并 按 图 27-2E 和 F, 将 原 放 棉 签 的 空 试 管 拨 出 棉 塞 ( 或 试 管 帽 ), 烧 灼 管 口, 插 入 用 过 的 棉 签, 将 试 管 放 回 试 管 架 6 划 线 另 取 接 种 环 在 火 焰 上 灭 菌, 按 图 3 3 方 法 进 行 划 线, 整 个 划 线 操 作 均 要 求 无 菌 操 作, 即 靠 近 火 焰, 而 且 动 作 要 快

85 3. 人 体 细 菌 的 检 查 (1) 手 指 ( 洗 手 前 与 洗 手 后 ) 1 分 别 在 两 个 琼 脂 平 板 上 标 明 洗 手 前 与 洗 手 后 ( 班 级 姓 名. 日 期 ) 2 移 去 皿 盖, 将 未 洗 过 的 手 指 在 琼 脂 平 板 的 表 面, 轻 轻 地 来 回 划 线, 盖 上 皿 盖 3 用 肥 皂 和 刷 子, 用 力 刷 手, 在 流 水 中 冲 洗 干 净, 干 燥 后, 在 另 一 琼 脂 平 板 表 面 来 回 移 动, 盖 上 皿 盖 (2) 头 发 在 揭 开 皿 盖 的 琼 脂 平 板 的 上 方, 用 手 将 头 发 用 力 摇 动 数 次, 使 细 菌 降 落 到 玻 脂 平 板 表 面, 然 后 盖 上 皿 盖 A. 接 种 时, 用 左 手 将 平 皿 开 启 一 缝 ;B. 棉 签 伸 入 平 板 接 种 ; C. 用 己 灭 菌 并 冷 却 了 的 接 种 环 划 线 ; D. 第 二 部 分 划 线 ; E. 最 后 部 分 划 线 (3) 咳 嗽 将 去 皿 盖 的 琼 脂 平 板 放 在 离 口 约 6~8cm 处, 对 着 琼 脂 表 面 用 力 咳 嗽, 然 后 盖 上 皿 盖 (4) 鼻 腔 1 按 照 实 验 台 检 查 法 的 步 骤 2 和 3, 取 出 棉 签, 并 将 其 弄 湿 2 用 湿 棉 签 在 鼻 腔 内 滚 动 数 次 3 按 实 验 台 检 查 法 的 步 骤 5 和 6, 接 种 与 划 线, 然 后 盖 上 皿 盖 4. 将 所 有 的 琼 脂 平 板 翻 转, 使 皿 底 朝 上, 放 37 培 养 箱, 培 养 1~2d 五. 结 果 记 录 方 法 (1) 菌 落 计 数 在 划 线 的 平 板 上, 如 果 菌 落 很 多 而 重 叠, 则 数 平 板 最 后 1/4 面 积 内 的 菌 落 数 不 是 划 线 的 平 板, 也 一 分 为 四, 数 l/4 面 积 的 菌 落 数 (2) 根 据 菌 落 大 小 形 状 高 度 干 湿 等 特 征 观 察 不 同 的 菌 落 类 型 但 要 注 意, 如 果 细 菌 数 量 太 多, 会 使 很 多 菌 落 生 长 在 一 起, 或 者 限 制 了 菌 落 生 长 而 变 得 很 小, 因 而 外 观 不 典 型, 故 观 察 菌 落 的 特 点 时, 要 选 择 分 离 得 很 开 的 单 个 菌 落 菌 落 特 征 描 写 方 法 如 下 : 1 大 小 大 中 小 针 尖 状 可 先 将 整 个 平 板 上 的 菌 落 粗 略 观 察 一 下, 再 决 定 大 中 小 的 标 准, 或 由 教 师 指 出 一 个 大 小 范 围 2 颜 色 黄 色 金 黄 色 灰 色 乳 白 色 红 色 粉 红 色 等 3 干 湿 情 况 干 燥 湿 润 粘 稠 4 形 态 圆 形 不 规 则 等 5 高 度 扁 平 隆 起 凹 下 6 透 明 程 度 透 明 半 透 明 不 透 明 7 边 缘 整 齐 不 整 齐 五 实 验 报 告 1. 结 果 (1) 将 你 自 已 的 平 板 结 果 记 录 于 下 表 中 样 品 来 源 1 2 菌 落 数 ( 近 似 值 ) 菌 落 类 型 大 小 形 态 干 湿 特 征 描 写 高 度 透 明 度 颜 色 边 缘

86 (2) 与 其 他 同 学 所 做 的 结 果 进 行 比 较 样 品 来 源 菌 落 数 (1/4 平 板 ) 菌 落 类 型 数 ( 近 似 值 ) 2. 思 考 题 (1) 比 较 各 种 来 源 的 样 品, 哪 一 种 样 品 的 平 板 菌 落 数 与 菌 落 类 型 最 多? (2) 人 多 的 实 验 室 与 无 菌 室 ( 或 无 人 走 动 的 实 验 室 ) 相 比, 平 板 上 的 菌 落 数 与 菌 落 类 型 有 什 么 区 别? 你 能 解 释 一 下 造 成 这 种 区 别 的 原 因 吗? (3) 洗 手 前 后 的 手 指 平 板, 菌 落 数 有 无 区 别? (4) 通 过 本 次 实 验, 在 防 止 培 养 物 的 污 染 与 防 止 细 菌 的 扩 散 方 面, 你 学 到 些 什 么? 有 什 么 体 会 实 验 28 微 生 物 的 诱 变 育 种 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 以 紫 外 线 诱 变 获 得 用 于 酱 油 生 产 的 高 产 蛋 白 酶 菌 株 为 例, 学 习 微 生 物 诱 变 育 种 的 基 本 操 作 方 法 内 容 :1. 对 米 曲 霉 (Aspergills oryzae ) 出 发 菌 株 进 行 处 理, 制 备 孢 子 悬 液 2. 用 紫 外 线 进 行 诱 变 处 理 3. 用 平 板 透 明 圈 法 进 行 两 次 初 筛 4. 用 摇 瓶 法 进 行 复 筛 及 酶 活 性 测 定 二 实 验 材 料 和 用 具 米 曲 霉 斜 面 菌 种 ; 豆 饼 斜 面 培 养 基 酪 素 培 养 基 蒸 馏 水 0.5% 酪 蛋 白 ; 三 角 瓶 (300mL 500mL) 试 管 培 养 皿 (9cm) 恒 温 摇 床 恒 温 培 养 箱 紫 外 照 射 箱 磁 力 搅 拌 器 脱 脂 棉 无 菌 漏 斗 玻 璃 珠 移 液 管 涂 布 器 酒 精 灯 三 操 作 步 骤 ( 一 ) 出 发 菌 株 的 选 择 及 菌 悬 液 制 备 1. 出 发 菌 株 的 选 择 可 直 接 选 用 生 产 酱 油 的 米 曲 霉 菌 株, 或 选 用 高 产 蛋 白 酶 的 米 曲 霉 菌 株 2. 菌 悬 液 制 备 取 出 发 菌 株 转 接 至 豆 饼 斜 面 培 养 基 中,30 培 养 3~5d 活 化 然 后 孢 子 洗 至 装 有 1mL 0.lmol/L ph6.0 的 无 菌 磷 酸 缓 冲 液 的 三 角 瓶 中 ( 内 装 玻 璃 珠, 装 量 以 大 致 铺 满 瓶 底 为 宜 ),30 振 荡 30min, 用 垫 有 脱 脂 棉 的 灭 菌 漏 斗 过 滤, 制 成 把 子 悬 液, 调 其 浓 度 为 10 6 ~10 8 个 /ml, 冷 冻 保 藏 备 用 ( 二 ) 诱 变 处 理 用 物 理 方 法 或 化 学 方 法, 所 用 诱 变 剂 种 类 及 剂 量 的 选 择 可 视 具 体 情 况 决 定, 有 时 还 可 采 用 复 合 处 理, 可 获 得 更 好 的 结 果 本 实 验 学 习 用 紫 外 线 照 射 的 诱 变 方 法 1. 紫 外 线 处 理 打 开 紫 外 灯 (30W) 预 热 20min 取 5mL 菌 悬 液 放 在 无 菌 的 培 养 皿 (9cm) 中, 同 时 制 作 5 份 逐 一 操 作, 将 培 养 皿 平 放 在 离 紫 外 灯 30cm( 垂 直 距 离 ) 处 的 磁 力 搅 拌 器 上, 照 射 l min 后 打 开 培 养 皿 盖, 开 始 照 射, 与 照 射 处 理 开 始 的 同 时 打 开 磁 力 搅 拌 器 进 行 搅 拌, 即 时 计 算 时 间, 照 射 时 间 分 别 为 15 s 30 s l min 2 min 5 min 照 射 后, 诱 变 菌 液 在 黑 暗 冷 冻 中 保 存 1~2h 然 后 在 红 灯 下 稀 释 涂 菌 进 行 初 筛 2. 稀 释 菌 悬 液 按 10 倍 稀 释 至 10-6, 从 10-5 和 10-6 中 各 取 出 0.lmL 加 入 到 酪 素 培 养 基 平 板 中 ( 每 个 稀 释 度 均 做 3 个 重 复 ), 然 后 涂 菌 并 静 置, 待 菌 液 渗 入 培 养 基 后 倒 置, 于 30

87 恒 温 培 养 2~3d ( 三 ) 优 良 菌 株 的 筛 选 1. 初 筛 首 先 观 察 在 菌 落 周 围 出 现 的 透 明 圈 大 小, 并 测 量 其 菌 落 直 径 与 透 明 圈 直 径 之 比, 选 择 其 比 值 大 且 菌 落 直 径 也 大 的 菌 落 40~50 个, 作 为 复 筛 菌 株 2. 平 板 复 筛 分 别 倒 酪 素 培 养 基 平 板, 在 每 个 平 皿 的 背 面 用 红 笔 划 线 分 区, 从 圆 心 划 线 至 周 边 分 成 8 等 份,1~7 份 中 点 种 初 筛 菌 株, 第 8 份 点 种 原 始 菌 株, 作 为 对 照 培 养 48h 后 即 可 见 生 长, 若 出 现 明 显 的 透 明 圈, 即 可 按 初 筛 方 法 检 测, 获 得 数 株 二 次 优 良 菌 株, 进 大 摇 瓶 复 筛 阶 段 3. 摇 瓶 复 筛 将 初 筛 出 的 菌 株, 接 入 米 曲 霉 复 筛 培 养 基 中 进 行 培 养, 其 方 法 是, 称 取 麦 秩 85g, 豆 饼 粉 ( 或 面 粉 )15g, 加 水 95~110mL( 称 为 润 水 ), 水 含 量 以 手 捏 后 指 缝 有 水 而 不 下 滴 为 宜, 于 500mL 三 角 瓶 中 装 入 15~20g( 料 厚 为 1~1.5cm),121 湿 热 灭 菌 30min, 然 后 分 别 接 入 以 上 初 筛 获 得 的 优 良 菌 株,30 培 养,24h 后 摇 瓶 一 次 并 均 匀 铺 开, 再 培 养 24~ 48h, 共 培 养 3~5d 后 检 测 蛋 白 酶 活 性 4. 蛋 白 酶 的 测 定 方 法 (1) 取 样 : 培 养 后 随 机 称 取 以 上 摇 瓶 培 养 物 1g, 加 蒸 馏 水 100mL,( 或 200mL),40 水 浴, 浸 酶 1h, 取 上 清 浸 液 测 定 酶 活 性 另 取 lg 培 养 物 于 105 烘 干 测 定 含 水 量 (2) 酶 活 性 测 定 :30 ph7.5 条 件 下 水 解 酪 蛋 白 ( 底 物 为 0.5% 酪 蛋 白 ), 每 分 钟 产 酪 氨 酸 1μg 为 一 个 酶 活 力 单 位 计 算 公 式 为 : (A 样 品 OD 680nm 值 -A 对 照 OD 680nm 值 ) K V/t N K: 标 准 曲 线 中 光 吸 收 为 1 时 的 酪 氨 酸 微 克 数 ; V: 酶 促 反 应 的 总 体 积 ; t: 酶 促 反 应 时 间 (min); N: 酶 的 稀 释 倍 数 5. 谷 氨 酸 的 检 测 此 项 检 测 也 是 酱 油 优 良 菌 株 的 重 要 指 标 之 一 检 测 培 养 基 : 豆 饼 粉 : 麸 夫 =6:4, 润 水 75%,121 湿 热 灭 菌 30min 谷 氨 酸 测 定 : 于 以 上 培 养 基 中 加 入 7% 盐 水 (W/V),40~45 水 浴, 水 解 9d 后 过 滤, 以 滤 液 检 测 谷 氨 酸 含 量 ( 测 压 法 ) 四 注 意 事 项 1. 紫 外 线 照 射 时 注 意 保 护 眼 睛 和 皮 肤 2. 诱 变 过 程 及 诱 变 后 的 稀 释 操 作 均 在 红 灯 下 进 行, 并 在 黑 暗 中 培 养 五 实 验 报 告 1. 试 列 表 说 明 高 产 蛋 白 酶 菌 株 的 筛 选 过 程 和 结 果 2. 你 认 为 以 上 的 筛 选 方 法 有 什 么 优 缺 点, 如 何 改 进? 六 问 题 和 思 考 1. 试 述 紫 外 线 诱 变 的 作 用 机 理 及 其 在 具 体 操 作 中 应 注 意 的 问 题 2. 为 什 么 在 诱 变 前 要 把 菌 悬 液 打 散 和 培 养 一 段 时 间? 注 : 筛 选 菌 株 数 的 计 算 若 按 突 变 率 为 0.01 计 算, 则 一 次 筛 选 可 取 个 菌 落, 第 一 次 筛 选 后 可 多 选 几 株 高 产 株, 而 二 级 筛 选 为 重 点 阶 段, 其 最 适 量 可 参 考 以 下 计 算 方 法 : 如 初 筛 菌 株 数 为 200 株, 二 次 筛 选 欲 选 株 数 为 2 株, 则 二 级 应 选 (200 2) 1/2, 为 20 株, 这 样 的 数 量 选 择, 使 有 可 能 从 较 少 的 数 量 中 获 得 相 对 较 多 的 优 良 菌 株

88 第 四 部 分 微 生 物 实 验 技 能 的 测 评 微 生 物 学 实 验 是 微 生 物 学 教 学 的 重 要 组 成 部 分, 对 学 生 实 验 基 本 技 能 的 培 养, 在 教 学 中 占 有 重 要 的 位 置 为 了 检 验 学 生 在 经 过 微 生 物 实 验 课 学 习 后, 对 微 生 物 实 验 基 本 技 术 和 知 识 的 掌 握 程 度, 并 对 学 生 学 习 效 果 进 行 评 定 测 评 内 容 包 括 对 微 生 物 学 实 验 基 本 知 识 和 技 能 的 掌 握, 应 用 所 学 知 识 进 行 实 验 设 计 及 系 统 地 完 成 实 验 的 实 际 工 作 能 力 实 验 44 和 实 验 45 是 为 此 而 设 计 的 两 种 测 评 方 式, 可 选 择 其 中 的 一 种 进 行 检 测 实 验 29 基 本 实 验 技 能 的 检 测 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 掌 握 微 生 物 学 的 基 本 实 验 技 能 并 进 行 测 试 内 容 :1. 复 习 全 部 基 本 实 验 操 作 2. 教 师 对 基 本 实 验 技 能 进 行 全 面 辅 导, 并 接 受 学 生 的 提 问 3. 开 放 实 验 室 ( 固 定 开 放 时 间, 学 生 可 自 由 进 入 实 验 室, 自 己 复 习 和 操 作 ) 二 实 验 材 料 和 用 具 细 菌 放 线 菌 酵 母 菌 霉 菌 菌 种, 细 菌 形 态 装 片 ; 培 养 基 ( 液 体 斜 面 平 板 ) 染 色 液 ; 载 玻 片 盖 玻 片 接 种 针 接 种 环 酒 精 灯 移 液 管 试 管 培 养 皿 包 装 纸 线 绳 高 压 蒸 汽 灭 菌 锅 显 微 镜 三 基 本 步 骤 ( 一 ) 复 习 的 主 要 内 容 1. 实 验 的 基 本 操 作 方 法 (1) 培 养 基 的 配 制 (2) 试 管 培 养 皿 移 液 管 等 的 包 扎 (3) 物 品 的 高 压 蒸 汽 灭 菌 和 干 热 灭 菌 (4) 细 菌 制 片 单 染 色 革 兰 氏 染 色 及 染 色 原 理 (5) 铺 平 板 制 斜 面 (6) 从 试 管 斜 面 菌 种 划 线 接 种 至 平 板 (7) 从 试 管 斜 面 菌 种 转 接 到 试 管 斜 面 (8) 从 试 管 斜 面 菌 种 转 接 至 液 体 培 养 基 2. 微 生 物 的 分 离 纯 化 (1) 四 大 类 群 微 生 物 的 常 用 培 养 基 及 其 ph 范 围 (2) 涂 布 法 和 混 菌 法 的 平 板 接 种 方 法 (3) 穿 刺 接 种 (4) 菌 悬 液 的 梯 度 稀 释 (5) 划 线 分 离 纯 化 微 生 物 (6) 从 土 壤 中 分 离 出 细 菌 放 线 菌 酵 母 菌 和 霉 菌 3. 微 生 物 的 形 态 (1) 油 镜 使 用 中 的 注 意 事 项 (2) 辨 认 细 菌 形 态 鞭 毛 荚 膜 细 胞 壁 异 染 颗 粒 伴 孢 晶 体 芽 孢 (3) 辨 认 酵 母 的 形 态 ( 液 泡 内 含 物 等 ) 出 芽 细 胞 核 假 菌 丝 (4) 区 分 常 见 霉 菌 ( 根 霉 毛 霉 青 霉 曲 霉 木 霉 ) (5) 细 菌 放 线 菌 酵 母 菌 霉 菌 菌 落 特 征 的 分 辨 (6) 细 菌 大 小 和 数 量 的 测 定 4. 生 理 生 化 测 定 (1)VP 反 应 和 MR 反 应 原 理 及 方 法 (2) 判 定 某 种 细 菌 是 否 发 酵 糖, 能 否 产 气 产 酸 的 方 法 (3) 如 何 初 步 鉴 定 一 种 细 菌 是 好 氧 厌 氧 兼 性 厌 氧

89 (4) 如 何 初 步 判 定 一 种 细 菌 是 否 运 动 (5) 理 化 因 素 ( 如 温 度 ph 紫 外 线 抗 生 素 等 ) 对 微 生 物 生 长 的 影 响 5. 免 疫 学 测 定 (1) 凝 集 反 应 的 原 理 和 方 法 (2) 沉 淀 反 应 的 原 理 和 方 法 (3) 如 何 用 免 疫 学 方 法 检 测 螺 旋 体 等 病 原 菌 的 存 在? 6. 其 他 (1) 抗 生 素 效 价 的 测 定 ( 原 理 和 方 法 ) (2) 噬 菌 体 效 价 的 测 定 ( 原 理 和 方 法 ) (3) 水 体 中 大 肠 菌 群 的 检 测 方 法 (4) 细 菌 转 导 频 率 的 检 测 方 法 ( 二 ) 检 测 方 式 教 师 按 上 述 测 评 内 容 和 要 求, 事 先 搭 配 好 分 组 出 好 题, 到 考 试 时 由 学 生 抽 取 考 题 3 个 ( 第 1 部 分 1 题, 第 2 部 分 1 题, 第 3 部 分 1 题 ), 在 教 师 面 前 当 场 回 答 完 成, 教 师 当 场 评 定 打 分 ( 三 ) 评 定 标 准 1. 熟 练 完 成 操 作, 正 确 回 答 原 理, 能 迅 速 判 断 微 生 物 形 态 及 结 构 ( 优 ) 2. 正 确 回 答 原 理, 操 作 正 确, 能 判 断 微 生 物 形 态 及 结 构 ( 良 ) 3. 基 本 正 确 地 回 答 原 理, 操 作 正 确, 能 判 断 微 生 物 形 态 及 结 构 ( 中 ) 4. 能 基 本 正 确 回 答 原 理, 操 作 不 够 熟 练, 但 基 本 正 确, 微 生 物 形 态 和 结 构 的 判 断 不 够 准 确 ( 及 格 ) 5. 未 达 到 以 上 的 最 起 码 要 求 者 为 不 及 格, 不 及 格 者 可 通 过 复 习 要 求 重 考 ( 四 ) 注 意 间 题 1. 要 当 场 完 成, 不 能 换 考 题 2. 要 给 学 生 准 备 考 题 的 时 间 3. 学 生 单 独 操 作 考 试, 与 其 他 学 生 分 开 4. 当 场 评 分 实 验 30 实 验 设 计 及 实 施 能 力 的 测 评 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 了 解 学 生 对 实 验 的 知 识 内 容 的 灵 活 应 用 能 力 内 容 :1. 分 析 实 验 设 计 2. 学 生 自 行 设 计 实 验 3. 学 生 独 立 完 成 自 行 设 计 的 实 验, 并 基 本 达 到 预 期 结 果 二 学 会 进 行 实 验 设 计 ( 一 ) 实 验 设 计 的 基 本 要 求 1. 写 出 实 验 目 的 相 基 本 原 理 2. 写 出 实 验 的 基 本 要 求 3. 详 细 写 出 实 验 的 每 一 个 步 骤 和 注 意 问 题 ( 二 ) 考 试 前 的 准 备 指 导 学 生 选 定 实 验 题 目, 或 由 老 师 指 定 题 目, 提 供 参 考 书 目 ( 三 ) 考 试 方 式 学 生 在 规 定 时 间 内 递 交 实 验 设 计 ( 四 ) 评 分 标 准 1. 具 有 科 学 性 和 可 行 性, 有 一 定 创 新 ( 优 ) 2. 无 科 学 性 错 误, 设 计 不 够 细 致, 基 本 可 行 ( 良 ) 3. 无 明 显 科 学 性 错 误, 设 计 有 部 分 不 够 合 理 ( 中 ) 4. 无 明 显 科 学 性 错 误, 设 计 不 够 合 理 ( 及 格 ) 5. 有 明 显 科 学 性 错 误, 设 计 不 合 理 ( 不 及 格 ) 三 自 行 设 计 实 验 独 立 完 成 的 考 核

90 ( 一 ) 考 前 准 备 1. 教 师 帮 助 学 生 修 改 和 完 善 实 验 设 计 2. 为 学 生 提 供 必 要 的 仪 器 药 品 ( 二 ) 考 试 方 式 在 一 定 时 间 里, 实 验 室 开 放, 学 生 在 规 定 时 间 内, 将 实 验 设 计 完 成, 并 提 交 实 验 报 告 ( 三 ) 评 分 标 准 1. 顺 利 完 成 实 验, 得 到 合 理 结 果, 实 验 中 操 作 正 确, 熟 练 ( 优 ) 2. 完 成 实 验, 得 到 较 合 理 结 果, 实 验 中 操 作 正 确 ( 良 ) 3. 完 成 实 验, 得 到 较 合 理 结 果, 实 验 操 作 基 本 正 确 ( 中 ) 4. 完 成 实 验, 末 得 到 合 理 结 果, 实 验 操 作 基 本 正 确 ( 及 格 ) 5. 未 得 到 合 理 结 果, 末 完 成 实 验, 实 验 中 操 作 不 熟 练, 不 正 确 ( 不 及 格 ) ( 四 ) 注 意 事 项 1. 注 意 实 验 室 安 全, 老 师 要 现 场 监 督 和 检 查 2. 如 果 条 件 不 允 许 单 个 学 生 完 成 考 试 实 验, 可 分 组 进 行 附 录 : 险 情 火 险 酒 精 乙 醚 或 汽 油 等 着 火 附 录 1 实 验 室 意 外 事 故 的 处 理 紧 急 处 理 立 刻 关 闭 电 门 煤 气, 使 用 灭 火 器, 沙 土 和 湿 布 灭 火 使 用 灭 火 器 或 沙 土 或 湿 布 覆 盖, 慎 勿 以 水 灭 火 衣 服 着 火 破 伤 火 伤 灼 伤 强 酸 溴 氯 磷 等 酸 性 药 品 的 灼 伤 强 碱 氢 氧 化 钠 金 属 钠 钾 等 碱 性 药 品 的 灼 伤 石 炭 酸 灼 伤 眼 灼 伤 眼 为 碱 伤 可 就 地 或 靠 墙 滚 转 先 除 尽 外 物, 用 蒸 馏 水 洗 净, 涂 以 碘 酒 或 红 汞 可 涂 5% 鞣 酸 2% 苦 味 酸 或 苦 味 酸 铵 茉 甲 酸 丁 酯 油 膏, 或 龙 胆 紫 液 等 先 以 大 量 清 水 冲 洗, 再 用 5% 重 碳 酸 钠 或 氢 氧 化 铵 溶 液 擦 洗 以 中 和 酸 先 以 大 量 清 水 冲 洗, 再 用 5% 硼 酸 溶 液 或 醋 酸 冲 洗 以 中 和 碱 以 浓 酒 精 擦 洗 先 以 大 量 清 水 冲 洗 以 5% 硼 酸 溶 液 冲 洗 然 后 于 滴 入 橄 榄 油 或 液 体 石 蜡 1 2 滴 以 滋 润 之 以 5% 重 碳 酸 钠 溶 液 冲 洗, 然 后 再 滴 入 橄 榄 油 或 液 体 石 蜡 1 2 滴 以 滋 润 之 眼 为 酸 伤 食 入 腐 蚀 性 物 质 食 入 酸 食 入 碱 立 即 以 大 量 清 水 漱 口, 并 服 镁 乳 或 牛 乳 等, 勿 服 催 吐 药 立 即 以 大 量 清 水 漱 口, 并 服 5% 醋 酸 食 蜡 柠 檬 汁 或 油 类 脂 肪 用 40% 乙 醇 漱 口, 并 喝 大 量 烧 酒, 再 服 用 催 吐 剂 使 其 吐 出 食 入 石 炭 酸 或 来 苏 水 吸 入 菌 液 立 即 大 量 清 水 漱 口, 再 以 1:1000 高 锰 酸 钾 溶 液 漱 口 吸 入 非 致 病 性 菌 液 吸 入 致 病 性 菌 液 吸 入 葡 萄 球 菌 链 球 菌 肺 炎 球 菌 液 立 即 以 大 量 热 水 漱 口, 再 以 消 毒 液 1:5000 米 他 芬,3% 过 氧 化 氢 或 1: 1000 高 锰 酸 钾 溶 液 漱 口 经 上 法 处 理 后, 并 注 射 1000 单 位 的 白 喉 抗 毒 素 以 预 防 经 上 法 处 理 后, 并 注 射 疫 菌 及 抗 生 素 以 预 防 患 病 吸 入 白 喉 菌 液 吸 入 伤 寒 霍 乱 痢 疾 布 氏 等 菌 液

91 附 录 2 实 验 用 培 养 基 配 制 1. 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 ( 用 于 细 菌 培 养 ) 牛 肉 膏 3g, 蛋 白 胨 10g,NaCl 5g, 水 1000mL, ph7.4~ 高 氏 1 号 培 养 基 ( 用 于 放 线 菌 培 养 ) 可 溶 性 淀 粉 20g, KNO 3 1g, NaCl 0.5g, K 2 HPO 4-3H 2 O 0.5g, MgSO 4 7H 2 O 0.5g, FeSO4 7H 2 O 0.01g, 水 1000mL, ph7.4~7.6 配 制 时 注 意, 可 溶 性 淀 粉 要 先 用 冷 水 调 匀 后 再 加 入 到 以 上 培 养 基 中 3. 马 丁 氏 (Martin) 培 养 基 ( 用 于 从 土 壤 中 分 离 真 菌 )K 2 HPO 4 1g, MgSO 4 7H 2 O 0.5g, 蛋 白 胨 5g, 葡 萄 糖 10g, 1/3000 孟 加 拉 红 水 溶 液 100mL, 水 900mL, 自 然 ph, 121 湿 热 灭 菌 30min. 待 培 养 基 融 化 后 冷 却 55~60 时 加 入 链 霉 素 ( 链 霉 素 含 量 为 30μg/mL). 4. 马 铃 薯 培 养 基 (PDA)( 用 于 霉 菌 或 酵 母 菌 培 养 ) 马 铃 薯 ( 去 皮 )200g, 蔗 糖 ( 或 葡 萄 糖 ) 20g, 水 1000mL, 配 制 方 法 如 下 : 将 马 铃 署 去 皮, 切 成 约 2cm 2 的 小 块, 放 入 1500mL 的 烧 杯 中 煮 沸 30min, 注 意 用 玻 棒 搅 拌 以 防 糊 底, 然 后 用 双 层 纱 布 过 滤, 取 其 滤 液 加 糖, 再 补 足 至 1000mL, 自 然 ph. 霉 菌 用 蔗 糖, 酵 母 菌 用 葡 萄 糖. 5. 察 氏 培 养 基 ( 蔗 糖 硝 酸 钠 培 养 基 )( 用 于 霉 菌 培 养 ) 蔗 糖 30g, NaNO 3 2g, K 2 HPO 4 1g, MgSO 4 7H 2 O 0.5g, KCl 0.5g, FeSO4 7H 2 O 0.1g, 水 1000mL, ph7.0~ Hayflik 培 养 基 ( 用 于 支 原 体 培 养 ) 牛 心 消 化 液 ( 或 浸 出 液 )1000mL, 蛋 白 胨 10g, NaCl 5g, 琼 脂 15g, ph7.8~8.0, 分 装 每 瓶 70mL, 121 湿 热 灭 菌 15min, 待 冷 却 至 80 左 右, 每 70mL 中 加 入 马 血 清 20mL,25% 鲜 酵 母 浸 出 液 10mL, 15 醋 酸 铊 水 溶 液 2.5mL, 青 霉 素 G 钾 盐 水 溶 液 (20 万 单 位 以 上 )0.5mL, 以 上 混 合 后 倾 注 平 板. 注 意 : 醋 酸 铊 是 极 毒 的 药 品, 需 特 别 注 意 安 全 操 作. 7. 麦 氏 (McCLary) 培 养 基 ( 醋 酸 钠 培 养 基 ) 葡 萄 糖 0.1g, KCl 0.18g, 酵 母 膏 0.25g, 醋 酸 钠 0.82g, 琼 脂 l.5g, 蒸 馏 水 l00ml 溶 解 后 分 装 试 管,1l5 湿 热 灭 菌 15min 8. 葡 萄 糖 蛋 白 胨 水 培 养 基 ( 用 于 V.P. 反 应 和 甲 基 红 试 验 ) 蛋 白 胨 0.5g, 葡 萄 糖 0.5g, K 2 HPO 4 0.2g, 水 100mL, ph7.2, 1l5 湿 热 灭 菌 20min 9. 蛋 白 胨 水 培 养 基 ( 用 于 吲 哚 试 验 ) 蛋 白 胨 10g, NaCl 5g, 水 1000mL,pH7.2~7.4, 121 湿 热 灭 菌 20min 10. 糖 发 酵 培 养 基 ( 用 于 细 菌 糖 发 酵 试 验 ) 蛋 白 胨 0.2g, NaCl 0.5g, K 2 HPO g, 水 100mL, 溴 麝 香 草 酚 蓝 (1% 水 溶 液 ) 0.3mL, 糖 类 lg 分 别 称 取 蛋 白 胨 和 NaCl 溶 于 热 水 中, 调 ph 至 7.4, 再 加 入 溴 麝 香 草 酚 蓝 ( 先 用 少 量 95% 乙 醇 溶 解 后, 再 加 水 配 成 1% 水 溶 液 ), 加 入 糖 类, 分 装 试 管, 装 量 4~5cm 高, 并 倒 放 入 一 杜 氏 小 管 ( 管 口 向 下, 管 内 充 满 培 养 液 ) 115 湿 热 灭 菌 20min 灭 菌 时 注 意 适 当 延 长 煮 沸 时 间, 尽 量 把 冷 空 气 排 尽 以 使 杜 氏 小 管 内 不 残 存 气 泡 常 用 的 糖 类, 如 葡 萄 糖 蔗 糖 甘 露 糖 麦 芽 糖 乳 糖 半 乳 糖 等 ( 后 两 种 糖 的 用 量 常 加 大 为 1.5%) 11. RCM 培 养 基 ( 强 化 梭 菌 培 养 基 ) ( 用 于 厌 氧 菌 培 养 ) 酵 母 膏 3g, 牛 肉 膏 l0g, 蛋 白 胨 10g, 可 溶 性 淀 粉 lg, 葡 萄 糖 5g, 半 胱 氨 酸 盐 酸 盐 0.5g,NaCl 3g,NaAc 3g, 水 l000ml, ph8.5, 刃 天 青 3mg/L, l2l 湿 热 灭 菌 30min 12. TYA 培 养 基 ( 用 于 厌 氧 菌 培 养 ) 葡 萄 糖 40g, 牛 肉 膏 2g, 酵 母 膏 2g, 胰 蛋 白 胨 (bacto-typetone)6g, 醋 酸 铵 3g, KH 2 PO 4 0.5g,MgSO 4 7H 2 O 0.2g,FeSO 4 7H 2 O 0.01g, 水 1000mL, ph6.5, 121 湿 热 灭 菌 30min 13. 玉 米 醪 培 养 基 ( 用 于 厌 氧 菌 培 养 ) 玉 米 粉 65g, 自 来 水 1000mL, 混 匀, 煮 10min 成 糊 状, 自 然 ph, 121 湿 热 灭 菌 30min 14. 中 性 红 培 养 基 ( 用 于 厌 氧 菌 培 养 ) 葡 萄 糖 40g, 胰 蛋 白 胨 6g, 酵 母 膏 2g, 牛 肉 膏 2g, 醋 酸 铵 3g, KH 2 PO 4 5g, 中 性 红 0.2g, MgSO 4 7H 2 O 0.2g,FeSO 4 7H 2 O 0.01g, 水 1000ml, ph6.2, 121 湿 热 灭 菌 30min 15.CaCO 3 明 胶 麦 芽 汁 培 养 基 ( 用 于 厌 氧 菌 培 养 ) 麦 芽 汁 (6 波 美 )1000mL, 水 1000mL, CaCO 3 10g, 明 胶 10g,pH6.8, 121 湿 热 灭 菌 30min 16.BCG 牛 乳 培 养 基 ( 用 于 乳 酸 发 酵 )(A) 溶 液 : 脱 脂 乳 粉 100g, 水 500mL, 加 入 1.6% 溴 甲 酚 绿 (B.C.G) 乙 醇 溶 液 1mL,80 灭 菌 20min (B) 溶 液 : 酵 母 膏 10g, 水 500mL, 琼 脂 20g, ph6.8, 121 湿 热 灭 菌 20min 以 无 菌 操 作 趁 热 将 (A) (B) 溶 液 混 合 均 匀 后 倒 平 板 17. 乳 酸 菌 培 养 基 ( 用 于 乳 酸 发 酵 ) 牛 肉 膏 5g, 酵 母 膏 5g, 蛋 白 胨 10g, 葡 萄 糖 10g, 乳 糖 5g, NaCl 5g, 水 1000mL, ph6.8, 121 湿 热 灭 菌 20min

92 18. 酒 精 发 酵 培 养 基 ( 用 于 酒 精 发 酵 ) 蔗 糖 10g, MgSO 4 7H 2 O 0.5g, NH 4 NO 3 0.5g, 20% 豆 芽 汁 2mL, KH 2 PO 4 0.5g, 水 100mL, 自 然 ph 19. 柯 索 夫 培 养 基 ( 用 于 钩 端 螺 旋 体 培 养 ) 优 质 蛋 白 胨 0.4g, NaCl 0.7g, KCl 0.02g, Na HCO g,CaCl 0.02g, KH 2 PO g, NaH 2 PO g, 蒸 馏 水 500 ml, 无 菌 兔 血 清 40mL 制 法 : 除 兔 血 清 外 的 其 余 各 成 分 混 合, 加 热 溶 解, 调 ph 至 7.2, 121 湿 热 灭 菌 20min, 待 冷 却 后, 加 入 无 菌 兔 血 清, 制 成 8% 血 清 溶 液, 然 后 分 装 试 管 (5~10mL/ 管 ), 56 水 浴 灭 活 lh 后 备 用 20. 豆 芽 汁 培 养 基 黄 豆 芽 500g, 加 水 1000mL, 煮 沸 lh, 过 滤 后 补 足 水 分,121 湿 热 灭 菌 后 存 放 备 用, 此 即 为 50% 的 豆 芽 汁, 用 于 细 菌 培 养 :10% 豆 芽 汁 200mL, 葡 萄 糖 ( 或 蔗 糖 )50g, 水 800mL, ph7.2~7.4 用 于 霉 菌 或 酵 母 菌 培 养 :10% 豆 芽 汁 200mL, 糖 50g, 水 800mL, 自 然 ph 霉 菌 用 蔗 糖, 酵 母 菌 用 葡 萄 糖 21.LB(Luria Bertani) 培 养 基 ( 细 菌 培 养, 常 在 分 子 生 物 学 中 应 用 ) 双 蒸 馏 水 950mL, 胰 蛋 白 胨 l0g, NaCl l0g, 酵 母 提 取 物 (bacto- yeast extract)5g, 用 lmol/l NaOH ( 约 l ml) 调 节 ph 值 至 7.0, 加 双 蒸 馏 水 至 总 体 积 为 1L,121 湿 热 灭 菌 30min 含 氨 苄 青 霉 素 LB 培 养 基 : 待 LB 培 养 基 灭 菌 后 冷 至 50 左 右 加 入 抗 生 素, 至 终 浓 度 为 80~100mg/L 22. 复 红 亚 硫 酸 钠 培 养 基 ( 远 藤 氏 培 养 基 ) ( 用 于 水 体 中 大 肠 菌 群 测 定 ) 蛋 白 胨 10g, 牛 肉 浸 膏 5g, 酵 母 浸 膏 5g, 琼 脂 20g, 乳 糖 10g, K 2 HPO 4 0.5g, 无 水 亚 硫 酸 钠 5g, 5% 碱 性 复 红 乙 醇 溶 液 20mL, 蒸 馏 水 1000mL 制 作 过 程 : 先 将 蛋 白 胨 牛 肉 浸 膏 酵 母 浸 膏 和 琼 脂 加 入 到 900mL 水 中, 加 热 溶 解, 再 加 入 K 2 PO 4, 溶 解 后 补 充 水 至 l000ml, 调 ph 至 7.2~7.4 随 后 加 入 乳 糖, 混 匀 溶 解 后, 于 115 湿 热 灭 菌 20min 再 称 取 亚 硫 酸 钠 至 一 无 菌 空 试 管 中, 用 少 许 无 菌 水 使 其 溶 解, 在 水 浴 中 煮 沸 10min 后, 立 即 滴 加 于 20mL 5% 碱 性 复 红 乙 醇 溶 液 中, 直 至 深 红 色 转 变 为 淡 粉 红 色 为 止 将 此 混 合 液 全 部 加 入 到 上 述 已 灭 菌 的 并 仍 保 持 融 化 状 态 的 培 养 基 中, 混 匀 后 立 即 倒 平 板, 待 凝 固 后 存 放 冰 箱 备 用, 若 颜 色 由 淡 红 变 为 深 红, 则 不 能 再 用 23. 乳 糖 蛋 白 胨 半 固 体 培 养 基 ( 用 于 水 体 中 大 肠 菌 群 测 定 ) 蛋 白 胨 10g, 牛 肉 浸 膏 5g, 酵 母 膏 5g, 乳 糖 10g, 琼 脂 5g, 蒸 馏 水 1000mL,pH7.2~7.4, 分 装 试 管 (l0ml/ 管 ), 115 湿 热 灭 菌 20min 24. 乳 糖 蛋 白 胨 培 养 液 ( 用 于 多 管 发 酵 法 检 测 水 体 中 大 肠 菌 群 ) 蛋 白 胨 10g, 牛 肉 膏 3g, 乳 糖 5g,NaCl 5g, 蒸 馏 水 l000ml,1.6% 溴 甲 酚 紫 乙 醇 溶 液 lml 调 ph 至 7.2, 分 装 试 管 (l0ml/ 管 ), 并 放 入 倒 置 杜 氏 小 管,l15 湿 热 灭 菌 20min 25. 三 倍 浓 乳 糖 蛋 白 胨 培 养 液 ( 用 于 水 体 中 大 肠 菌 群 测 定 ) 将 乳 糖 蛋 白 胨 培 养 液 中 各 营 养 成 分 以 扩 大 3 倍 加 入 到 l000ml 水 中, 制 法 同 上, 分 装 于 放 有 倒 置 杜 氏 小 管 的 试 管 中, 每 管 5mL,1l5 湿 热 灭 菌 20min 26. 伊 红 美 蓝 培 养 基 (EMB 培 养 基 )( 用 于 水 体 中 大 肠 菌 群 测 定 和 细 菌 转 导 ) 蛋 白 胨 l0g, 乳 糖 10g, K 2 HPO 4 2g, 琼 脂 25g, 2%/ 伊 红 Y( 曙 红 ) 水 溶 液 20mL, 0.5% 美 蓝 ( 亚 甲 蓝 ) 水 溶 液 l3ml,ph7.4 制 作 过 程 : 先 将 蛋 白 胨 乳 糖 K 2 HPO 4 和 琼 脂 混 匀, 加 热 溶 解 后, 调 ph 至 7.4, 1l5 湿 热 灭 菌 20min, 然 后 加 入 已 分 别 灭 菌 的 伊 红 液 和 美 蓝 液, 充 分 混 匀, 防 止 产 生 气 泡 待 培 养 基 冷 却 到 50 左 右 倒 平 皿 如 培 养 基 太 热 会 产 生 过 多 的 凝 集 水, 可 在 平 板 凝 固 后 倒 置 存 于 冰 箱 备 用 在 细 菌 转 导 实 验 中 用 半 乳 糖 代 替 乳 糖, 其 余 成 分 不 变 27. 加 倍 肉 汤 培 养 基 ( 用 于 细 菌 转 导 ) 牛 肉 膏 6g, 蛋 白 胨 20g, NaCL 10g, 水 1000mL, ph7.4~ 半 固 体 素 琼 脂 ( 用 于 细 菌 转 导 ) 琼 脂 1g, 水 100mL, 121 湿 热 灭 菌 30min 29. 豆 饼 斜 面 培 养 基 ( 用 于 产 蛋 白 酶 霉 菌 菌 株 筛 选 ): 豆 饼 100g 加 水 5~6 倍, 煮 出 滤 汁 100mL, 汁 内 加 入 KH 2 PO 4 0.1%, MgSO %, (NH 4 ) 2 SO %, 可 溶 性 淀 粉 2%, ph6, 琼 脂 2%~2.5% 30. 酪 素 培 养 基 ( 用 于 蛋 白 酶 菌 株 筛 选 ) 分 别 配 制 A 液 和 B 液 A 液 : 称 取 Na 2 HPO 4 7H 2 O 1.07g 干 酪 素 4g, 加 适 量 蒸 馏 水, 并 加 热 溶 解 B 液 : 称 取 KH 2 PO g, 加 水 溶 解 A B 液 混 合 后, 加 入 酪 素 水 解 液 0.3 ml, 加 琼 脂 20g, 最 后 用 蒸 馏 水 定 容 至 1000mL

93 酪 素 水 解 液 的 配 制 :1g 酪 蛋 白 溶 于 碱 性 缓 冲 液 中, 加 入 1% 的 枯 草 芽 孢 杆 菌 蛋 白 酶 25mL 加 水 至 100mL, 30 水 解 lh 用 于 配 制 培 养 基 时, 其 用 量 为 1000mL 培 养 基 中 加 入 100mL 以 上 水 解 液 31. 细 菌 基 本 培 养 基 ( 用 于 筛 选 营 养 缺 陷 型 ) Na 2 HPO 4 7H 2 O 1g,MgSO 4 7H 2 O 0.2g, 葡 萄 糖 5g, NaCl 5g, K 2 HPO 4 lg, 水 l000ml, ph7.0, 1l5 湿 热 灭 菌 30min 32. YEPD 培 养 基 ( 用 于 酵 母 原 生 质 体 融 合 ) 酵 母 粉 10g, 蛋 白 胨 20g, 葡 萄 糖 20g, 蒸 馏 水 1000mL, ph6.0,115 湿 热 灭 菌 20min 33. YEPD 高 渗 培 养 基 ( 用 于 酵 母 原 生 质 体 融 合 ) 在 YEPD 培 养 基 中 加 入 0.6mol/L 的 NaCL, 3% 琼 脂 34. YNB 基 本 培 养 基 ( 用 于 酵 母 原 生 质 体 融 合 ) 0.67% 酵 母 氮 碱 基 (YNB, 不 含 氨 基 酸, Difco), 2% 葡 萄 糖,3% 琼 脂,pH6.2 另 一 配 方 为 : 葡 萄 糖 10g (NH 4 ) 2 SO 4 1g,K 2 HPO g, KHPO g, KI g,MgSO 4 7H 2 O 0.5g, CaCl 2 2H 2 O 0.lg, NaCl0.1g, 维 量 元 素 母 液 lml, 维 生 素 母 液 lml( 母 液 均 按 常 规 配 制 ), 水 1000mL, ph5.8~ YNB 高 渗 基 本 培 养 基 ( 用 于 原 生 质 体 融 合 ) 在 YNB 基 本 培 养 基 中 加 入 0.6mol/LNaCl 36. 酚 红 半 固 体 柱 状 培 养 基 ( 用 于 检 查 氧 与 菌 生 长 的 关 系 ) 蛋 白 胨 1g, 葡 萄 糖 10g, 玉 米 浆 10g, 琼 脂 7g, 水 1000mL, ph7.2 在 调 好 ph 后, 加 入 1.6% 酚 红 溶 液 数 滴, 至 培 养 基 变 为 深 红 色, 分 装 于 大 试 管 中, 装 量 约 为 试 管 高 度 的 1/2,1l5 灭 菌 20min 细 菌 在 此 培 养 基 中 利 用 葡 萄 糖 生 长 产 酸, 使 酚 红 从 红 色 变 成 黄 色, 在 不 同 部 位 生 长 的 细 菌, 可 使 培 养 基 的 相 应 部 位 颜 色 改 变 但 注 意 培 养 时 间 太 长, 酸 可 扩 散 以 致 不 能 正 确 判 断 结 果 以 上 各 种 培 养 基 均 可 配 制 成 固 体 或 半 固 体 状 态, 只 需 改 变 琼 脂 用 量 即 可, 前 者 为 1.5%~ 2.0%, 后 者 为 0.3%~0.8% 中 文 名 称 英 文 名 称 应 加 的 NaOH/mL* 附 录 3 酸 碱 指 示 剂 的 配 制 ( 按 笔 画 顺 序 排 列 ) 酸 性 颜 色 碱 性 颜 色 ph 范 围 甲 基 红 methyl red 37.0 红 黄 4.2~6.3 甲 酚 红 cresol red 26.2 黄 红 7.2~8.8 甲 酚 红 cresol red 0.1% 乙 醇 (90%) 红 黄 0.2~1.8 间 甲 酚 紫 ( 酸 域 ) 间 甲 酚 紫 ( 碱 域 ) meta-creso purple 26.2 红 黄 1.2~2.8 meta-cresol purple 26.2 黄 紫 7.4~9.0 茜 素 黄 -R alizarin yellow-r 0.1% 水 溶 液 黄 红 10.1~12.0 氯 酚 红 chlorophenol red 23.6 黄 红 4.8~6.4 溴 酚 蓝 bromophenol blue 14.9 黄 蓝 3.0~4.6 溴 酚 红 bromophenol red 19.5 黄 红 5.2~6.8 溴 甲 酚 绿 bromecresol green 14.3 黄 红 3.8~5.4 溴 甲 酚 紫 bromoocresol purple 18.5 黄 紫 5.2~6.8 溴 麝 香 草 酚 蓝 bromothymol boue 16.0 黄 蓝 6.0~7.6 酚 红 Phenol red 28.2 黄 红 6.8~8.4 酚 酞 Phenolphthalein 1% 乙 醇 (90%) 无 色 红 8.2~9.8 麝 香 草 酚 蓝 ( 碱 域 ) 麝 香 草 酚 蓝 ( 酸 域 ) thymol blue 21.5 黄 蓝 8.0~9.6 thymol blue 21.5 红 黄 1.2~2.8

94 麝 香 草 酚 酞 ( 百 里 酚 酞 ) thymol-phthalein 0.1% 乙 醇 (90%) 无 色 蓝 9.3~10.5 * 精 确 称 取 指 示 剂 粉 末 0.1g, 移 至 研 钵 中, 按 上 表 分 数 次 加 入 0.01mol/L NaOH 溶 液, 仔 细 研 磨 直 至 溶 解 为 止, 最 终 用 蒸 馏 水 稀 释 至 250mL, 从 而 配 成 0.04% 指 示 剂 溶 液 但 甲 基 红 及 酚 红 溶 液 应 稀 释 至 500mL, 故 最 终 浓 度 为 0.02%. 附 录 4 实 验 用 染 色 液 及 试 剂 的 配 制 ( 一 ) 实 验 用 染 色 液 的 配 制 1. 黑 色 素 液 水 溶 性 黑 素 10g, 蒸 馏 水 100mL, 甲 醛 ( 福 尔 马 林 )0.5mL 可 用 作 荚 膜 的 背 景 染 色 2. 墨 汁 染 色 液 国 产 绘 图 墨 汁 40mL, 甘 油 2mL, 液 体 石 炭 酸 2mL 先 将 墨 汁 用 多 层 纱 布 过 滤, 加 甘 油 混 匀 后, 水 浴 加 热, 再 加 石 炭 酸 搅 匀, 冷 却 后 备 用 用 作 荚 膜 的 背 景 染 色 3. 吕 氏 (Loeffier) 美 蓝 染 色 液 A 液 : 美 蓝 (methylene blue, 又 名 甲 烯 蓝 )0.3g, 95% 乙 醇 30mL; B 液 :0.0l% KOH l00ml 混 合 A 液 和 B 液 即 成, 用 于 细 菌 单 染 色, 可 长 期 保 存 根 据 需 要 可 配 制 成 稀 释 美 蓝 液, 按 1:10 或 1:100 稀 释 均 可 4. 革 兰 氏 染 色 液 (1) 结 晶 紫 (crystal violet) 液 : 结 晶 紫 乙 醇 饱 和 液 ( 结 晶 紫 2g 溶 于 20mL95% 乙 醇 中 )20mL, 1% 草 酸 铵 水 溶 液 80mL 将 两 液 混 匀 置 24h 后 过 滤 即 成 此 液 不 易 保 存, 如 有 沉 淀 出 现, 需 重 新 配 制 (2) 卢 戈 (Lugol) 氏 碘 液 : 碘 1g, 碘 化 钾 2g, 蒸 馏 水 300mL 先 将 碘 化 钾 溶 于 少 量 蒸 馏 水 中, 然 后 加 入 碘 使 之 完 全 溶 解, 再 加 蒸 馏 水 至 300mL 即 成 配 成 后 贮 于 棕 色 瓶 内 备 用, 如 变 为 浅 黄 色 即 不 能 使 用 (3)95% 乙 醇 : 用 于 脱 色, 脱 色 后 可 选 用 以 下 (4) 或 (5) 的 其 中 一 项 复 染 即 可 (4) 稀 释 石 炭 酸 复 红 溶 液 : 碱 性 复 红 乙 醇 饱 和 液 ( 碱 性 复 红 1g, 95% 乙 醇 l0ml, 5% 石 炭 酸 90mL 混 合 溶 解 即 成 碱 性 复 红 乙 醇 饱 和 液 ), 取 石 炭 酸 复 红 饱 和 液 l0ml 加 蒸 馏 水 90mL 即 成 (5) 番 红 溶 液 : 番 红 O(safranine, 又 称 沙 黄 O)2.5g, 95% 乙 醇 100mL, 溶 解 后 可 贮 存 于 密 闭 的 棕 色 瓶 中, 用 时 取 20mL 与 80mL 蒸 馏 水 混 匀 即 可 以 上 染 液 配 合 使 用, 可 区 分 出 革 兰 氏 染 色 阳 性 (G + ) 或 阴 性 (G - ) 细 菌,G - 被 染 成 蓝 紫 色, G + 被 染 成 淡 红 色 5. 鞭 毛 染 色 液 A 液 : 丹 宁 酸 5.0g, FeCl 3 1.5g,15% 甲 醛 ( 福 尔 马 林 )2.0mL,l%NaOH 1.0mL, 蒸 馏 水 l00ml; B 液 :AgNO 3 2.0g, 蒸 馏 水 100mL 待 AgNO 3 溶 解 后, 取 出 l0ml 备 用, 向 其 余 的 90mLAgNO 3 中 滴 加 NH 4 OH, 即 可 形 成 很 厚 的 沉 淀, 继 续 滴 加 NH 4 OH 至 沉 淀 刚 刚 溶 解 成 为 澄 清 溶 液 为 止, 再 将 备 用 的 AgNO 3 慢 慢 滴 入, 则 溶 液 出 现 薄 雾, 但 轻 轻 摇 动 后, 薄 雾 状 的 沉 淀 又 消 失, 继 续 滴 入 AgNO 3, 直 到 摇 动 后 仍 呈 现 轻 微 而 稳 定 的 薄 雾 状 沉 淀 为 止, 如 雾 重, 说 明 银 盐 沉 淀 出, 不 宜 再 用 通 常 在 配 制 当 天 便 用, 次 日 效 果 欠 佳, 第 3 天 则 不 能 使 用 % 沙 黄 (Safranine) 液 :2.5% 沙 黄 乙 醇 液 20mL, 蒸 馏 水 80mL 将 2.5% 沙 黄 乙 醇 液 作 为 母 液 保 存 于 不 透 气 的 棕 色 瓶 中, 使 用 时 再 稀 释 7. 5% 孔 雀 绿 水 溶 液 : 孔 雀 绿 5.0g, 蒸 馏 水 100mL % 碱 性 复 红 : 碱 性 复 红 0.05g,95% 乙 醇 100mL 9. 齐 氏 (Ziehl) 石 炭 酸 复 红 液 : 碱 性 复 红 0.3g 溶 于 95% 乙 醇 l0ml 中 为 A 液 :0.01%KOH 溶 液 l00ml 为 B 液 混 合 A B 液 即 成 10. 姬 姆 萨 (Giemsa) 染 液 (1) 贮 存 液 : 称 取 姬 姆 萨 粉 0.5g, 甘 油 33mL, 甲 醇 33mL 先 将 姬 姆 萨 粉 研 细, 再 逐 滴 加 入 甘 油, 继 续 研 磨, 最 后 加 入 甲 醇, 在 56 放 置 1~24h 后 即 可 使 用 (2) 应 用 液 ( 临 用 时 配 制 ): 取 1mL 贮 存 液 加 19mL ph7.4 磷 酸 缓 冲 液 即 成 亦 可 取 贮 存 液 : 甲 醇 =1:4 的 比 例 配 制 成 染 色 液 11. 乳 酸 石 炭 酸 棉 蓝 染 色 液 ( 用 于 真 菌 固 定 和 染 色 ) 石 炭 酸 ( 结 晶 酚 )20g, 乳 酸 20mL,

95 甘 油 40mL, 棉 蓝 0.05g, 蒸 馏 水 20mL 将 棉 蓝 溶 于 蒸 馏 水 中, 再 加 入 其 他 成 分, 微 加 热 使 其 溶 解, 冷 却 后 用 滴 少 量 染 液 于 真 菌 涂 片 上, 加 上 盖 玻 片 即 可 观 察 霉 菌 菌 丝 和 孢 子 均 可 染 成 蓝 色 染 色 后 的 标 本 可 用 树 脂 封 固, 能 长 期 保 存 12. 1% 瑞 氏 (Wright s) 染 色 液 : 称 取 瑞 氏 染 色 粉 6g, 放 研 钵 内 磨 细, 不 断 滴 加 甲 醇 ( 共 600mL) 并 继 续 研 磨 使 溶 解 经 过 滤 后 染 液 须 贮 存 一 年 以 上 才 可 使 用, 保 存 时 间 愈 入, 则 染 色 色 泽 愈 佳 13. 阿 氏 (Albert) 异 染 粒 染 色 液 : A 液 : 甲 苯 胺 蓝 (toluidine blue)0.15g, 孔 雀 绿 0.2g, 冰 醋 酸 lml,95% 乙 醇 2mL, 蒸 馏 水 100mL; B 液 : 碘 2g, 碘 化 钾 3g, 蒸 馏 水 300ml 先 用 A 液 染 色 1min, 倾 去 A 液 后, 用 B 液 冲 去 A 液, 并 染 1min 异 染 粒 呈 黑 色, 其 他 部 分 为 暗 绿 或 浅 绿 ( 二 ) 实 验 用 试 剂 的 配 制 l. 乳 酸 苯 酚 固 定 液 乳 酸 10g, 结 晶 苯 酚 10g, 甘 油 20g, 蒸 馏 水 10 ml % 溴 甲 酚 紫 溴 甲 酚 紫 1.6g 溶 于 100mL 乙 醇 中, 贮 存 于 棕 色 瓶 中 保 存 备 用 用 作 培 养 基 指 示 剂 时, 每 1000mL 培 养 基 中 加 入 lml 1.6% 溴 甲 酚 紫 即 可 3. V.P. 试 剂 CuSO 4 1g, 蒸 馏 水 l0ml, 浓 氨 水 40mL,10% NaOH 950mL 先 将 CuSO 4 溶 于 蒸 馏 水 中, 然 后 加 浓 氨 水, 最 后 加 入 10%NaOH % 甲 基 红 试 剂 甲 基 红 0.1g,95% 乙 醇 760mL, 蒸 馏 水 100mL 5. 吲 哚 反 应 试 剂 对 二 甲 基 氨 基 苯 甲 醛 8g, 95% 乙 醇 760mL, 浓 HCl160mL 6. Alsever s 血 细 胞 保 存 液 葡 萄 糖 2.05g, 柠 橡 酸 钠 0.8g, NaCl 0.42g, 蒸 馏 水 l00ml 以 上 成 分 混 匀 后, 微 加 温 使 其 溶 解 后, 用 柠 檬 酸 调 节 ph 6.1, 分 装 于 三 角 瓶 中 (30~50mL/ 瓶 ), 113 湿 热 灭 菌 15min, 备 用 7. Hank s 液 (l) 贮 存 液 A 液 :(I)NaCl 80g, KCl 4g, MgSO 4 7H 2 O 1g,MgCl 2 6H 2 O 1g, 用 双 蒸 馏 水 定 容 至 450mL:(II)CaCl 2 1.4g ( 或 CaCl 2 2H 2 O 1.85g) 用 双 蒸 馏 水 定 容 至 50mL 将 I 和 II 液 混 合, 加 氯 仿 1mL 即 成 A 液 (2) 贮 存 液 B 液 :Na 2 HPO 4 12H 2 O 1.52g,KH 2 PO 4 0.6g, 酚 红 0.2g, 葡 萄 糖 10g, 用 双 蒸 馏 水 定 容 至 500mL, 然 后 加 氯 仿 1mL, 酚 红 应 先 置 研 钵 内 磨 细, 然 后 按 配 方 顺 序 一 一 溶 解 (3) 应 用 液 : 取 上 述 贮 存 液 的 A 和 B 液 各 25mL, 加 双 蒸 馏 水 定 容 至 450mL,113 湿 热 灭 菌 20min 置 4 下 保 存 使 用 前 用 无 菌 的 3% NaHCO 3 调 至 所 需 ph 注 意 : 药 品 必 须 全 部 用 A.R 试 剂, 并 按 配 方 顺 序 加 入, 用 适 量 双 蒸 馏 水 溶 解, 待 前 一 种 药 品 完 全 溶 解 后 再 加 入 后 一 种 药 品, 最 后 补 足 水 到 总 量 (4)10% 小 牛 血 清 的 Hank s 液 : 小 牛 血 清 必 须 先 经 56 30min 灭 活 后 才 可 使 用, 应 小 瓶 分 装 保 存, 长 期 备 用 用 时 按 10% 用 量 加 至 应 用 液 中 mol/LCaCl 2 溶 液 双 蒸 馏 水 900mL,CaCl 2 11g, 定 容 至 ll, 可 用 孔 径 为 0.22μm 的 滤 器 过 滤 除 菌 或 12l 湿 热 灭 菌 20min mol/L CaCl 2 溶 液 双 蒸 馏 水 900mL,CaCl 2 5.5g, 定 容 至 ll, 可 用 孔 径 为 0.22μ m 的 滤 器 过 滤 除 菌 或 12l 湿 热 灭 菌 20min 10. α 淀 粉 酶 活 力 测 定 试 剂 (1) 碘 原 液 : 称 取 碘 11g, 碘 化 钾 22g, 加 水 溶 解 定 容 至 500mL (2) 标 准 稀 碘 液 : 取 碘 原 液 15mL, 加 碘 化 钾 8g, 定 容 至 500mL (3 ) 比 色 稀 碘 液 : 取 碘 原 液 2mL, 加 碘 化 钾 20g, 定 容 至 500mL (4)2% 可 溶 性 淀 粉 : 称 取 干 燥 可 溶 性 淀 粉 2g, 先 以 少 许 蒸 馏 水 混 合 均 匀, 再 徐 徐 倾 入 煮 沸 的 蒸 馏 水 中, 继 续 煮 沸 2min, 待 冷 却 后 定 容 至 100 ml( 此 液 当 天 配 制 使 用 ) (5) 标 准 糊 精 液 : 称 取 分 析 纯 糊 精 0.3g, 用 少 许 蒸 馏 水 混 匀 后 倾 入 400mL 水 中, 冷 却 后 定 容 至 500mL, 加 入 几 滴 甲 苯 试 剂 防 腐, 冰 箱 保 存 11. ph6.0 磷 酸 氢 二 钠 - 柠 檬 酸 缓 冲 液 称 取 Na 2 HPO 4 12H 2 O 45.23g, 柠 檬 酸 (C 6 H 8 O 7 H 2 0) 8.07g, 加 蒸 馏 水 定 容 至 1000mL lmol/L 磷 酸 缓 冲 液 (ph7.0) 称 取 Na 2 HPO 4 12H 2 O 35.82g, 溶 于 1000mL 蒸 馏 水

96 中, 为 A 液 : 称 取 NaH 2 PO 4 2H 2 O15.605g, 溶 于 l000ml 蒸 馏 水 中, 为 B 液 取 A 液 61mL, B 液 39mL, 可 得 到 100mL 0.lmol/L ph7.0 的 磷 酸 缓 冲 液 13. 测 定 乳 酸 的 试 剂 (l)ph9.0 缓 冲 液 : 在 300mL 容 量 瓶 中 加 入 甘 氨 酸 11.4g, 24%NaOH 2mL, 加 275mL 蒸 馏 水 (2)NAD 溶 液 :NAD 600mg 溶 于 20mL 蒸 馏 水 中 (3)L(+)LDH: 加 5mg L(+)LDH 于 lml 蒸 馏 水 中 (4)D(-)LDH: 加 2mg D(-)LDH 于 lml 蒸 馏 水 中 14. Taq 缓 冲 液 (10 ) Tris-HCl (ph8.4) 100mmol/L,KCl 500mmol/L,MgCl 2 15mmol/L, BSA ( 牛 血 清 清 蛋 白 ) 或 明 胶 lmg/ml 15. dntp 混 合 液 datp 50mmol/L,dCTP 50mmol/L,dGTP 50mmol/L, dttp 50mmol/L 16. 1% 琼 脂 糖 琼 脂 糖 lg, TAE100mL, 100 融 化 后 待 凉 至 40 倒 胶, 胶 厚 度 约 0.4~ TAE Tris 碱 4.84mL, 冰 乙 酸 1.l4mL,0.5mol/L ph8.0 的 EDTA - Na 2 2H 2 O ( 乙 二 胺 四 乙 酸 钠 盐 ) 2mL mol/L EDTA(pH8.0) 在 800mL 蒸 馏 水 中 加 186.lg EDTA, 剧 烈 搅 拌, 用 NaOH 调 ph 至 8.0( 约 20g 颗 粒 ), 定 容 至 ll, 分 装 后 121 湿 热 灭 菌 备 用 19. 硝 酸 盐 还 原 试 剂 (1) 格 里 斯 氏 (Griess) 试 剂 A 液 : 对 氨 基 苯 磺 酸 0.5g, 稀 醋 酸 (10% 左 右 )150mL B 液 :α 萘 胺 0.1g, 蒸 馏 水 20mL, 稀 醋 酸 (10% 左 右 )150 ml (2) 二 苯 胺 试 剂 : 二 苯 胺 0.5g 溶 于 l00ml 浓 硫 酸 中, 用 20 ml 蒸 馏 水 稀 释 在 培 养 液 中 滴 加 A B 液 后 溶 液 如 变 为 粉 红 色 玫 瑰 红 色 橙 色 或 棕 色 等 表 示 有 亚 硝 酸 盐 还 原, 反 应 为 阳 性, 如 无 色 出 现 则 可 加 1~2 滴 二 苯 胺 试 剂 : 如 溶 液 呈 蓝 色 则 表 示 培 养 液 中 仍 存 在 有 硝 酸 盐, 从 而 证 实 该 菌 无 硝 酸 盐 还 原 作 用 : 如 溶 液 不 呈 蓝 色, 则 表 示 形 成 的 亚 硝 酸 盐 已 进 一 步 还 原 成 其 他 物 质, 故 硝 酸 盐 还 原 反 应 仍 为 阳 性 附 录 5 微 生 物 学 实 验 中 一 些 常 用 数 据 表 ( 一 ) 常 用 消 毒 剂 名 称 浓 度 使 用 范 围 注 意 问 题 名 称 浓 度 使 用 范 围 升 汞 甲 醛 ( 福 尔 马 林 ) 来 苏 水 ( 煤 酚 皂 液 ) 新 洁 尔 灭 0.05%~ 0.1% 10mL/ m 3 3%~5% 植 物 组 织 和 虫 体 外 部 消 毒 接 种 室 消 毒 接 种 室 消 毒, 擦 洗 桌 面 及 器 械 0.25% 皮 肤 及 器 皿 消 毒 腐 蚀 金 属 器 皿 用 于 熏 蒸 硫 柳 汞 石 炭 酸 ( 苯 酚 ) 0.01%~ 0.1% 3%~ 5% 杀 菌 力 强 漂 白 粉 2%~ 对 芽 孢 无 效 5% 乙 醇 70%~ 75% 高 锰 酸 0.1% 皮 肤 及 器 应 随 用 随 硫 磺 15g/m 2 生 物 制 品 防 腐, 皮 肤 消 毒 接 种 室 消 毒 ( 喷 雾 ) 器 皿 消 毒 皮 肤 消 毒 皮 肤 消 毒 熏 蒸, 注 意 问 题 多 用 于 抑 菌 杀 菌 力 强 腐 蚀 金 属 伤 皮 肤 对 芽 孢 无 效 腐 蚀

97 钾 皿 消 毒 配 空 气 消 毒 * 生 石 灰 1%~3% 消 毒 地 面 及 排 泄 物 腐 蚀 必 强 *10mL/m 3 加 热 熏 蒸, 或 迅 速 加 入 甲 醛 10 份 高 锰 酸 钾 中, 使 其 产 生 黄 色 浓 烟, 立 即 密 闭 房 间, 熏 蒸 6 24h. 波 尔 度 (Baume) ( 二 ) 比 重 糖 度 换 算 表 比 重 糖 度 (Brix) 波 尔 度 (Baume) 比 重 金 属 糖 度 (Brix) 用 途 气 体 的 干 燥 ( 三 ) 常 用 干 燥 剂 常 用 干 燥 剂 名 称 石 灰, 无 水 CaCl 2, P 2 O 5, 浓 H 2 SO 4,KOH 流 体 的 干 燥 P 2 O 5, 浓 H 2 SO 4, 无 水 CaCl 2, 无 水 K 2 CO 3 KOH, 无 水 Na 2 SO 4, 无 水 MgSO 4, 无 水 CaSO 4, 金 属 钠 干 燥 剂 中 的 吸 水 有 机 溶 剂 蒸 汽 干 燥 酸 性 气 体 的 干 燥 P 2 O 5, 浓 H 2 SO 4, 无 水 CaCl 2, 硅 胶 石 蜡 片 石 灰,KOH,NaOH 碱 性 气 体 的 干 燥 浓 H 2 SO 4,P 2 O 5

98 附 录 6 玻 璃 器 皿 及 玻 片 洗 涤 法 ( 一 ) 玻 片 洗 涤 法 细 菌 染 色 的 玻 片, 必 须 清 洁 无 油, 清 洗 方 法 如 下 : 1. 新 购 置 的 载 片, 先 用 2% 盐 酸 浸 泡 数 小 时, 冲 去 盐 酸 再 放 浓 洗 液 中 浸 泡 过 液, 用 自 来 水 冲 净 洗 液, 浸 泡 在 蒸 馏 水 中 或 擦 干 装 盒 备 用 2. 用 过 的 载 片, 先 用 纸 擦 去 石 蜡 油, 再 放 入 洗 衣 粉 液 中 煮 沸, 稍 冷 后 取 出 逐 个 用 清 水 洗 净, 放 浓 洗 液 中 浸 泡 24h, 控 去 洗 液, 用 自 来 水 冲 洗 蒸 馏 水 浸 泡 3. 用 于 鞭 毛 染 色 的 玻 片, 经 以 上 步 骤 清 洗 后, 应 选 择 表 面 光 滑 无 伤 痕 者, 浸 泡 在 95% 的 乙 醇 中 暂 时 存 放, 用 时 取 出, 用 干 净 纱 布 擦 去 酒 清, 并 经 过 火 焰 微 热, 使 残 余 的 酒 精 挥 发, 再 用 水 滴 检 查, 如 水 滴 均 散 开, 方 可 使 用 4. 洗 净 的 玻 片, 最 好 及 时 使 用, 以 免 空 气 中 飘 浮 的 油 污 沾 染, 长 期 保 存 的 干 净 玻 片, 用 前 应 再 次 洗 涤 后 方 可 使 用 5. 盖 片 使 用 前, 可 用 洗 衣 粉 或 洗 液 浸 泡, 洗 净 后 再 用 95% 乙 醇 浸 泡, 擦 干 备 用, 用 过 的 盖 片 也 应 及 时 洗 净 擦 干 保 存 ( 二 ) 玻 璃 器 皿 洗 涤 法 清 洁 的 玻 璃 器 皿 是 得 到 正 确 实 验 结 果 的 重 要 条 件 之 一, 由 于 实 验 目 的 不 同, 对 各 种 器 皿 的 清 洁 程 度 的 要 求 也 不 同 l. 一 般 玻 璃 器 皿 ( 如 锥 形 瓶 培 养 皿 试 管 等 ) 可 用 毛 刷 及 去 污 粉 或 肥 皂 洗 去 灰 尘 油 垢 无 机 盐 类 等 物 质, 然 后 用 自 来 水 冲 洗 干 净 少 数 实 验 要 求 高 的 器 皿, 可 先 在 洗 液 中 浸 泡 数 10min, 再 用 自 来 水 冲 洗 最 后 用 蒸 馏 水 洗 2~3 次 以 水 在 内 壁 能 均 匀 分 布 成 一 薄 层 而 不 出 现 水 珠, 为 油 垢 除 尽 的 标 准 洗 刷 干 净 的 玻 璃 仪 器 烘 干 备 用 2. 用 过 的 器 皿 应 立 即 洗 刷, 放 置 太 久 会 增 加 洗 刷 的 困 难 染 菌 的 玻 璃 器 皿, 应 先 经 121 高 压 蒸 汽 灭 菌 20~30min 后 取 出, 趁 热 倒 出 容 器 内 之 培 养 物, 再 用 热 肥 皂 洗 刷 干 净, 用 水 冲 洗 带 菌 的 移 液 管 和 毛 细 吸 管, 应 立 即 放 大 5% 的 石 炭 酸 溶 液 中 浸 泡 数 小 时, 先 灭 菌, 然 后 再 用 水 冲 洗, 有 些 实 验, 还 需 要 用 蒸 馏 水 迸 一 步 冲 洗 3. 新 购 置 的 玻 璃 器 皿 含 有 游 离 碱, 一 般 先 用 2% 盐 酸 或 洗 液 浸 泡 数 小 时 后. 再 用 水 冲 洗 干 净, 新 的 载 玻 片 和 盖 玻 片 先 浸 入 肥 皂 水 ( 或 2% 盐 酸 ) 内 lh, 再 用 水 洗 净. 以 软 布 擦 干 后 浸 入 滴 有 少 量 盐 酸 的 95% 乙 醇 中, 保 存 备 用 已 用 过 的 带 有 活 菌 的 载 玻 片 或 盖 玻 片 可 先 浸 在 5% 石 炭 酸 溶 液 中 消 毒, 再 用 水 冲 洗 干 净, 擦 干 后, 浸 入 95% 乙 醇 中 保 存 备 用 ( 三 ) 洗 液 的 配 制 通 常 用 的 洗 液 是 重 铬 酸 钾 ( 或 重 铬 酸 钠 ) 的 硫 酸 溶 液 称 为 铬 酸 洗 液, 其 成 分 是 : 重 铬 酸 钾 60g, 浓 硫 酸 460mL, 水 300mL 配 制 方 法 为 : 重 铬 酸 钾 溶 解 在 温 水 中, 冷 却 后 再 徐 徐 加 大 浓 硫 酸 ( 比 重 为 l..84 左 右 可 以 用 废 硫 酸 ), 配 制 好 的 溶 液 呈 红 色. 并 有 均 匀 的 红 色 小 结 晶, 稀 重 铬 酸 钾 溶 液 可 如 下 配 制 : 重 铬 酸 钾 60g, 浓 硫 酸 60mL, 水 1000mL 铬 酸 洗 液 是 一 种 强 氧 化 剂, 去 污 能 力 很 强 常 用 它 来 洗 去 玻 璃 和 瓷 质 器 皿 的 有 饥 物 质, 切 不 可 用 于 洗 涤 金 属 器 皿 铬 酸 洗 液 加 热 后, 去 污 作 用 更 强, 一 般 可 加 热 到 45~50, 稀 铬 酸 洗 液 可 煮 沸, 洗 液 可 反 复 使 用, 直 到 溶 液 呈 青 褐 色 为 止

99 附 录 7 各 国 主 要 菌 种 保 藏 机 构 单 位 名 称 单 位 缩 写 单 位 名 称 单 位 缩 写 中 国 微 生 物 菌 种 保 藏 管 理 委 员 会 CCCM 中 国 科 学 院 微 生 物 研 究 所 菌 种 保 藏 中 心 中 国 科 学 院 武 汉 病 毒 所 菌 种 保 藏 轻 工 部 食 品 发 酵 工 业 科 学 研 究 所 中 心 卫 生 部 药 品 生 物 检 定 所 中 国 医 学 科 学 院 皮 肤 病 研 究 所 中 国 医 学 科 学 院 病 毒 研 究 所 国 家 医 药 总 局 四 川 抗 生 素 研 究 所 华 北 制 药 厂 抗 生 素 研 究 所 农 业 部 兽 医 药 品 监 察 所 世 界 菌 种 保 藏 联 合 会 WFCC 日 本 微 生 物 菌 种 保 藏 联 合 会 JFCC 美 国 标 准 菌 株 保 藏 中 心 ATCC 北 海 道 大 学 农 学 部 应 用 微 生 物 教 AHU 研 室 美 国 农 业 部 北 方 研 究 利 用 发 展 部 NRRL 东 京 大 学 农 学 部 发 酵 教 研 室 ATU 美 国 农 业 研 究 服 务 处 菌 中 收 藏 馆 ARS 东 京 大 学 应 用 微 生 物 研 究 所 IAM 美 国 Upjohn 公 司 菌 种 保 藏 部 UPJOHN 东 京 大 学 医 学 科 学 研 究 所 IID 加 拿 大 Alberta 大 学 霉 菌 标 本 室 UAMH 东 京 大 学 医 学 院 细 菌 学 教 研 室 MTU 加 拿 大 国 家 科 学 研 究 委 员 会 NRC 大 阪 发 酵 研 究 所 IFO 法 国 典 型 微 生 物 保 藏 中 心 CCTM 广 岛 大 学 工 业 学 部 发 酵 工 业 系 AUT 捷 克 和 斯 洛 伐 克 国 家 菌 保 会 CNCTC 新 西 兰 植 物 病 害 真 菌 保 藏 部 PDDCC 荷 兰 真 菌 中 心 收 藏 所 CBS 德 国 科 赫 研 究 所 RKI 英 国 国 立 典 型 菌 种 收 藏 馆 NCTC 德 国 发 酵 红 叶 研 究 所 微 生 微 生 物 MIG 收 藏 室 英 联 邦 真 菌 研 究 所 CMI 德 国 微 生 物 研 究 所 菌 种 收 藏 室 KIM 英 国 国 立 工 业 细 菌 收 藏 所 NCIB 附 录 8 实 验 用 缩 写 名 称 对 照 表 Ala 丙 氨 酸 alanine Gln 谷 氨 酰 胺 glutamine Arg 精 氨 酸 arginine Glu 谷 氨 酸 glutamic acid Asn 天 冬 酰 胺 asparagine Gly 甘 氨 酸 glycine Asp 天 冬 氨 酸 aspartic acid His 组 氨 酸 histidine BSA 牛 血 清 清 清 蛋 白 bovine serum Ile 异 亮 氨 酸 isoleucine albumin edna 互 补 DNA complementary DNA Leu 亮 氨 酸 leucine Cys 半 胱 氨 酸 cysteine LDH 乳 酸 脱 氢 酶 lactate dehydrogenase datp 脱 氧 腺 苷 三 磷 酸 deoxyadenosine Lys 赖 氨 酸 lysine triphosphate dctp 脱 氧 胞 苷 三 磷 酸 deoxycytidine Met 蛋 氨 酸 ( 甲 硫 氨 酸 )methionine triphosphate dgtp 脱 氧 鸟 苷 三 磷 酸 deoxyguanosine NAD 烟 酰 胺 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸 ( 辅 酶 I) triphosphate dntp 脱 氧 核 苷 三 磷 酸 deoxynucleoside nicotinamide adenine dinucleotide triphosphate

100 dttp 脱 氧 胸 苷 三 磷 酸 deoxythymidine triphosphate DTT 二 硫 苏 糖 醇 dithiothreitol EB(EtBr) 溴 化 乙 锭 ethidium bromide EDTA 乙 二 胺 四 乙 酸 ethylenediamine tetraacetic acid EtOH 乙 醇 ethanol PEG 聚 乙 二 醇 polyethylene glycol Pfu 噬 菌 斑 形 成 单 位 plaque-forming unit Phe 苯 丙 氨 酸 phenylalanine Pro 脯 氨 酸 proline trna 核 蛋 白 体 RNA ribosomal RNA SDS 十 二 烷 基 磺 酸 钠 sodium dodecyl sulfate Ser 丝 氨 酸 serine NADH 还 原 型 烟 酰 胺 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸 ( 还 原 型 辅 酶 I) reduced nicotinamide adenine dinucleotide PAGE 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 Polyacrylamide gel electrophoresis PCR 聚 合 酶 链 式 反 应 polymerase chain reaction TE Tris-EDTA 缓 冲 液 Tris-EDTA buffer Thr 苏 氨 酸 threonine trna 转 移 RNA transfer RNA Trp 色 氨 酸 tryptophan Tyr 酪 氨 酸 tyrosine Val 颉 氨 酸 valine 附 录 9 实 验 常 用 中 英 名 词 对 照 表 EMB 培 养 基 eosin methylene blue medium 发 酵 液 fermentation solution V.P. 试 验 Voges-Proskauer test 四 环 素 tetracycline 三 画 对 流 免 疫 电 泳 counter immuoelectrophoresis 子 囊 ascus ( 复 : asci) 平 板 Plate 子 囊 孢 子 ascospore 平 板 划 线 streak plate 小 梗 sterigma 平 板 菌 落 计 数 法 enumeration by platecount method 干 热 灭 菌 hot oven sterilization 灭 菌 sterilization 干 燥 箱 drying oven 生 长 曲 线 growth curve 马 丁 培 养 基 Martin s medium 甲 基 红 (M.R.) 试 验 Methyl red test 马 铃 薯 葡 萄 糖 培 养 基 Potato extract glucose 目 镜 测 微 尺 Ocular micrometer medium 四 画 石 炭 酸 ( 酚 )Phenol 专 性 厌 氧 菌 obligate anaerobe 立 克 次 氏 体 Rickettsia 中 性 红 neutral red 节 孢 子 arthrospore 分 生 孢 子 conidium( 复 : conidia) 六 画 分 生 孢 子 梗 conidiophore 产 氨 试 验 Production of ammonia test 分 离 isolation 伊 红 美 蓝 培 养 基 eosin methylene blue medium 分 辨 率 ( 清 晰 度 )Resoiving power 划 线 培 养 streak culture (resolution) 双 筒 显 微 镜 biocular microscope 厌 氧 细 菌 anaerobic bacteria 孔 雀 绿 malachite green 厌 氧 培 养 法 anaerobic culture method 巴 斯 德 消 毒 法 Pasteurization 吕 氏 美 蓝 液 Loeffler s methylene blue 支 原 体 mycoplasma 多 粘 菌 素 Polymyxin 无 性 繁 殖 vegetative propagation 好 氧 细 菌 aerobic bacterium( 复 :bacteria) 无 菌 水 sterile water 异 养 微 生 物 heterotrophic microbe 无 菌 移 液 管 sterile pipette 异 染 粒 metachromatic granule 无 菌 操 作 ( 无 菌 技 术 )aseptic technique 有 性 繁 殖 sexual reproduction

101 比 浊 法 turbidimetry 气 生 菌 丝 aerial hypha( 复 :hyphae) 水 浸 法 wet-mount method 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 beef extract peptone medium 计 算 室 counting chamber 五 画 卡 那 霉 素 kanamycin 血 细 胞 计 数 板 haemocytometer 衣 原 体 Chlamydia 负 染 色 negative stain 齐 氏 石 炭 酸 复 红 染 液 Ziehl s carbolfuchsin 七 画 伴 孢 晶 体 parasporal crystal 免 疫 血 清 Immune serum 利 夫 森 氏 鞭 毛 染 色 Leifson s flagella stain 九 画 吲 哚 试 验 indole test 匍 匐 枝 stolon 局 限 性 转 导 specialized transduction 厚 垣 孢 子 chalmydospore 抑 制 剂 indhibitor 垣 酸 teichoic acid 抑 菌 圈 zone of inhibition 复 染 counterstain 抗 生 素 antibiotics 恒 温 箱 incubator 抗 生 素 发 酵 antibotic fermentation 挑 菌 落 colony selection 抗 血 清 antiserum 柠 檬 酸 盐 培 养 基 citrate medium 抗 体 antibody 抗 原 antigen 测 微 尺 micrometer 抗 菌 谱 antibiotic spectrum 相 差 显 微 镜 phase contrast microscope 杜 氏 小 管 Durbam tube 穿 刺 培 养 stab culture 来 苏 尔 lysol 细 晶 紫 crystal violet 沉 淀 反 应 precipitation reaction 耐 氧 细 菌 aerotolerant bacteria 沉 淀 原 precipinogen 荚 膜 染 色 capsule stain 沉 淀 素 precipitin 诱 变 剂 mutagenic agent 纯 化 purification 诱 变 效 应 mutagenic effect 芽 孢 spore 革 兰 氏 阳 性 菌 Gram-positive bacteria, G + 芽 孢 染 色 spore stain 革 兰 氏 阴 性 菌 Gram-negative bacteria, G - 豆 芽 汁 葡 萄 糖 培 养 基 soybean sprout extract 革 兰 氏 染 色 Gram stain glucose medium 阿 须 贝 无 氮 培 养 基 Ashby medium 革 兰 氏 碘 液 Gram s iodine solution 麦 芽 汁 培 养 基 malt extract medium 香 柏 油 cedar oil 八 画 十 画 乳 酸 石 炭 酸 液 lactophenol solution 倾 注 法 pour-plate method 乳 糖 发 酵 lactose fermentation 兼 性 厌 氧 菌 faculative anaerobe 乳 糖 蛋 白 胨 培 养 基 lactose peptone medium 原 生 质 体 protoplast 单 菌 落 single colony 振 荡 培 养 shake culture 单 筒 显 微 镜 monocular microscope 根 瘤 菌 nodule bacteria 固 氮 作 用 nitrogen fixation 氨 苄 青 霉 素 ampicillin 国 际 单 位 制 international system of units, SI 涂 抹 培 养 smearing culture 奈 氏 试 剂 Nessler s reagent 涂 布 器 ( 刮 刀 )scraper 孢 子 囊 sporangium( 复 :sporangia) 清 毒 desomfectopm 孢 子 囊 柄 sporangiophore 消 毒 剂 disinfectant 孢 囊 孢 子 sporangiospore 真 菌 fungi 明 胶 液 化 试 验 gelatin liguefaction test 胰 蛋 白 胨 bacto-tryptone 杯 碟 法 cylinder-plate method 载 片 slide 油 镜 oil immersion 酒 精 发 酵 alcoholic fermentation 物 镜 objective, objective lens 高 氏 1 号 合 成 培 养 基 Gause s No. 1 synthetic medium 细 调 节 器 fine adjustment 高 压 蒸 汽 灭 菌 high pressure steam sterilization 肽 聚 糖 peptidoglycan 十 一 画 苯 胺 黑 ( 黑 色 素 )nigrosin 假 根 rhizine 转 导 tramsduction 假 菌 丝 pseudohypha 转 导 子 transductant 培 养 皿 petri dish

102 培 养 基 medium 培 养 液 culture solution 悬 液 suspension 悬 滴 法 hanging drop method 接 合 conjugation 接 合 孢 子 zygospore 接 种 针 inoculating needle 接 种 环 inoculating loop 斜 面 slant 斜 面 接 种 inoculation of an agar slant 液 体 接 种 broth transfer 淀 粉 水 解 试 验 hydrolysis of strarch test 球 形 体 sphaeroplast 盖 片 cover glass 硅 胶 silica gel 移 液 管 Breed pipette 脱 色 剂 decolourising agent 菌 丝 hypha( 复 :hyphae) 菌 丝 体 mycelium( 复 :mycelia) 菌 落 colony 营 养 菌 丝 vegetative hypha 十 二 画 媒 染 剂 mordant 普 遍 性 转 导 general transduction 棉 塞 cotton pluge 氯 霉 素 chloramphenicol 琼 脂 扩 散 法 agar diffusion method 琼 脂 糖 凝 胶 agarose gel 稀 释 分 离 法 isolation by dilution method 稀 释 液 diluent(diluted solution) 紫 外 线 ultraviolet rays 葡 萄 糖 蛋 白 胨 培 养 基 glucose peptone medium 链 霉 素 streptomycin 十 三 画 微 生 物 发 酵 microbial fermentation 摇 床 rotating shaker 数 值 孔 径 numerical aperture(n.a) 暗 视 野 显 微 镜 darkfield microscope 溶 菌 酶 lysozyme 滤 膜 法 membrane filter technique 简 单 染 色 simple stain 蓝 细 菌 cyanobacteria 酪 蛋 白 水 解 培 养 基 casein hydrolysate medium 十 四 画 以 上 察 氏 培 养 基 Czapek s medium 碱 性 复 红 basic fuchsin 碱 性 染 料 basic dye 稳 定 期 stationary phase 聚 -β- 羟 丁 酸 poly-β-hydroxybutyrate,phb 酵 母 甘 露 醇 培 养 基 yeast extract mannitol medium 酵 母 菌 yeast 蕃 红 ( 沙 黄 藏 花 红 )safranin 佳 性 没 食 子 酸 pyrogallic acid 霉 菌 mould, mold 凝 胶 扩 散 gel diffusion 凝 集 反 应 agglutination reaction 凝 集 原 agglutinogen 凝 集 素 bacteriophage 噬 菌 体 agglutinate 噬 菌 体 裂 解 phage lysis 噬 菌 斑 plaque 镜 台 测 微 尺 stage micrometer 螺 旋 体 spirochaeta 鞭 毛 flagellum( 复 :flagella) 主 要 参 考 书 1 沈 萍 范 秀 容 李 广 斌, 微 生 物 学 实 验 ( 第 三 版 ) 北 京 : 高 等 教 育 出 版 社, 黄 秀 梨 主 编, 微 生 物 学 实 验 指 导, 北 京 : 高 等 教 育 出 版 社, 施 普 林 格 出 版 社, 杨 新 美, 中 国 食 用 菌 栽 培 学, 北 京 : 农 业 出 版 社, 张 松, 食 用 菌 学, 广 州 ; 华 南 理 工 大 学 出 版 社,2000