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1 培训教程 H-Class 基础 2011 Waters Corporation 1

2 内容提要 ACQUITY UPLCTM 色谱柱简介 BEH 第二代杂化颗粒化学 Waters 颗粒技术 色谱柱硬件 ecord ACQUITY UPLCTM 色谱柱使用指南 2011 Waters Corporation 2

3 ACQUITY UPLC 颗粒化学 在杂化的碳 - 硅基质内具有桥式乙烷的 1.7 µm 颗粒 改善了高 ph 稳定性 改善了硅胶的柱效与反压 三官能团键合 C18 配体 改善低 ph 稳定性 专利端基封口技术 可达到的最佳峰形 2011 Waters Corporation 3

4 创造全新的颗粒技术 优势劣势 无机 ( 硅胶 ) 机械强度高 高柱效 保留时间可预测 有限的 ph 范围 碱性化合物拖尾 化学稳定性差 聚合物 ( 碳 ) 宽 ph 范围 没有离子相互作用 化学稳定性好 软, 机械强度低 柱效低 保留时间不可预测 杂化 ( 硅 - 碳键合 ) 颗粒技术 2011 Waters Corporation 4

5 第一代杂化技术 (1999) ( 甲基 - 碳 - 硅 ) 颗粒 甲基在杂化颗粒杂化颗粒表面 ( 更好的峰形 ) 并且在杂化颗粒杂化颗粒内部 ( 高 ph 条件下的长寿命 ) MethylPolyethoxysilane (MPEOS) Tetraethoxysilane (TEOS) Methyltriethoxysilane (MTEOS) 2011 Waters Corporation 5

6 第二代杂化技术简介 桥式乙基硅氧烷 / 硅胶杂化颗粒 EtO CH 2 CH 2 OEt O Si Si O Si O O Si O EtO OEt OEt Si O O Si O OEt Et Et n EtO 4 Si EtO EtO OEt + EtO EtO Si EtO CH 2 CH 2 Si OEt OEt OEt Polyethoxysilane (BPEOS) Bis(triethoxysilyl)ethane Tetraethoxysilane (BTEE) (TEOS) 2011 Waters Corporation 6

7 新的第二代桥式乙基硅氧烷 / 硅胶杂化颗粒 Si O C C Si O C C Si Si O C C Si Si O Si O 2011 Waters Corporation 7

8 Ethylene Bridged Hybrid (BEH) 颗粒 硅胶基质中的乙基桥 BEH 颗粒的益处 Surface Wall OH OH OH OH OH H2 C CH 2 OH OH O Si O Si O Si O Si O Si O Si O Si O Si O Si O H CH O O O 2 C O O O O 2 CH2 H 2 C O Si O Si O Si Si O O Si O Si O Si O Si O Si O H 2 C CH 2 O O O O O O O OH Si O Si O O O 耐高压 宽 ph 范围 (1-12) 高柱效 (1.7 µm) 比硅胶低的硅醇基活性 2011 Waters Corporation 8

9 优化的小颗粒解决方案 1.7 µm 颗粒 新的专利桥式杂化颗粒 o 提供更高的机械强度同时改善色谱性能 适于保留和质量传递的多孔 创新的筛分技术 色谱柱硬件 新的筛板技术以便保留小颗粒 新的端口接头技术以便高压下使用 填充技术 色谱柱填充压力超过 20,000 psi 专利技术 2011 Waters Corporation 9

10 ACQUITY UPLC 色谱柱化学 USP L1 USP L7 USP L1 USP L11 BEH C18 三官能团键合 C 18 专利的端基封口技术 宽 ph 范围 BEH C8 三官能团键合 C 8 专利的端基封口技术 宽 ph 范围 BEH Shield RP18 单官能团键合内嵌极性基团 BEH Phenyl 三官能团键合 C 6 Phenyl 专利的端基封口技术 两种 UPLC 颗粒 : Ethylene Bridged Hybrid (BEH) High Strength Silica (HSS) 不同基质的颗粒给出不同的选择性 BEH HILIC 未键合的 BEH 颗粒 HILIC 用于极性更大的化合物 USP L1 HSS T3 T3 键合及封端 对极性化合物的优异保留 2011 Waters Corporation 10

11 UPLC 技术的 HSS 化学品 HSS T3 T3: 极性组分保留 全水相兼容的 C 18 化学品 为最大化保留而设计 HSS C 18 高键合密度, 三官能团键合 C 18 化学品 通用的, 高效 C 18 化学品 为更好的峰形而应用的特定端基封口技术 硅胶颗粒性能 HSS C 18 SB SB: Selectivity for Bases 无端基封口 : 最佳的硅烷基选择性 为方法开发者而设计 2011 Waters Corporation 11

12 UPLC 颗粒和化学品总结 Launch Date Mar 2004 Mar 2005 Mar 2005 Mar 2005 Dec 2005 Sep 2006 Jun 2007 Jan 方法开发常用 2011 Waters Corporation 12

13 VanGuard 预柱特为 UPLC 使用而设计 第一个也是唯一能在高达 15,000 psi (1,000 bar) 下日常使用的保护柱 专利的超低扩散设计 有效地防护和保持 UPLC 色谱柱的效能 2011 Waters Corporation 13

14 UPLC HILIC 用于强极性碱性化合物的分离 Conditions Column: ACQUITY UPLC BEH HILIC 2.1 x 50 mm, 1.7µm Mobile Phase A: ACN:10 mm NH 4 CH 2 COOH, ph 5.5 (95:5) Mobile Phase B: ACN:10 mm NH 4 CH 2 COOH, ph 5.5 (50:50) Flow Rate: 0.5 ml/min Gradient: Time Profile (min) %A %B Injection Volume: 2 µl Sample Diluent: ACN:MeOH (75:25) Sample Concentration: 25 µg/ml 0.10 Temperature: 30 o C Detection: 254 nm Instrument: ACQUITY UPLC System 0.00 with TUV Compounds 1. Uracil 2. 5-Fluorocytosine 3. Cytosine AU AU Minutes Injection 10 Injection 2,000 Injection 2000 No loss in efficiency, peak shape or retention over the course of 2,000 injections Minutes 2011 Waters Corporation 14

15 用户色谱柱寿命试验 Isocratic Aging Experiment Compounds 1. Ketorolac (208 μg/ml) in MeOH 2. Naproxen (13 μg/ml) in MeOH ACQUITY UPLC BEH Shield RP x 50 mm, 1.7 μm 加速色谱柱老化试验 : 1. Install and equilibrate column. 2. Set flow rate to 0.5 ml/min (6,000 psi), inject and record data. 3. Increase flow rate to 1.25 ml/min to achieve backpressure of 13,000 psi. 4. Inject 200 to 400 times. 5. Reduce flow rate to 0.5 ml/min (6,000 psi), inject and record data. 6. Cycle and repeat steps Initial injection 1 2 AU Minutes Injection 4, NO loss in efficiency or peak shape after 4,000 injections at 13,000 psi and 65 o C 0.20 AU Minutes Data courtesy of Dr. Ken Wehmeyer, The Proctor & Gamble Company 2011 Waters Corporation 15

16 UPLC 氨基酸分析应用方案 2011 Waters Corporation 16

17 HPLC 和 UPLC 氨基酸方法 HPLC 50 分钟周期时间 AMQ Cys Asp Ser Glu Gly NH3 His Arg Thr Pro Lys Tyr Met Ala Val ILe Leu Phe Minutes AMQ UPLC TM 10 分钟周期时间 NH3 His Asp Ser Arg Gly Glu Ala Thr Pro Cys Met Val NVa ILe Leu Phe Tyr Lys Waters Corporation Minutes 17

18 氨基酸分析的 ESI-MS 兼容性 直接流速进入离子源 700 ul/min Minutes Intensity 6x Peak 1 - ZQ F1 Scan ES+, Con Ser 4x10 7 2x m/z Intensity Peak 2 - ZQ F1 Scan ES+, C 1.4x x x x x x x m/z Ala 2011 Waters Corporation 18

19 用于肽谱图的 ACQUITY UPLC 柱 肽分离技术 ACQUITY UPLC 色谱柱经肽谱图 QC 检测 o ACQUITY UPLC BEH130 C18 1.7µm, 2.1mm x 50/100/150mm o ACQUITY UPLC BEH300 C18 1.7µm, 2.1mm x 50/100/150mm 用于 ACQUITY UPLC 肽谱图的高灵敏度 UV 检测器 仪器控制 混合器 2011 Waters Corporation 19

20 固定相的选择性 Conditions Columns: ACQUITY UPLC BEH 2.1 x 50 mm, 1.7µm ACQUITY UPLC HSS T3 2.1 x 50 mm, 1.8 µm Mobile Phase A: 0.1% HCOOH in H 2 O Mobile Phase B: 0.1% HCOOH in ACN Flow Rate: 1.0 ml/min Gradient: Time Profile (min) %A %B Curve Initial Injection Volume: 1 µl Sample Conc: mg/ml Temperature: 35 o C Detection: 240 nm Instrument: ACQUITY UPLC System with ACQUITY UPLC PDA Compounds 1. Acetaminophen 2. 2-Acetamidophenol 3. Caffeine 4. Acetanilide 5. Acetylsalicylic Acid 6. Salicylic Acid 7. Phenacetin HSS T Waters Corporation 20

21 来自紫海胆的咖啡酸分离 : 不同 UPLC 色谱柱的选择性差异 Conditions Columns: ACQUITY UPLC TM BEH C x 50 mm, 1.7 µm Mobile Phase A: 0.1% CF 3 COOH in H 2 O Mobile Phase B: 0.08% CF 3 COOH in ACN Flow Rate: 0.5 ml/min Gradient: Time Profile Curve (min) %A %B Injection Volume: 1 µl Sample Diluent: 50:50 H 2 O: MeOH with 0.05% CF 3 COOH Sample Concentration: 100 µg/ml Temperature: 40 o C Detection: 330 nm Instrument: ACQUITY UPLC TM System with ACQUITY UPLC TUV C 18 C Shield RP Compounds 1. Caftaric acid 2. Chlorogenic acid 3. Cynarin 4. Echinacoside 5. Cichoric acid 3 5 Phenyl Minutes 2011 Waters Corporation 21

22 Ultra Performance LC 的耐受性 AU 耐受性试验的测试条件 : 从 10 到 90% 甲醇的 1 分钟梯度 1000 次进样 温度 :55ºC 最大压力 :8500psi 流速 :1.3ml/min ACQUITY UPLC TM C 18 Column 2.1 x 30mm 1.7 µm 黑色 : 第一次进样褐色 : 第 1000 次进样 Minutes 2011 Waters Corporation 22

23 新的第二代杂化技术改善了高 ph 稳定性 桥式杂化 C 18 桥式杂化硅胶 测试终止 ( 估计 >250 h) 测试终止 ( 估计 >250 h) XTerra MS C 18 Silica C 18 品牌 A Silica C 18 品牌 B Symmetry C 在 50mM TEA 中实验时数 (ph 10, 50 C) 2011 Waters Corporation 23

24 新的第二代杂化技术改善了低 ph 稳定性 加速低 ph 水解实验 对羟基苯甲酸甲酯 110 %Initial Retention 在 1% TFA 水溶液中小时数,80 C 品牌 A RP18 桥式杂化 C 18 品牌 B C 18 品牌 C C Waters Corporation 24

25 ACQUITY UPLC 和品牌 A C18 碱性化合物的峰形 ACQUITY UPLC Column 2.1 x 50 mm, 1.7 μm P = 6875 psi * N USP T f 1.26 * N USP 1853 T f 4.39 Brand A C x 50mm, 1.8 μm P = 4428 psi Minutes 2011 Waters Corporation 25

26 Waters 颗粒技术 60 μm 人发(非常细的头发 人发 非常细的头发) 非常细的头发 5 μm 颗粒 (可以放置 可以放置 12 个) 图像使用同样的标尺 (线条长度 线条长度 = 10 μm) 2011 Waters Corporation 1.7 μm ACQUITY UPLC颗粒 颗粒 (可以放置 可以放置 33 个) 优化的颗粒度分布 在给定压力下 可以得到最高的柱效 26

27 优化的颗粒度分布 : 使得 N 和反压相匹配 Differential Volume % 4.0% 3.5% 3.0% 2.5% 2.0% 1.5% 1.0% 0.5% 0.0% 窄分布宽分布 Wider distribution = higher backpressure Particle Size (µm) 2011 Waters Corporation 27

28 颗粒大小对柱效和反压的影响 500, , ,000 假定 : 1) 100 mm 长柱 2) 在最佳线速度下的最大反压 3) ACN/H 2 O 梯度, 40 o C 1.0 μm 350, μm Efficiency (N/m) 300, , , , , μm 1.8 μm 2.5 μm 3.5 μm 5.0 μm 柱效提高 21% 反压增高 79% 柱效提高 70% 反压增高 780% 50, μm 0 0 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000 6,000 7,000 8,000 9,000 15,000psi 30,000psi Backpressure (bar) 135,000psi 2011 Waters Corporation 28

29 ACQUITY UPLC 色谱柱的设计 设计达到标准压力高于 15,000 psi 筛板设计为能保留 < 2.0 微米颗粒 创新的设计 2011 Waters Corporation 29

30 ACQUITY UPLC 新的管路和接头 HPLC 接头 经典的拉伸管路 UPLC TM 接头 无中心研磨的管路 经典的 Waters 接头 更硬的锥箍 管路的外观 2011 Waters Corporation 30

31 ACQUITY UPLC 新的管路和接头 ACQUITY Parker/Swagelok 制式 其它 Waters 柱 Waters 制式 2011 Waters Corporation 31

32 ACQUITY 色谱柱的接头 不锈钢管路 i.d. 柱入口 镀金不锈钢接头 两个不锈钢锥箍 Peek 管路 i.d. 柱出口 2011 Waters Corporation 32

33 新式可追溯性的 ecord 技术 系绳 支架 包嵌式 16 mm 微芯片 2011 Waters Corporation 33

34 Waters 质量控制 (QC) 结果 2011 Waters Corporation 34

35 用户色谱柱使用历史 色谱柱无纸使用记录 2011 Waters Corporation 35

36 ecord 小结 ecord 永久附在色谱柱上 智能芯片自动下载关键参数到色谱柱历史文件 提供色谱柱全程使用历史 信息不可删除 存在芯片上的信息可减少记录纸张 2011 Waters Corporation 36

37 BEH 色谱柱使用指南 每一根色谱柱都有各自的性能检测色谱图而且还包括以下信息 : 硅胶批号 柱序列号 USP 理论塔板数 USP 拖尾因子 容量因子以及色谱条件 这些数据保存在 ecord 智能芯片中, 可以作为以后的参考 ecord TM 安装 将 ecord TM 智能芯片扣在柱温箱侧面的读码器上 2011 Waters Corporation 37

38 色谱柱与系统连接 使用 ACQUITY 专用管路 ACQUITY UPLCTM 系统配备了严格控制公差范围的管路和镀金镙丝, 以保证最小化柱外体积 冲洗输送过任何缓冲液流动相的泵系统, 然后将色谱柱入口连接到在线过滤器出口 设置泵流速为 0.1ml/min, 用 100% 的有机相 ( 甲醇或乙腈 ) 冲洗色谱柱, 在 5 分钟之内将流速升至 0.5ml/min 当流动相通畅地从柱出口端流出时, 停止流速并且将柱出口端连接到检测器 这样可以避免空气进入到检测器系统, 从而很快使基线平衡 2011 Waters Corporation 38

39 新色谱柱在使用之前需进行柱效测定,Waters 推荐使用 性能测试色谱图 中所用的合适的混合物分析您所收到的色谱柱 测定理论塔板数, 并用这个值来定期地比较 随着时间的推移, 要每间隔一段时间就重新测定一下, 以此追踪色谱柱性能. 由于不同的 UPLC 色谱系统中连接质量 操作环境 系统电子学 试剂质量以及柱条件和操作技术的不同, 因此方法有时需要稍作改变 2011 Waters Corporation 39

40 色谱柱的平衡 在改变不同的流动相系统之前保证流动相的互溶是非常重要的 新的 ACQUITY UPLC TM BEH 柱是保存在 100% 乙腈中的. 为避免流动相中缓冲盐在色谱柱或系统中沉淀, 先用 5 倍柱体积的水 / 有机相混合溶剂来冲洗 可用与所用缓冲盐相同或是更低的有机溶剂组成冲洗 ( 比如在用 60% 甲醇 40% 缓冲液之前, 先用 60% 的甲醇水溶液冲洗色谱柱和系统 ) 2011 Waters Corporation 40

41 色谱柱的平衡 平衡色谱柱需要用 10 倍柱体积的流动相 常用的 2.1mm 50mm 柱柱体积约为 0.2ml 注意 如果流动相中有低浓度的添加剂 ( 比如离子对试剂 ), 则需要用 100 到 200 倍柱体积的流动相来完全平衡. 另外, 流动相中如果含有甲酸盐 ( 比如甲酸铵, 甲酸等 ) 也需要长时间的初始柱平衡 2011 Waters Corporation 41

42 色谱柱使用准则 样品制备 样品中的杂质常常是色谱柱污染的原因, 避免这种情况的一种选择就是使用合适的 Waters Oasis 固相提取小柱或是 Sep-pak 小柱在样品分析前进行净化 最好用流动相或是弱于流动相 ( 更少的有机相 ) 来配制样品, 这样能够得到好的峰形和灵敏度 如果样品不溶于流动相, 要确保溶样溶剂与流动相是互溶的, 从而避免样品或是缓冲液的沉淀 用 0.2um 的膜过滤样品以去除颗粒. 如果样品溶于包含有机相的溶剂中, 那么要确保膜材料不会在有机相中溶解. 联系膜生产商咨询关于膜的溶剂兼溶性问题. 或是应该考虑在 10000rmp 转速以上的离心机上离心 20 分钟, 然后将上层清液转移到合适的进样瓶中 2011 Waters Corporation 42

43 色谱柱使用准则 ph 范围 ACQUITY UPLC TM BEH 柱推荐使用的 ph 范围是 1 到 12 ( 参见下页的缓冲液表 ) 另外, 不同的操作温度和缓冲盐种类, 柱寿命会有所不同 例如, 在加热的情况下使用 ph=8 的磷酸盐缓冲液会降低柱寿命 2011 Waters Corporation 43

44 推荐使用的缓冲盐 2011 Waters Corporation 44

45 色谱柱使用准则 试剂 为保持最好的柱性能, 请使用高质量的色谱级溶剂 用前过滤所有的缓冲盐水溶液, 推荐使用 Pall Gelman Laboratory Acrodisc 滤膜 溶剂中包含的悬浮颗粒会在柱入口端的筛板处形成堵塞, 这将会导致高反压和低柱效 为防止气泡在泵和检测器中形成, 所有溶剂在使用前要完全脱气 推荐使用在线过滤装置 这对于低压梯度尤其重要, 因为有机相和水相在梯度混和时会产生气泡 2011 Waters Corporation 45

46 色谱柱使用准则 压力 温度 ACQUITY UPLC TM BEH 柱能够耐 15000psi(1034bar 或 103Mpa) 的反压 ACQUITY UPLC TM BEH 柱的温度范围为 为确保 ACQUITY UPLC TM BEH 柱的选择性 降低溶剂粘度和提高质量迁移速率, 推荐在 柱温下使用 在极端的 ph 条件 温度或是反压下工作会缩短柱寿命 2011 Waters Corporation 46

47 色谱柱清洗和再生 峰形改变 峰分岔 肩峰 保留时间漂移 分离度变化或是反压增加表明色谱柱可能被污染 用纯有机溶剂冲洗 ( 注意不要有缓冲盐沉淀 ) 通常足够去除这些污染 用 20 倍柱体积的 HPLC 级溶剂清洗, 增加柱温到 会增加清洗效率 如果以上冲洗不能解决问题, 可用以下清洗和再生程序来冲洗色谱柱 选用清洗程序应适合样品的性质或是任何你确认的柱内污染物 ( 参看下表 ) 2011 Waters Corporation 47

48 色谱柱清洗程序表 2011 Waters Corporation 48

49 色谱柱的保存 色谱柱在室温下停用四天以上, 应用 100% 乙腈保存 对于在高温下的应用, 为保证最好的柱寿命应在使用后立即保存在 100% 的乙腈中 不要将色谱柱保存在缓冲盐洗脱液中 如果流动相包括缓冲盐, 用 10 倍柱体积的 HPLC 级水冲洗色谱柱, 然后用 100% 的乙腈替换保存 如果不用水过渡, 当 100% 的乙腈充满柱时, 就会导致缓冲盐在柱中沉淀 色谱柱应完全密封以避免溶剂挥发柱床变干 2011 Waters Corporation 49

50 色谱柱长寿秘诀 为了最大限度地延长 UPLC 柱寿命, 请密切关注以下几点 : 水的质量 ( 包括水的纯化系统 ) 溶剂质量 流动相制备, 储存和放置时间 样品质量和制备 控制水相流动相长菌是关键因素 2011 Waters Corporation 50

51 控制水相流动相长菌 您的流动相看起来是这个样子吗? 流动相 A 组成 : 0.1% HCOOH 配制时间 : 2. 17, 1937 这种吃藻类的细枝鲶鱼似乎是下一个产品? 2011 Waters Corporation 51

52 控制水相流动相长菌 请正确回答以下问题 我能用 100% 水相流动相吗? 我能加少量的有机溶剂到我的水相流动相中吗? 我必须要用 0.2 µm 滤膜过滤水相流动相吗? 我的流动相能用多久? 我要在标签上注明配制日期吗? 我应当 用光 还是每 小时制备新鲜的流动相? 对水的质量有何要求? 现行的水质要求有什么改变吗? 我的水纯化系统的工作状况如何? 何时需要做维修? 我能用 ph 7 的磷酸盐缓冲液吗 ( 它是非常容易生长细菌的 )? 2011 Waters Corporation 52

i

i i i ii 1 2 3 4 % N) 5 50.0 AMINO ACID #64 [modified by Administrator] IntAmp_1 nc 40.0 30.0 20.0 10.0 0.0-10.0 1 - ala - 10.483 2 - thr - 11.107 3 - gly - 11.872 4 - val - 13.458 5 - ser - 14.903 6 - pro

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