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1 实验六 大肠杆菌感受态细胞 的制备和转化

2 取和酶切因工连接程的连接基本路转化线质粒 DNA 提基质粒 DNA 提 PCR

3 实验目的 掌握氯化钙法制备与转化感受态细胞的原理 方法和技术 学会对质粒转化结果的评估

4 实验原理 转化 (Transformation) 是将外源 DNA 分子引入受体细胞, 使之获得新的遗传性 状的一种手段, 它是微生物遗传 分子遗传 基因工程等研究领域的基本实验技术 如需将质粒载体转移进受体细菌, 需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源 DNA 细胞经过细胞经过一些特殊方法 ( 电击法 CaCl 2 法等处理后, 细胞膜的通透性发生了暂时性的改变, 成为能允许外源 DNA 分子进入的细胞, 即感受态细胞 (Compenent cells)

5 0.1mol/L CaCl 2 是一种低渗溶液, 在 0 冷冻处理大肠 杆菌细胞时, 细胞膨胀成球形,DNA 可吸附在其表面 在短在短 暂的热冲击下, 细胞可吸收外源 DNA 摄入了外援 DNA 的细胞在丰富培养基内复制并增殖, 表达外源基因 带有选择标记基因的外源载体在受体细胞内表达时, 受体细胞表现标记基因的表型, 使转化子与非转化子在选择培养基上区分开来

6 Amp r : 抗氨苄青霉素 β 内酰胺酶 多克隆位点 : 外源 DNA 片段的插入位点 Amp s 菌株 Amp r 培养基上含有 X-Gal 和 IPTG 时, 可使用蓝白斑筛选方法鉴别真正的重组的转化子 涂布于含 Amp 的培养基上, 可以生长 次日可见白色菌落 -- 转化子

7 蓝白斑筛选的原理 ( α- 互补 )

8 蓝白斑筛选的原理 ( α- 互补 ) 现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的 DNA 的短区段, 其中有 β- 半乳糖苷酶基因 (lacz) 的调控序列和前 146 个氨基酸的编码信息 在这个编码区中插入了一个多克隆位点 (MCS), 它并不破坏读框, 但可使少数几个氨基酸插入到 β- 半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能, 这种载体适用于可编码 β- 半乳糖苷酶 C 端部分序列的宿主细胞 因此, 宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性, 但它们同时存在时, 可形成具有酶学活性的蛋白质 这种现象称为 α- 互补 由 α- 互补而产生的 LacZ+ 细菌在诱导剂 IPTG 的作用下, 在生色底物 X-Gal 存在时产生蓝色菌落, 因而易于识别 然而, 当外源 DNA 插入到质粒的多克隆位点后, 几乎不可避免地导致无 α- 互补能力的氨基端片段, 使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落 这种重组子的筛选, 称为蓝白斑筛选 如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的平板 37 温箱倒置培养 12-16hr 后, 有重组质粒的细菌形成白色菌落

9 材料 设备及试剂 材料 E. coli DH5α 菌株 : R - M - Amp - ( 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株, 即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体 (Rˉ,Mˉ), 它可以容忍外源 DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代 ) puc19 质粒 DNA( 浓度 :10ng/μl): / 购买或实验室自制 设备 : 恒温摇床 ; 电热恒温培养箱 ; 台式高速离心机 ; 无菌工 作台 ; 低温冰箱 ; 恒温水浴锅 ; 分光光度计 ; 微量移液枪

10 试剂 1 LB 固体和液体培养基 LB 培养基配方 :( 单位 g/l) 胰蛋白胨 10 酵母提取物 5 NaCl 10 琼脂 (1.5%) 15g ( 注 :LB 培养液不加琼脂 ) 按配方称量药品, 加入一定量的 ddh 2 O 后置电炉上加热熔解琼脂, 待琼脂完全熔解后加入 ddh 2 O 定容至 1000ml, 用 NaOH 调节 ph 至 湿热高压灭菌 分钟, 待冷却至 60 左右, 在超静工作台 中加入一定量的 Amp 储存液, 使终浓度为 100μg/ml, 摇匀后用培养皿铺板

11 2 Amp 母液 : 称取氨苄青霉素 100mg 溶于 1mlddH 2 O 中,0.22μm 0 滤器 过滤除菌, 用 EP 管分装后储存于 -20 冰箱 mol/L CaCl 2 溶液 : 称 0.56gCaCl 2 ( 无水分析纯 ), 溶于 50ml 重蒸水中, 定容 至 100ml, 用 0.22μm 滤器过滤除菌 or 高压灭菌 EP 管分装 于 0 冰箱储存. 4 标准 puc19 质粒 : 浓度 10ng/μl

12 操作步骤 ( 一 ) 受体菌的培养 1-70 或 -20 低温冰箱取出菌种后, 在 LB 培养液中培养过夜, 进 行活化 ; 2 取几微升活化后的菌液( 取量视菌的密度而定 ) 在 LB 平板上涂布, 于 37 培养箱中培养 24h; 从 LB 平板上挑取单菌落, 接种于 3-5ml LB 液体 培养基中,37 下振荡培养 12 小时左右, 直至对数生长后期 3 将该菌悬液以 1:100-1:50 的比例接种于 LB 液体培养基中,37 振荡培 养 2-3 小时至 OD 600 =0.5 5 左右 ( 生长对数期 ) ( 注 : 这一步非常关键 培养过度的菌液含有较多的 老 细胞, 制备成感受态细胞后其接受 外援 DNA 能力较低, 从而导致转化率降低 )

13 ( 二 ) 感受态细胞的制备 ( CaCl 2 法 ) 1 将 1.5ml 菌液移入离心管中, 冰上放置 10 分钟, 然后于 4 下 5000rpm 离心 5 分钟 2 弃去上清 ( 轻轻倾倒掉上清液, 并用吸水纸或移液器移除残余 的过多水分 ) 3 加入 1ml 预冷的 0. 1mol/L 的 CaCl 2 溶液, 轻轻拨动管底使细胞完 全悬浮, 冰上放置 15 分钟后,4 下 5000rpm 离心 5 分钟 3 弃去上清, 加入 0.2ml 预冷的 0. 1mol/L 的 CaCl 2 溶液, 轻轻悬浮 细胞, 即制成感受态细胞 将感受态细胞悬液分装成 2 份, 每份 100μl( 注意悬液密度要均匀 ) 冰上放置备用 4 暂时不用的感受态细胞可置于 -80 保存 注 :CaClC Cl 2 处理后的细胞比较脆弱, 尽量温柔操作!

14 ( 三 ) 质粒 puc19 的转化 1. 质粒和感受态细胞混和 : 分别在 100μl 感受态细胞悬液中加入下列 DNA 质粒或水, 轻轻摇匀后冰上放置 30 分钟 感受态细胞 + puc19 质粒 2μl ( 含量不超过 50ng, 体积不超过 10μl) 感受态细胞 + 无菌水 2μl ( 阴性对照 ) 2. 热击 :42 水浴中热击 90 秒 ( 注 : 精确计算时间, 过长将对细胞造成伤害 ), 热击后立即置于冰上冷 2-5 分钟 ( 禁止摇动 ) 3. 复苏 : 向每管中加入 400μl LB 液体培养基 ( 注 : 不含 Amp), 混匀 后 37 轻摇培养 1~1.5 小时, 使细菌恢复正常生长状态, 并表达质粒编码的抗生素抗性基因 (Amp r )

15 ( 四 ) 涂布平板筛选转化质粒 1. 将上述 3 管培养液摇匀后取 50μl 涂布于含 Amp 的筛选平板上 ( 注 :1. 将培养液摇匀后涂布 ;2. 为了便于计算转化率, 必须获得分散的 独立的菌落用于计数 所以涂布时尽量将 50μl 的培养液均匀涂布于培养基的表面, 使之尽量分散 ) 2. 正面向上放置 15 分钟, 待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37 培养过夜 ( 五 ) 次日 (12-14 小时后 ) 观察和计算转化率 : 观察记录转化情况并统计转化率 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子, 根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率, 公式如下 : 转化子总数 = 该皿的菌落数 稀释倍数 ( 注 : 稀释倍数 = 转化反应原液总体积 / 涂板菌液体积 ) 转化频率 = 转化子总数 / 质粒 DNA 加入量 (μg) ( 注 : 理想值可达 ~ 转化子 / μg DNA)

16 预期实验结果

17 实验报告 (3) 思考题 计算转化率并根据转化率和阴性对照分析实验结果 (1). 根据本实验你认为影响转化率的因素有哪些? (2). 如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落, 你将如何解释这种现象?

18 实验中要考虑的重要因素 为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素 : 1. 细胞生长状态和密度 : 不要用经过多次继代或储于 4 的培养菌, 最好从 -70 或 -20 甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好, 可通过监测培 养液的 OD 来控制 DH5α 菌株的 OD 600 为 0.5 时, 细胞密度在 个 /ml 左右 ( 不同的菌株情况有所不同 ), 这时比较合适 密度过高或不 足均会影响转化效率

19 2. 质粒的质量和浓度 : 用于转化的质粒 DNA 应主要是超螺旋态 DNA(cccDNA) 转化效率与外源 DNA 的浓度在一定范围内成正比, 但当 加入的外源 DNA 的量过多或体积过大时, 转化效率就会降低 1ng 的 cccdna 即可使 50μl 的感受态细胞达到饱和 一般情况下,DNA 溶液的 体积不应超过感受态细胞体积的 5% 3. 试剂的质量 : 所用的试剂, 如 CaCl 2 等均需是最高纯度的 (GR. 或 AR.), 并用超纯水配制, 最好分装保存于干燥的冷暗处 4. 防止杂菌和杂 DNA 的污染 : 严格来说, 整个操作过程均应在无菌条件 下进行, 所用器皿, 如离心管, tip 头等最好是新的, 并经高压灭菌处 理, 所有的试剂都要灭菌, 且注意防止被其它试剂 DNA 酶或杂 DNA 所污 染, 否则均会影响转化效率或杂 DNA 的转入, 为以后的筛选 鉴定带 来不必要的麻烦

20 下次试验 : 植物总 RNA 的提取 (P150) 预习提取 RNA 的原理和防止 RNA 酶污染的方法 准备试验材料 : 幼嫩的植物叶片

9. 此时的感受态细胞可以依照下面的步骤 10 到 16 直接进行转化操作, 也可以分装, 加入甘油后于 -70 C 冰冻保藏 10. 向事先灭菌, 并经冷处理的 1.5ml 聚丙烯管中转移 100 微升感受态细胞悬浮液 向每个转化管中加入 DNA( 一般含量是 10 微升或更低的体积中所含量应不超

9. 此时的感受态细胞可以依照下面的步骤 10 到 16 直接进行转化操作, 也可以分装, 加入甘油后于 -70 C 冰冻保藏 10. 向事先灭菌, 并经冷处理的 1.5ml 聚丙烯管中转移 100 微升感受态细胞悬浮液 向每个转化管中加入 DNA( 一般含量是 10 微升或更低的体积中所含量应不超 氯化钙法 (Calcium Chloride) 大肠杆菌感受态细胞的制备 本方法适用于批量制备大肠杆菌感受态细胞, 所得感受态细胞可以获得 5 x 10 6 到 2x 10 7 转化克隆 / 微克超螺旋质粒 DNA 材料 (MATERIALS) 缓冲液和溶液 (Buffers and Solutions) ( 冰冷的 )CaCl 2 2H 2 O (1 M) 冰冷的 MgCl 2 -CaCl 2 s

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