436 一种新型抗性质粒的构建及其在核黄素生产菌中的运用 3 期 列的遗传改造, 在其染色体上整合了两个或更多的核黄素操 纵子的拷贝, 得到了能够过量生产核黄素的基因工程菌 ; 在 此基础上, 又进行了核黄素操纵子的启动子替换等工作, 进 一步提高了核黄素产量 [6]. 国内天津大学赵学明教授研究组
|
|
|
- 费 应
- 5 years ago
- Views:
Transcription
1 DOI: /SP.J 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 2015,21 ( 3 ) : 一种新型抗性质粒的构建及其在核黄素生产菌中的运用 * 程毅鹏饶志明 ** 杨套伟满在伟徐美娟张显 江南大学生物工程学院, 工业生物技术教育部重点实验室无锡 摘要枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis RF1 是课题组前期通过基因工程改造得到的一株核黄素高产菌, 为了进一步提高核黄素的产量, 需要对该菌株进行进一步的基因工程改造. 首先将编码的链丝菌素乙酰基转移酶基因 sat 克隆到 pma5 质粒上, 构建具有诺瓦丝菌素 Norseothricin(NTC) 抗性的重组质粒 pma5-sat, 实验证实该重组质粒能够用于 B. subtilis RF1 的抗性筛选. 随后将核黄素合成相关的关键酶葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶编码基因 zwf 克隆到重组质粒 pma5-sat 上, 获得重组质粒 pma5-sat-zwf, 并成功构建重组菌 B. subtilis RF1/pMA5-sat-zwf. 结果显示, 重组菌胞内葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶活力比原始菌提高了近 50 倍, 说明葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶在重组菌中成功过量表达 ; 根据发酵特性分析, 重组菌 B. subtilis RF1/pMA5-sat-zwf 最终核黄素产量达到 g/l, 比原始菌 B. subtilis RF1 提高了 30.3%. 综上, 构建的新型抗性质粒能够成功运用于核黄素生产菌枯草芽孢杆菌的基因工程改造. 图 5 表 3 参 23 关键词枯草芽孢杆菌 ; 抗性质粒 ; 核黄素 ; 葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶 CLC Q78 : Q936 Construction of a new resistance plasmid capable of riboflavin production in Bacillus subtilis RF1* CHENG Yipeng, RAO Zhiming **, YANG Taowei, MAN Zaiwei, XU Meijuan & ZHANG Xian Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi , China Abstract In our previous study, a genetically engineered strain Bacillus subtilis RF1 was constructed for riboflavin production. To enhance riboflavin production, further genetic modification was required to operate on B. subtilis RF1. The sat gene encoded Streptothricin acetyltransferase was inserted into expression vector pma5, and the recombinant plasmid pma5- sat was constructed and transformed into B. subtilis RF1. Glucose-6-phosphate dehydrogenase encoded by gene zwf is one of key enzymes involved in pentose phosphate pathway. And gene zwf harbored in the new plasmid pma5-sat was constructed and was successfully transformed into B. subtilis RF1 to obtain recombinant strain B. subtilis RF1/pMA5-sat-zwf. The intracellular glucose-6-phosphate dehydrogenase activity of recombinant strain B. subtilis RF1/pMA5-sat-zwf was about 50- fold higher than that of strain B. subtilis RF1. The fermentation results showed that the riboflavin production by recombinant strain B. subtilis RF1/pMA5-sat-zwf reached g/l, which was 30.3% higher than that by strain B. subtilis RF1. The results indicate that this new resistance plasmid can be successfully used in riboflavin-producing strain B. subtilis RF1. Keywords Bacillus subtilis; resistance plasmid; riboflavin; glucose-6-phosphate dehydrogenase 诺瓦丝菌素 (Norseothricin,NTC) 是一种链丝菌素 Streptothricin 类抗生素, 能够抑制蛋白质的合成 [1]. NTC 被广泛运用于细菌 真菌 酵母 植物细胞等的抗性筛选, 是一 收稿日期 Received: 接受日期 Accepted: * 国家重点基础研究发展计划 (973 计划 ) 项目 (2012CB725202) 国家自然科学基金项目 ( ) 教育部重点基金 (113033A) 江苏高校优势学科建设工程资助项目和江苏省现代发酵工业协同创新中心资助 Supported by the State Key Basic R & D Program of China (973 Program, 2012CB725202), the National Natural Science Foundation of China ( ), the Research Project of Chinese Ministry of Education (113033A), the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions, and the Collaborative Innovation Center for Advanced Industrial Fermentation of Jiangsu Province ** 通讯作者 Corresponding author ( raozhm@jiangnan.edu.cn) 种对阳性筛选子没有副作用的一种抗生素. 并且,NTC 易溶 于水, 在 4 水溶液中可稳定保存 2 年. 核黄素是一种维生素, 又称维生素 B2, 是人和动物体必 需的维生素之一, 为黄素酶类辅酶的组成部分, 在生物体内 主要以黄素单核苷酸 (FMN) 和黄素腺嘌呤二核苷酸 (FAD) 的形式存在, 参与机体组织呼吸链电子传递及氧化还原反 应, 在呼吸和生物氧化中起着重要作用, 是生命活动中不可 [2-4] 缺少的维生素. 目前, 全球对核黄素的需求量超过 t/ 年, 市场规模 2 亿美元, 主要通过微生物发酵法生产 [5]. 目 前工业上发酵生产核黄素的菌株主要为 Bacillus subtilis 工程 菌, 具有发酵周期短 原料要求相对简单 产量高等优点. Perkins 等人利用基因工程手段, 对 B. subtilis 168 进行了一系
2 436 一种新型抗性质粒的构建及其在核黄素生产菌中的运用 3 期 列的遗传改造, 在其染色体上整合了两个或更多的核黄素操 纵子的拷贝, 得到了能够过量生产核黄素的基因工程菌 ; 在 此基础上, 又进行了核黄素操纵子的启动子替换等工作, 进 一步提高了核黄素产量 [6]. 国内天津大学赵学明教授研究组 对 B. subtilis 发酵产核黄素进行了全面系统的研究工作, 通过 增加核黄素操纵子的拷贝数 基因重排 代谢途径修饰与改 造等工作得到了合成核黄素的优良菌株 [7-8]. 已有的枯草芽孢 杆菌基因改造过程中采用的抗性筛选标记都是一些常用的 抗生素如氨苄青霉素 卡纳霉素 氯霉素等, 而使用诺瓦丝 菌素作为枯草芽孢杆菌遗传改造抗性筛选标记的研究还未 见报道. 室前期通过传统诱变育种及基因工程改造获得 一株核黄素产生菌枯草芽孢杆菌 B. subtilis RF1, 但该菌株核 黄素生产能力与其他已报道的结果仍存在差距, 为了进一步 提高该菌株的核黄素生产能力, 需要对该菌株进行进一步 遗传改造. 但是, 由于前期遗传改造获得的转化子都是通过 使用不同抗生素筛选获得, 导致菌株 RF1 对氨苄青霉素 卡 纳霉素 红霉素 氯霉素等常见抗生素都有抗性, 给进一步 遗传改造带来了困难. 然而, 近期实验发现, 该菌株对于诺 瓦丝菌素没有抗性, 由基因 sat 编码的链丝菌素乙酰基转移 酶, 能使抗生素 NTC 失活 [9-11]. 于是我们尝试改造已有 pma5 质粒, 克隆 sat 基因至 pma5 质粒, 构建具有 NTC 抗性的新质 粒 pma5-sat, 用于后续遗传改造实验的阳性克隆筛选工作 ; 随后, 为了验证该质粒的实用性, 我们将核黄素合成关键酶 葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶基因 zwf 克隆到质粒 pma5-sat 构建重 组质粒 pma5-sat-zwf, 并导入核黄素生产菌株 B.subtilis RF1 中, 考察酶葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶过量表达对核黄素合成的 影响, 同时为质粒 pma5-sat 在枯草芽孢杆菌遗传改造中的 应用提供借鉴. 1 材料与方法 1.1 材料 菌种与质粒实验所用菌株及质粒见表 主要试剂与仪器质粒提取 胶回收试剂盒 抗生 素 葡萄糖 -6- 磷酸 葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶 辅酶 NADP + PCR 引物等购自上海生工生物工程有限公司. PCR 相关酶 T4 DNA 连接酶 限制性内切酶等购自 Takara 公司. 其他试剂为 国产分析纯. PCR 仪 蛋白电泳仪购自 BioRad 公司, 核酸电泳 仪购自北京六一仪器厂,UVP 凝胶成像仪购自英国 UVP 有限 公司, 离心机购自 Sigma 公司, 发酵罐购自上海保兴生物设备 工程有限公司, 生物传感分析仪 (SBA-40C) 购自中国山东科 学院生物研究所 培养基种子培养基 (g/l): 蛋白胨 10, 酵母浸粉 5, NaCl 10. 发酵罐发酵培养基 (g/l): 葡萄糖 40, 酵母粉 10, 二水 合柠檬酸三钠 0.11,(NH4) 2 HPO 4 6, KH 2 PO 4 5, MgSO 4 7H 2 O 1.5, ZnSO 4 7H 2 O 0.03, MnCl 2 4H 2 O 0.05, FeSO 4 7H 2 O 发酵罐补料培养基 (g/l): 葡萄糖 600, 酵母粉 10, (NH 4 ) 2 HPO 4 6,KH 2 PO 4 5. 表 1 所用的菌株及质粒 Table 1 Strains and plasmids used in this study 菌种 / 质粒 Strain/plasmid 菌株 Strain E. coli JM109 培养基用高压蒸汽灭菌锅 115 灭菌 21 min, 其中种子 培养基为自然 ph, 发酵罐发酵培养基用 30%(V/V)NH 4 OH 和 1 mol/l H 2 SO 4 控制 ph 为 抗性质粒的构建根据 NCBI 中提供的链丝菌素乙酰基转移酶基因 sat (ID: ) 序列, 用 Primer 5.0 软件设计引物 P1 P2( 表 2), 并在其上下游引入酶切位点 BamH I 和 Mlu I. 由上海生 工公司合成全基因片段并连在 puc 质粒上, 以该连有 sat 基 因的质粒为模板, 克隆出基因片段. 其中 PCR 扩增体系 : 合 成的连有 sat 全基因片段的质粒 DNA 1 μl, 上下游引物各 0.5 μl,dntp Mix 4 μl,10 Ex Taq Buffer 5 μl, 灭菌的双 蒸水 38 μl,ex Taq DNA 聚合酶 1 μl. 扩增条件 :94 预变 性,5 min, 一个循环 ;94 变性,1 min,58 退火,1 min, 72 延伸,30 s,35 个循环 ;72,10 min, 一个循环 ;15, 10 min, 一个循环., 扩增 sat 基因, 大小为 525 bp. PCR 产物经 胶回收后得到 sat 基因片段, 连接克隆载体 pmd-18t, 转化 E. coli JM109, 阳性转化子经酶切验证后, 并将重组质粒命名 为 T-sat. 载体 T-sat 和 pma5 通过 BamH I 与 Mlu I 双酶切, 经 琼脂糖凝胶电泳后, 回收目的片段,16 连接过夜后转化 E. coli JM109, 通过酶切验证, 最终得到抗性质粒 pma5-sat. 表 2 所用的引物 Table 2 Primers used in this study 名称 Primer 特性 Characteristics enda1 glnv44 thi-1 rela1 gyra96 reca1 mcrb + Δ(lac-proAB) e14- [F trad36 proab + laci q laczδm15] hsdr17(rk mk + ) 序列 Primer sequence (5-3 ) 来源 Source Invitrogen B. subtilis RF1 Riboflavin producer, Cm r, Em r 本实验室 Our laboratory 质粒 Plasmid E. coli clone plasmid Amp r, Col E pmd18-t TaKaRa origin T-zwf T-sat A derivative of pmd18-t, Amp r, harboring zwf gene A derivative of pmd18-t, Amp r, harboring NTC gene pma5 B.subtilis expression vector, Km r 本实验室 Our laboratory pma5-sat pma5-zwf pma5-sat-zwf A derivative of pma5, Km r,ntc r, harboring NTC gene A derivative of pma5, Km r, harboring zwf gene A derivative of pma5, Km r,ntc r, harboring NTC, zwf gene 大小 Size (bp) P1 ACCGGGATCCATGAAAATTTCGGTGATC 28 P2 GGCACGCGTTTAGGCGTCATCCTGTGCTCC 30 P3 AGGCGGATCCGTGAAAACAAACCAACAACC 31 P4 ACCGACGCGTTTATATGTTCCACCAGTGTA 29 P5 AGGCGATATCGTAAGCTAGACAAAAC 26 P6 ACCGGGTACCTTATATGTTCCACCAGTG 28 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol
![21 卷程毅鹏等 437 1.3 抗性质粒的功能验证从重组菌 E. coli JM109/pMA5-sat 中提取构建正确的重 组质粒 pma5-sat, 用按文献 [12-13] 中的方法, 将重组质粒转 化感受态枯草芽孢杆菌 B. subtilis RF1, 将感受态细胞涂布在 20 mg/l NTC 抗性平板上, 进行抗性验证. 1.4 葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶基因 zwf 克隆表达根据 NCBI 中提供的 B.](/docs-images/88/115108599/images/3-1.jpg "subtilis 168 的 zwf 基因序列, 用 Primer 5.0 软件设计引物 P3 P4, 并在其上下游引入酶切位 点 BamH I 和 Mlu I. 以 B.subtilis RF1 基因组 DNA 为模板, 克隆 出基因片段. PCR 产物经胶回收后得到 zwf 基因片段, 连接克 隆载体 pmd-18t, 转化 E.")
3 21 卷程毅鹏等 抗性质粒的功能验证从重组菌 E. coli JM109/pMA5-sat 中提取构建正确的重 组质粒 pma5-sat, 用按文献 [12-13] 中的方法, 将重组质粒转 化感受态枯草芽孢杆菌 B. subtilis RF1, 将感受态细胞涂布在 20 mg/l NTC 抗性平板上, 进行抗性验证. 1.4 葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶基因 zwf 克隆表达根据 NCBI 中提供的 B. subtilis 168 的 zwf 基因序列, 用 Primer 5.0 软件设计引物 P3 P4, 并在其上下游引入酶切位 点 BamH I 和 Mlu I. 以 B.subtilis RF1 基因组 DNA 为模板, 克隆 出基因片段. PCR 产物经胶回收后得到 zwf 基因片段, 连接克 隆载体 pmd-18t, 转化 E. coli JM109, 阳性转化子经酶切验 证后, 由上海生工生物有限公司测序, 并将重组质粒命名为 T-zwf. 载体 T-zwf 和 pma5 通过 BamH I 与 Mlu I 双酶切, 经琼脂 糖凝胶电泳后, 回收目的片段,16 连接过夜后转化 E. coli JM109, 通过酶切验证, 最终得到表达载体 pma5-zwf. 再设 计引物 P5 P6, 并在其上下游引入酶切位点 EcoR V 和 Kpn I. 以质粒 pma5-zwf 为模板克隆出带启动子 HpaII 的基因片段 HpaII-zwf. 基因片段 HpaII-zwf 和载体 pma5-sat 通过 EcoR V 与 Kpn I 双酶切, 经琼脂糖凝胶电泳后, 回收目的片段,16 连接过夜后转化 E. coli JM109, 通过酶切验证, 最终得到表 达载体 pma5-sat-zwf. 1.5 重组 B.subtilis RF1/pMA5-sat-zwf 菌的构建将质粒 pma5-sat-zwf 按 1.3 中所述方法转化 B.subtilis RF1 菌株. 1.6 葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶 SDS-PAGE 和细胞蛋白浓度测定采用 5% 的浓缩胶及 12% 分离胶的不连续垂直平板电泳, [14] 考马斯亮兰 R-250 染色. 蛋白含量采用 Bradford 法测定, 以 BSA 为标准蛋白. 1.7 葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶酶活测定反应体系 :5 mmol/l glucose-6-phospate;1 mmol/l NADP + ;50 mmol/l 磷酸盐缓冲液,pH 7.0. 反应体系体积为 1.6 ml. 葡糖糖 -6- 磷酸脱氢酶催化戊糖磷酸途径第一步反应, 将葡糖糖 -6- 磷酸还原成 6- 磷酸葡萄糖酸 -δ- 内酯, 同时将 1 分 子 NADP + 转变成 NADPH. NADPH 在 340 nm 处有吸收, 根据 NADPH 的增加量计算葡糖糖 -6- 磷酸脱氢酶的酶活. 酶活力 单位 (U) 定义为每分钟生成 1 mmol/l NADPH 所需的酶量为 一个酶活单位 (U) [15]. 1.8 胞内辅酶 NADPH 水平测定细胞内辅酶水平通过辅酶测定试剂盒 (BioVision) 测 定, 具体方法见试剂盒说明书. 1.9 菌株发酵条件及产物测定发酵罐培养条件 :5 L 发酵罐装液量 2 L, 转速 600 r/ min, 用 30%(V/V)NH 4 OH 和 1 mol/l H 2 SO 4 控制 ph 为 6.8, 温 度 40, 采取葡萄糖浓度限制补料策略使发酵液葡萄糖浓 度保持在 g/l. 用生物传感分析仪 (SBA-40C 山东, 中 国 ) 测定发酵液中残余葡萄糖的含量. 核黄素浓度测定根据文献 [16] 方法进行. 2 结果与分析 2.1 NTC 抗性质粒的构建及功能验证首先, 根据 1.2 描述的方法克隆获得基因 sat, 将该基 因连到载体 pma5 上获得重组质粒 pma5-sat( 图 1). 将重 组质粒 pma5-sat 转化到菌株 B. subtilis RF1 中, 得到重组菌 B. subtilis RF1/pMA5-sat. 将菌株 B. subtilis RF1 和 B. subtilis RF1/pMA5-sat 分别涂布于含有 20 mg/l NTC 抗生素的固体 LB 琼脂平板, 结果发现 B. subtilis RF1 不能在抗性平板上 生长, 而 B. subtilis RF1/pMA5-sat 却能够在抗性平板上生长 ( 图 2), 表明链丝菌素乙酰基转移酶能够通过质粒 pma5- sat 在菌株中 B. subtilis RF1 表达, 从而使重组菌株 B. subtilis RF1/pMA5-sat 产生对 NTC 抗生素产生抗性, 通过遗传稳定 性实验表明质粒 pma5-sat 具有较好的遗传稳定性, 因此, 可 以用于阳性转化子的抗性筛选. BamHI HpaII 7700 bp MluI A B 图 1 重组质粒 pma5-sat 的构建和 PCR 验证图. A: 重组质粒 pma5-sat 图谱 ;B: 重组质粒 PCR 验证图. Fig. 1 Construction of recombinant plasmid pma5-sat and PCR identification of the transformants. A: Map of recombinant plasmid pma5-sat; B: PCR identification 1: DL2000 marker; 2: amplification of gene sat from pma5-sat. A B 图 2 B. subtilis RF1(A) 和 B. subtilis RF1/pMA45-sat(B) 涂布 NTC 抗性平板验证图. Fig. 2 B. subtilis RF1 (A) and B. subtilis RF1/pMA5-sat (B) on the LB agar plate. 2.2 葡糖糖 -6- 磷酸脱氢酶基因 zwf 的克隆与表达以 B. subtilis RF1 的染色体为模板,P3 P4 为引物进行 PCR 扩增, 获得大小约为 1.5 kb 的基因片段, 与 pmd18-t 克隆 Chin J Appl Environ Biol 应用与环境生物学报
4 438 一种新型抗性质粒的构建及其在核黄素生产菌中的运用 3 期 载体连接后测序, 结果表明与 NCBI 数据库公布的序列一致. 然后酶切得到基因片段与质粒 pma5 连接得到质粒 pma5- zwf, 以质粒 pma5-zwf 为模板,P5 P6 为引物, 克隆出带有质 粒 pma5 启动子的基因片段 HpaII-zwf, 酶切后与质粒 pma5- sat 进行连接, 得到重组表达载体 pma5-sat-zwf. 将重组表达 载体 pma5-sat-zwf 转化原始菌 B. subtilis RF1, 在 NTC 终浓度 为 20 mg/l 的 LB 平板上挑取转化子培养, 提取质粒经单双酶 切验证正确后, 即得到重组菌 B. subtilis RF1/pMA5-sat-zwf. 分别将原始菌与重组菌菌体进行超声破碎, 取上清液进行 SDS-PAGE 分析, 检测到重组菌存在分子量 (M r ) 约为 的特异性加强条带 ( 图 3). 并检测原始菌与重组菌胞内葡 糖糖 -6- 磷酸脱氢酶的酶活, 发现重组菌的葡糖糖 -6- 磷酸脱 氢酶的活力比原始菌提高约 50 倍 ( 表 3) 图 3 原始菌与重组菌全细胞蛋的 SDS-PAGE 分析. 1: 蛋白 Marker;2:B. subtilis RF1 细胞破碎上清 ;3:B. subtilis RF1/pMA5-sat-zwf 细胞破碎上清. Fig. 3 SDS-PAGE analysis of proteins in whole cells of B. subtilis RF1 and B. subtilis RF1/pMA5-sat-zwf. 1: protein markers (kda); 2: supernatant of B. subtilis RF1; 3: supernatant of B. subtilis RF1/pMA5-sat-zwf. 表 3 重组菌与原始菌 ZWF 酶活力分析 Table 3 Comparison of ZWF activities in B. subtilis RF1 and B. subtilis RF1/pMA5-sat-zwf 菌株 Strain B. subtilis RF1 crude enzyme B.subtilis RF1/pMA5- sat-zwf crude enzyme 总蛋白 Total protein (ρ/mg ml -1 ) 酶活 Total enzyme activity (Λ/U ml -1 ) 比酶活 Specific activity (λ/u mg -1 ) 过量表达葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶对菌体生长代谢 底物消耗 胞内辅酶水平和核黄素产量的影响分别将菌株 B. subtilis RF1/pMA5-sat-zwf 与 B. subtilis RF1 在 5 L 发酵罐中进行核黄素发酵培养, 定时取样测定发酵液中细胞 OD 葡萄糖及核黄素含量, 并绘制发酵曲线 ( 图 4) 菌体生长比较由图 4 可知, 原始菌和重组菌生长趋势基本一致, 生长可以分为 3 个阶段 :0-4 h, 菌株生长处于延滞期, 菌体生长缓慢 ; 随后, 菌株生长进入指数生长期, 菌体量快速增加 ;48 h 以后, 菌株生长速度减慢, 进入稳定生长期. 但是, 在发酵前期重组菌比原始菌生长缓慢, 可能原因是外源质粒的引入导致葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶过量表达, 从而加重了菌体的生长负担,48 h 以前原始菌的菌体 OD 和核黄素产量都比重组菌高 ; 但是随后重组菌表现出更大的生长潜力, 菌体量最终超过原始菌, 可能原因是由于葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶过量表达, 增加了葡萄糖的消耗能力, 从而提高了菌株的生长能力. 发酵 60 h, 重组菌菌体 OD 达到 70.4, 相对原始 图 4 原始菌与重组菌发酵曲线. Fig. 4 Riboflavin fermentation curves of B. subtilis RF1 and B. subtilis RF1/pMA5-sat-zwf. 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol
5 21 卷程毅鹏等 439 菌的 60.8 提高了 15.8% 葡萄糖消耗比较由图 4 可知, 发酵前期原始菌的葡糖 糖消耗比重组菌快, 可能是原始菌前期生长比重组菌快. 但 是发酵中后期, 由于重组菌的快速生长和关键酶过量表达, 使得重组菌的葡糖糖消耗速率明显提高, 最终发酵 60 h 时, 重组菌和原始菌的葡糖糖消耗分别为 464 g 和 413 g 细胞内辅酶 NADPH 水平的变化通过测细胞 ( 发酵 48 h) 的辅酶 NADPH 的水平, 可以看出重组菌胞内辅酶水平 比原始菌提高了 5 倍 ( 图 5). 葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶是葡萄糖 进入磷酸戊糖途径的关键酶基因, 而葡萄糖通过磷酸戊糖 途径代谢时会产生大量的辅酶 NADPH [15]. 因此, 重组菌胞 内辅酶水平说明过量表达葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶有效地加强 了磷酸戊糖途径通量, 从而显著提高了胞内辅酶 NADPH 水 平 [17] 核黄素产量比较由原始菌与重组菌发酵曲线 ( 图 4) 可以看出,48 h 前, 原始菌和重组菌合成核黄素的速率基本 没有差别, 而 48 h 后, 重组菌合成核黄素的速率显著提高, 最终发酵 60 h, 重组菌核黄素产量和对葡萄糖的得率达到 g/l 与 g/g, 分别比原始菌 (9.22 g/l 和 g/g) 提高了 30.3% 和 15.3%. 可能原因是, 发酵前 48 h, 虽然重组菌菌体量 低于原始菌, 但是过量表达 zwf 使重组菌胞内 NADPH 水平提 高, 进而提高了重组菌单位细胞的核黄素生产速率, 因此, 二者核黄素生产速率并未因菌体量的差别而不同 ; 然而, 48 h 后, 重组菌菌体量迅速增加, 并高于原始菌, 因而, 导致 重组菌的核黄素合成速率显著提高, 同时重组菌胞内辅酶 NADPH 水平高于原始菌, 最终导致重组菌核黄素产量和对 葡萄糖的得率分别高于原始菌. CDW 有限的矛盾, 因此需要开发和引入新的抗性筛选标记. 本实 验研究前期通过基因工程改造等手段所获得一株具有多重 抗性的核黄素产生菌枯草芽孢杆菌 B. subtilis RF1, 这无疑增 加了其进一步遗传改造的难度. 已报道的枯草芽孢杆菌基因 改造过程中采用的抗性筛选标记都是一些常用的抗生素如 氨苄青霉素 卡纳霉素 氯霉素等 [18-19], 而使用诺瓦丝菌素作 为枯草芽孢杆菌遗传改造抗性筛选标记的研究还鲜见报道. 以枯草芽孢杆菌常用的遗传表达载体 pma5 为基础, 通过克隆 NTC 编码基因 sat 至质粒 pma5 中, 首次构建得到一 种新型抗性质粒 pma5-sat, 通过转化实验验证该重组质粒 能够使核黄素产生菌 B. subtilis RF1 产生 NTC 抗性, 因此可以 用于核黄素产生菌 B. subtilis RF1 的遗传改造. 在枯草芽孢杆菌核黄素代谢途径中, 核黄素的合成以 GTP 和核酮糖 -5- 磷酸 (P5P) 为前体物经过 7 步酶催化反应 得到, 同时需要辅酶 NADPH 的参与. 所以制约核黄素的过 量合成的主要因素 : 一是前体物 GTP 和核酮糖 -5- 磷酸的供 [20] 应 ; 二是反应体系中辅酶 NADPH 的水平. 而磷酸戊糖途 径可以提供较充足的前体物质和 NADPH, 葡萄糖 -6- 磷酸脱 氢酶是葡萄糖进入磷酸戊糖途的一个关键酶. 因此, 我们尝 试将葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶编码基因 zwf 通过新构建的抗性质粒 pma5-sat 克隆至重组 B. subtilis RF1 中, 结果发现 ZWF 在 B. subtilis RF1 中成功过量表达. 发酵罐发酵结果表明, 过 量表达 zwf 的重组菌发酵 60 h, 核黄素产量和对葡萄糖的得 率分别比原始菌的提高了 30.3% 和 15.3%. 可能要因是通过在 B. subtilis RF1 中过量表达磷酸戊糖途径的一个关键酶葡萄 糖 -6- 磷酸脱氢酶, 改善了该代谢流的通量, 提高了核黄素合 成的前体物核酮糖 -5- 磷酸的量和胞内 NADPH 水平, 进而提 高了核黄素的产量. 虽然得到的核黄素的产量较之 国内外最高产量还有一定的差距 [21-23], 但是相信通过进一步 遗产改造 代谢调控以及发酵条件和培养基成分的优化等 实验, 核黄素的产量会得到进一步的提高. 首次证明 NTC 抗性基因 sat 能够用于 B. subtilis 遗传改造, 为 B. subtilis 进一步表达外源基因提供了基础. 同时, 的抗性质 粒的构建过程对于其它菌株的抗性筛选实验有一定的借鉴 意义. 参考文献 [References] 1 Kochupurakkal BS, Dirk JL. Nourseothricin N-acetyl transferase: a positive selection marker for mammalian cells [J]. Plos ONE, 2013, 8 图 5 原始菌与重组菌细胞内辅酶 NADPH 比较. Fig. 5 Intracellular NADPH concentrations in B. subtilis RF1 and B. subtilis RF1/pMA5-sat-zwf. 3 讨论与结论 利用抗性基因作为菌株遗传改造的筛选标记是基因工 程领域常用的技术和手段, 然而, 随着改造次数增多, 需要 用到的抗性基因和抗生素的种类势必随着增加, 而我们常用 的抗生素无非包括氨苄青霉素 卡纳霉素 氯霉素等几种, 这就造成逐渐增加的抗生素种类的需要和常用抗生素种类 (7): McCormick D. Two interconnected Bvitamins: riboflavin and pyridoxine [J]. Physiol Rev, 1989, 69: Zuanetti C, Moncada S, Ehakim R. Protective effect of vagual stimulation on reperfusion arrllythmias in cat [J]. Circ Res, 1987, 6l (3): Maclachlan I, C1ara Strand T. Riboflavin in the Chicken 5 -splice site mutation in the gene for riboflavin binding protein [J]. J Biol Chem, 1993, 286 (31): Loon V, Hohmann HP, Bretzel W. Development of a fermentation process for the manufacture of riboflavin [J]. Chimia, 1996, 50: Chin J Appl Environ Biol 应用与环境生物学报
6 440 一种新型抗性质粒的构建及其在核黄素生产菌中的运用 3 期 6 Perkins JB, Sloma A, Hermann T, Theriault K, Zachgo E, Erdenberger T. Genetic engineering of Bacillus subtilis for the commercial production of riboflavin [J]. J Ind Microbiol Biotech, 1999, 22 (1): 张帆, 宋辉, 班睿. hprk 基因敲除及对其枯草芽孢杆菌核黄素发酵的影响 [J]. 生物工程学报,2006, 22 (4): [Zhang F, Song H, Ban R. Knockout of the hprk gene in B. subtilis CcpA mutant and its influence on riboflavin fermentation [J]. Chin J Biotech, 2006, 22 (4): ] 8 Zhu YB, Chen X, Chen T, Zhao XM. Enhancement of riboflavin production by overexpression of acetolactate synthase in pta mutant of Bacillus subtilis [J]. FEMS Microbiol Lett, 2007, 266 (2): Van TT, Rooney PJ, Knoll LJ. Nourseothricin acetyltransferease: a positive selectable markr for Toxoplasma gondi [J]. Parasitol, 2006, 92 (3): Ahn J, Won M, Kyun ML, Kim YS, Jung CR, Im DS, Song KB, Chung KS. Development of episomal vectors carrying a nourseothricinresistance marker for use in minimal media for Schizosaccharomyces pombe [J]. Yeast, 2013, 30 (6): Joshi PB, Webb JR, Davies JE, McMaster WR. The gene encoding streptothricin acetyltransferase (sat) as a selectable marker for Leishmania expression vectors [J]. Gene, 1995, 156 (1): Nicholson WL. The Bacillus subtilis ydjl(bdha) gene encodes acetoin reductase/2,3-butanediol dehydrogenase [J]. Appl Environ Microbiol, 2008, 74 (22): Nagarajan V, Albertson H, Chen M, Ribbe J. Modular expression and secretion vectors for Bacillus subtilis [J]. Gene, 1992, 114 (1): Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding [J]. Anal Biochem, 1976, 72 (1/2): Rendón JL, Del Arenal IP, Guevara-Flores A, Mendoza-Hernández G, Pardo JP. Glucose 6-phosphate dehydrogenase from larval Taenia crassiceps (cysticerci): purification and properties [J]. Parasitol Res, 2008, 102 (6): Man ZW, Rao ZM, Cheng YP, Yang TW, Zhang X, Xu MJ, Xu ZH. Enhanced riboflavin production by recombinant Bacillus subtilis RF1 through the optimization of agitation speed [J]. World J Microbiol Biotechnol, 2014, 30 (2): Zhang X, Zhang RZ, Bao T, Rao ZM, Yang TW, Xu MJ, Xu ZH, Li HZ, Yang ST. The rebalanced pathway significantly enhances acetoin production by disruption of acetoin reductase gene and moderate expression of a new water forming NADH oxidase in Bacillus subtilis [J]. Metab Eng, 2014, 23: 刘项羽, 徐美娟, 杨套伟, 张显, 饶志明. β- 甘露聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的克隆及表达 [J]. 应用与环境生物学报, 2012, 18 (4): [Liu XY, XU MJ, Yang TW, Zhang X, Rao ZM. Cloning and expression of β-mannanase gene in Bacillus subtilis [J]. Chin J Appl Environ Biol, 2012, 18 (4): ] 19 王远, 高秋强, 辛秀娟, 鲍杰. β- 葡萄糖苷酶基因和内切葡聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达 [J]. 应用与环境生物学报, 2013, 19 (6): [Wang Y, Gao QQ, Xin XJ, Bao J. Expression of endoglucanase gene and β-glucosidase genes in Bacillus subtilis [J]. Chin J Appl Environ Biol, 2013, 19 (6): ] 20 Hümbelin M, Griesser V, Keller T, Schurter W, Haiker M, Hohmann HP, Ritz H. GTP cyclohydrolase II and 3,4-dihydroxy-2-butanone 4-phosphate synthase are rate-limiting enzymes in riboflavin synthesis of an industrial Bacillus subtilis strain used for riboflavin production [J]. J Ind Microbiol Biotechnol, 1999, 22 (1): Wu QL, Chen T, Gan Y, Chen X, Zhao XM. Optimization of riboflavin production by recombinant Bacillus subtilis RH44 using statistical designs [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 76 (4): Shi SB, Shen Z, Chen X, Chen T, Zhao XM. Increased production of riboflavin by metabolic engineering of the purine pathway in Bacillus subtilis [J]. Biochem Eng J, 2009, 46 (1): Shi SB, Chen T, Chen X, Wu QL, Gan Y, Zhao XM. Enhancing riboflavin production by genetic modification of purine pathway in Bacillus subtilis [J]. J Biotechnol, 2008, 136 (Supp1): S35-S36 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol
材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析
生物技术通报 黄艳燕 黄靖华 卢福芝 孙靓 彭立新 周兴 黄日波 利用 的方法从鼠李糖乳杆菌基因组 中扩增到 乳酸脱氢酶基因 并连接到载体 上 构建表达质粒 将重组质粒 转化大肠杆菌 重组菌株经 诱导表达 电泳分 析表明 在大肠杆菌中实现了表达 表达产物的分子量约为 同时采用紫外分光光度法测定 乳酸脱氢酶的酶活 测得重组菌株的 乳酸脱氢酶活力为 最适反应温度为 最适 乳酸脱氢酶 克隆 表达 鼠李糖乳杆菌
Microsoft Word - 杨书尧.doc
第 30 卷 第 3 期 2015 年 6 月 天 津 科 技 大 学 学 报 Journal of Tianjin University of Science & Technology Vol. 30 No. 3 Jun. 2015 DOI:10.13364/j.issn.1672-6510.20140066 过 表 达 PNP 对 肌 苷 生 产 菌 合 成 利 巴 韦 林 的 影 响 杨 书
材料 方法
生物技术通报 张发洲 杨慧兰 为了构建单纯疱疹病毒 型 感染细胞多肽 真核表达质粒 应用 技术从 株 的基因组中扩增 基因 并连接至真核表达载体 对阳性克隆进行菌落 酶切和测序鉴定后 成功构建了重 组质粒 用 转染试剂盒将重组质粒 转染至 细胞中 并用 及 检测其表达情况 结果显示 基因在 细胞中得到正确表达 真核表达质粒 的构建成功 为进 一步研究 对宿主细胞的影响奠定了基础 单纯疱疹病毒 型 感染细胞多肽
标题
吉林农业大学学报 ２０１６ ３８ １ ８７ ９１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｈｔｔｐ ｘｕｅｂａｏ ｊｌａｕ ｅｄｕ ｃｎ Ｅ ｍａｉｌ ｊｌｎｄｘｂ ｖｉｐ ｓｉｎａ ｃｏｍ 神 经 生 长 因 子 ｍｒｎａ 在 鹅 等 级 前 卵 泡 中 的 表达 刘璐璐 隋玉健 朱海洋 武惠岩 杨 辉 孙永峰 吉林农业大学动物科学技术学院 长春 １３０１１８
福建农业学报 材料与方法 试验菌株 引物 主要仪器 主要试剂 细菌培养 模板的制备 反应条件 扩增产物的检测 特异性试验 敏感性试验 分离菌株检测 产物的克隆及序列测定 结果与分析
380 研 究 论 文 发 酵 天 数 双 乙 酰 测 定 : 参 照 GB4927-4928-2001 标 准 发 酵 液 中 的 化 学 成 分 的 测 定 : 采 用 GC-8A 型 气 相 色 谱 测 定 1.5 离 子 注 入 方 法 [6] 把 待 处 理 的 菌 株 细 胞 均 匀 涂
![380 研 究 论 文 发 酵 天 数 双 乙 酰 测 定 : 参 照 GB4927-4928-2001 标 准 发 酵 液 中 的 化 学 成 分 的 测 定 : 采 用 GC-8A 型 气 相 色 谱 测 定 1.5 离 子 注 入 方 法 [6] 把 待 处 理 的 菌 株 细 胞 均 匀 涂](/thumbs/43/23114460.jpg "380 研 究 论 文 发 酵 天 数 双 乙 酰 测 定 : 参 照 GB4927-4928-2001 标 准 发 酵 液 中 的 化 学 成 分 的 测 定 : 采 用 GC-8A 型 气 相 色 谱 测 定 1.5 离 子 注 入 方 法 [6] 把 待 处 理 的 菌 株 细 胞 均 匀 涂")
中 国 细 胞 生 物 学 学 报 Chinese Journal of Cell Biology 2011, 33(4): 379-384 http://www.cjcb.org 全 小 麦 啤 酒 酵 母 菌 株 的 诱 变 育 种 及 应 用 研 究 袁 仲 1* 张 百 胜 1 张 慎 举 1 马 绮 云 2 陈 柯 羽 2 ( 1 商 丘 职 业 技 术 学 院 园 林 食 品 加 工 系,
Microsoft Word - 793-797 tb20150504赵宏宇s-高校教改纵横.doc
微 生 物 学 通 报 Microbiology China tongbao@im.ac.cn Apr. 20, 2016, 43(4): 793 797 http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn DOI: 10.13344/j.microbiol.china.150504 高 校 教 改 纵 横 生 物 工 程 专 业 发 酵 课 程 群 建 设 探 索 * 赵 宏 宇
12-1b T Q235B ML15 Ca OH Table 1 Chemical composition of specimens % C Si Mn S P Cr Ni Fe
* - - 100084 Q235B ML15 Ca OH 2 DOI 10. 13204 /j. gyjz201508023 STUDY OF GALVANIC CORROSION SENSITIVITY BETWEEN ANY COUPLE OF STUD WELDMENT OR BEAM Lu Xinying Li Yang Li Yuanjin Department of Civil Engineering
Syngene GBOXHR Retsch MM400 KQ DE Eppendorf Table 1 The sources of Astragali Radix and Hedysarum Radix No. 1 AMM2011_NMGTY Astr
PCR 龙平, 崔占虎, 李虔全, 徐建平, 张春红, 周立社 * *, 李旻辉 ( 包头医学院, 内蒙古包头 014060) DNA 30 28 DNA trnl-trnf PCR PCR 136 bp 323 bp 10% PCR PCR Astragalus membranaceus Fisch. Bge. var. mongho- licus Bge. Hsiao A. membranaceus
ph ph ph Langmuir mg /g Al 2 O 3 ph 7. 0 ~ 9. 0 ph HCO - 3 CO 2-3 PO mg /L 5 p
1 2 1 2 3 1 2 1. 100054 2. 100054 3. 100036 ph ph ph Langmuir 166. 67 mg /g Al 2 O 3 ph 7. 0 ~ 9. 0 ph HCO - 4 5. 00 mg /L 5 ph doi 10. 13928 /j. cnki. wrahe. 2017. 03. 017 TV213. 4 + TU991. 26 + 6 A 1000-0860
集結渦漩法在小板顫振分析之應用
工 程 科 技 與 教 育 學 刊 第 10 卷 第 1 期 第 83~88 頁 民 國 102 年 3 月 以 兩 相 流 動 提 高 超 過 濾 濃 縮 醱 酵 液 玻 尿 酸 之 回 收 率 蘇 芳 儀 陳 樹 人 * 國 立 高 雄 應 用 科 技 大 學 化 學 工 程 與 材 料 工 程 系 通 訊 作 者 電 子 郵 件 :E-mail : biochen@kuas.edu.tw 摘
1172 微生物学通报 2008, Vol.35, No.8 [2], ;,,, (Saccha- romyces cerevisiae),,,,, [3] γ- GSH1 γ-, - [4],, ADH2 ADH II (alcohol dehydrogenase II),, [5] ADH2 G
![1172 微生物学通报 2008, Vol.35, No.8 [2], ;,,, (Saccha- romyces cerevisiae),,,,, [3] γ- GSH1 γ-, - [4],, ADH2 ADH II (alcohol dehydrogenase II),, [5] ADH2 G](/thumbs/92/108602306.jpg "1172 微生物学通报 2008, Vol.35, No.8 [2], ;,,, (Saccha- romyces cerevisiae),,,,, [3] γ- GSH1 γ-, - [4],, ADH2 ADH II (alcohol dehydrogenase II),, [5] ADH2 G")
微生物学通报 AUG 20, 2008, 35(8): 1171~1175 Microbiology tongbao@im.ac.cn 2008 by Institute of Microbiology, CAS 研究报告 低乙醇脱氢酶 Ⅱ 活性的抗老化啤酒 1 蔡勇 酵母工程菌的构建 1 母茜 2 王肇悦 2 张博润 1* 晏本菊 (1. 625014) (2. 100101) 摘要 : 采用自克隆技术,
L 8 0 g L ~0 700 g L % 6 00% 1 50% 1 3 NaCl 0 50% NH 4 2 SO % KH 2 PO % CaCO % 0 03% ~ 0 04% 2 24 h 0 02
38 5 Vol 38 No 5 2014 9 Journal of Jiangxi Normal UniversityNatural Science Sep 2014 1000-5862201405-0501-05 1 1* 2 2 1 3300222 330052 Streptomyces lincolnensis 13 8 6% 12 4% Q 93 A 0 1 2 Streptomyces
H 2 SO ml ml 1. 0 ml C 4. 0 ml - 30 min 490 nm 0 ~ 100 μg /ml Zhao = VρN 100% 1 m V ml ρ g
16 6 2018 11 Chinese Journal of Bioprocess Engineering Vol. 16 No. 6 Nov. 2018 doi 10. 3969 /j. issn. 1672-3678. 2018. 06. 004 1 2 1 1 1. 330200 2. 330006 4 Box-Behnken 1 25 g /ml 121 92 min 2 6. 284%
在 培 养 职 前 卓 越 化 学 教 师 的 院 校, 会 编 一 本 过 去 称 作 化 学 教 学 论 实 验, 现 在 拟 为 卓 越 化 学 教 师 教 育 实 验 教 学 研 究 的 教 材 各 院 校 对 这 门 课 程 所 给 的 学 时 不 太 一 样, 但 都 是 围 绕 实 验
doi: 10.3866/pku.DXHX201607011 卓 越 化 学 教 师 教 育 实 验 教 学 研 究 课 程 探 微 * 杨 承 印 汪 蒙 蒙 赵 洋 ( 陕 西 师 范 大 学 化 学 化 工 学 院, 西 安 710119) 摘 要 : 在 对 实 验 操 作 进 行 编 码 的 基 础 上 对 高 中 化 学 课 程 标 准 中 有 关 实 验 进 行 统 计 分 析, 以
Invitrogen 1.4 pet-gr, ICE-LGR, PCR TA, pmd18-t/gr pet-21a(+) (Nde I Xho I), E. coli DH-5,,,, pet-gr GR ORF cdna, GR, : PU: 5 -GGAATTCCAT
42 6 Vol.42, No.6 2011 11 OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA Nov., 2011 南极衣藻 (Chlamydomonas sp. ICE-L) 谷胱 * 甘肽还原酶基因的原核表达及其条件优化 1 1 燏 1 1 2 (1. 524025; 2. 266061) RT-PCR GR ORF cdna, ; IPTG,, pet-gr BL21,
物理学报 Acta Phys. Sin. Vol. 62, No. 14 (2013) 147802 叠 [4]. PET 设备最重要的部件就是探测器环, 探测 备重建图像具有减少数据插值的优势. 器环的性能直接影响 PET 的成像能力. 探头与探头 之间得到的符合直线叫做投影线. 所有的投影线在
![物理学报 Acta Phys. Sin. Vol. 62, No. 14 (2013) 147802 叠 [4]. PET 设备最重要的部件就是探测器环, 探测 备重建图像具有减少数据插值的优势. 器环的性能直接影响 PET 的成像能力. 探头与探头 之间得到的符合直线叫做投影线. 所有的投影线在](/thumbs/41/22573722.jpg "物理学报 Acta Phys. Sin. Vol. 62, No. 14 (2013) 147802 叠 [4]. PET 设备最重要的部件就是探测器环, 探测 备重建图像具有减少数据插值的优势. 器环的性能直接影响 PET 的成像能力. 探头与探头 之间得到的符合直线叫做投影线. 所有的投影线在")
数 据 插 值 对 正 电 子 发 射 断 层 成 像 设 备 的 图 像 重 建 影 响 的 研 究 * 杨 昆 刘 新 新 李 晓 苇 ( 河 北 大 学 物 理 学 院, 保 定 071000 ) ( 2013 年 1 月 30 日 收 到 ; 2013 年 4 月 9 日 收 到 修 改 稿 ) 正 电 子 发 射 断 层 扫 描 (positron emission computed tomography,
TGF-β AngⅡ B SD ~ 220g SPF. SCXK No SYXK ~ 25 40% ~ 70% OR37G-C
2017 7 43 4 Journal of Southwest Minzu University Natural Science Edition Jul. 2017 Vol. 43 No. 4 doi10. 11920 /xnmdzk. 2017. 04. 008 1 1 1 2 1 1 3 1. 610212 2. 6100413. 610031 AngⅡ TGF-β. SD 60 180 ~
5期xin
中 国 农 学 通 报 2014,30(5):23-27 Chinese Agricultural Science Bulletin 大 肠 杆 菌 生 物 膜 的 筛 选 及 生 长 曲 线 测 定 喻 华 英, 李 启 峰 ( 塔 里 木 大 学 动 物 科 学 学 院, 新 疆 阿 拉 尔 843300) 摘 要 : 为 探 究 犊 牛 腹 泻 病 中 大 肠 杆 菌 生 物 膜 的 形 成
基 础 研 究 食 品 科 学 2011, Vol. 32, No. 07 17 白 球 蛋 白 醇 溶 蛋 白 和 碱 溶 蛋 白 等, 发 现 白 果 中 的 蛋 白 质 主 要 以 清 蛋 白 和 球 蛋 白 为 主, 其 中 白 果 清 蛋 白 具 有 抗 氧 化 和 延 缓 衰 老 等 作
16 李 莹 莹 1, 吴 彩 娥 1, *, 杨 剑 婷 2, 范 龚 健 1 (1. 南 京 林 业 大 学 森 林 资 源 与 环 境 学 院, 江 苏 南 京 210037;2. 安 徽 科 技 学 院 食 品 药 品 学 院, 安 徽 凤 阳 233100) 对 白 果 的 主 要 过 敏 蛋 白 进 行 鉴 定, 并 对 其 过 敏 原 性 进 行 分 析 以 SDS-PAGE 和 Western-Blotting
Microsoft Word - 骆健美.doc
第 30 卷 第 2 期 2015 年 4 月 天 津 科 技 大 学 学 报 Journal of Tianjin University of Science & Technology Vol. 30 No. 2 Apr. 2015 DOI:10.13364/j.issn.1672-6510.20140064 IrrE 重 组 大 肠 杆 菌 的 构 建 和 性 能 分 析 骆 健 美, 郑 媛
臧晓南 张学成 王高歌 刘金姐 张晓辉 刘 滨 对两种丝状蓝藻 钝顶节旋藻和盐泽螺旋藻 在基因工程中常用作选择试剂的 种抗生素 氯霉素 氨苄青霉素 红霉素 链霉素 卡那霉素 庆大霉素和新霉素 的敏感性作比较实验 结果表明 两种蓝藻对抗生素的敏感性既有共同的特点 也有 明显的差异 它们对红霉素 氯霉素和链霉素最敏感 致死浓度分别为 和 两种蓝藻对氨苄青霉素比较敏感 的氨苄青霉素即可抑制 和 的生长 但
第 期 黄雪莲等 响应面优化绿色木霉菌培养基 材料与方法 菌种 仪器与试剂 菌种的活化 单因素试验 响应面优化试验 优化工艺的验证 数据处理 结果与分析
第 卷第 期 年 月 食品与生物技术学报 响应面优化绿色木霉菌培养基 黄雪莲 于新 仲恺农业工程学院轻工食品学院 广东广州 利用响应面分析法对绿色木霉菌的培养基进行优化 通过测量不同营养条件下绿色木霉 菌落生长直径研究其生物学特性 在单因素实验的基础上 选定葡萄糖添加量 丙氨酸添加量和磷酸二氢钾添加量 个因素进行中心组合实验 建立二次回归方程 并应用响应面分析法进行优化 结果表明 绿色木霉菌最佳培养基为葡萄糖
2月5期aa
中 国 农 学 通 报 212,28():2-27 Chinese Agricultural cience Bulletin 血 清 11 型 鸭 疫 里 默 氏 菌 的 分 离 鉴 定 1,2 2, 2, 2, 2, 2, 2, 杨 晓 辉, 程 龙 飞, 陈 红 梅, 施 少 华, 傅 光 华, 万 春 和, 黄 瑜 ( 1 福 建 省 农 业 科 学 院 畜 牧 兽 医 研 究 所, 福 州
Microsoft Word - 封面.doc
中 华 人 民 共 和 国 国 家 环 境 保 护 标 准 HJ 585 2010 代 替 GB 11897 89 水 质 游 离 氯 和 总 氯 的 测 定 N,N- 二 乙 基 -1,4- 苯 二 胺 滴 定 法 Water quality Determination of free chlorine and total chlorine Titrimetric method using N,N-diethyl-1,4-phenylenediamine
/MPa / kg m - 3 /MPa /MPa 2. 1E ~ 56 ANSYS 6 Hz (a) 一阶垂向弯曲 (b) 一阶侧向弯曲 (c) 一阶扭转 (d) 二阶侧向弯曲 (e) 二阶垂向弯曲 (f) 弯扭组合 2 6 Hz
31 3 Vol. 31 No. 3 218 9 Journal of Shijiazhuang Tiedao University Natural Science Edition Sep. 218 1 1 2 1 2 1 1. 543 2. 543 U462. 3 217-2 - 16 A 295-373 218 3-63 - 6 1-4 5-7 8-11 1 11 11 398 mm 86 mm
% GIS / / Fig. 1 Characteristics of flood disaster variation in suburbs of Shang
20 6 2011 12 JOURNAL OF NATURAL DISASTERS Vol. 20 No. 6 Dec. 2011 1004-4574 2011 06-0094 - 05 200062 1949-1990 1949 1977 0. 8 0. 03345 0. 01243 30 100 P426. 616 A Risk analysis of flood disaster in Shanghai
92 China Biotechnology Vol. 32 No g 3 00ml 5ml 0. 5mol /L 24 % 24 ph NaOH Ca OH ml h 24h 48h 72h OD
殏 檪檪 殏 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 China Biotechnology 202 32 3 9-99 殏 殏 8 Mitchell Bieniek Mitchell Bieniek 2 Garrett Flack 2 * 00086 2 60506 Clostridium acetobutylicum AS. 7 Clostridium acetobutylicum AS. 32
: 307, [], [2],,,, [3] (Response Surface Methodology, RSA),,, [4,5] Design-Expert 6.0,,,, [6] VPJ33 ph 3,, ph, OD, Design-Expert 6.0 Box-Behnken, VPJ3
![: 307, [], [2],,,, [3] (Response Surface Methodology, RSA),,, [4,5] Design-Expert 6.0,,,, [6] VPJ33 ph 3,, ph, OD, Design-Expert 6.0 Box-Behnken, VPJ3](/thumbs/42/23094730.jpg ": 307, [], [2],,,, [3] (Response Surface Methodology, RSA),,, [4,5] Design-Expert 6.0,,,, [6] VPJ33 ph 3,, ph, OD, Design-Expert 6.0 Box-Behnken, VPJ3")
微 生 物 学 通 报 FEB 20, 2008, 35(2) 306~30 Microbiology 2008 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@im.ac.cn 生 物 实 验 室 响 应 面 分 析 法 优 化 副 溶 血 性 弧 菌 生 长 条 件 刘 代 新 宁 喜 斌 * 张 继 伦 2 (. 200090) (2. 20202) 摘 要
:TGF-β bfgf 23 KEY WORDS:transforminggrowthfactor-β ;basicfibroblastgrowthfactor; bonemarrow mesenchymalstemcels;eukaryoticexpressionvector; liposomet
2 ( )208 58 JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)208,Vol.58No. TGF-β bfgf,, 2 (., 330006; 2., 5040) : -β (TGF-β ) (bfgf) (BMSCs), SD BMSCs Percol PCR TGF-β bfgf, pcdna3.(+), 3 BMSCs RT-PCR Westernblot
<4D6963726F736F667420576F7264202D203231D3A4D3D7B6F9CAB3C6B7BACDC8E9C6B7D6D0D6ACB7BEB5C4B2E2B6A82E646F63>
中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 GB 5413.3 2010 食 品 安 全 国 家 标 准 婴 幼 儿 食 品 和 乳 品 中 脂 肪 的 测 定 National food safety standard Determination of fat in foods for infants and young children, milk and milk products 2010-03-26
10 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 1 期 2012 年 1 月 生 药 打 粉 入 药 的 基 本 特 点, 借 鉴 材 料 学 粉 体 学 等 学 科 的 研 究 成 果, 在 中 药 传 统 制 药 理 念 的 启 发
中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 1 期 2012 年 1 月 9 基 于 传 统 丸 散 剂 特 点 的 中 药 粒 子 设 计 技 术 研 究 1, 杨 明 2, 韩 丽 1, 杨 胜 3, 张 定 1, 苏 柘 僮 1, 郭 治 平 4, 邹 文 铨 1. 成 都 中 医 药 大 学 四 川 省 中 药 资 源 系 统 研
2011第1期第二部分
中 国 农 学 通 报 2011,27(01):466-470 Chinese Agricultural Science Bulletin 关 于 农 业 信 息 化 与 农 村 信 息 化 关 系 的 探 讨 高 万 林, 张 港 红, 李 桢, 赵 佳 宁 ( 中 国 农 业 大 学 信 息 与 电 气 工 程 学 院, 北 京 100083) 摘 要 : 文 章 通 过 分 析 农 业 农 村
医学科研方法
医 学 科 研 方 法 主 讲 苏 秀 兰 细 胞 生 物 学 教 授 第 一 讲 绪 论 一 概 念 : 在 医 学 科 学 研 究 活 动 中, 运 用 科 学 的 实 践 和 理 论 思 维 的 技 巧, 充 分 发 挥 自 己 的 智 慧, 去 寻 找 观 念 世 界 与 现 实 世 界 之 间 的 联 系 或 规 律, 从 而 发 现 新 现 象, 提 出 新 理 论 的 手 段 二 医
Microsoft Word - 1263-1268gc100083张静.doc
生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2010, September 25; 26(9): 1263 1268 journals.im.ac.cn Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@im.ac.cn 2010 CJB, All rights reserved. 发 酵 工 程 分 阶 段 ph 调 控 提 高 2-
Microsoft Word doc
5 7 Vol. 5 No. 7 2014 7 Journal of Food Safety and Quality Jul., 2014 HTS-ELISA 甄玉萍, 裴世春 *, 高建伟 (, 161006) 摘要 :,,,,, HTS-ELISA, (Trailing), 关键词 : - ; ; ; Progress of monoclonal antibody secretion hybridoma
43 14. 45 3 7 220 1 2 cm /s 2 1. 5 3 1 4 c d 1 /40 1 /4 1 /9 600 0. 129 6 7 1 /6 400 1 /256 000 1. 5 2 2 2. 1 /m /Hz /kn / kn m 6 6 0. 1 ~ 50 600 1 80
43 14 2013 7 Building Structure Vol. 43 No. 14 Jul. 2013 * 1 1 1 2 3 3 3 2 2 1 100013 2 430022 3 200002 1 40 ETABS ABAQUS TU355 TU317 +. 1 A 1002-848X 2013 14-0044-04 Compairion study between the shaking
1 GIS 95 Y = F y + (1 F) (1) 0 0 Y0 kg/hm 2 /day F y 0 y c kg/hm 2 /day [12] y m 20 kg/hm 2 /hour Y = cl cn ch G [ F( y ) T m yo + (2) (1 F)(
![1 GIS 95 Y = F y + (1 F) (1) 0 0 Y0 kg/hm 2 /day F y 0 y c kg/hm 2 /day [12] y m 20 kg/hm 2 /hour Y = cl cn ch G [ F( y ) T m yo + (2) (1 F)(](/thumbs/91/104997423.jpg "1 GIS 95 Y = F y + (1 F) (1) 0 0 Y0 kg/hm 2 /day F y 0 y c kg/hm 2 /day [12] y m 20 kg/hm 2 /hour Y = cl cn ch G [ F( y ) T m yo + (2) (1 F)(")
24 1 Vol.24 No.1 94 2008 1 Transactions of the CSAE Jan. 2008 2008 1 100094 2 100035 3 100081 4 100081 5 100101 GIS ( ) 65.12 16.82 13.74 15.27 11.07 t/(hm 2 a) 10.93% 41.43% 46.93% 65.4%. Bi Jiye, Zhu
Microsoft Word - 050771.doc
2005 年 第 25 卷 有 机 化 学 Vol. 25, 2005 第 7 期, 771~779 Chinese Journal of Organic Chemistry No. 7, 771~779 综 述 与 进 展 紫 草 素 的 全 合 成 研 究 进 展 徐 德 锋 管 鹏 健 毛 志 强 李 绍 顺 * ( 上 海 交 通 大 学 药 学 院 上 海 200030) 摘 要 综 述
Kluyveromyces sp. Y-85 Saccharomyces cerevisiae E-15, E g/100ml Y-85 E-15 DNA Y YEPD MM E E-15 Y-85 Y-85 12h E h 0.1%ED
10384 9626012 UDC 1999 7 1999 7 16 1999 1999 7 1 Kluyveromyces sp. Y-85 Saccharomyces cerevisiae E-15, E-15 10 2.98g/100ml Y-85 E-15 DNA Y-85 45 YEPD MM E-15 45 30 E-15 Y-85 Y-85 12h E-15 10 h 0.1%EDTA-,
摘要
中 華 民 國 第 五 十 一 屆 中 小 學 科 學 展 覽 會 作 品 說 明 書 科 別 : 生 物 科 組 別 : 高 中 組 作 品 名 稱 : 不 給 糖 就 搗 蛋 - 蛀 牙 細 菌 的 抑 制 關 鍵 詞 :Bacillus horikoshii 轉 糖 鏈 球 菌 蛀 牙 編 號 : 摘 要 : 本 實 驗 的 目 的 是 希 望 能 找 出 人 類 牙 齒 上 的 主 要 菌
mm ~
16 3 2011 6 Vol 16 No 3 JOURNAL OF HARBIN UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY Jun 2011 1 2 3 1 150040 2 150040 3 450052 1 3 4 > 1 ~ 3 > > U414 A 1007-2683 2011 03-0121- 06 Shrinkage Characteristics of
untitled
理 類 CN9626 行 96 年 1 1 96 年 12 31 參 行 97 年 2 28 1 行 離 Lactic acid bacteria 金 Staphylococcus aureus 行 離 159 API 50 CHL 行 離 159 不 度 了 行 H 2 O 2 1 Lactobacillus plantarum 了 識 益 益 來 不 利 來 益 切 了 流 Joerger 2003
Z-I A b Z-I A b Z Z-I A A b Z-I Miller [5] Z i I i Z-I [6] Z-I Z-I Z-I Z-I Z I Wilson [7] 1970 [8] [9] 20.32% Sasaki [10] Nino- miya [11] [12]
![Z-I A b Z-I A b Z Z-I A A b Z-I Miller [5] Z i I i Z-I [6] Z-I Z-I Z-I Z-I Z I Wilson [7] 1970 [8] [9] 20.32% Sasaki [10] Nino- miya [11] [12]](/thumbs/50/26692510.jpg "Z-I A b Z-I A b Z Z-I A A b Z-I Miller [5] Z i I i Z-I [6] Z-I Z-I Z-I Z-I Z I Wilson [7] 1970 [8] [9] 20.32% Sasaki [10] Nino- miya [11] [12]")
24 2 Vol.24, No.2 2008 04 JOURNAL OF TROPICAL METEOROLOGY Apr., 2008 1004-4965(2008)02-0147-09 1 2 2 3 3 (1. 310017 2. 100081 3. 325001) Z-I A b Z I (Haitang) (Matsa) Z-I Z-I P458.1.24 A 1 [1] [2] [3]
g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min
25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.
材料 方法 载体构建 转基因植株的获得
生物技术通报 唐宏琨 曾洪梅 杨秀芬 邱德文 通过根癌农杆菌 介导转化法 将含有激发子基因 的植物表达载体 转化三生烟 获得了转基因烟草植株 用 检测确认了阳性转化株 用 杂交 和 杂交进一步证实了 基因的整合 转录和表达 对 代转基因阳性株进行 接种试验 结果显示 与非转基 因对照相比 表达 的烟草叶片枯斑数量减少 表明蛋白激发子基因 的表达提高了转基因烟草对 的抗性 激发子 基因 烟草 转化 材料
% 8. 48% 3 80 Alcalase Novozymes Alcalase 2. 4 L Bacillus licheniformis 2. 4 AU /g 1. 2 Hitachi S-4700 JEOL JEM-1200EX Olympus Bu
2011 33 6 1117-1121 http / /xuebao. jxau. edu. cn Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis E - mail ndxb7775@ sina. com * 311400 Alcalase 2. 4 L TS225. 1 + 6 A 1000-2286 2011 06-1117 - 05 A Study on
Vol. 22 No. 4 JOURNAL OF HARBIN UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY Aug GPS,,, : km, 2. 51, , ; ; ; ; DOI: 10.
22 4 2017 8 Vol. 22 No. 4 JOURNAL OF HARBIN UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY Aug. 2017 150080 GPS,,, : 27. 36 km, 2. 51, 110. 43, ; ; ; ; DOI: 10. 15938 /j. jhust. 2017. 04. 015 U469. 13 A 1007-2683
240 生 异 性 相 吸 的 异 性 效 应 [6] 虽 然, 心 理 学 基 础 研 [7-8] 究 已 经 证 实 存 在 异 性 相 吸 异 性 相 吸 是 否 存 在 于 名 字 认 知 识 别 尚 无 报 道 本 实 验 选 取 不 同 性 别 的 名 字 作 为 刺 激 材 料, 通
![240 生 异 性 相 吸 的 异 性 效 应 [6] 虽 然, 心 理 学 基 础 研 [7-8] 究 已 经 证 实 存 在 异 性 相 吸 异 性 相 吸 是 否 存 在 于 名 字 认 知 识 别 尚 无 报 道 本 实 验 选 取 不 同 性 别 的 名 字 作 为 刺 激 材 料, 通](/thumbs/42/22943812.jpg "240 生 异 性 相 吸 的 异 性 效 应 [6] 虽 然, 心 理 学 基 础 研 [7-8] 究 已 经 证 实 存 在 异 性 相 吸 异 性 相 吸 是 否 存 在 于 名 字 认 知 识 别 尚 无 报 道 本 实 验 选 取 不 同 性 别 的 名 字 作 为 刺 激 材 料, 通")
2011 年 Journal of Capital Medical University 4月 第2 期 Apr 2011 Vol 32 No 2 基础研究 doi: 10 3969 / j issn 1006-7795 2011 02 015 人脑识别不同性别名字反应时的差异研究 高迎霄 陈昭燃 * 张明霞 ( 首都医科大学神经生物系高级脑功能中心) 摘要 目的 探讨男女对不同性别名字认知加工速度是否存在差异
< 1+1 <! " #$% &!"#$ %&' ( )( %&* ) + ), %&- )+. )../'0 ) 1 ) "' )!"#$%&' (1% ( )* " + + %,-.2(13/01 )' 扩增 &' 基因 煮沸获得铜绿假单胞菌 ) 基因组作为模板 ) )( 作为引物
213456!"# $ % # %557;&/55/?5,/ @@@!88>>!"#!$% &'()*+ 武汉市疾病预防控制中心 武汉 /&55, % 华中科技大学同济医学院病原生物学系微生物教研室 武汉 /&55&5 & 武汉市第十一医院 武汉 /&5555,- O ' 0 ' =! 6!, 2 M*34!. 5 '2 ' 0 0* 6) 7 88^9:;0, 6! 89-4 O?@ 7%58
相 关 报 道 近 年 来 临 床 上 运 用 多 种 针 灸 疗 法 治 疗 肥 胖 及 其 引 起 的 并 发 症, 如 高 脂 血 症 糖 尿 病 高 血 压 及 痛 经 等, 均 获 得 满 意 疗 效. caused by sedentary lifestyle and genetic f
在 线 投 稿 : http://www.baishideng.com/wcjd/ch/index.aspx 帮 助 平 台 : http://www.wjgnet.com/esps/helpdesk.aspx DOI: 10.11569/wcjd.v24.i5.815 世 界 华 人 消 化 杂 志 2016 年 2 月 18 日 ; 24(5): 815-820 ISSN 1009-3079 (print)
31 17 www. watergasheat. com km 2 17 km 15 km hm % mm Fig. 1 Technical route of p
31 17 215 9 CHINA WATER & WASTEWATER Vol. 31 No. 17 Sep. 215 < > 232 SUSTAIN BMP SUSTAIN TU992 C 1-462 215 17-111 - 8 Planning and Design of Sponge City Case Study of Beijing Yongding River Ecological
14 16 constructed by codon optimization according to the cdna sequence of 3-ketosteroid 9α-hydroxylase of Rhodococcus erythropolis SQ1 reksha and Myco
16 6 2018 11 Chinese Journal of Bioprocess Engineering Vol. 16 No. 6 Nov. 2018 doi 10. 3969 /j. issn. 1672-3678. 2018. 06. 003 3- -9α- 9α- -4- -3 17-1 2 1 1 3 1 1 2 1 2 1 2 1. 315100 2. 310027 3. 310058
Microsoft Word - 崔宝臣.doc
微生物学通报 DEC 20, 2009, 36(12): 1871~1875 Microbiology tongbao@im.ac.cn 2009 by Institute of Microbiology, CAS 简报 正交实验优选光合细菌混合菌群产氢的最佳条件 * 崔宝臣 张国欣侯博邵姝媛 ( 163318) 摘要 : 对光合细菌混合菌群产氢影响因子进行了实验研究 通过单因素实验和正交实验, 系统考察了碳源
1444 微生物学通报 2008, Vol.35, No.9, β- [1] [2], [3 5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13], 1992, Nakamura T [14], 2003, [15] Subtilisin DFE, 16S rdna, (Mi
![1444 微生物学通报 2008, Vol.35, No.9, β- [1] [2], [3 5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13], 1992, Nakamura T [14], 2003, [15] Subtilisin DFE, 16S rdna, (Mi](/thumbs/93/113515430.jpg "1444 微生物学通报 2008, Vol.35, No.9, β- [1] [2], [3 5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13], 1992, Nakamura T [14], 2003, [15] Subtilisin DFE, 16S rdna, (Mi")
微生物学通报 SEP 20, 2008, 35(9): 1443~1449 Microbiology tongbao@im.ac.cn 2008 by Institute of Microbiology, CAS 研究报告 纤溶酶产生菌 藤黄微球菌的筛选 鉴定及纤溶酶基因的克隆 1, 2 肖璐 2 张仁怀 2* 张义正 (1. 411201) (2. 610064) 摘要 : 通过血粉培养基富集 纤维蛋白培养基筛选,
第16卷 第2期 邯郸学院学报 2006年6月
第 18 卷 第 4 期 邯 郸 学 院 学 报 2008 年 12 月 Vol.18 No.4 Journal of Handan College Dec. 2008 赵 文 化 研 究 论 赵 都 邯 郸 与 赵 国 都 城 研 究 问 题 朱 士 光 ( 陕 西 师 范 大 学 历 史 地 理 研 究 所, 陕 西 西 安 710062) 摘 要 : 战 国 七 雄 之 一 的 赵 国 都 城
甘蔗糖业2011年电子合订本
甘 蔗 糖 业 2011 年 第 6 期,2011 年 12 月 Sugarcane and Canesugar No. 6, Dec. 2011 低 钾 胁 迫 对 甘 蔗 不 同 品 系 生 长 和 光 合 特 性 的 影 响 李 奇 伟, 卢 颖 林, 周 文 灵, 陈 迪 文, 敖 俊 华, 黄 莹, 黄 振 瑞, 江 永 ( 广 州 甘 蔗 糖 业 研 究 所 广 东 省 甘 蔗 改 良
200 31 5 SWAN 0. 01 0. 01 6 min TITAN Thunder Identification Tracking Analysis SWAN TITAN and Nowcasting 19 TREC Tracking Radar Echo by Correlaction T
31 1 2013 3 Journal of Arid Meteorology Vol. 31 No. 1 March 2013. SWAN J. 2013 31 1 199-205. doi 10. 11755 /j. issn. 1006-7639 2013-01 - 0199 SWAN 730020 2011 7 7 SWAN SWAN 2012 2 SWAN 1006-7639 2013-01
第二部分
中 国 农 通 报 0,7(04):478-48 Chinese Agricultural Science Bulletin 基 于 网 络 平 台 的 生 物 统 计 改 革 及 实 践 效 果 分 析 袁 文, 彭 惠 茹, 张 洪 亮, 刘 文 欣, 华 金 平, 苏 胜 宝, 孔 繁 玲 ( 中 国 农 大 科 技 术 发 展 研 究 院, 北 京 0093; 中 国 农 大 农 与 生 物
填 表 说 明 1. 本 表 所 填 数 据 截 至 时 间 为 2011 年 9 月 底 2. 本 表 请 用 A4 纸 双 面 打 印, 加 盖 学 校 公 章 后 上 报 3. 表 内 所 填 数 据 请 学 校 认 真 核 实, 确 保 准 确 无 误 4. 建 设 完 成 情 况 对 照
填 表 说 明 1. 本 表 所 填 数 据 截 至 时 间 为 2011 年 9 月 底 2. 本 表 请 用 A4 纸 双 面 打 印, 加 盖 学 校 公 章 后 上 报 3. 表 内 所 填 数 据 请 学 校 认 真 核 实, 确 保 准 确 无 误 4. 建 设 完 成 情 况 对 照 表 等 相 关 表 格 栏 高 不 够 请 自 行 增 加 5. 表 格 中 填 写 的 相 关 量
从菜鸟到高手-手把手教你qPCR教程II
从 菜 鸟 到 高 手 - 手 把 手 教 你 qpcr 教 程 II --- 定 量 PCR 原 理 常 见 问 题 分 析 和 数 据 统 计 分 析 前 言 由 于 Real-time qpcr 的 众 多 优 点, 现 在 已 经 是 生 命 科 学 领 域 的 一 项 常 规 技 术 越 来 越 多 的 研 究 文 章 中 涉 及 RT-PCR 的 实 验, 也 基 本 上 被 real-time
( ) 039 (CIP) /. :, ISBN TS CIP ( 2005) : : : : * ( ) : ( 010 ) / www. cip. com. cn
( ) 039 (CIP) /. :, 2005. 3 ISBN 7-5025-6678-3... -. TS211. 4 CIP ( 2005) 012222 : : : : * ( 3 100029 ) : ( 010 ) 64982530 http:/ / www. cip. com. cn * 850mm 1168mm 1/ 32 7 196 2005 4 1 2005 4 1 ISBN 7-5025-6678-3/
T K mm mm Q345B 600 mm 200 mm 50 mm 600 mm 300 mm 50 mm 2 K ~ 0. 3 mm 13 ~ 15 mm Q345B 25
23 4 2018 8 Vol. 23 No. 4 JOURNAL OF HARBIN UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY Aug. 2018 Q345B 1 " 1 2 2 2 1. 150040 2. 200125 Q345B 536. 47 MPa 281 HV Q345B DOI 10. 15938 /j. jhust. 2018. 04. 021 TG444
76 34 2. 1. 1 Fig. 1 1 a-a b-b a-a σ ma = 74. 4 MPa σ a = 15. 74 MPa σ 0a =90. 15 MPa 0. 9 σ t =135 MPa b-b σ mb = 21. 77 MPa τ b = 13. 789 MPa σ 0b =
34 11 2012 11 SHIP SCIENCE AND TECHNOLOGY Vol. 34 No. 11 Nov. 2012 0 430064 GB150-98 ASME THR3 +. 4 A 1672-7649 2012 11-0075 - 07 doi 10. 3404 /j. issn. 1672-7649. 2012. 11. 017 Stress and fatigue analysis
Microsoft Word - 17--刘秀秀_new_.doc
土 壤 (Soils), 2014, 46(5): 875 880 1 缺 钾 对 油 菜 主 序 产 量 性 状 的 影 响 及 施 钾 效 果 * ( 430070) (+K) ( K) 1 321 kg/hm 2 111% 50.1% 9.2% 33.6% 21.6% 10.3% 69.6% 41.7% 20.1% 124.4% S143.3 57.2% [1] [2] [3] [4 6] 2005
林学 园艺
中国农学通报 2015,31(10):153-157 Chinese Agricultural Science Bulletin 蚬壳花椒资源繁育与有效成分研究进展 杨 辉 李 猛 王 平 孙吉康 代明龙 中南林业科技大学生命科学与技术学院 长沙 410004 摘 要 总结了蚬壳花椒的一般特性及生长发育特征 地理分布差异 组织培养 扦插嫁接 有性繁育 遗 传多样性分析 药用成分的种类 有效成分的分离纯化方法
Fig. 1 1 The sketch for forced lead shear damper mm 45 mm 4 mm 200 mm 25 mm 2 mm mm Table 2 The energy dissip
* - 1 1 2 3 1. 100124 2. 100124 3. 210018 - ABAQUS - DOI 10. 13204 /j. gyjz201511033 EXPERIMENTAL STUDY AND THEORETICAL MODEL OF A NEW TYPE OF STEEL-LEAD DAMPING Shen Fei 1 Xue Suduo 1 Peng Lingyun 2 Ye
JOURNAL OF EARTHQUAKE ENGINEERING AND ENGINEERING VIBRATION Vol. 31 No. 5 Oct /35 TU3521 P315.
31 5 2011 10 JOURNAL OF EARTHQUAKE ENGINEERING AND ENGINEERING VIBRATION Vol. 31 No. 5 Oct. 2011 1000-1301 2011 05-0075 - 09 510405 1 /35 TU3521 P315. 8 A Earthquake simulation shaking table test and analysis
兽医临床诊断学实验指导
兽 医 临 床 诊 断 学 实 验 指 导 河 北 科 技 师 范 学 院 动 物 科 学 系 临 床 兽 医 学 实 验 室 2009 年 2 月 目 录 学 生 实 验 守 则... 3 实 习 一 动 物 的 接 近 保 定 和 基 本 检 查 法...4 实 习 二 临 床 基 本 检 查 法 及 一 般 检 查...10 实 习 三 循 环 系 统 的 临 床 检 查...15 实 习 四
ICS 11 020 C 50 中华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准 Ws/T361-⒛ ll 乳酸脱 氢 酶催化 活 性 浓度测定 参 考方 法 Reference procedure For the measurement of catalytic activity concentration of lactate dehydrogenase 2011-12-14 2012-06-o1
S9 2 S S S S S S
17 2 Journal of South China University of Technology Vol. 17 No. 2 2015 4 Social Science Edition Api. 2015 * 510640 TU981 A 1009-055X 201502-0106 - 11 HEMC Higher Education Mega Center 43. 3 18 ~ 20 35
±Ä¦¬®É¶¡¤Î¾B³±¹ïªãÂŵæ\(Brassica oleracea L
(Brassica oleracea L.) 1 2 3 7mMNO3-1mMNH4+ 1. 128 2. 3. (1895) Mayo (Wright and Davison, 1964) (hemoglobin methemoglobin) (cyanosis) (secondary amines) (nitrosamines) (Maynark 1989) et al., 1970 (Shaner
Microsoft Word tb 张续-研究报告y.doc
微生物学通报 Microbiology China tongbao@im.ac.cn Jan. 20, 2017, 44(1): 59 67 http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160271 研究报告 枯草芽孢杆菌基因修饰生产核黄素 张续 1 班睿 1* 刘露 1 张然 (1. 300350) (2. 300222)
g 100mv /g 0. 5 ~ 5kHz 1 YSV8116 DASP 1 N 2. 2 [ M] { x } + [ C] { x } + [ K]{ x } = { f t } 1 M C K 3 M C K f t x t 1 [ H( ω )] = - ω 2
![g 100mv /g 0. 5 ~ 5kHz 1 YSV8116 DASP 1 N 2. 2 [ M] { x } + [ C] { x } + [ K]{ x } = { f t } 1 M C K 3 M C K f t x t 1 [ H( ω )] = - ω 2](/thumbs/50/26301205.jpg "g 100mv /g 0. 5 ~ 5kHz 1 YSV8116 DASP 1 N 2. 2 [ M] { x } + [ C] { x } + [ K]{ x } = { f t } 1 M C K 3 M C K f t x t 1 [ H( ω )] = - ω 2")
10 2016 10 No. 10 Modular Machine Tool & Automatic Manufacturing Technique Oct. 2016 1001-2265 2016 10-0012 - 05 DOI 10. 13462 /j. cnki. mmtamt. 2016. 10. 004 * 116024 MIMO TH166 TG502 A Dynamic Performance
13期
中 国 农 学 通 报,9():- Chinese Agricultural Science Bulletin 药 百 合 种 子 萌 发 及 染 色 体 倍 性 检 测 吴 昀, 马 怡 迪, 张 琳, 夏 宜 平 ( 浙 江 大 学 农 业 与 生 物 技 术 学 院 园 艺 系 / 农 业 部 园 艺 植 物 生 长 发 育 与 品 质 调 控 重 点 开 放 实 验 室, 杭 州 ) 摘 要
GB 15973—1995麻风病诊断标准及处理原则
炭 疽 诊 断 标 准 及 处 理 原 则 前 言 GB 17015 1997 炭 疽 (Anthrax) 是 由 炭 疽 芽 孢 杆 菌 (Bacillus anthracis) 引 起 的 一 种 人 与 动 物 共 患 传 染 病, 主 要 存 在 于 食 草 动 物 和 牲 畜 群 落 之 中, 并 能 造 成 环 境 的 广 泛 污 染 由 于 炭 疽 芽 孢 具 有 对 外 界 环 境
<4D6963726F736F667420576F7264202D20B2CCA3BA4542B2A1B6BE52746120496747BFB9CCE5D3EBB1C7D1CAB0A9B7D6C6DAB5C4B9D8CFB52E646F63>
EB 病 毒 Rta/IgG 抗 体 与 鼻 咽 癌 分 期 的 关 系 蔡 永 林, 郑 裕 明, 成 积 儒, 李 军, 莫 永 坤, 钟 青 燕 ( 广 西 梧 州 市 红 十 字 会 医 院, 梧 州 市 肿 瘤 防 治 研 究 所, 广 西 梧 州 543002) 摘 要 : 目 的 探 讨 EB 病 毒 Rta/IgG 抗 体 与 鼻 咽 癌 临 床 分 期 的 关 系 方 法 用 酶
32期
中 国 农 学 通 报 2014,30(32):38-42 Chinese Agricultural Science Bulletin 中 草 药 饲 料 添 加 剂 对 黄 鳝 性 激 素 含 量 的 影 响 1,2 1,2 1,2 2 赵 庆 凯, 丁 炜 东, 邴 旭 文, 王 建 新 ( 1 南 京 农 业 大 学 无 锡 渔 业 学 院, 江 苏 无 锡 214081; 2 中 国 水 产
instillation therapy combined with Western medicine can reduce the levels of ALT, TBA, ALP, TBIL, DBIL and GGT, and improve the anti-cmv-igm negative
在 线 投 稿 : http://www.baishideng.com/wcjd/ch/index.aspx 帮 助 平 台 : http://www.wjgnet.com/esps/helpdesk.aspx DOI: 10.11569/wcjd.v23.i28.4568 世 界 华 人 消 化 杂 志 2015 年 10 月 8 日 ; 23(28): 4568-4573 ISSN 1009-3079
AFLP % 1. 1 DNA 5 RAPD DNA 0. 1g % ~ ph 6 10 DNA 9 40μl TE SSR STS 20ng /L
2012 13 2 201-206 Journal of Plant Genetic Resources / 071001 41 SSR 21 SSR 41 52 2 ~ 4 2. 5 Shannon 0. 21 ~ 1. 40 0. 73 5. 54 3 7 9 13. 16% ~ 186. 49% 5. 48 6 11 SSR Genetic Diversity of Peanut Arachis
5-25袁宏钧.indd
第 24 卷 第 5 期 2015 年 5 月 碘 131 doi:10.3978/j.issn.1005-6947.2015.05.005 http://dx.doi.org/10.3978/j.issn.1005-6947.2015.05.005 Chinese Journal of General Surgery, 2015, 24(5):643 647. Chinese Journal of
150 微生物学通报 2009, Vol.36, No.1 (systemic lupus erythematosus, SLE), Sm(B B D1), Sm D1, SLE [1], Sm D1 (immunoblot, IBT) (enzyme linked immunosorbent as
![150 微生物学通报 2009, Vol.36, No.1 (systemic lupus erythematosus, SLE), Sm(B B D1), Sm D1, SLE [1], Sm D1 (immunoblot, IBT) (enzyme linked immunosorbent as](/thumbs/88/114888322.jpg "150 微生物学通报 2009, Vol.36, No.1 (systemic lupus erythematosus, SLE), Sm(B B D1), Sm D1, SLE [1], Sm D1 (immunoblot, IBT) (enzyme linked immunosorbent as")
微生物学通报 JAN 20, 2009, 36(1): 149~153 Microbiology tongbao@im.ac.cn 2009 by Institute of Microbiology, CAS 生物实验室 人 SmD1 抗原的酵母真核表达及其初步应用 * 杨湘越吴文冰兰小鹏 ( 350025) 摘要 : 通过 PCR 扩增 Sm D1 基因, 与酵母表达载体 ppic9k 重组, 构建表达质粒
34 22 f t = f 0 w t + f r t f w θ t = F cos p - ω 0 t - φ 1 2 f r θ t = F cos p - ω 0 t - φ 2 3 p ω 0 F F φ 1 φ 2 t A B s Fig. 1
22 2 2018 2 Electri c Machines and Control Vol. 22 No. 2 Feb. 2018 1 2 3 3 1. 214082 2. 214082 3. 150001 DOI 10. 15938 /j. emc. 2018. 02. 005 TM 301. 4 A 1007-449X 2018 02-0033- 08 Research of permanent
115 的 大 量 废 弃 物 被 丢 弃 或 直 接 燃 烧 [3] 此 外, 海 南 省 文 昌 鸡 年 产 量 约 8 0 只, 鸡 粪 年 产 量 超 过 100 万 t 这 些 富 含 养 分 的 固 体 有 机 废 弃 物 不 进 行 处 理, 不 仅 会 极 大 浪 费 大 量 养 分
![115 的 大 量 废 弃 物 被 丢 弃 或 直 接 燃 烧 [3] 此 外, 海 南 省 文 昌 鸡 年 产 量 约 8 0 只, 鸡 粪 年 产 量 超 过 100 万 t 这 些 富 含 养 分 的 固 体 有 机 废 弃 物 不 进 行 处 理, 不 仅 会 极 大 浪 费 大 量 养 分](/thumbs/40/22009911.jpg "115 的 大 量 废 弃 物 被 丢 弃 或 直 接 燃 烧 [3] 此 外, 海 南 省 文 昌 鸡 年 产 量 约 8 0 只, 鸡 粪 年 产 量 超 过 100 万 t 这 些 富 含 养 分 的 固 体 有 机 废 弃 物 不 进 行 处 理, 不 仅 会 极 大 浪 费 大 量 养 分")
广东农业科学 16 43 6 114-118 Guangdong Agricultural Sciences doi 10.16768/j.issn.1004-874X.16.06.0 刘军 董存明 吕诗锦 等. 腐熟菌剂不同添加量对鸡粪椰糠高温堆肥的影响 [J]. 广东农业科学 16 43 6 114-118. 腐熟菌剂不同添加量对鸡粪 椰糠高温堆肥的影响 刘 军 董存明 吕诗锦 阮云泽 王蓓蓓
去 中 和 ; [3] 消 化 最 好 在 37 培 养 箱 或 室 温 25 以 上 的 环 境 下 进 行 消 化, 消 化 2--5 min 后, 把 培 养 瓶 放 在 显 微 镜 下 观 察, 发 现 胞 质 回 缩 细 胞 间 隙 增 大, 细 胞 变 圆 后, 立 即 将 培 养 瓶
![去 中 和 ; [3] 消 化 最 好 在 37 培 养 箱 或 室 温 25 以 上 的 环 境 下 进 行 消 化, 消 化 2--5 min 后, 把 培 养 瓶 放 在 显 微 镜 下 观 察, 发 现 胞 质 回 缩 细 胞 间 隙 增 大, 细 胞 变 圆 后, 立 即 将 培 养 瓶](/thumbs/42/23090277.jpg "去 中 和 ; [3] 消 化 最 好 在 37 培 养 箱 或 室 温 25 以 上 的 环 境 下 进 行 消 化, 消 化 2--5 min 后, 把 培 养 瓶 放 在 显 微 镜 下 观 察, 发 现 胞 质 回 缩 细 胞 间 隙 增 大, 细 胞 变 圆 后, 立 即 将 培 养 瓶")
第 一 节 细 胞 培 养 的 相 关 技 术 1 细 胞 的 复 苏 概 述 复 苏 细 胞 要 求 快 速 融 化 的 手 段, 这 样 可 以 保 证 细 胞 外 结 晶 在 很 短 的 时 间 内 即 融 化 避 免 由 于 缓 慢 融 化 使 水 分 渗 入 细 胞 内 形 成 胞 内 再 结 晶 对 细 胞 造 成 损 害 用 品 培 养 液 吸 管 离 心 管 培 养 瓶 步 骤 [1]
Index SSCI Art education ) OR TS =( medic* teach* ) & Humanities Citation Index A&HCI SCIE SSCI A&HCI = 25784 / Thomson AND Countries/Territories = Re
姚 洁 敏 ( 上 海 中 医 药 大 学 基 础 医 学 院, 上 海 201203) 本 文 通 过 对 发 表 在 SCI SSCI 及 A&HCI 收 录 期 刊 上 的 中 国 医 学 教 育 研 究 文 献 的 分 析, 从 发 文 年 代 期 刊 来 源 被 引 情 况 作 者 机 构 及 国 际 合 作 等 方 面, 来 解 析 中 国 该 领 域 目 前 的 国 际 学 术 影 响,
Microsoft Word - 3098-3102 20150611007-蔡伟江-二校
6 8 Vol. 6 No. 8 2015 8 Journal of Food Safety and Quality Aug., 2015 蔡 伟 江 *, 邓 鹏 飞, 刘 光 兰, 李 丹 (, 519040) 摘 要 : 目 的, 方 法 (4.6 mm 250 mm, 5.0 μm) ; : : : =70: 16: 14(V:V:V),, : 1.0 ml/min; : 40 ; : 10
(CIP) : / :,, :,2000.5 ISBN 7-04 - 008822-3 - - N - 42 CIP (2000)60397 55 100009 010-64054588 010-64014048 / 8501168 1/ 32 7.875
( ) (CIP) : / :,, :,2000.5 ISBN 7-04 - 008822-3 - - N - 42 CIP (2000)60397 55 100009 010-64054588 010-64014048 http:/ / www.hep.edu.cn 8501168 1/ 32 7.875 190 000 8.40, ( ) 1 16 16 16 18 21 22 24 24 24
<453A5CCAB3C6B7BFC6D1A73131C4EA3134C6DA5C3134C6DA5C3032B7D6CEF6>
227 ELISA 刘 沙 洲 1,2, 桑 小 雪 1, 欧 阳 华 学 3, 雷 绍 荣 3, 白 林 含 1, * (1. 四 川 大 学 生 命 科 学 学 院, 四 川 成 都 610065;2. 成 都 市 食 品 药 品 检 测 中 心, 四 川 成 都 610045; 3. 四 川 省 农 业 科 学 院 分 析 测 试 中 心, 四 川 成 都 610066) 目 的 : 比 较
~ ~
* 40 4 2016 7 Vol. 40 No. 4 July 2016 35 Population Research 2014 1 2016 2016 9101. 0 40 49. 6% 2017 ~ 2021 1719. 5 160 ~ 470 100872 Accumulated Couples and Extra Births under the Universal Tw o-child
United Nations ~ ~ % 2010
42 3 2018 5 Vol. 42 No. 3 May 2018 38 Population Research 2014 60 3% ~ 4% 10% 60 +
标题
环 球 中 医 药 2016 年 5 月 第 9 卷 第 5 期 摇 Global Traditional Chinese Medicine, May 2016,Vol 郾 9, No 郾 5 摇 557 两 种 电 针 对 脊 髓 损 伤 14 天 后 大 鼠 运 动 功 能 神 经 元 及 MEK2 p 鄄 ERK1 表 达 的 影 响 论 著 宋 良 玉 摇 吕 威 摇 景 泉 凯 摇 莫 雨
~ 10 2 P Y i t = my i t W Y i t 1000 PY i t Y t i W Y i t t i m Y i t t i 15 ~ 49 1 Y Y Y 15 ~ j j t j t = j P i t i = 15 P n i t n Y
* 35 4 2011 7 Vol. 35 No. 4 July 2011 3 Population Research 1950 ~ 1981 The Estimation Method and Its Application of Cohort Age - specific Fertility Rates Wang Gongzhou Hu Yaoling Abstract Based on the
PCR专题改.doc
Primer3 http://frodowimitedu/cgi-bin/primer3/primer3_wwwcgi Primer5 Oligo665 Primer5 http://wwwbioonnet/dispbbsasp?boardid=25&id=38536 Oligo667 http://wwwbioonnet/dispbbsasp?boardid=25&id=40898 1 PCR 1
3 461 DNA lx PDV PDV 2 10% ~ 15% PDV PDV 1 PDV PDV PDV Tagashira PDV d 5 Co
Chinese Bulletin of Entomology 2010 47 3 460 ~ 466 檻檻 檻檻檻檻檻檻檻檻檻檻檻檻 * 450002 Parasitic effects on host Plutella xylostella testes by two endoparasitoids. HE Fan BAI Su-Fen LI Xin CHAO Yun-Fei College of
<4D6963726F736F667420576F7264202D203631372D3632312032303133303430333030312DBACEC0F25FD0A3B6D4B8E55F2DB6FED0A32D2D2DC8A5B5F4CDBCD6D0B5C4BBD8B3B5B7FBBAC52E646F63>
第 4 卷 第 2 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol. 4 No. 2 2013 年 4 月 Journal of Food Safety and Quality Apr., 2013 何 莉 *, 姜 笑 寒 ( 广 东 省 食 品 药 品 职 业 技 术 学 校, 广 州 510663) 摘 要 : 本 文 通 过 科 学 地 运 用 html5+jsp+sql 技 术, 建
Microsoft Word 聂雪梅.doc
4 4 Vol. 4 No. 4 2013 8 Journal of Food Safety and Quality Aug., 2013 聂雪梅 *, 李立, 孙利, 高飞 (, 100123) 摘要 : 2011 12,, 2007~2011,,,, 关键词 : ; ; ; ; Trade and notification situation on food import and export
Microsoft Word - 360145.doc
项 目 批 准 号 81273814 归 口 管 理 部 门 申 请 代 码 收 件 日 期 H2716 360145 y 国 家 自 然 科 学 基 金 委 员 会 资 助 项 目 计 划 书 资 助 类 别 : 面 上 项 目 亚 类 说 明 : 非 连 续 资 助 类 项 目 附 注 说 明 : 项 目 名 称 : 益 气 养 肺 法 拮 抗 bfgf 对 肺 癌 微 环 境 介 导 化 疗
404 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 2 期 2011 年 2 月 加 入 的 十 二 烷 基 磺 酸 钠 活 性 剂 1.23 g, 在 球 磨 机 转 速 600 r/min 的 条 件 下 球 磨 8 h, 所 得 粉
中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 2 期 2011 年 2 月 403 纳 米 技 术 在 中 药 领 域 的 研 究 进 展 1, 吴 芸 2 1,, 严 国 俊 2, 蔡 宝 昌 1, 2, 3* 1. 国 家 中 医 药 管 理 局 中 药 炮 制 标 准 重 点 研 究 实 验 室, 江 苏 南 京 210046 2. 国
Phire Hot StartII DNA 聚合酶
重 要 提 示 Phusion 人 源 样 本 直 接 PCR 试 剂 盒 产 品 货 号 :F-150,200rxns x 20μl 变 性 温 度 为 98 C 退 火 温 度 与 众 多 常 规 DNA 聚 合 酶 ( 如 Taq DNA 聚 合 酶 ) 不 同, 具 体 请 参 照 6.3 延 伸 时, 若 扩 增 子 片 段 1kb, 则 延 伸 时 间 设 定 为 15s 即 可 ; 若