Microsoft Word - GenEscortTM I 转染试剂使用说明.doc

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麦嵇
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1 GenEscort TM Ⅰ 使用说明书一. 产品介绍 GenEscort TM I 是针对一些常用贴壁细胞设计的经济型产品, 该试剂由一种不可降解的分枝状 PEI 衍生物与其它组分复合而成对绝大多数贴壁细胞系具有较高的转染效率, 特别适用于各种常规细胞如 293,CHO,COS,A549,LLC,B16F10 等细胞的转染可进行寡核苷酸和 sirna 运送也能用于体内的动物实验 GenEscort TM I 与传统的脂质体相比无论在转染效果和实验操作上都有明显的优势, 主要表现为 : 经济实惠, 适用于大多数常用的贴壁细胞系转染效率高, 细胞毒性低使用较少的 DNA 量即可获得高的转染效率培养基可含或不含血清, 可以用 PBS 或不含血清的培养基稀释 DNA 进行转染, 转染过程中不需换液转染方法操作简单, 转染过程快速转染的重复性好, 可进行寡核苷酸和 sirna 运送需要较少的转染条件优化二. 运输与储存运输 : 常温储存 :2-8 一年 ; -15 至 20 二年以上三. 转染前的准备与注意事项 1. 细胞接种为了取得较高的转染效率, 推荐使用在 50 代以内的细胞进行转染实验要求在转染前 24 小时对细胞再次传代, 在培养基中加入抗生素对转染效果没有影响转染时细胞密度一般应为 60-80%, 但这因细胞株的不同而变化, 对最常用的细胞株建议细胞密度为 70-90% 以 24 孔板的转染为例, 最理想条件是在转染前 24 小时, 每孔接种 (500 µl ) 个细胞在大多数情况下, 如果在细胞贴壁后 ( 接种几小时后 ) 即进行转染, 也可以得到相近的结果表 1 列举了不同细胞培养装置的推荐细胞数量 2.DNA 的质量为了取得较高的转染效率, 推荐使用高纯度的质粒仅仅根据 DNA 电泳条带的情况估计 DNA 的量和纯度是不够准确的建议对提取的质粒 DNA 的量和纯度进行检测,DNA 含量 (μg/ml)=50 (260 nm 的读数 ) 稀释倍数, 通过检测质粒 DNA 在 260nm 和 280nm 的 OD 值的比值 (OD260/OD280) 估计核酸的纯度,OD260/OD280 值应该 1.8 转染时不同品质的 DNA 用量不同, 以 24 孔板转染为例, 使用酚氯仿沉淀法提取的质粒 DNA 一般每孔需要加入 2μg 质粒 DNA, 而使用 Qiagen 分离柱或类似方法提取的质粒 DNA 一般每孔需要

2 加入 0.5-1μg 质粒 DNA 南京慧基生物技术有限公司表 1 不同细胞培养装置转染前一天细胞接种的推荐细胞数量细胞培养装置接种细胞数量每装置面积细胞培养液总体积 (cm 2 / 孔或皿 ) ( 每孔或每皿 )* 96 孔板 ml ml 48 孔板 ml ml 24 孔板 ml - 1 ml 12 孔板 ml - 2 ml 6 孔板 / 35 mm 培养皿 ml - 4 ml 60 mm 培养皿 ml - 10 ml 100 mm 培养皿 ml 20 ml 140 mm 培养皿 ml 40 ml 为了提高转染效率可以首先使用低细胞培养液总体积, 转染 2 h 小时后补加一倍的含血清细胞培液 3. 血清的影响与大多数脂质体转染试剂不同的是, 在转染过程中细胞培养基中包含血清反而可以提高转染效果但是在 GenEscort TM Ⅰ 和 DNA 形成转染复合物的过程中不能添加血清转染复合物的制备过程中可以使用不含血清的培养基或细胞实验室常用的 PBS 稀释质粒 DNA 和转染试剂 4.GenEscort TM Ⅰ 的用量在体外细胞转染试验中, 对于接种细胞密度在 60%-90% 之间的实验样本, 可通过预试验在 GenEscort TM Ⅰ(μl) DNA(μg)= 之间选择最佳的比例对大多数细胞 GenEscort TM Ⅰ(μl) DNA(μg) 的推荐比例为 2 1 在动物体内转染试验中, 动物肿瘤模型的建立需要根据研究情况进行选择 ; 核酸的给药剂量可根据需要进行调整, 其与 GenEscort TM Ⅰ 的使用比例最好通过体外细胞水平的实验确定, 但通常 DNA/RNA/siRNA/(μg):GenEscort TM Ⅰ(μl)1:2-1:3; 核酸的给药途径可根据研究情况确定, 可选择静脉注射肌内注射瘤内注射腹腔注射等 5.PBS 配制方法 800ml 蒸馏水中溶解 8g NaCl, 0.2g KCl, 3.63g Na 2 HPO 4. 12H 2 O( 或 1.44g Na 2 HPO 4 ) 和 0.24g KH 2 PO 4, 用 HCl 调节溶液 ph 至 7.4 加水定容至 1L, 高压灭菌 20 分钟, 保存于室温 ( 见分子克隆实验指南第二版 P927) 四. 操作步骤贴壁细胞转染 ( 以 24 孔板转染为例 ): 1 μg DNA 质粒稀释于 50 μl 不含血清和抗生素的培养基中, 轻轻混匀注 : PBS (ph 7.4) 缓冲液, 即前述细胞培养室常用的 PBS 以及 opti MEM (Invitrogen) 也能

3 用于稀释 DNA 和转染试剂 2 μl GenEscort TM Ⅰ 稀释于 50 μl 不含血清和抗生素的培养基中, 轻轻混匀注 : PBS (ph 7.4) 缓冲液, 即前述细胞培养室常用的 PBS 以及 opti MEM (Invitrogen) 也能用于稀释转染试剂和 DNA 50μl GenEscort TM Ⅰ 稀释液滴加到 50 μl DNA 稀释液中, 轻轻混匀, 室温孵育分钟, 从而获得 100 μl GenEscort TM Ⅰ/DNA 复合物为简化操作, 在充分注意及时混匀的前提下, 前面几步可以合并为一步完成 : 将 1 μg DNA 质粒稀释于 100 μl 不含血清和抗生素的培养基或 PBS 中, 轻轻混匀, 然后加入 2 μl GenEscort TM Ⅰ 后立刻混匀, 室温放置 min, 获得 100μl 转染复合物注意!: 两种溶液的混合顺序对转染结果非常重要, 切勿颠倒顺序同时室温孵育时间最好不超过 20 分钟, 然后立即加入到培养基中通常将孵育分钟后 GenEscort TM Ⅰ/DNA 复合物与培养基在 EP 管中混合后再加入每孔中转染效果更好 100μl GenEscort TM Ⅰ/DNA 复合物滴加到每孔中并轻轻摇动使其与新鲜的培养基均匀混合注 : 接种细胞的 0.5 ml - 1 ml 的培养基, 在进行转染时已经 24 小时了, 如果已经发黄, 最好在转染时更换为新鲜的培养基把细胞放置在 37,CO 2 孵育箱孵育小时后, 分析报告基因转染效率悬浮细胞转染为了提高转染效率可以首先使用低细胞培养液总体积 ( 见表 1 细胞培养液总体积的下限或更低一些 ), 转染 2-3 h 小时后补加一倍的含血清细胞培液以 24 孔板转染为例, 具体为以细胞培养液总体积的下限 (500μl ) 接种细胞 2 小时后, 加入同样方法制备的 100 μl GenEscort TM Ⅰ /DNA 复合物, 轻轻摇动使均匀混合, 转染 2 h 小时后补加含血清细胞培液至总体积 1 ml, 继续培养至小时后, 分析报告基因转染效率表 2 在不同细胞培养装置转染时, 制备转染复合物各组分的使用量细胞培养装置 DNA 用量 (µg) 稀释 DNA 的稀释剂体积 (µl) GenEscort 试剂的体积 (µl) 稀释 GenEscort 的稀释剂体积 (µl) 每孔转染复合物溶液的用量 (µl) 96 孔板孔板孔板孔板孔板 mm 培养皿 mm 培养皿 mm 培养皿 mm 培养皿

4 高通量系统实验步骤 ( 在 96- 孔板上的转染 ): 转染复合物的制备对每孔, 在 EP 管中将 200 ng DNA 稀释于 15 µl PBS 中, 轻轻混匀对每孔, 在 EP 管中将 0.4 µl 的 GenEscort TM Ⅰ 溶液稀释于 15 µl PBS 中, 轻轻混匀将 15 µl GenEscort TM Ⅰ 稀释液加到 15 µl DNA 稀释液中, 轻轻混匀注意 : 两种溶液的混合顺序对转染结果非常重要, 切勿颠倒滴加顺序轻轻振荡混匀后, 室温下静止分钟后, 立刻加入到每孔中细胞的接种与转染细胞经胰酶消化后, 用新鲜的含血清的培养基洗一次, 然后在 96 孔板上接种细胞, 每孔 200 µl 个细胞, 细胞培养 24 小时后进行转染将上述制备好的 30 µl GenEscort TM Ⅰ/DNA 复合物滴加到每孔中, 轻轻摇动细胞培养板使转染复合物均匀分散在 37 C,5% CO 2 下培养小时后, 分析报告基因转染效率动物体内转染质粒 DNA( 或其他核苷酸类成分 ) 用量与 GenEscort TM Ⅰ 的使用比例最好通过体外细胞水平的实验确定, 但通常 DNA/RNA/siRNA/(μg):GenEscort TM Ⅰ(μl) 为 1:2-1:3; 核酸的给药途径可根据研究情况确定, 可选择静脉注射肌内注射瘤内注射腹腔注射等以小鼠瘤内注射进行基因治疗为例 : (1) 肿瘤细胞株接种于小鼠背部皮下, 定期用游标卡尺测量移植瘤直径, 待肿瘤生长至 100 mm 3 后将动物随机分组给药肿瘤体积 (tumor volume,tv) 的计算公式为 : TV = 1/2 a b 2 其中 a b 分别表示长宽 (2)10µg(1µg/µl) 质粒 ( 或其他寡核苷酸类成分 ) 与 20µl PBS 在 1.5 ml 无菌 EP 管中混匀后, 再加入 20µl GenEscort TM Ⅰ 混匀, 室温放置 min, 获得 50 µl 转染复合物 (3) 瘤体局部消毒后, 将前述的 50µl 转染复合物直接注射到小鼠肿瘤内 (4) 动物继续饲养, 如需要多次给药, 则转染方法按 (2), (3) 进行定期用游标卡尺测量移植瘤直径, 计算肿瘤体积 (5) 处死动物手术剥取瘤块进行分析

5 问题低转染效率细胞毒性大转染结果不重复原因与解决办法优化转染实验中所用的质粒 DNA 的用量采用高质量的质粒 DNA, 并确认其中不含有 RNA ( OD260/OD280 大于 1.8 ) 转染前细胞的密度应达到 60-80%, 并保证细胞形态是最佳的优化 GenEscort /DNA 的比值 (2µl GenEscort /µg DNA - 6µl GenEscort /µg DNA.) 设立阳性对照, 例如 GFP Gene 和 luciferase Gene 以便检查转染结果减少转染时细胞培液的体积接种前, 细胞的健康状况直接影响细胞毒性保持 GenEscort TM /DNA 比率的同时减少质粒的数量核准 DNA 的浓度, 确保 GenEscort TM /DNA 比率为每 µg DNA 不超过 2µl GenEscort TM 试剂减少 GenEscort TM /DNA 复合物与细胞的培育时间可以在转染 4 小时后吸去转染复合物换成新鲜的完全培养基确定基因表达产物是否有毒性, 如果表达的蛋白对细胞有毒性, 应该减少转染实验中所用的质粒 DNA 用量确认质粒没有内毒素细胞传代次数多, 细胞老化, 或者细胞分裂条件已经变化在这种情况下, 如果转染结果不可重复, 可能是细胞状态不佳, 应该从液氮罐里取一只新的细胞株培养并用于转染实验在不同的试剂 /DNA 比或不同的细胞密度下, 转染效果可能差别较大所使用 DNA 的品质变化, 所用培养基的改变以及试剂 /DNA 比的不同都可能导致转染结果的不重复 References 1. Boussif O., F. Lezoualc'h, M. A. Zanta, M. D. Mergny, D. Scherman, B. Demeneix and J. P. Behr (1995) A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A 92, Remy J. S., B. Abdallah, M. A. Zanta, O. Boussif, J. P. Behr and B. Demeneix (1998) Gene-Transfer with Lipospermines and Polyethylenimines. Adv. Drug Delivery Rev. 30, Horbinski C., M. K. Stachowiak, D. Higgins and S. G. Finnegan (2001) Polyethylenimine mediated transfection of cultured postmitotic neurons from rat sympathic ganglia and adult human retina. BMC Neuroscience 2,

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