使用 Geltrex 基质或 rhlaminin-521 预包被 24 孔板使用 Geltrex 基质包被 1. 使用含有 GlutaMAX 添加剂的冷的 Gibco DMEM/F-12 培养基 ( 货号 :10565) 制备 1:100 稀释的 Geltrex 基质 2. 在 24 孔板的每个孔中

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缝柳
5 years ago
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1 转染实验方案 Lipofectamine Stem 转染试剂在 StemFlex 培养基中使用 Lipofectamine Stem 转染试剂转染多能性干细胞 PSC 生长培养基传代试剂及络合培养基组分货号 StemFlex 培养基 A Geltrex 适用于 hesc 且不含 LDEV 的还原型生长因子基底膜基质 A rhlaminin-521 A29248 不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液 (DPBS) Versene 溶液 TrypLE Select 酶 (1X), 不含酚红 RevitaCell 添加剂 A Opti-MEM I 减血清培养基未分化的人多能性干细胞 (PSC) 在无滋养层培养系统中扩增, 如使用 Gibco StemFlex 培养基配合 Gibco Geltrex 基质或 rhlaminin-521 等成分确定的基质, 是实现高效转染的理想选择传代以您选择的培养形式维持 PSC, 如包被有 Geltrex 基质或 rhlaminin-521 的 6 孔板 60 cm 培养皿或 T-75 培养瓶, 使用 StemFlex 培养基在 6 孔板中扩增 PSC, 然后在 24 孔板中进行转染, 是该实验方案采用的常规形式在 PSC 达到 85% 融合度前, 每 3 至 5 天传代一次提示 : 使用 Gibco Versene 溶液进行 PSC 的常规传代与扩增时, 重新接种 5 10 个细胞的较大细胞团块可以促进细胞在 StemFlex 培养基中的重新贴壁和存活, 且无需加入 Gibco RevitaCell 添加剂 PSC 可以在 Geltrex 基质或 rhlaminin-521 上使用 StemFlex 培养基扩增并进行后续转染操作

2 使用 Geltrex 基质或 rhlaminin-521 预包被 24 孔板使用 Geltrex 基质包被 1. 使用含有 GlutaMAX 添加剂的冷的 Gibco DMEM/F-12 培养基 ( 货号 :10565) 制备 1:100 稀释的 Geltrex 基质 2. 在 24 孔板的每个孔中加入 300 μl 稀释的 Geltrex 基质, 37 C 孵育至少 1 小时, 待用在每个孔中加入 1 ml TrypLE Select 酶, 晃动使其均匀覆盖 PSC,37 C 孵育 3 5 分钟用 1 ml 移液管轻轻吹吸细胞悬液 5 10 次, 使其解离成单细胞将细胞悬液转移至含有 3 ml StemFlex 培养基的 15 ml 锥形管中, 失活 TrypLE Select 酶使用 rhlaminin-521 包被 1. 加入 300 μl 的 rhlaminin-521 储液 (0.5 mg/ml) 至 12 ml 2. DPBS 中, 配制 1:40 稀释的 rhlaminin-521, 使其终浓度为 2.5 μg/ml 在 24 孔板的每个孔中加入 400 μl 稀释的 rhlaminin-521, 37 C 孵育至少 2 小时, 按 0.5 μg/cm 2 的量使用 rhlaminin-521 进行包被重要信息 :rhlaminin-521 的最佳包被浓度取决于 PSC 细胞系, 其范围为 0.5 至 2 μg/cm² 如果观察到细胞贴壁不完全, 则提高浓度提示 :Geltrex 基质或 rhlaminin-521 包被的培养板可提前制备, 并置于 4 C 保存至多 2 周接种细胞前先室温平衡 1 小时接种细胞用于转染 1. 为最大程度地提高转染效率, 建议使用 G i b c o TrypLE Select 酶将 PSC 处理为单细胞悬液后接种重要信息 : 由于 PSC 单细胞的贴壁效率低于细胞团块, 因此我们建议在含 Geltrex 基质或 rhlaminin-521 的 StemFlex 培养体系中加入 RevitaCell 添加剂, 过夜重新接种, 然后第二天进行转染 2. 当 PSC 无滋养层培养物的融合度低于 85% 时, 去除 StemFlex 培养基, 在 6 孔板的每个孔中, 用 2 ml DPBS 轻轻冲洗细胞两次重要信息 : 在转染过程中,PSC 培养物的增殖需要空间, 因此, 应按照推荐起始数量接种细胞 ( 第 11 步 ), 在转染当天达到 30% 汇合 g 离心细胞悬液 4 分钟吸弃上清液, 用含有 RevitaCell 添加剂的 3 ml StemFlex 培养基将细胞沉淀重悬为单细胞悬液采用 Invitrogen Countess II 自动细胞计数仪或其他方法进行总活细胞计数使用含有 RevitaCell 添加剂的 StemFlex 培养基稀释, 至最终浓度为 100,000 个细胞 /ml 吸弃用于预包被 24 孔板的 Geltrex 基质或 rhlaminin-521 在含有 RevitaCell 添加剂的 StemFlex 培养基中加入 0.5 ml 的 PSC 悬液, 在预包被的 24 孔板中接种 50,000 个细胞 / 孔转染当天更换培养基配制含有 RevitaCell 添加剂的 Gibco Opti-MEM I 培养基溶液吸弃 StemFlex 培养基, 在各孔中加入 0.5 ml 含有添加剂的 Opti-MEM I 培养基, 然后转染重要信息 : 在含有 RevitaCell 添加剂的 Opti-MEM I 培养基 ( 而非 StemFlex 培养基, 因其可抑制转染 ) 中转染 2

DNA 转染实验方案执行下列步骤, 这些步骤已经过优化, 适合在 StemFlex 培养基中使用 Invitrogen Lipofectamine Stem 转染试剂进行转染 : 步骤试管络合组分每孔用量 (24 孔板 ) 1 试管 1 2 试管 2 Lipofectamine Stem 试剂 2 µl DNA (0.

5 ml 含有 RevitaCell 添加剂的 Opti-MEM I 培养基 6 在每孔中加入第 4 步的复合物 50 μl; 轻轻晃动培养板, 确保复合物在整个孔中分布均匀 7 8 将培养皿放回培养箱, 在 37 C 5% CO 2 的条件下培养细胞 4 小时重要信息 : 转染 4 小时后, 在每孔中加入 0.

3 DNA 转染实验方案执行下列步骤, 这些步骤已经过优化, 适合在 StemFlex 培养基中使用 Invitrogen Lipofectamine Stem 转染试剂进行转染 : 步骤试管络合组分每孔用量 (24 孔板 ) 1 试管 1 2 试管 2 Lipofectamine Stem 试剂 2 µl DNA (0.5 5 μg/μl) 3 将试管 2 的溶液加入试管 1 中, 混合均匀 4 室温孵育步骤 3 的混合物 10 分钟 500 ng 5 在转染前, 吸弃 StemFlex 培养基, 在每孔中加入 0.5 ml 含有 RevitaCell 添加剂的 Opti-MEM I 培养基 6 在每孔中加入第 4 步的复合物 50 μl; 轻轻晃动培养板, 确保复合物在整个孔中分布均匀 7 8 将培养皿放回培养箱, 在 37 C 5% CO 2 的条件下培养细胞 4 小时重要信息 : 转染 4 小时后, 在每孔中加入 0.5 ml 预热至室温的 StemFlex 培养基, 如果 PSC 进行 48 小时转染, 则在第二天吸弃 StemFlex 培养基和转染复合物, 在每孔中加入 0.5 ml 新鲜 StemFlex 培养基 ; 在细胞达到 85% 融合度前传代转染效率分析转染 24 和 48 小时后, 利用荧光显微镜或流式细胞仪观察转染 GFP 报告基因重组体的 PSC, 进行终点分析 ( 图 1) A 实验技巧实现最佳转染所需的 Lipofectamine Stem 试剂用量取决于 PSC 的接种数量和 DNA 的用量使用包含在人 PSC 中处于激活状态启动子 ( 如 EF1α 启动子 ) 的质粒是评估转染效率的关键 ; 一些启动子会在 PSC 中转录沉默, 如巨细胞病毒 (CMV) 启动子如果 DNA 制备物的细胞毒性明显, 则将每孔的 DNA 量减少至 250 ng, 这样可提高存活率, 同时保持高效转染 B 图 1. ipsc 的转染后分析 (A) 荧光图像显示 71% 的转染效率,(B) 为明场图像图中为使用 500 ng 11.2 kb EF1α-GFP 质粒及 2 μl Lipofectamine Stem 试剂在 StemFlex 培养基及 Geltrex 基质中转染 44 小时后的 ipsc 3

4 mrna 转染实验方案执行下列步骤, 这些步骤已经过优化, 适合在 StemFlex 培养基中使用 Lipofectamine Stem 转染试剂进行转染 : 步骤试管络合组分每孔用量 (24 孔板 ) 1 试管 1 2 试管 2 Lipofectamine Stem 试剂 2 µl mrna (0.5 5 μg/μl) 3 将试管 2 的溶液加入试管 1 中, 混合均匀 4 室温孵育步骤 3 的混合物 10 分钟 ng 5 在转染前, 吸弃 StemFlex 培养基, 在每孔中加入 0.5 ml 含有 RevitaCell 添加剂的 Opti-MEM I 培养基 6 在每孔中加入第 4 步的复合物 50 μl; 轻轻晃动培养板, 确保复合物在整个孔中分布均匀 7 8 将培养皿放回培养箱, 在 37 C 5% CO 2 的条件下培养细胞 4 小时重要信息 : 转染 4 小时后, 在每孔中加入 0.5 ml 预热至室温的 StemFlex 培养基, 如果 PSC 进行 48 小时转染, 则在第二天吸弃 StemFlex 培养基和转染复合物, 在每孔中加入 0.5 ml 新鲜 StemFlex 培养基 ; 在细胞达到 85% 融合度前传代转染效率分析转染 24 和 48 小时后, 利用荧光显微镜或流式细胞仪观察转染编码荧光蛋白 mrna 的 PSC, 进行终点分析 ( 图 2) A 实验技巧获得特定结果所需的 mrna 量根据用户应用的不同而异 ;Lipofectamine Stem 试剂可在较宽的剂量范围内将 mrna 高效导入 PSC 在您的目的转录物外包含独立的 GFP mrna (50 ng), 可实现转染效率的独立评估如果 mrna 制备物的细胞毒性明显, 则将每孔的 mrna 量减少至 250 ng, 这样可提高存活率的同时保持高效转染 B 体外转录的 (IVT) mrna 的生成和纯化方法可能具有细胞毒性和 / 或翻译抑制 - 用于体外转录的 Invitrogen mmessage mmachine 试剂盒采用抗 - 反向加帽 (ARCA) 系统以及 Invitrogen MEGAclear 柱可用来去除具有细胞毒性的无帽转录物和小分子的未结合核苷酸图 2. ipsc 的转染后分析 (A) 荧光图像显示 68% 的转染效率,(B) 为明场图像图中为使用 250 ng GFP mrna 及 2 μl Lipofectamine Stem 试剂在 StemFlex 培养基及 Geltrex 基质中转染 44 小时后的 ipsc (NCRM1) 4

核糖核蛋白 (RNP) 转染实验方案 RNP 复合物组分 : Invitrogen GeneArt Platinum Cas9 核酸酶 ( 货号 :B25641) 转染当天 ( 在 24 孔板的单个孔中接种 PSC 1 天后 ) 执行下列步骤, 这些步骤已经过优化, 适合在 StemFlex 培养基中使用 Lipofectamine Stem 试剂进行转染 : grna ( 参见

5 μg/μl) 3 将试管 2 的溶液加入试管 1 中, 混合均匀 4 室温孵育步骤 3 的混合物 10 分钟 375 ng 5 在转染前, 吸弃 StemFlex 培养基, 在每孔中加入 0.

5 ml 预热至室温的 StemFlex 培养基, 如果 PSC 进行 48 小时转染, 则在第二天吸弃 StemFlex 培养基和转染复合物, 在每孔中加入 0.

5 核糖核蛋白 (RNP) 转染实验方案 RNP 复合物组分 : Invitrogen GeneArt Platinum Cas9 核酸酶 ( 货号 :B25641) 转染当天 ( 在 24 孔板的单个孔中接种 PSC 1 天后 ) 执行下列步骤, 这些步骤已经过优化, 适合在 StemFlex 培养基中使用 Lipofectamine Stem 试剂进行转染 : grna ( 参见利用体外转录设计并生成 grna ) 步骤试管络合组分每孔用量 (24 孔板 ) 1 试管 1 2 试管 2 Lipofectamine Stem 试剂 2 µl Cas9 核酸酶 1.5 µg grna ( μg/μl) 3 将试管 2 的溶液加入试管 1 中, 混合均匀 4 室温孵育步骤 3 的混合物 10 分钟 375 ng 5 在转染前, 吸弃 StemFlex 培养基, 在每孔中加入 0.5 ml 含有 RevitaCell 添加剂的 Opti-MEM I 培养基 6 在每孔中加入第 4 步的复合物 50 μl; 轻轻晃动培养板, 确保复合物在整个孔中分布均匀 7 8 将培养皿放回培养箱, 在 37 C 5% CO 2 的条件下培养细胞 4 小时重要信息 : 转染 4 小时后, 在每孔中加入 0.5 ml 预热至室温的 StemFlex 培养基, 如果 PSC 进行 48 小时转染, 则在第二天吸弃 StemFlex 培养基和转染复合物, 在每孔中加入 0.5 ml 新鲜 StemFlex 培养基 ; 在细胞达到 85% 融合度前传代转染效率分析转染 24 和 48 小时后, 利用荧光显微镜或流式细胞仪观察转染 GFP 报告基因重组体的 PSC, 使用 Invitrogen GeneArt 基因组剪切检测试剂盒或类似的分析产品分析双链断裂 (DSB) 形成 ( 图 3) 实验技巧将 50 ng GFP mrna 加入转录复合物及 RNP 复合物中, 可单独检测转染效率将 PSC 重新接种至 Opti-MEM I 培养基及玻连蛋白上, 还可进行反向转染, 但接种的细胞数量应增加至 150,000 个 / 孔解离 PSC, 然后按照上述推荐方法制备转染复合物吸弃包被溶液, 将悬浮细胞加入孔中, 覆盖转染复合物, 晃动混匀 PSC 接触并贴附时即转染开始进行 A B C Lipofectamine Stem 试剂体积 NCRM1 H9 NCRM1 H9 2 µl 2 µl Controls 插入缺失形成 : 35% 37% 图 3. ipsc 的转染后分析 (A) 荧光图像显示 60% 的转染效率,(B) 为明场图像图中为使用 1.5 μg GeneArt Platinum Cas9 核酸酶 375 ng grna 50 ng GFP mrna 及 2 μl Lipofectamine Stem 试剂在 StemFlex 培养基及 Geltrex 基质中转染 24 小时后的 ipsc (NCRM1) (C) 转染 48 小时后的 NCRM1 ipsc 和 H9 hesc 基因组剪切检测分析显示,HPRT 位点内分别形成 35% 和 37% 的插入缺失 5

6 利用体外转录设计并生成 grna 除 RNP 转染效率外, 特定位点的 DSB/ 插入缺失形成的效率还取决于 grna 设计使用 Invitrogen GeneArt CRISPR 搜索和设计工具 ( 登录 thermofisher.com/ crisprdesign), 从我们大于 600,000 种靶向人类基因组中单个基因的预设计 grna 序列数据库中搜索这些预设计 grna 已经过针对基因敲除实验的优化, 一般靶向每个基因的前三个转录外显子使用 Invitrogen GeneArt Precision grna 合成试剂盒 ( 货号 :A29377) 克隆并生成您需要的 grna 与 Invitrogen Qubit RNA BR 分析试剂盒 ( 货号 :Q10210) 结合使用, 可在 Invitrogen Qubit 3 荧光计 ( 货号 :Q33216) 上定量 grna 浓度如需了解更多信息, 请登录 thermofisher.com/transfection 赛默飞官方微信赛默飞生命科学官方微信

接种细胞用于转染 1. 当 PSC 无滋养层培养物的融合度低于 85% 时, 去除 mtesr1 重要信息 : 使用不含钙和镁的 DPBS, 因为这些离子会干扰 Versene 溶液的作用一次操作不超过 3 个孔, 这样可以准确计时解离过程 2. 重要信息 : 如果使用其他基于 EDTA 的解离试

接种细胞用于转染 1. 当 PSC 无滋养层培养物的融合度低于 85% 时, 去除 mtesr1 重要信息 : 使用不含钙和镁的 DPBS, 因为这些离子会干扰 Versene 溶液的作用一次操作不超过 3 个孔, 这样可以准确计时解离过程 2. 重要信息 : 如果使用其他基于 EDTA 的解离试转染实验方案 Lipofectamine Stem 转染试剂在 mtesr1 培养基及 Geltrex 基质中使用 Lipofectamine Stem 试剂转染多能性干细胞 PSC 生长培养基传代试剂及络合培养基组分货号 mtesr1 培养基 (STEMCELL Technologies) 05850 Geltrex 适用于 hesc 且不含 LDEV 的还原型生长因子基底膜基质 1413302